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DAIANE PLACIDO TORRES

Desenvolvimento de mtodos simples e rpidos para determinao de mercrio total e inorgnico em amostras biolgicas por espectrometria de absoro atmica com vapor frio

Florianpolis 2009

II Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Fsicas e Matemticas Departamento de Qumica Programa de Ps-graduao em Qumica

Desenvolvimento de mtodos simples e rpidos para determinao de mercrio total e inorgnico em amostras biolgicas por espectrometria de absoro atmica com vapor frio

Dissertao de Mestrado

Daiane Placido Torres

Florianpolis 2009

III

Desenvolvimento de mtodos simples e rpidos para determinao de mercrio total e inorgnico em amostras biolgicas por espectrometria de absoro atmica com vapor frio

Daiane Placido Torres

Orientador: Prof. Dr. Adilson Jos Curtius Co-orientadora: Vera Lcia Azzolin Frescura Bascuan

Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para obteno do ttulo de mestre em qumica analtica

Florianpolis 2009

IV Daiane Placido Torres

Desenvolvimento de mtodos simples e rpidos para determinao de mercrio total e inorgnico em amostras biolgicas por espectrometria de absoro atmica com vapor frio

Esta dissertao foi julgada e aprovada para obteno do ttulo de Mestre em Qumica no Programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina

Florianpolis, 11 de fevereiro de 2009. ____________________________ Prof. Dr. Ademir Neves Coordenador do Programa de Ps-Graduao

BANCA EXAMINADORA

__________________________ Prof. Dr. Adilson Jos Curtius Orientador

___________________________ Prof. Dr. Vera L. A. F. Bascuan Co-orientadora

____________________________ Prof. Dr. Ivan Gonalves de Souza DQ UFSC

____________________________ Prof. Dr. Gustavo Amadeu Micke DQ UFSC

____________________________ Dr. Eder Jose dos Santos TECPAR PR

V AGRADECIMENTOS

Ao professor Adilson, meu orientador, por acreditar em meu potencial, pela confiana em mim depositada e pelos valiosos ensinamentos. professora Vera, minha co-orientadora, pelos ensinamentos, apoio e carinho. Ao meu pai, Atair, e minha me, Juclia, por existirem e me dar todo o suporte necessrio pra enfrentar cada dia da minha vida. Aos meus irmos, Luciano e Juliana, por sua graa e luz. Aos meus colegas de laboratrio Dai Paula, Daniel, Eduardo, Fbio, Fabola, Jairo, Jessee e Luciano pela amizade e pelos momentos de descontrao, inspirao e ensinamento. Aos meus ex-colegas do laboratrio Alessandra, Anderson, Lsia, Mariana, Mirela, Ral, Rennan e Tatiana pelos ensinamentos e amizade, apesar da distncia. s minhas grandes colegas e amigas Ingrid e Tati pelo apoio, amizade e carinho. minha grande amiga Laura, sua famlia (Sueli, Chico, Tom, Viviane, Eduardo, rica) e amigos (Isadora e Frango) por todo o apoio, carinho e alegria que me proporcionam constantemente. Aos meus queridos familiares, tios e tias, Salete, Fernanda (In Memoriam), Irlete, Elizete, Ins, Cludia, Flor, Gorete, Vanderlei e Valdir pelo apoio e carinho. Aos meus queridos amigos e amigas Taize, Zoraide, Pedrinho e Deise pela ateno e afeto, mesmo longe. Ao professor Valdir por toda a abertura e disponibilidade. A Deus, por me dar fora para enfrentar e tirar boas lies de cada dia da minha vida e por me presentear de tantas formas. Aos meus colegas de curso e a todos que de alguma forma contriburam com meus trabalhos de iniciao cientfica e mestrado, e tambm para me tornar uma pessoa melhor. Aos membros da banca, por aceitarem o convite e pelas suas contribuies. Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

VI SUMRIO

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................1 LISTA DE TABELAS............................................................................................................3 LISTA DE ABREVIAES..................................................................................................4 RESUMO................................................................................................................................5 ABSTRACT............................................................................................................................7 1. INTRODUO..................................................................................................................9 1.1. Mercrio em amostras biolgicas....................................................................................9 1.2. Mercrio no Brasil e no mundo.....................................................................................11 1.3. Tcnica de anlise..........................................................................................................13 1.4. Mecanismos de reduo na CVG...................................................................................15 1.5. Preparo das amostras......................................................................................................17 2. OBJETIVOS.....................................................................................................................19 3. MATERIAIS E MTODOS.............................................................................................20 3.1. Instrumentao...............................................................................................................20 3.2. Tratamento do tubo de grafite com um modificador permanente..................................22 3.3. Reagentes e materiais de referncia...............................................................................22 3.4. Preparo da amostra.........................................................................................................24 3.5. Procedimento analtico...................................................................................................24 4. RESULTADOS E DISCUSSO......................................................................................26 4.1. Determinao de mercrio total e inorgnico em suspenses aquosas de amostras biolgicas usando CV AAS e oxidao in situ com KMnO4................................................26 4.1.1. Avaliao do tempo de sonificao sobre o sinal de mercrio...................................26 4.1.2. Efeito do tempo de repouso sobre o sinal de mercrio...............................................27 4.1.3. Efeito da concentrao de NaBH4...............................................................................28 4.1.4. Avaliao da concentrao de KMnO4.......................................................................30 4.1.5. Avaliao do tempo de reao com a soluo de KMnO4..........................................31 4.1.6. Parmetros de mrito...................................................................................................32 4.1.7. Calibrao com metilmercrio....................................................................................33 4.1.8. Resultados analticos...................................................................................................35

VII 4.2. Determinao de mercrio total e inorgnico em amostras biolgicas usando CV AAS aps o pr-tratamento com TMAH ou microondas...............................................................37 4.2.1. Efeito da concentrao de NaBH4...............................................................................38 4.2.2. Tratamento da amostra com TMAH...........................................................................40 4.2.3. Digesto cida dos CRM assistida por microondas....................................................41 4.2.4. Tempo de repouso para amostras em TMAH.............................................................42 4.2.5. Volume de amostra.....................................................................................................43 4.2.6. Especiao...................................................................................................................44 4.2.7. Parmetros de mrito...................................................................................................45 4.2.8. Resultados analticos...................................................................................................46 5. CONCLUSES.................................................................................................................50 6. REFERNCIAS................................................................................................................51 7. ANEXOS: Artigos............................................................................................................56

1 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Sistema MHS-15 de gerao qumica de vapor com atomizador de quartzo.....20 Figura 2 Efeito do tempo de sonificao sobre o sinal de absorvncia normalizado para mercrio a partir das suspenses das amostras preparadas em gua. () DOLT-3 3,6
g L-1, () BCR 186 3,2 g L-1 e () TORT-2 0,5 g L-1.....................................26

Figura 3 Efeito do tempo de repouso sobre o sinal de absorvncia normalizado para mercrio a partir das suspenses das amostras preparadas em gua. () DOLT-3 3,6
g L-1, () BCR 186 3,0 g L-1 e () TORT-2 1,2 g L-1.....................................27

Figura 4 Efeito da concentrao de NaBH4 sobre o sinal de absorvncia para suspenses de amostra e uma soluo padro preparadas em gua. () DOLT-3 8,2 g L-1, () BCR 186 6,8 g L-1 e () Hg2+ 5,0 g L-1..................................................................29 Figura 5 Efeito da concentrao de KMnO4 sobre o sinal de absorvncia para mercrio nas suspenses de amostra e soluo padro preparadas em gua. () DOLT-3 13,5 g
L-1, () BCR 186 7,9 g L-1 e () Hg
2+

10,0 g L-1.............................................31

Figura 6 Efeito do tempo de reao com a soluo de KMnO4 2,0% m/v sobre o sinal de absorvncia para mercrio nas suspenses de amostra e soluo padro preparadas em gua. () DOLT-3 14,4 g L-1, () BCR 186 6,0 g L-1 e () Hg2+ 10,0 g L-1....32 Figura 7 Avaliao do meio de preparo da soluo padro de metilmercrio. () npropanol e () cido clordrico 0,6 mol L-1.................................................................34 Figura 8 Efeito da concentrao de NaBH4 sobre o sinal de absorvncia para as solues de amostra digeridas com cido em forno de microondas e uma soluo padro em meio cido. () DOLT-3 13,3 g L-1, () BCR 186 7,9 g L-1 e () Hg2+ 5,0 g L-1..........................................................................................................................................38
Figura 9 Efeito da concentrao de NaBH4 sobre o sinal de absorvncia para as suspenses de CRM tratados com TMAH e uma soluo padro em TMAH obtido por CV-GF AAS. ( ) DOLT-2 10,8 g L-1, ( ) BCR 186 9,9 g L-1, ( ) GBW 9101 10,8 g L-1 e ( ) Hg2+ 10,0 g L-1. .....................................................................................................................39

2
Figura 10 Efeito do volume de TMAH sobre o sinal de absorvncia para as suspenses de CRM tratados com TMAH obtido por CV-GF AAS. ( ) DOLT-2 8,6 g L-1, ( ) BCR 186 7,9 g L-1 e ( ) GBW 9101 8,6 g L-1....................................................................................40 Figura 11 Efeito da concentrao de HCl sobre o sinal de absorvncia para as suspenses de CRM tratados com TMAH e uma soluo padro em TMAH obtido por CV-GF AAS. ( ) DOLT-2 10,8 g L-1, ( ) BCR 186 9,9 g L-1, ( ) GBW 9101 10,8 g L-1 e ( ) Hg2+ 10,0 g L-1........................................................................................................................41

Figura 12 Efeito do tempo de repouso sobre o sinal de absorvncia normalizado para mercrio a partir das suspenses de CRM em TMAH. () DOLT-3 7,2 g L-1, ( ) BCR 186 6,0 g L-1 e () TORT-2 1,3 g L-1..............................................................43

3 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Programa de temperatura do forno de grafite para determinao de mercrio total por CV-GF AAS...........................................................................................................22 Tabela 2 Figuras de mrito para a determinao de Hg total e inorgnico em soluo padro aquosa com e sem KMnO4 2,0% m/v por CV AAS..................................................33 Tabela 3 Figuras de mrito para a determinao de mercrio a partir de solues padro de metilmercrio em HCl e n-propanol com KMnO4 2,0% m/v, por CV AAS...................34 Tabela 4 Resultados analticos para a determinao de Hg total (com adio de KMnO4), inorgnico (sem adio de KMnO4) e metilmercrio (obtido pela diferena entre Hg total e Hg2+) em CRM preparados na forma de suspenso aquosa por CV AAS. Valores obtidos (mdia limite de confiana) em g g-1; n = 3.....................................................................36 Tabela 5 Figuras de mrito para a determinao de Hg total e inorgnico por CV AAS com e sem o aquecimento do tubo de quartzo......................................................................46 Tabela 6 Resultados analticos para a determinao de Hg total (amostras digeridas em forno de microondas), inorgnico (amostras em TMAH) e metilmercrio (obtido pela diferena entre Hg total e Hg2+) em CRM por CV AAS. Valores obtidos (mdia limite de confiana) em g g-1; n = 3...................................................................................................48 Tabela 7 Resultados analticos para a determinao de Hg total (com aquecimento do tubo de
quartzo), inorgnico (com o tubo de quartzo a temperatura ambiente) e metilmercrio (obtido pela diferena entre Hg total e Hg2+) em CRM tratados com TMAH por CV AAS. Valores obtidos (mdia desvio padro) em g g-1; n = 3...................................................................................49

4 LISTA DE ABREVIAES

AAS Espectrometria de absoro atmica (Atomic absorption spectrometry) CV Vapor frio (Cold vapor) CV AAS Espectrometria de absoro atmica com vapor frio (Cold vapor atomic absorption spectrometry) CVG Gerao qumica de vapor (Chemical vapor generation) CV-GF AAS Espectrometria de absoro atmica com forno de grafite aps gerao de vapor frio (Cold vapor graphite furnace atomic absorption spectrometry) CRM Material de referncia certificada (Certified reference material) GC Cromatografia gasosa (Gas chromatography) GC-FAPES Espectrometria de emisso em plasma com atomizao em forno acoplada a cromatografia gasosa (Gas chromatography with furnace atomization plasma emission spectrometric detection) ETV-ICP-MS Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado e vaporizao eletrotrmica (Electrothermal vaporization inductively coupled plasma mass spectrometry) FI-CV AAS Espectrometria de absoro atmica com vapor frio e injeo em fluxo (Flow injection cold vapor atomic absorption spectrometry) HG Gerao de hidreto (Hydride generation) HG AAS Espectrometria de absoro atmica com gerao de hidreto (Hydride generation atomic absorption spectrometry) ICP-OES Espectrometria de emisso ptica com plasma indutivamente acoplado (Inductively coupled plasma emission spectrometry) LD Limite de deteco LQ Limite de quantificao MIP-OES Espectrometria de emisso tica com plasma induzido por microondas (Microwave induced plasma optical emission spectrometry) PP Polipropileno QTA Atomizador de quartzo (Quartz tube atomizer) RSD Desvio padro relativo (Relative standard deviation) TMAH Hidrxido de tetrametilamnio (Tetramethylammonium hydroxide)

5 RESUMO

Foram desenvolvidos trs procedimentos simples, rpidos e confiveis para a determinao de mercrio total e inorgnico e, indiretamente, metilmercrio, em amostras biolgicas certificadas de referncia por espectrometria de absoro atmica com gerao de vapor frio (CV AAS) aps oxidao da amostra com KMnO4, ou tratamento da amostra com hidrxido de tetrametilamnio (TMAH) ou digesto cida da amostra assistida por microondas. O mtodo de CV AAS empregando KMnO4 como agente oxidante para determinao das espcies de mercrio em materiais certificados de referncia (CRM) biolgicos, diretamente a partir de suspenso preparada em gua, no requer nenhum tempo de repouso ou aquecimento da mesma, sendo as amostras simplesmente misturadas com gua podendo a medida ser realizada imediatamente. Para a determinao de mercrio inorgnico, nenhuma etapa adicional necessria. Para a determinao de mercrio total, as amostras foram oxidadas previamente com uma soluo de KMnO4 2,0% m/v por dois minutos. Depois disso, a medida pode ser realizada similarmente quela para a determinao de mercrio inorgnico. A concentrao de mercrio orgnico pode ser calculada como a diferena entre mercrio total e inorgnico. A maior vantagem deste procedimento que somente um mnimo de reagentes e etapas de manipulao da amostra so requeridos, o que permanece como um pr-requisito para anlises de rotina, particularmente para a determinao de mercrio e suas espcies. Os resultados foram concordantes com os valores certificados ou prximos aos valores informados a um nvel de confiana de 95% para os materiais de referncia investigados. O desvio padro relativo foi menor que 7,0% para a maioria dos CRM. Os limites de deteco para a amostra foram determinados como 0,020 e 0,016 g g-1 para mercrio inorgnico e total, respectivamente. O mtodo de CV AAS empregando tratamento da amostra com TMAH a temperatura ambiente foi empregado para a determinao de mercrio inorgnico mantendo-se o tubo de quartzo a temperatura ambiente. A concentrao de mercrio total foi medida pela mesma tcnica e aps o mesmo tratamento da amostra, sendo, no entanto o tubo de quartzo aquecido em uma chama de ar/acetileno, ou depois da digesto cida dos CRM em forno de microondas. Como no mtodo anterior, mercrio orgnico foi obtido pela diferena. As concentraes obtidas por estes mtodos tambm concordaram com os

6 valores certificados de acordo com o teste t para um nvel de confiana de 95%. Os desvios padro relativos foram menores que 3,0% para os CRM digeridos em microondas e menores do que 6,0% para os CRM tratados com TMAH, com o tubo de quartzo mantido temperatura ambiente. Os limites de deteco nas amostras foram 0,021e 0,041g g-1 para Hg inorgnico e total, respectivamente, j que a massa de amostra para mercrio total nos CRM digeridos foi metade daquela para a determinao de mercrio inorgnico. Os desvios padro relativos para os CRM tratados com TMAH com o tubo de quartzo aquecido na chama de ar/acetileno foram, em geral, menores que 10,0%. Neste caso, o limite de deteco para Hg total nas amostras foi de 0,13 g g-1. Simplicidade, alta eficincia, sem o uso de tcnicas cromatogrficas, e no utilizao de solues padro de metilmercrio so algumas das qualidades dos mtodos propostos, tornando-os adequados para anlise rotineira de especiao de mercrio em amostras biolgicas. O procedimento proposto que emprega tratamento dos CRM com gua e oxidao in situ com permanganato de potssio se mostrou rpido, seguro e ambientalmente correto. Alm disso, ainda minimiza as chances de contaminao da amostra e pode ser facilmente aplicvel anlise de rotina de materiais biolgicos. Por outro lado, o procedimento de pr-tratamento da amostra com TMAH possibilita uma solubilizao simples, segura, reprodutiva e efetiva. A determinao de mercrio total com o tubo de quartzo a temperatura ambiente, depois da digesto cida dos CRM em microondas, garante um LD similar quele obtido para Hg2+. Alm disso, a etapa de medida de Hg total nos CRM digeridos mais rpida do que aquela com os mesmos tratados com TMAH com o tubo de quartzo aquecido na chama de ar/acetileno.

7 ABSTRACT

Three simple, rapid and reliable procedures for the determination of total and inorganic mercury and, indirectly, methylmercury, in certified reference biological samples by cold vapor atomic absorption spectrometry (CV AAS) after sample oxidation with KMnO4, or sample treatment with tetramethylammonium hydroxide (TMAH) or microwave-assisted acid digestion of the sample have been developed. The method using CV AAS employing KMnO4 as oxidizing agent for the determination of mercury species in biological certified reference materials (CRM) directly from slurries prepared in water does not require any standing time or heating of the slurry. Samples are simply mixed with water and measurement can be carried out immediately. For inorganic mercury determination, no additional preparation is required. For total mercury determination the samples have to be previously oxidized with a 2.0% m/v KMnO4 solution for two minutes. After that, the measurement can be carried out similarly to that for inorganic mercury determination. The organic mercury concentration can be calculated as the difference between total and inorganic mercury. The greatest advantage of this method is that only a minimum of reagents and sample handling steps are required, which stands as a prerequisite for routine analysis, particularly for the determination of mercury and its species. The results were in agreement with the certified values at a confidence level of 95% or close to the informed values for the reference materials investigated. The relative standard deviation was less than 7.0% for most of the reference materials investigated. The limits of detection in the sample were determined as 0.020 and 0.016 g g-1 for inorganic and total mercury, respectively. The method using CV AAS employing sample treatment with TMAH at room temperature has been employed for the inorganic mercury determination, keeping the quartz tube at room temperature. Total mercury is measured by the same technique and after the same sample treatment but heating of the quartz tube in an air/acetylene flame, or after the CRM acid digestion in a microwave oven. As in the previous method, organic mercury is obtained by difference. The concentrations obtained by this method also agree with the certified values according to t-test at a 95% confidence level. The relative standard deviations were lower than 3.0% for digested CRM and lower than 6.0% for those after treatment with TMAH, being the quartz tube kept at room temperature. The limits of

8 detection in the samples were 0.021 and 0.041g g-1 for inorganic and total Hg, respectively, since the sample mass for total mercury in the digested CRM was half of that for inorganic mercury determination. The relative standard deviations for the CRM treated with TMAH being the quartz tube heated in an air-acetylene flame were, in general, lower than 10.0%. In this case, the limit of detection for total Hg in the samples was 0.13 g g-1. Simplicity, high efficiency, without using chromatographic techniques, and not requiring the use of methylmercury standard solutions, are some of the qualities of the proposed methods, which make them adequate for mercury speciation analysis in biological samples. The proposed procedure employing CRM treatment with water and in situ oxidation with potassium permanganate has proved to be fast, safe and environmentally friendly. Moreover, it still minimizes sample contamination risk and it can be easily applicable to routine analysis of biological samples. On the other hand, the procedure employing sample pretreatment with TMAH has led to a simple, safe, reproducible and effective solubilization method for biological samples. The determination of total mercury at room temperature, after acid digestion of the CRM in microwave oven, assures a limit of detection similar to that obtained for Hg2+. In addition, the measurement step of total Hg in the microwave digested CRM is faster than that with the CRM treated with TMAH being the quartz tube heated in an air-acetylene flame.

9 1. INTRODUO 1.1. Mercrio em amostras biolgicas

Mercrio um poluente global identificado como altamente txico, alm ser acumulativo e persistente no meio ambiente. As vrias espcies de mercrio diferem grandemente em suas propriedades bio-fsico-qumicas tal como toxicidade, solubilidade, e taxa de bioacumulao pelos organismos. O principal caminho para a exposio humana o consumo de peixe contaminado e outros frutos do mar que bioacumulam mercrio orgnico. Esse processo depende da formao de compostos orgnicos de mercrio a partir do mercrio inorgnico em ecossistemas aquticos. As espcies de mercrio orgnicas, altamente txicas e solveis em gordura, tendem a se acumular em tecidos de peixe, de onde elas podem entrar na cadeia alimentar humana. Mercrio inorgnico (Hg2+) e metilmercrio (CH3Hg+) so as duas principais espcies geralmente encontradas em amostras biolgicas. Portanto, a anlise de amostras somente para determinao da quantidade de mercrio total no conclusiva, porque fornece somente uma informao parcial sobre seu impacto na sade humana e no meio ambiente.1,2 A determinao de mercrio total e suas espcies em amostras biolgicas requer considerao cuidadosa do pr-tratamento da amostra.3 Um mtodo de preparo de amostra rpido e simples tem sido reportado, usando hidrxido de tetrametilamnio (TMAH) para solubilizar amostras biolgicas a fim de se determinar mercrio e outros analitos.4-8 A amostragem em suspenso um mtodo de preparo de amostra particularmente atrativo pois combina as vantagens da amostragem lquida e slida. Desta forma, as amostras so facilmente preparadas, no requerendo um pr-tratamento qumico agressivo, so menos susceptveis a contaminao e perda do analito antes da anlise e, geralmente, padres aquosos podem ser usados para a calibrao.9,10 Um outro mtodo simples de preparo de amostra na forma de suspenso, embora no to rpido, consiste no pr-tratamento com cido frmico para solubilizao de amostra biolgica, o qual tem sido usado com sucesso por alguns autores.11,12 No ambiente marinho, a distribuio e especiao de Hg so de interesse considervel j que pode ocorrer biometilao e subseqente bioconcentrao na cadeia alimentar. O mercrio est predominantemente presente como metilmercrio nas amostras biolgicas marinhas. Ferramentas para anlise de especiao envolvem procedimentos de

10 preparo de amostra mais brandos para preservar a integridade de quaisquer compostos organomercricos.13 Digesto de matrizes orgnicas e inorgnicas um estgio crtico na determinao de elementos trao, j que pode determinar a preciso e exatido dos resultados. Uma grande variedade de combinao de cidos fortes, oxidantes, radiao ultravioleta, temperatura e presso elevadas tm sido usadas e recomendadas.14 A extrao de espcies de mercrio a partir da matriz da amostra reconhecidamente uma das etapas mais crticas de um mtodo analtico. A principal preocupao na extrao deve ser (1) perda de mercrio em elevadas temperaturas, usadas em procedimentos de digesto, (2) interconverso de espcies a partir da coleta das amostras, (3) contaminao da amostra e (4) a necessidade de usar grandes quantidades de reagentes durante o pr-tratamento, o que aumenta o valor do branco e empobrece o limite de deteco. O mtodo de pr-tratamento da amostra deve permitir solubilizao das espcies orgnicas a partir da amostra de interesse, sem quebrar a ligao C-Hg.1 Subtrao da frao de mercrio inorgnico a partir da quantidade de mercrio total um mtodo indireto comum para a determinao das espcies de mercrio orgnicas encontrado na literatura. Sem qualquer procedimento de digesto prvio, mercrio inorgnico pode ser seletivamente determinado.4,15 Vrias tcnicas hifenadas seletivas tm sido aplicadas para a anlise de especiao de mercrio ao nvel de trao, a maioria delas combinando separao cromatogrfica e determinao espectromtrica.16 Entretanto, o uso de instrumentao analtica sofisticada, embora frequentemente associada boa exatido e sensibilidade, caracterizada por procedimentos analticos trabalhosos e caros, o que frequentemente adiciona complexidade tarefa de anlise de especiao em matrizes biolgicas. Embora muita pesquisa seja dirigida para melhorar a instrumentao analtica, a procura por mtodos que buscam simplificar o preparo da amostra e a prpria anlise pode ser igualmente se no mais valiosa, pela reduo do custo e complexidade do procedimento.11 Duas rotas principais so disponveis para diferenciar entre espcies orgnicas e inorgnicas. Uma faz o uso de tcnicas cromatogrficas, principalmente cromatografia gasosa, sendo possvel distinguir todas as espcies organomercuriais, embora mercrio inorgnico no possa ser determinado diretamente. A segunda possibilidade reduo seletiva, que se baseia nos diferentes comportamentos de reduo do mercrio orgnico e inorgnico na presena de redutores diferentes. A reduo seletiva no permite a identificao das diferentes espcies orgnicas, mas pode diferenciar compostos de

11 alquilmercrio do mercrio inorgnico. Metil, etil e fenilmercrio so os organomercuriais mais comumente reportados em amostras biolgicas marinhas.5,17,18 A espectrometria de absoro atmica com vapor frio (CV AAS) a tcnica mais largamente usada para a determinao de mercrio por causa da sua alta sensibilidade, ausncia quase absoluta de interferncias espectrais, custo operacional relativamente baixo e simplicidade. Entretanto, a determinao de mercrio total por CV AAS geralmente requer um pr-tratamento da amostra, a fim de atingir decomposio completa da matria orgnica e produzir, quantitativamente, uma espcie de mercrio inica, a qual pode ser posteriormente reduzida a mercrio elementar.14

1.2. Mercrio no Brasil e no mundo

Um dos casos mais conhecidos de contaminao por mercrio ocorreu em 1953, em Minamata, no Japo. A contaminao da Baa de Minamata por metilmercrio ficou conhecida como a doena de Minamata, quando a Chisso Fertilizer C. Ltd. (uma das maiores indstrias do Japo, que produzia fertilizantes qumicos, resinas sintticas, plsticos e compostos qumicos) produzia o metilmercrio como um subproduto do processo de produo do acetaldedo. Os resduos eram despejados nas guas da baa e a populao de Minamata alimentava-se de peixes provenientes desta baa. Em pacientes expostos, aps cinco anos da ocorrncia da contaminao, foram encontradas concentraes de mercrio extremamente elevadas no cabelo, variando de 2,46 a 705 mg/kg. Em 1960, o nvel de mercrio no lodo prximo ao canal de drenagem da indstria apresentava um valor de 2010 mg/kg em peso seco. Nos animais marinhos os nveis de mercrio tambm foram elevados: 35,7 mg/kg nos caranguejos e 5,61 mg/kg nas ostras. Ficou oficialmente reconhecido que 2252 pessoas foram diretamente contaminadas pelo metilmercrio, sendo que 1043 bitos ocorreram e um total de 12127 pessoas reivindicou estar doente.19,20 Na dcada de 70, no Iraque, Paquisto, Gana e Guatemala ocorreram vrios casos de contaminao de agricultores e seus familiares, que utilizavam gros tratados com fungicidas a base de metil e etilmercrio na confeco de po caseiro. No caso particular do Iraque, mais de 6900 pessoas foram hospitalizadas e, pelo menos, 459 morreram. Em 1969, nos Estados Unidos, tambm houve uma intoxicao resultante da ingesto de carne de

12 porcos alimentados com gros tratados com fungicidas organometlicos. A literatura apresenta vrios casos de contaminao com mercrio que vo desde a quebra de termmetros em hospitais e lares at a contaminao de lagos e rios por atividades industriais, principalmente de indstrias de cloro-lcali. Um caso recente ocorreu em Sorocaba, em SP, na Rede Ferroviria Federal S. A. quando um vazamento de mercrio contaminou dez adolescentes com idades entre 13 e 17 anos. O mercrio metlico era proveniente de um reator eltrico desativado desmontado por saqueadores de sucata de cobre.19 No Brasil, entretanto, a regio mais afetada por contaminao de mercrio a amaznica. A contaminao se d devido presena de minas de ouro nessa regio. No processo de minerao de ouro, uma enorme quantidade de mercrio metlico tem sido usada e liberada de modo abusivo no ecossistema local desde meados da dcada de 70 at meados dos anos 90. Estima-se que cerca de 100 toneladas de Hg tenham sido emitidas anualmente (uma para cada tonelada de ouro), das quais 45% foram despejadas nos rios e 55% na atmosfera. Tratando-se de mercrio, existe a possibilidade de causar dois tipos de danos sade na bacia do rio Amazonas: envenenamento ocupacional por Hg inorgnico pela inalao direta de vapor de Hg durante os processos de queima e requeima da amlgama Hg-Au, ou uma parte do Hg descartado no rio metilado e, em seguida, bioacumulado a um nvel significativo em peixe. Assim, as pessoas que vivem ao longo do rio e dependem dos produtos ribeirinhos so facilmente expostas a metilmercrio, que pode atingir nveis txicos, atravs do consumo repetido de peixes contaminados.2123 Os mineradores de ouro usam Hg para recuperar o ouro devido a uma de suas propriedades: capacidade de formar amlgamas com outros metais. A alta densidade (assim como a do ouro) tende a concentr-los nas fraes de sedimentos mais pesadas. A alta volatilidade permite a separao de Hg e Au por volatilizao do Hg, quando se queima a amlgama. Esse processo muito atrativo devido sua simplicidade e baixo custo, e tem sido largamente usado na bacia Amaznica brasileira e em outros pases da Amrica Latina (Bolvia, Peru, Colmbia e Venezuela), bem como na sia e frica.24 Desde os anos 80, o Brasil alcanou o primeiro lugar na produo de ouro na Amrica do Sul com uma produo anual de 100 a 200 toneladas, com cerca de 90% vinda de minas informais ou garimpos.25 A poluio ambiental por mercrio na Amaznia, que se origina do mercrio metlico, bastante diferente daquela experimentada no passado no Japo e Iraque, as

13 quais se originaram do metilmercrio. Em reas de minerao de ouro, envenenamento ocupacional devido ao mercrio inorgnico pode ocorrer entre os mineradores, ao passo que as pessoas que vivem rio abaixo da minerao de ouro, podem estar expostas a mercrio inorgnico e metilmercrio. Portanto, a especiao de mercrio essencial no levantamento topogrfico do comportamento qumico do mercrio nos ecossistemas.26

1.3.Tcnica de anlise

A gerao qumica de vapor (CVG) uma tcnica analtica bastante sensvel na qual os analitos so vaporizados na forma de tomos ou molculas gasosos atravs de uma reao qumica temperatura ambiente e, posteriormente, transportados para um atomizador ou cela de absoro aquecida ou no. A gerao qumica de vapor pode ocorrer atravs da tcnica de gerao de hidreto (HG) para determinao de elementos como As, Bi, Pb, Sb, Se, e Te, tcnica de vapor frio (CV), para determinao de Hg e Cd, etilao, para determinao de Pb e Hg, e gerao de carbonil, para determinao de Ni. O mtodo utilizado neste trabalho foi a tcnica de vapor frio, na qual o mercrio presente na amostra forma mercrio metlico, uma espcie bastante voltil, ao reagir em meio cido com o agente redutor tetrahidroborato de sdio, NaBH4.27 A espectrometria de absoro atmica com gerao qumica de vapor (CVG AAS) um mtodo analtico instrumental sensvel e convencional, amplamente usado, pois: - Garante uma eficincia de transporte de at 100% do frasco reacional ao atomizador, - O vapor formado homogneo, - Permite a separao do analito a partir da matriz potencialmente interferente, - Utilizao de um grande volume de soluo, - Obteno de baixos LD, tambm devido possvel pr-concentrao in situ do analito, - Permite estudos de especiao, - Pode ser acoplada a diferentes tcnicas (AAS, ICP-OES, ICP-MS). Entretanto, a gerao qumica de vapor apresenta algumas desvantagens, uma vez que: - A primeira etapa uma reao qumica, sujeita a interferncias,

14 - O estado de oxidao e forma (composto) do analito so crticos, - Concomitantes da soluo podem impedir a gerao ou liberao do vapor, - O pH da soluo e as concentraes dos reagentes podem ser crticos, - Cintica da reao e liberao podem ser afetadas por fatores como viscosidade e volume, - O mercrio particularmente sensvel a reaes de troca, o que pode causar perdas e contaminao.

Os vapores gerados pela reao com o redutor podem ser alternativamente coletados em uma superfcie previamente tratada com um modificador qumico. Para a determinao de mercrio um mtodo bastante convencional a reteno dos seus vapores em um tubo de grafite tratado com Au, por espectrometria de absoro atmica com forno de grafite aps gerao de vapor frio (CV-GF AAS).2,4 No entanto, apesar de melhoras significativas na instrumentao, a determinao de metilmercrio muitas vezes prejudicada por problemas relativos a recuperaes no-quantitativas e questes sobre a possibilidade de formao e interconverso de metilmercrio durante as etapas de preparo da amostra e separao. A gerao de vapor frio diretamente de alquotas de amostras preparadas na forma de suspenso tem se apresentado como uma alternativa simples e eficaz, pois evita que se utilizem os tratamentos intensivos e tediosos para o preparo das amostras, sujeitos perda do analito ou contaminao das mesmas. Especiao de compostos de mercrio em amostras biolgicas e ambientais requer procedimentos analticos rigorosos em cada estgio, coleta da amostra, tratamento ou medida.11,19,2830 Novas formas de gerao e introduo de vapores de espcies volteis empregando espectrometria atmica vm sendo investigadas nos ltimos anos. Dentre essas, pode-se citar o uso de ferramentas qumicas e fsicas para a reduo seletiva dos analitos, como no trabalho de Monteiro e colaboradores,31 em que NaBH4 0,01% m/v usado para reduzir Hg2+ e o mesmo redutor, na concentrao de 0,3% m/v, empregado para reduzir metilmercrio na presena de cloreto de ferro(III). Alternativamente, mtodos fotoqumicos de gerao de vapor tambm esto sendo investigados por vrios grupos no mundo, bem como a gerao de vapor frio promovida por ultra-som para a determinao de mercrio,32,33 gerao de vapor frio a partir de luz visvel e ultravioleta para especiao de

15 mercrio,3,34 gerao de vapor assistida por radiao ultravioleta para determinao de Se,35 e de vrios outros elementos volteis, metais de transio, metais nobres e no metais.36

1.4. Mecanismos de reduo na CVG

A gerao qumica de vapor usando reao em fase aquosa de tetrahidroborato , atualmente, um dos mtodos mais populares para a determinao de As, Sb, Bi, Se, Te, Ge, Pb, e Hg por AAS e outras tcnicas de espectrometria atmica.4,10,31 O mecanismo da CVG tem sido alvo de relativamente poucas investigaes. A primeira hiptese do mecanismo da gerao de hidreto foi postulada por Robbins e Caruso em 1979,37 e conhecida como mecanismo do hidrognio nascente. Eles argumentaram que a espcie ativa no processo de derivatizao/reduo o hidrognio atmico, ou o hidrognio nascente, o qual pensado ser formado durante a hidrlise cida do tetrahidroborato, ou seja: BH4- + H+ + 3H2O B(OH)3 MHn + + 8H

Com o tomo de hidrognio sendo responsvel pela derivatizao do elemento ao hidreto: M(m+) + (m + n)H mH+

Onde m representa o estado de oxidao do analito e n o nmero de coordenao do hidreto. O excesso de hidrognio atmico forma hidrognio molecular, o qual um dos produtos finais da hidrlise catalisada por cido do tetrahidroborato, atravs de reaes do tipo: H + H + H H2 H2 + OH

H2O

O mecanismo de CVG tem sido recentemente investigado e discutido de acordo com propriedades fundamentais do tetrahidroborato e complexos borano reportados na literatura. De acordo com evidncias experimentais coletadas a partir de estudos sobre troca de deutrio hidrognio realizados por DUlivo e colaboradores,38 a formao de hidrognio atmico no vivel pela hidrlise cida do tetrahidroborato ou outros complexos borano. Hidrognio molecular e espcies de hidroborano, no hidrognio atmico, so formados como intermedirios de reao durante a hidrlise do tetrahidroborato. Alm disso, experimentos com NaBD4 e outros reagentes deuterados

16 (D3O+ em D2O, NaOD) indicam que a reao de gerao de vapor em meio cido devida transferncia direta de hidrognio ligado ao boro durante a gerao de AsH3, SbH3 e CH3HgH. Essa evidncia apresenta um argumento slido contra o mecanismo do hidrognio nascente. O mecanismo de hidrlise do tetrahidroborato est estritamente relacionado com o mecanismo da CVG. A decomposio do tetrahidroborato em soluo aquosa pura pode ser representada como segue no esquema abaixo: BH4- + H2O + H2OBH3 H2OBH2OH
-

H+

H2OBH3

+ H2 + H2 + H2 + + H2O 4H2

+ +

H2O H2O + + H
+

H2OBH2OH B(OH)3 B(OH)3

H2OBH(OH)2

H2OBH(OH)2 BH4 + 3H2O

H2O

As reaes acima se referem hidrlise em meio no qual os nicos ligantes possveis so H2O e OH-. Quanto a CVG, uma ou mais espcies de hidroborano formadas durante a hidrlise do tetrahidroborato so as espcies reativas efetivas para Hg(II), As(III), Sb(III), Bi(III), Se(IV), Te(IV) e Sn(IV). Em outro trabalho de DUlivo e colaboradores,39 foi demonstrado que mercrio o elemento mais reativo da famlia dos elementos que sofrem CVG. Ele pode ser reduzido em condies alcalinas em nvel de nanomolar, ou usando quantidades micromolares de tetrahidroborato em condies cidas. Os resultados indicaram que as espcies de mercrio, Hg2+, seus complexos com cloreto, ou ambos, so muito reativos em relao a todos os intermedirios hidroborano possveis formados pela decomposio do tetrahidroborato, conforme reao abaixo. BH4-
k1 1

[BH3] ou LBH3n

k2

L2BH2n

k3

L3BHn

k4

B(OH)3

Onde L pode ser um ou mais grupos entre H2O, OH- e Cl-, e n a carga, a qual pode ser +1, 0, ou 1, dependendo das caractersticas de L. Sob as condies de reao tipicamente empregadas em CVG (meio de HCl, pH < 2 e temperatura ambiente), a taxa de hidrlise cida das espcies de hidroborano, em geral, parece seguir a ordem k1 < k2 < k3 < k4.

17 1.5. Preparo das amostras

Um pr-requisito importante para a determinao bem sucedida de mercrio em amostras biolgicas que o mercrio esteja presente no estado de oxidao 2+ para que possa ser reduzido a mercrio elementar (Hg0) na presena de um agente redutor adequado. A quantificao pode ento ser realizada pelo transporte do vapor de mercrio formado para dentro de um atomizador de quartzo para determinao por espectrometria de absoro atmica. Compostos organomercricos no so, entretanto, reduzidos a mercrio elementar por SnCl2 ou, no completamente por NaBH4.31 A quantificao nestas condies impossvel, a menos que um pr-tratamento adequado da amostra seja realizado. Para a anlise de amostras biolgicas por CV AAS, o pr-tratamento deve atingir dois objetivos. Primeiro, a matria orgnica na amostra deve ser suficientemente oxidada para liberar as espcies de mercrio a partir da matriz da amostra, e segundo, o mercrio liberado deve ser completamente oxidado a Hg2+. Uma variedade de combinaes de cidos fortes (HCl, H2SO4, HNO3), oxidantes (H2O2, KMnO4, K2Cr2O7, K2S2O8), temperaturas elevadas, radiao ultravioleta e exposio a microondas tm sido usadas e recomendadas.4,4043 Hidrxido de tetrametilamnio (TMAH) ou N(CH3)4OH, uma base forte e solvel em gua, um agente alternativo para o preparo de amostras biolgicas. Recentemente, TMAH tem sido usado como solubilizador de tecidos para vrias amostras biolgicas antes da anlise para a determinao de elementos trao por MIP-OES,8 FI-CV AAS,5,6 ETVICP-MS,13 GC-FAPES,44 CV AAS usando diferentes temperaturas no tubo de quartzo 4,15 e CV/HG AAS e CV/HG ICP-OES.45 A determinao de mercrio em amostras slidas geralmente envolve vrias etapas analticas, incluindo extrao, derivatizao (quando GC est envolvida), separao e deteco.46 O mtodo analtico apropriado depende da natureza da amostra e da concentrao de mercrio. Entretanto, os compartimentos mais crticos para especiao ainda esto ligados fase slida biota e solo/sedimento. Nos procedimentos de extrao de espcies organomercricas mais comuns, a partir de amostras ambientais, so usadas extrao cida (geralmente combinada com extrao de solvente), destilao e extrao alcalina. Neste sentido, dois tpicos conflitantes precisam ser tratados: obter uma recuperao adequada e prevenir perdas de espcies, especialmente devido destruio dos compostos.29 O uso de microondas tem sido estabelecido durante a ltima dcada como

18 eficiente auxiliar na digesto cida de vrios tipos de amostras para a determinao de elementos trao. A possibilidade de perder mercrio atravs de volatilizao durante a digesto da amostra em temperatura alta, impede o uso dos procedimentos de fuso ou calcinao. O uso de um frasco de Teflon selado, aquecido a alta temperatura, pode prevenir perdas de mercrio voltil. As principais vantagens da digesto em microondas usando frasco fechado so que o tempo de digesto significativamente reduzido, e a contaminao da amostra e as perdas do analito por volatilizao tambm so minimizadas.41,43 O primeiro mtodo proposto neste trabalho consiste na oxidao de suspenses aquosas de materiais certificados de referncia (CRM) biolgicos com KMnO4, permitindo a determinao da concentrao de mercrio total, usando o mesmo sistema redutor empregado para determinao de Hg2+. Na segunda parte deste trabalho, mercrio inorgnico ser determinado depois do tratamento dos CRM com TMAH e mercrio total ser determinado nas mesmas amostras pelo aquecimento do tubo de quartzo em uma chama de ar/acetileno. Alternativamente mercrio total ser determinado depois da digesto cida das amostras em forno de microondas, por CV AAS, mantendo-se o tubo de quartzo na temperatura ambiente.

19 2. OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho o desenvolvimento de procedimentos simples, rpidos e confiveis para a especiao de mercrio em amostras biolgicas certificadas de referncia por espectrometria de absoro atmica com vapor frio (CV AAS) e empregando KMnO4 como agente oxidante, tratamento da amostra com TMAH ou digesto cida assistida por microondas.

20 3. MATERIAIS E MTODOS 3.1. Instrumentao

Para a determinao de mercrio por CV AAS se empregou um sistema de gerao qumica de vapor (MHS-15 da Perkin Elmer, CT, EUA) operado em modo batelada acoplado ao espectrmetro de absoro atmica (AAnalyst 100, Perkin Elmer) equipado com uma lmpada de ctodo oco de mercrio (Perkin Elmer) e um corretor de fundo de deutrio. As seguintes condies de operao foram adotadas: comprimento de onda, 253,7 nm; fenda espectral, 0,7 nm; corrente, 6,0 mA. Para todas as medidas um tubo de quartzo com comprimento de 165 mm e um dimetro de 12 mm posicionado no caminho ptico foi usado, mantido a temperatura ambiente ou, ocasionalmente, aquecido a aproximadamente 700 C em uma chama de ar/acetileno, com vazes de 7,0 L min-1 (ar) e 1,5 L min-1 (acetileno). Argnio com uma pureza de 99,996% (White Martins, So Paulo, Brasil) foi usado como gs carreador para o vapor de mercrio, a uma presso de 250 kPa. Neste caso, rea de pico foi usada para avaliao do sinal. As amostras foram pesadas usando uma microbalana AG204 (Mettler Toledo, Greifensee, Sua). A digesto cida das amostras assistida por microondas foi realizada em um forno de microondas MLS-1200 MEGA (Milestone, Sorisole, Itlia). A Figura 1 mostra o sistema MHS-15 com o atomizador de quartzo (QTA).

Figura 1 Sistema MHS-15 de gerao qumica de vapor com atomizador de quartzo.

21 Para a determinao de Hg total por CV-GF AAS foi empregado um espectrmetro de absoro atmica AAS 5 EA (Analytik Jena, Jena, Alemanha) equipado com um sistema de correo de fundo com fonte contnua (lmpada de arco de deutrio) e um atomizador eletrotrmico com tubo de grafite aquecido transversalmente. Um sistema de gerao qumica de vapor HS 5 (Analytik Jena) operado em modo de batelada, foi acoplado ao atomizador eletrotrmico via um amostrador automtico para forno MPE 5 (Analytik Jena) usado na introduo do vapor de mercrio no forno de grafite. O vapor de mercrio gerado no reator foi transportado ao tubo de grafite atravs de uma linha de transferncia de politetrafluoretileno (PTFE) de 2,0 mm de dimetro e 0,5 m de comprimento, conectada ao amostrador automtico e a um capilar de titnio de 1,0 mm de dimetro na outra extremidade. O capilar de titnio foi introduzido no orifcio do tubo de grafite via amostrador automtico. Argnio foi usado como gs carreador para o vapor de mercrio, e como gs de purga e de proteo para o atomizador de grafite. Tubos de grafite sem plataforma recobertos piroliticamente (Analytik Jena) foram usados. Altura de pico, que neste caso mais sensvel do que a rea, foi usada exclusivamente para a avaliao do sinal neste sistema, j que os efeitos cinticos na gerao do vapor frio so compensados pela reteno do vapor no tubo de grafite tratado. A lmpada de ctodo oco de mercrio (ISTHorseheads, NY) foi operada a 6,0 mA (comprimento de onda 253,7 nm; fenda espectral 0,5 nm). O sistema de gerao de vapor foi operado usando-se as seguintes condies otimizadas:2 volume de amostra: 3,0 mL; tempo de bombeamento, 20 s; tempo de reao, 20 s; tempo de limpeza, 10 s. A vazo de gs para as etapas de bombeamento, reao e limpeza foi 300 mL min-1. Uma soluo 3,0% m/v de tetrahidroborato de sdio estabilizada em hidrxido de sdio 1,0% m/v foi usada como agente redutor. O programa de temperatura do forno de grafite usado para reteno e atomizao do mercrio mostrado na Tabela 1. O tubo de grafite foi previamente tratado com ouro, como descrito no item a seguir.

22
Tabela 1 Programa de temperatura do forno de grafite para determinao de mercrio total por CV-GF AAS.

Parmetros Etapa Pr-aquecimentoa Auto Zero Atomizaob Limpeza


a

Temperatura/ C 100 100 700 1000

Rampa/ C s-1 25 0 250 250

Permanncia/ s 10 6 5 5

Vazo de gs/ mL min-1 100 100 0 250

Coleta do vapor de mercrio neste estgio. bRegistro da absorvncia em altura de pico.

3.2. Tratamento do tubo de grafite com um modificador permanente

Tubos de grafite piroliticamente recobertos foram pr-tratados pela pipetagem de 40 L de uma soluo padro de ouro 500 mg L-1 no tubo e submetendo-o a um programa de temperatura j usado em um trabalho prvio,2 usando-se temperatura de pirlise de 160 C, atomizao de 900 C e limpeza de 1000 C. Esse procedimento foi repetido 25 vezes, resultando em uma massa total de 500 g do modificador depositado na parede do tubo de grafite. Ouro foi escolhido como modificador permanente devido alta afinidade que apresenta por mercrio, proporcionando assim uma etapa de reteno muito efetiva.

3.3. Reagentes e materiais de referncia

Todos os reagentes usados foram, no mnimo, de grau analtico e as solues foram preparadas usando gua de alta pureza com uma resistividade de 18,2 M cm, obtida a partir de um sistema de purificao de gua (Milli-Q Plus, Millipore, Beadford, MA, EUA). cido clordrico 37% (Merck, Darmstadt, Alemanha, 1003171000), cido ntrico 65% (Merck, 1004561000) e n-propanol (Nuclear, So Paulo, Brasil, 311629) foram bidestilados em um sistema de destilao abaixo do ponto de ebulio (Krner

23 Analysentechnik, Rosenheim, Alemanha). Uma soluo de TMAH 25% m/v em meio de metanol (Fluka, Buchs, Sua, 87732) foi usada para tratar as amostras antes da determinao de mercrio. cido ntrico e perxido de hidrognio 30% v/v (Merck, K27281110) foram empregados para a digesto da amostra assistida por microondas. O pH das amostras digeridas foi medido com um papel indicador universal em listras plsticas (Carlo Erba, 435121). A soluo do agente redutor foi preparada pela dissoluo de NaBH4 slido (Nuclear, 311898) e NaOH em peletes (Carlo Erba, Milo, Itlia, 480498), e estocados em frasco de polipropileno (PP) sob refrigerao. A soluo do agente oxidante foi preparada pela dissoluo de KMnO4 slido (Merck, 5082) em frasco de PP idntico ao usado para o preparo das amostras. Solues de referncia de mercrio inorgnico na faixa entre 1,0 e 50,0 g L-1 foram preparadas diariamente pela diluio seqencial apropriada da soluo estoque de mercrio inorgnico 1000 mg L-1 (Merck, 1702260500). Cloreto de metilmercrio 95% (Alfa Aesar, Ward Hill, MA, EUA) foi empregado para preparar solues por diluio seqencial. Agente anti-espumante Antifoam A (Fluka, 10794) foi usado para a anlise das amostras. Frascos de PP foram usados para o preparo e preservao das amostras (Techno Plastic Products, Trasadingen, Sua, 91015). Frascos de plstico e vidro foram lavados com gua da torneira e uma soluo de Extran diluda (Merck). Posteriormente, foram imersos em uma soluo de HNO3 10% v/v por no mnimo 48 h, e rinsados exaustivamente com gua desionizada antes do seu uso. Os seguintes materiais certificados de referncia foram analisados: BCR 186 (rim de porco liofilizado), BCR 278R (tecido de mexilho), BCR 397 (cabelo humano) e ERM-CE 278 (tecido de mexilho) do Institute for Reference Materials and Measurements (Geel, Blgica), GBW 9101 (cabelo humano) do Shanghai Institute of Nuclear Research of China (Shanghai, China), TORT-2 (hepatopncreas de lagosta), DORM-1 (msculo de peixe), e DOLT-2 e DOLT-3 (fgado de peixe) do National Research Council Canada (Ottawa, Ontrio, Canad).

24 3.4. Preparo da amostra

Para o tratamento alcalino, os materiais certificados de referncia (CRM) foram preparados misturando-se 100,0 500,0 mg da amostra biolgica com a soluo de TMAH 25% m/v. Um volume de 5,0 L de TMAH foi adicionado para cada mg de amostra, usando-se no mnimo 1,0 mL quando a massa da amostra foi menor do que 200,0 mg. A suspenso do CRM foi deixada em repouso por, no mnimo, 3 h temperatura ambiente e ento o volume foi completado at 25,0 mL com gua desionizada. A concentrao final de TMAH na suspenso foi 1,0 2,5% m/v. Para a digesto dos CRM em forno de microondas, uma massa de 100,0 250,0 mg foi misturada com 3,0 mL de HNO3 concentrado e 0,5 mL de H2O2 30% v/v. A digesto cida assistida por microondas foi realizada em um forno de microondas empregando um programa de cinco etapas recomendado pelo fabricante na seguinte ordem: um minuto em 250 W, um minuto em 0 W, cinco minutos em 400 W e cinco minutos em 650 W, seguido por cinco minutos de ventilao, sendo que a soluo resultante da digesto em microondas teve o volume completado para 25,0 mL com gua desionizada. Para o procedimento com oxidao in situ da amostra com permanganato de potssio, os CRM foram preparados simplesmente pela mistura de 100,0 500,0 mg da amostra biolgica p com gua desionizada para um volume final de 25,0 mL. Sob essas condies, mercrio foi encontrado ser estvel na suspenso da amostra. A suspenso final foi opaca, lembrando a cor original da amostra em p. As suspenses foram preparadas e estocadas no mesmo frasco, simplificando o procedimento.

3.5. Procedimento analtico

Para as amostras tratadas com TMAH ou digeridas em microondas, uma alquota de 3,0 mL da amostra ou soluo padro foi transferida ao frasco de reao. O agente redutor foi adicionado continuamente a esse frasco por 5 s e o vapor gerado foi transportado para o tubo de quartzo. Para o procedimento com tratamento alcalino, junto com a amostra, foi necessrio adicionar 2,0 mL de HCl 2,5 mol L-1 e 100 L de agente anti-espumante. Estas mesmas condies foram empregadas para a determinao de mercrio total a partir das

25 amostras tratadas com TMAH com aquecimento do tudo de quartzo na chama de ar/acetileno. As solues padro foram preparadas em TMAH 1,0% v/v na faixa de concentrao de 1,0 a 50,0 g L-1. Uma soluo de NaBH4 1,0% m/v estabilizada com NaOH 0,5% m/v foi usada como agente redutor para determinar mercrio total nos CRM digeridos em microondas, enquanto a concentrao para determinar mercrio inorgnico, a partir dos CRM em meio de TMAH, foi de 3,0% m/v de NaBH4 estabilizada com NaOH 1,0% m/v. As solues de agente redutor foram injetadas por 5 s ao frasco de reao, resultando em um volume aproximado de 1,5 mL. Somente uma curva de calibrao contra padres aquosos em meio cido foi realizada para os dois procedimentos (tratamento com TMAH e digesto cida). As solues padro foram preparadas em cido ntrico 5,0% v/v na faixa de concentrao de 3,0 a 15,0 g L-1. Essas solues foram preparadas imediatamente antes das determinaes. Para o procedimento analtico com oxidao in situ da amostra, uma alquota de 3,0 mL da suspenso da amostra agitada foi transferida ao frasco de reao juntamente com 2,0 mL de HCl 1,0 mol L-1, com a adio de 100 L de Antifoam A. Uma soluo de NaBH4 1,5% m/v estabilizada com NaOH 0,5% m/v foi adicionada ao frasco de reao por 5 s para a determinao de mercrio inorgnico. Para se determinar mercrio total, foi necessrio a adio de 0,5 mL ou 1,0 mL de uma soluo de KMnO4 2,0% m/v mistura e esperar 2 minutos antes da medida, exceto para as solues de calibrao, as quais puderam ser medidas imediatamente. Maior volume da soluo de KMnO4 2,0% m/v foi necessrio para os CRM TORT-2 e ERM-CE 278, devido s massas maiores, de cerca de 500,0 mg que foram requeridas para essas duas amostras. Neste caso, uma soluo de NaBH4 3,0% m/v estabilizada com NaOH 1,0% m/v foi usada como agente redutor. A calibrao foi realizada contra padres aquosos na faixa de concentrao de 3,0 a 15,0 g L-1. Essas solues foram preparadas imediatamente antes das determinaes. Por outro lado, para a determinao de mercrio total, 3,0 mL da soluo padro em HNO3 5,0% v/v foi misturado com 200 L da soluo de KMnO4 2,0% m/v. A concentrao da frao orgnica foi calculada, em todos os procedimentos, como a diferena entre o mercrio total e o inorgnico determinados.

26 4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Determinao de mercrio total e inorgnico em suspenses aquosas de amostras biolgicas usando CV AAS e oxidao in situ com KMnO4

4.1.1. Avaliao do tempo de sonificao sobre o sinal de mercrio

O efeito da cavitao ultra-snica sobre o sinal obtido para mercrio inorgnico a partir das suspenses aquosas dos CRM mostrado na Figura 2.

Absorvncia Integrada Normalizada / s g

-1

5 4 3

0,6 0,5 0,4 0,3 0 10 20 30 40 50 60

Tempo de Sonificao / min

Figura 2 Efeito do tempo de sonificao sobre o sinal de absorvncia normalizado para mercrio a partir das suspenses das amostras preparadas em gua. () DOLT-3 3,6 g L-1, () BCR 186 3,2 g L-1 e () TORT-2 0,5 g L-1.

Os sinais de absorvncia integrada foram normalizados para a massa de amostra na suspenso. Como pode ser visto, no h efeito significativo do tempo de sonificao sobre as intensidades do sinal para mercrio na faixa de tempo estudada para qualquer das trs amostras, como poderia ser esperado, j que as amostras no foram acidificadas. Visto que a sonificao das amostras no promoveu nenhuma vantagem adicional para a extrao do mercrio, esta etapa no foi adotada nos experimentos adicionais. O tempo e a amplitude de sonificao tm sido mais importantes para amostras ambientais, tal como investigado por

27 Krishna et al.1 para cinza de carvo, lquen e musgo enriquecido com metilmercrio e mercrio inorgnico. Entretanto, o tempo de sonificao estudado neste trabalho, foi significativamente mais curto que aquele empregado por Krishna et al.

4.1.2. Efeito do tempo de repouso sobre o sinal de mercrio

O efeito do tempo de repouso da suspenso preparada em gua sobre a intensidade do sinal de mercrio inorgnico pode ser visto na Figura 3. Os sinais de absorvncia integrada foram normalizados para a massa da suspenso.

6,0
-1

Absorvncia Integrada Normalizada / s g

5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0 5 10 15 20 25

Tempo de Repouso / h

Figura 3 Efeito do tempo de repouso sobre o sinal de absorvncia normalizado para mercrio a partir das suspenses das amostras preparadas em gua. () DOLT-3 3,6 g L-1, () BCR 186 3,0 g L-1 e () TORT-2 1,2 g L-1.

O sinal para mercrio diminui, embora em uma extenso relativamente pequena, com o aumento do tempo de repouso de 0 para 24 horas. Isso pode ser atribudo a perdas da frao de Hg solubilizado por adsoro nas paredes do frasco de PP e/ou volatilizao de Hg0, j que Hg2+ pode ser espontaneamente convertido a Hg elementar na soluo e ser perdido por volatilizao.47,48 Essa perda parcial, entretanto, pode ser facilmente evitada pela anlise da amostra logo aps o preparo da suspenso, obtendo-se mxima sensibilidade

28 sem qualquer tempo de repouso, ao contrrio de outros procedimentos de amostragem em suspenso.9,49 Apesar disso, mesmo depois de 10 horas de repouso, as perdas podem ser consideradas insignificantes. De fato, esse comportamento foi primeiramente observado em nosso estudo prvio para avaliar a concentrao necessria de TMAH para tratar amostras biolgicas e determinar as espcies de mercrio.4 Esse estudo mostrou que mesmo em baixas concentraes de TMAH o sinal para mercrio ficou prximo daquele obtido com concentraes mais altas. Naturalmente, a prxima etapa foi eliminar o TMAH e investigar uma suspenso com apenas gua e a amostra. Neste contexto, o uso de tratamento com gua pode ser uma boa alternativa para minimizar as desvantagens de procedimentos convencionais em termos de nmero de etapas analticas, tempo, eficincia de extrao e baixo consumo de reagentes. Uma possvel explicao para esse comportamento que existe uma reao muito rpida envolvida no processo de gerao qumica de vapor de mercrio a partir de partculas slidas.40 Pode-se assumir que a maioria do mercrio permanece ocluso nas partculas slidas at a adio do agente redutor, o qual capaz de liberar o mercrio para a fase vapor devido a um aumento na entropia do sistema. O mercrio liberado a partir das partculas slidas para a soluo rapidamente transformado em vapor de mercrio atmico, o qual ento carregado pelo fluxo de argnio para o tubo de quartzo. Preparar uma suspenso aquosa de amostras biolgicas pode ser uma alternativa para a digesto cida convencional a fim de se determinar mercrio e suas espcies nessas amostras, evitando-se a interconverso das espcies. J que nenhum aquecimento necessrio, perda do analito devido volatilizao evitada, e o procedimento tambm muito menos propenso a contaminao. Uma vantagem adicional a no utilizao de quantidades grandes de cidos minerais concentrados, os quais sempre representam um risco para a sade do operador, para o meio ambiente e para a manuteno dos equipamentos.8

4.1.3. Efeito da concentrao de NaBH4 Como mostrado na Figura 4, a absorvncia integrada aumenta com o aumento da concentrao de NaBH4 para a suspenso da DOLT-3 e soluo padro de mercrio at

29 1,5% m/v, alcanando um plat para concentraes de NaBH4 de 1,5 a 3,0% m/v, diminuindo rapidamente para concentraes mais altas. Uma ligeira diferena pode ser notada para a suspenso da BCR 186, para a qual o sinal aumentou at uma concentrao de NaBH4 de 3,0% m/v, diminuindo rapidamente para concentraes mais altas.

0,30

0,25

Absorvncia Integrada / s

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00 0 1 2 3 4 5 6

Concentrao de NaBH4 / % m/v

Figura 4 Efeito da concentrao de NaBH4 sobre o sinal de absorvncia para suspenses de amostra e uma soluo padro preparadas em gua. () DOLT-3 8,2 g L-1, () BCR 186 6,8 g L-1 e () Hg2+ 5,0 g L-1.

A diminuio do sinal para concentraes mais altas de agente redutor pode estar relacionada ao excesso de vapor formado, alm do vapor de mercrio, durante a reao de gerao qumica de vapor devido alta concentrao de NaBH4, incluindo vapor de gua, que em ocasies pode condensar na linha de transferncia, impedindo a passagem do vapor do analito. Consequentemente, a concentrao de NaBH4 foi selecionada como 1,5% m/v estabilizada com 0,5% m/v de NaOH para determinao de Hg inorgnico e 3,0% m/v em NaOH 1,0% m/v para determinao de Hg total, a fim de compensar a presena de KMnO4.

30 4.1.4. Avaliao da concentrao de KMnO4 Mercrio inorgnico foi determinado usando a reduo com NaBH4 a partir da suspenso, ao passo que mercrio total foi determinado depois da oxidao do mercrio orgnico para mercrio inorgnico na suspenso atravs da reao com KMnO4. O efeito da concentrao de KMnO4 no sinal analtico foi avaliado pelo uso de dois CRM e uma soluo padro de mercrio inorgnico. Pela Figura 5 pode ser visto que, sem a adio de KMnO4, o sinal relativamente baixo para ambas as amostras e para a soluo padro, porque sob essas condies somente mercrio inorgnico reage efetivamente com NaBH4 para formar vapor de mercrio elementar. Com o aumento da concentrao de KMnO4 o sinal para mercrio nas amostras e soluo padro aumenta significativamente, como resultado da converso de mercrio orgnico a Hg2+ nas amostras e devido a uma possvel ao cataltica do mangans para a reao de gerao de vapor de mercrio a partir da soluo padro, o que a princpio parece ser contraditrio, j que se trata de um oxidante. A adio de uma soluo de KMnO4 2,0% m/v permitiu obteno de intensidades de sinal adequadas, com um comportamento similar para todas as amostras analisadas e para a soluo padro. Portanto, essa concentrao de KMnO4 foi escolhida como tima e usada nos experimentos posteriores. A adio de KMnO4 em altas concentraes resultou na formao de um precipitado marrom para algumas amostras, muito provavelmente devido formao de MnO2. Por outro lado, a cor roxa caracterstica do KMnO4 desaparecia em menos de um minuto para as suspenses preparadas com aproximadamente 500 mg de amostra, quando concentraes mais baixas de KMnO4 foram adicionadas. Neste caso, concentraes mais altas foram necessrias para atingir completa oxidao do analito, j que os componentes da amostra estavam consumindo a maioria do KMnO4.

31

0,50 0,45

Absorvncia Integrada / s

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,00 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Concentrao de KMnO4 / % m/v

Figura 5 Efeito da concentrao de KMnO4 sobre o sinal de absorvncia para mercrio nas suspenses de amostra e soluo padro preparadas em gua. () DOLT-3 13,5 g L-1, () BCR 186 7,9 g L-1 e () Hg2+ 10,0 g L-1.

4.1.5. Avaliao do tempo de reao com a soluo de KMnO4 Um ponto muito importante para mencionar a formao do hidreto voltil CH3HgH a partir da reduo do metilmercrio, por NaBH4 em meio cido, ao invs do vapor de mercrio atmico, o qual produzido a partir da reduo de Hg2+ por NaBH4 ou SnCl2.5 Para que se possa medir o mercrio total, uma decomposio prvia do metilmercrio e de outras espcies orgnicas necessria,6 o que nesta parte do trabalho foi atingido pelo emprego da oxidao com KMnO4, como j mencionado. Depois da concentrao de KMnO4, otimizou-se o tempo requerido para oxidao total de mercrio orgnico a Hg2+ nas amostras biolgicas com uma soluo de KMnO4 2,0% m/v, como visto na Figura 6. Um tempo de reao de dois minutos foi selecionado como timo para as amostras, j que para BCR 186 o sinal de mercrio repetitvel depois desse tempo, e nenhuma melhoria significativa foi obtida para perodos de reao mais longos para as outras amostras. Um outro detalhe importante reside no fato que a sedimentao de partculas slidas aps a formao da suspenso mais rpida que aquela observada com o tratamento com TMAH. Este fato torna a agitao mecnica

32 imediatamente antes da pipetagem da amostra uma etapa muito importante, a fim de assegurar a homogeneidade da suspenso.

0,50

Absorvncia Integrada / s

0,45

0,40

0,35 0,2 0,1 0,0 0 1 2 3 4

Tempo de reao com KMnO4 / min

Figura 6 Efeito do tempo de reao com a soluo de KMnO4 2,0% m/v sobre o sinal de absorvncia para mercrio nas suspenses de amostra e soluo padro preparadas em gua. () DOLT-3 14,4 g L-1, () BCR 186 6,0 g L-1 e () Hg2+ 10,0 g L-1.

4.1.6. Parmetros de mrito

Os parmetros de mrito para ambos os procedimentos foram obtidos usando solues aquosas de Hg2+ com e sem a adio de KMnO4. Como mostrado na Tabela 2, um limite de deteco (LD) mais baixo foi obtido para a determinao de mercrio total usando KMnO4, visto que a sensibilidade, medida pela inclinao da curva de calibrao, foi mais alta para este procedimento. O LD foi definido como trs vezes o desvio padro de dez leituras do branco, dividido pela inclinao da curva de calibrao. O limite de quantificao (LQ) definido como trs vezes o LD. Os valores de limite de deteco mostrados na Tabela 2 foram calculados para as amostras baseados em uma massa de 500 mg. Um ponto para mencionar que as sensibilidades para a determinao de mercrio total e inorgnico esto muito prximas, como originalmente proposto, sendo ainda maior para mercrio total, diferentemente do procedimento com o tubo de quartzo aquecido, a ser discutido. Em geral, os LD obtidos foram perfeitamente adequados para as amostras

33 biolgicas analisadas no se necessitando de procedimentos de pr-concentrao, exceto para a amostra ERM-CE 278, que tem uma concentrao muito baixa de mercrio inorgnico.

Tabela 2 Figuras de mrito para a determinao de Hg total e inorgnico em soluo padro aquosa com e sem KMnO4 2,0% m/v, por CV AAS.

Soluo padro Hg2+ Hg total

KMnO4

Inclinao / (g L-1)-1 s

LD / ng g-1

Faixa de Calibrao / g L-1 3,0 15,0 3,0 15,0

No Sim

0,037 0,048

0,9992 0,9999

20 16

4.1.7. Calibrao com metilmercrio

Um estudo com solues de metilmercrio foi realizado para avaliar seu comportamento em diferentes meios de preparo. Solues padro de metilmercrio foram preparadas em cido clordrico 0,6 mol L-1 ou em n-propanol. Imediatamente antes da medida, 1,0 mL de uma soluo de HCl 1,0 mol L-1 foi adicionado s solues de metilmercrio quando em meio de n-propanol. A calibrao para cada meio das solues padro de metilmercrio foi realizada com e sem a adio de 200 L de uma soluo de KMnO4 2,0% m/v. A Tabela 3 apresenta os parmetros de mrito para as curvas de calibrao em ambos os meios com adio de KMnO4. Esses resultados confirmam que metilmercrio eficientemente hidrolisado pela oxidao com KMnO4, particularmente porque a sensibilidade da curva de calibrao com CH3Hg+ em HCl na presena de KMnO4 muito similar quela para a determinao de Hg2+. Uma sensibilidade 10% menor foi obtida para a curva de calibrao realizada com CH3Hg+ em n-propanol, o que pode estar relacionado maior viscosidade deste meio, o que dificulta a liberao do vapor de Hg.

34
Tabela 3 Figuras de mrito para a determinao de mercrio a partir de solues padro de metilmercrio em HCl e n-propanol com KMnO4 2,0% m/v, por CV AAS.

Soluo padro CH3Hg+/HCl CH3Hg+/n-propanol

KMnO4

Inclinao / (g L ) s
-1 -1

LD / ng g
-1

Faixa de Calibrao / g L-1 3,0 12,6 3,0 12,0

Sim Sim

0,036 0,033

0,9999 0,9998

Um comportamento um pouco diferente foi observado para as curvas de calibrao sem a adio de KMnO4. Esperava-se que nenhum sinal seria obtido sob essas condies, j que nenhuma etapa de oxidao foi empregada. A Figura 7 mostra as curvas em HCl 0,6 mol L-1 e em n-propanol, sem a etapa de oxidao com KMnO4. Pode ser observado que hidrlise parcial de metilmercrio acontece e que este efeito fortemente dependente da concentrao de metilmercrio. Uma reao rpida e possivelmente catalisada por cido pode acontecer, sendo as solues de calibrao em meio cido aquelas que sofrem a hidrlise mais acentuada. Apesar disso, o efeito tem influncia negligencivel na anlise das amostras biolgicas, j que todas tm concentrao de metilmercrio em soluo menor ou igual a 6,4 g L-1, concentrao na qual o efeito da hidrlise no significativo.
0,30

0,25

Absorvncia Integrada /s

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00 0 2 4 6 8 10
-1

12

Concentrao de Metilmercrio / g L

Figura 7 Avaliao do meio de preparo da soluo padro de metilmercrio. () n-propanol e () cido clordrico 0,6 mol L-1.

35 4.1.8. Resultados analticos

Na maioria dos CRM, metilmercrio e mercrio inorgnico so encontrados em concentraes muito mais altas em relao s outras espcies, dependendo da natureza do CRM. Em todos os casos, a diferena entre o mercrio total e o inorgnico foi considerada como metilmercrio, o que teve uma boa concordncia com os valores certificados. A exatido do mtodo foi avaliada pela anlise de vrios CRM. Os resultados obtidos para Hg total, Hg2+ e CH3Hg+ esto apresentados na Tabela 4. Os valores determinados para mercrio inorgnico concordam com a diferena entre as concentraes de metilmercrio e mercrio total certificadas ou com resultados publicados previamente [4], ficando dentro do limite de confiana de 95% do valor certificado ou prximo dos valores informados dos materiais de referncia investigados. A concentrao de metilmercrio reportada para duas amostras certificadas e os valores esto em boa concordncia com os obtidos neste trabalho. Esta concordncia outra evidncia para demonstrar que os valores obtidos por CV AAS sem a oxidao da amostra corresponde concentrao de Hg2+. A concentrao de mercrio orgnico obtida, calculada como a diferena entre os valores obtidos com e sem oxidao usando KMnO4, tambm concorda com a concentrao de metilmercrio certificada, de acordo com o teste t para um nvel de confiana de 95%. Isso demonstra que a concentrao de mercrio orgnico obtida pela diferena praticamente de metilmercrio. O desvio padro relativo foi menor que 7,0% para a maioria das amostras.

36

Tabela 4 Resultados analticos para a determinao de Hg total (com adio de KMnO4), inorgnico (sem adio de KMnO4) e metilmercrio (obtido pela diferena entre Hg total e Hg2+) em CRM preparados na forma de suspenso aquosa por CV AAS. Valores obtidos (mdia limite de confiana) em g g-1; n = 3.

Mercrio total Certificado BCR 186 DOLT-3 TORT-2 ERM-CE 278


a c

Metilmercrio (como Hg) Certificado NI 1,59 0,12 0,152 0,013 NI Encontradoa 0,70 0,08 1,65 0,04 0,148 0,009 ND

Mercrio inorgnico Informadob 1,5 0,1c 1,78 0,118 NI Encontrado 1,30 0,14 1,86 0,19 0,135 0,021 < LQ

Encontrado 2,01 0,22 3,51 0,19 0,28 0,03 0,193 0,031

1,97 0,04 3,37 0,14 0,27 0,06 0,196 0,009

Calculado como a diferena entre Hg total e Hg inorgnico. b Calculado como a diferena entre Hg total e CH3Hg+ como Hg. Determinado por Torres et al. 4. NI: no informado. ND: no determinado.

37 4.2. Determinao de mercrio total e inorgnico em amostras biolgicas usando CV AAS aps o pr-tratamento com TMAH ou microondas Em um trabalho prvio, Torres et al.4 desenvolveram uma tcnica usando CV AAS para especiao de mercrio atravs da solubilizao com TMAH em amostras biolgicas. A gerao qumica de vapor, obtida pelo uso de NaBH4, permitiu a determinao de mercrio total com o tubo de quartzo aquecido em uma chama de ar-acetileno, e de mercrio inorgnico com o mesmo atomizador a temperatura ambiente. A partir da, ficou claro que o tratamento das amostras com TMAH suave e incapaz de quebrar a ligao entre mercrio e o radical metil sob as condies empregadas. Entretanto, o aquecimento do tubo de quartzo diminui consideravelmente a sensibilidade para a determinao de mercrio total, tendo em vista a reduo do tempo de residncia dos tomos na clula de absoro. Para contornar esta limitao, uma alternativa muito simples a determinao de mercrio total a temperatura ambiente depois de um pr-tratamento da amostra que assegure que todas as espcies de mercrio tenham sido oxidadas a Hg2+. Deste modo, possvel determinar seletivamente as espcies de mercrio presentes nas amostras biolgicas, sendo o mercrio inorgnico determinado nas amostras tratadas com TMAH e o mercrio total (Hg2+ e mercrio na forma orgnica) determinado nas amostras aps digesto cida em forno de microondas pela tcnica de CV AAS com o tubo de quartzo mantido temperatura ambiente. Nesta parte do trabalho sero apresentados os resultados da determinao de mercrio inorgnico nos CRM tratados com TMAH, sendo a concentrao de mercrio total medida pela mesma tcnica, mas com o aquecimento do tubo de quartzo em uma chama de ar/acetileno, ou depois da digesto cida dos CRM em forno de microondas. CV-GF AAS com reteno do vapor em um tubo de grafite aquecido tratado com Au foi usada para otimizar algumas condies de gerao de vapor nas amostras tratadas com TMAH. Como no mtodo anterior, a concentrao de mercrio orgnico obtido pela diferena.

38

4.2.1. Efeito da concentrao de NaBH4 O efeito da concentrao de NaBH4 sobre a gerao de vapor frio a partir das amostras digeridas com cido em forno de microondas ou tratadas com TMAH pode ser visto nas Figura 8 e 9, respectivamente. Para as amostras digeridas em microondas, a absorvncia integrada aumenta com um aumento na concentrao de NaBH4 para mercrio total nas solues de DOLT-3 e BCR 186 at 1,0% m/v, diminuindo para concentraes mais altas do agente redutor. Para a soluo padro de Hg2+, a absorvncia integrada aumenta com a concentrao de NaBH4 at 1,0% m/v, mantendo-se em um plat para concentraes de NaBH4 de 1,0 a 3,0% m/v.

0,14 0,12

Absorvncia Integrada / s

0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Concentrao de NaBH4 / % m/v

Figura 8 Efeito da concentrao de NaBH4 sobre o sinal de absorvncia para as solues de amostra digeridas com cido em forno de microondas e uma soluo padro em meio cido. () DOLT-3 13,3 g L-1, () BCR 186 7,9 g L-1 e () Hg2+ 5,0 g L-1.

A diminuio do sinal de mercrio nos CRM digeridos para concentraes mais altas de NaBH4 pode estar relacionada a alta produo de vapores durante a reao de gerao qumica de vapor, o que pode diluir o vapor de mercrio e diminuir o tempo de residncia dos tomos de mercrio na cela de absoro, e, portanto, o sinal de absorvncia.

39

Desta forma, a concentrao de NaBH4 foi selecionada como 1,0% m/v em NaOH 0,5% m/v para determinao de mercrio total. O perfil do grfico para o estudo da concentrao de NaBH4 por CV-GF AAS, obtido previamente4, com as suspenses de CRM tratados com TMAH difere do obtido para os CRM digeridos, como mostra a Figura 9. Para o meio alcalino, a absorvncia aumenta com a concentrao de NaBH4 para os trs CRM at a maior concentrao estudada, 6,0% m/v, enquanto que para a soluo padro em meio de TMAH o sinal praticamente estvel a partir de 3,0% m/v do redutor, similarmente ao caso anterior. O mais provvel que mais redutor requerido neste meio em comparao s amostras digeridas devido presena da matriz das amostras, visto que os CRM ficam na forma de suspenso no meio de TMAH. Entretanto, a concentrao de NaBH4 selecionada foi de 3,0% m/v em NaOH 1,0% m/v a fim de reduzir a quantidade de gua condensada na linha de transferncia, a qual piora a preciso.

0,5

Absorvncia integrada / s

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 1 2 3 4 5 6

Concentracao de NaBH4/% m/v

Figura 9 Efeito da concentrao de NaBH4 sobre o sinal de absorvncia para as suspenses de CRM tratados com TMAH e uma soluo padro em TMAH obtido por CV-GF AAS. ( ) DOLT-2 10,8 g L-1, ( ) BCR 186 9,9 g L-1, ( ) GBW 9101 10,8 g L-1 e ( ) Hg2+ 10,0 g L-1.

40

4.2.2. Tratamento da amostra com TMAH

O efeito do volume da soluo de TMAH sobre o sinal de absorvncia do mercrio previamente avaliado4 para suspenses de trs das amostras biolgicas certificadas por CVGF AAS apresentado na Figura 10. As intensidades do sinal de mercrio, normalizadas para a massa de amostra, foi quase constante para 1,0 a 3,0 mL de TMAH. Um detalhe importante para ser mencionado a produo de espuma quando volumes relativamente grandes de TMAH foram empregados. Desta forma foi adotado o seguinte procedimento: 5 L de TMAH por mg de amostra, usando um mnimo de 1,0 mL do reagente para massas menores que 200 mg (para os CRM que apresentam concentraes mais altas de mercrio).

0,5

Absorvncia integrada / s

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 1 2 3 4 5

Volume de TMAH / mL

Figura 10 Efeito do volume de TMAH sobre o sinal de absorvncia para as suspenses de CRM tratados com TMAH obtido por CV-GF AAS. ( ) DOLT-2 8,6 g L-1, ( ) BCR 186 7,9 g L-1 e ( ) GBW 9101 8,6 g L-1.

A concentrao mais alta de HCl de 2,5 mol L-1 foi selecionada a partir dos resultados obtidos por CV-GF AAS,4 de acordo com o grfico da Figura 11. Foram usadas as mesmas condies: uma alquota de 3,0 mL da suspenso do CRM em meio de TMAH

41

foi transferida para o frasco de reao juntamente com 2,0 mL de HCl 2,5 mol L-1 e 100 L de agente antiespumante.

0,60

Absorvncia integrada / s

0,45

0,30

0,15

0,00 1 2 3 4 5
-1

Concentrao de HCl / mol L

Figura 11 Efeito da concentrao de HCl sobre o sinal de absorvncia para as suspenses de CRM tratados com TMAH e uma soluo padro em TMAH obtido por CV-GF AAS. ( ) DOLT-2 10,8 g L-1, ( ) BCR 186 9,9 g L-1, ( ) GBW 9101 10,8 g L-1 e ( ) Hg2+ 10,0 g L-1.

4.2.3. Digesto cida dos CRM assistida por microondas

Pr-tratamento da amostra com digesto cida da matria orgnica tipicamente requerido antes da pr-concentrao de elementos trao presentes em amostras biolgicas e ambientais. Felizmente, a gerao qumica de vapor geralmente no requer decomposio completa da matria orgnica. Tudo que requerido em HG AAS e CV AAS que o elemento do analito seja liberado de sua ligao qumica com os componentes da matriz e transformados em um estado de oxidao bem definido, tal como Hg2+, que pode ser reduzido a mercrio elementar pelo redutor NaBH4.41,42

42

Visto que o meio da amostra neste procedimento de pr-tratamento suficientemente cido (pH < 0) a etapa na qual o analito ser determinado para as amostras digeridas mais rpida que aquela para as amostras em TMAH. Isso acontece porque somente a soluo da amostra pipetada nesse procedimento, sem a necessidade de adio de cido ou agente antiespumante. Alm disso, o frasco de reao, depois de cada medida, permanecia muito limpo, em contraste com aquele usado para as suspenses em TMAH.

4.2.4. Tempo de repouso para amostras em TMAH

As perdas durante a estocagem podem representar uma frao importante do mercrio inicial presente na mesma soluo e, conseqentemente, podem causar srios erros sistemticos.47 Dois grupos de pesquisa diferentes tm proposto explicao para esses eventos. De acordo com Bloom et al.,48 mercrio pode ser perdido para as paredes do frasco a partir de amostras no preservadas ou tambm preservadas em cido. Garrafas de polietileno, por exemplo, permitiram a difuso de Hg0 atravs das paredes para e a partir das amostras, dependendo da concentrao na amostra e na atmosfera de estocagem. Krivan et al.47 props mecanismos para essas perdas, os quais tambm incluem adsoro de mercrio nas paredes do vaso, volatilizao de compostos de mercrio e reduo dos compostos de mercrio a mercrio elementar seguida por sua volatilizao. Tendo em vista esses pontos, um estudo para avaliar possveis perdas de mercrio durante a estocagem de amostras biolgicas preparadas em TMAH foi realizado. Os frascos usados para este estudo foram de polipropileno cilndrico fechados com um dimetro de 2,7 cm e uma altura de 11,5 cm, a temperatura ambiente. O efeito do tempo de repouso sobre a intensidade do sinal de absorvncia normalizado para trs suspenses de CRM foi avaliado durante um perodo de vinte e um dias, como pode ser visto na Figura 12. O sinal de absorvncia integrada para cada suspenso foi normalizado com relao ao de uma soluo padro de Hg2+ 10,0 g L-1 em HNO3 5,0% v/v preparada diariamente. As intensidades do sinal de absorvncia para as amostras, no geral, diminuram at o dcimo quarto dia, sendo a diminuio mais pronunciada depois do stimo dia. Depois do dcimo quarto dia h uma

43

tendncia para estabilizao. A diminuio sugere volatilizao de mercrio e/ou difuso de mercrio atravs das paredes do frasco. Vapores de mercrio foram produzidos pela simples elevao do pH da amostra para 13 usando uma base forte ou TMAH.50 Perdas de mercrio tambm foram detectadas em meio de TMAH por Vieira et al.3 Perda significante de mercrio, at 50%, para as amostras estudadas pode ocorrer em vinte e um dias, indicando que a suspenso da amostra em TMAH deve ser preferencialmente analisada imediatamente depois do preparo.

3,2

Absorvncia Integrada Normalizada

2,8 2,4 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Tempo de preparo / Dias

Figura 12 Efeito do tempo de repouso sobre o sinal de absorvncia normalizado para mercrio a partir das suspenses dos CRM em TMAH. () DOLT-3 7,2 g L-1, () BCR 186 6,0 g L-1 e () TORT-2 1,3 g L-1.

4.2.5. Volume de amostra

O volume de amostra digerida injetado no frasco de reao de grande importncia j que est diretamente relacionado com o limite de deteco. Esse volume foi variado de 1,0 a 5,0 mL e foi possvel observar um aumento quase linear do sinal de absorvncia com o volume, mostrando um comportamento muito similar quele observado por Ribeiro et al.,

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que usou o mesmo sistema de CV AAS deste trabalho para determinar a concentrao de

mercrio total em amostras ambientais slidas preparadas na forma de suspenso em meio cido. O volume de 3,0 mL foi adotado. Nesta condio, boa sensibilidade e repetitividade so obtidas. Alm disso, a mesma sensibilidade assegurada para os dois procedimentos de determinao usados no presente trabalho, o que essencial para preciso aceitvel da concentrao de metilmercrio.

4.2.6. Especiao Em trabalho desenvolvido previamente4 e tambm por Kaercher et al.15 pde-se demonstrar que possvel determinar Hg2+ seletivamente em CRM biolgicos tratados com TMAH por CV AAS, mantendo o tubo de quartzo a temperatura ambiente. Nesta condio, no h energia suficiente para clivar a ligao entre Hg e o radical orgnico. Depois disso, a medida das mesmas amostras com o aquecimento do tubo de quartzo em uma chama de aracetileno, torna possvel a determinao de mercrio total. Entretanto, o aquecimento do tubo de quartzo diminui consideravelmente a sensibilidade para a determinao de mercrio total. Uma maneira muito simples de contornar essa limitao usar um procedimento alternativo para clivar a ligao com o radical orgnico, ao invs de aquecer o tubo, a fim de obter um limite de deteco similar quele para Hg2+. Vrios procedimentos com agentes oxidantes so possveis para oxidao da matriz da amostra e determinao de mercrio total. Nesta parte do trabalho, digesto cida das amostras assistida por microondas foi escolhida, permitindo determinar a concentrao de mercrio total com melhor sensibilidade, usando as mesmas condies empregadas para a determinao de Hg2+. Alm disso, uma estimativa da concentrao de metilmercrio pode ser obtida como a diferena entre as concentraes de mercrio total e inorgnico, sendo a concentrao de mercrio inorgnico determinada nas amostras tratadas com TMAH.

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4.2.7. Parmetros de mrito

Os parmetros de mrito para ambos os procedimentos (tratamento com TMAH e digesto cida) foram obtidos usando solues aquosas de Hg2+ em HNO3 5,0% v/v. Os limites de deteco (LD) nas amostras tratadas com TMAH apresentam valores comparveis aos obtidos em meio cido, como esperado, dado que as determinaes foram feitas sob as mesmas condies instrumentais. Os limites de deteco na amostra foram 0,021 g g-1 e 0,041 g g-1 para mercrio inorgnico e total, respectivamente, visto que a massa de amostra para mercrio total foi metade daquela para determinao de mercrio inorgnico. As massas de amostra usadas para calcular os LD para mercrio total e inorgnico foram 250,0 e 500,0 mg, respectivamente, em um volume final de 25,0 mL. A sensibilidade obtida para a determinao de Hg total a partir dos CRM digeridos em microondas com o tubo de quartzo a temperatura ambiente foi trs vezes melhor que aquela obtida empregando o aquecimento do tubo de quartzo: 0,029 s L g-1 contra 0,010 s L g-1 com aquecimento. Como conseqncia, o limite de deteco para mercrio total melhorou consideravelmente utilizando as amostras digeridas em microondas ao invs do aquecimento do tubo de quartzo. A Tabela 5 apresenta os parmetros de mrito para a determinao de mercrio total e inorgnico em CRM tratados com TMAH ou digeridos com cido. A digesto cida dos CRM assistida por microondas para a determinao de mercrio total possibilitou a construo de uma nica curva de calibrao, com as solues padro em meio de HNO3 5,0% v/v, para ambos os procedimentos (tratamento com TMAH ou com cido), tornando o mtodo ainda mais rpido. Um coeficiente de correlao tpico de 0,9999 na curva de calibrao foi obtido. Alm disso, a etapa de medida de Hg total nos CRM digeridos mais rpida do que aquela com os mesmos tratados com TMAH com o tubo de quartzo aquecido na chama de ar/acetileno, j que somente o CRM digerido precisa ser pipetado e transferido para o frasco de reao, o qual, depois de cada medida, permanecia muito limpo, em contraste com aquele usado para as suspenses em TMAH.

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Tabela 5 Figuras de mrito para a determinao de Hg total e inorgnico por CV AAS com e sem o aquecimento do tubo de quartzo.

Soluo padro / Hg2+ HNO3 5,0% v/v TMAH 1,0% m/v TMAH 1,0% m/v
a

Chama / Ar/C2H2 No No Sim

Inclinao / (g L-1)-1 s 0,029 0,031 0,010


2+ b

LD / ng g-1
21a/41b

Faixa de Calibrao / g L-1


3,0 15,0

0,9999

0,9983 0,9995

25 130

1,0 50,0 1,0 50,0

Limite de deteco para Hg . Limite de deteco para Hg total.

4.2.8. Resultados analticos

A exatido dos mtodos para a determinao de mercrio total e inorgnico foi avaliada pela anlise de alguns materiais certificados de referncia. Os resultados obtidos para mercrio total, Hg2+ e CH3Hg+ esto apresentados nas Tabelas 6 e 7. Os valores determinados para mercrio inorgnico concordam com a diferena entre os valores certificados para metilmercrio e Hg total e com resultados publicados anteriormente, os quais ficaram dentro de um limite de confiana de 95% dos valores certificados ou prximos aos valores informados para os materiais de referncia. Essa concordncia confirma que o valor obtido por CV AAS depois do tratamento com TMAH corresponde concentrao de Hg2+. A concentrao de mercrio orgnico, calculada como a diferena entre os valores obtidos por CV AAS depois da digesto da amostra assistida por microondas e pr-tratamento da amostra com TMAH com e sem aquecimento do tubo de quartzo, tambm concorda com a concentrao de metilmercrio certificada, de acordo com o teste t para um nvel de confiana de 95%. Isso sugere que a concentrao de mercrio orgnico obtida pela diferena mencionada de fato metilmercrio. Os desvios padro relativos foram no geral menores que 3,0% para os CRM digeridos e menores do que 6,0% para aqueles tratados com TMAH. Os desvios padro relativos para os CRM tratados com TMAH sendo o tubo de quartzo aquecido na chama de ar/acetileno foram, em geral,

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menores que 10,0%. Neste caso, o limite de deteco para Hg total nas amostras foi de 0,13 g g-1.

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Tabela 6 Resultados analticos para a determinao de Hg total (amostras digeridas em forno de microondas), inorgnico (amostras em TMAH) e metilmercrio (obtido pela diferena entre Hg total e Hg2+) em CRM por CV AAS. Valores obtidos (mdia limite de confiana) em g g-1; n = 3.

Mercrio total Certificado BCR 186 DOLT-3 TORT-2 ERM-CE 278


a c

Metilmercrio Certificado NI 1,59 0,12 0,152 0,013 NI Encontradoa 0,60 0,20 1,64 0,19 0,166 0,010 ND

Mercrio inorgnico Informadob 1,5 0,1c 1,78 0,118 NI Encontrado 1,41 0,26 1,86 0,27 0,138 0,030 < LQ

Encontrado 2,02 0,07 3,50 0,08 0,30 0,02 0,226 0,036

1,97 0,04 3,37 0,14 0,27 0,06 0,196 0,009

Calculado como a diferena entre Hg total e Hg inorgnico. b Calculado como a diferena entre Hg total e CH3Hg+ como Hg. Determinado por Torres et al. 4. NI: no informado. ND: no determinado.

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Tabela 7 Resultados analticos para a determinao de Hg total (com aquecimento do tubo de quartzo), inorgnico (com o tubo de quartzo a temperatura ambiente) e metilmercrio (obtido pela diferena entre Hg total e Hg2+) em CRM tratados com TMAH por CV AAS. Valores obtidos (mdia desvio padro) em g g-1; n = 3.

Mercrio total Certificado BCR 186 DOLT-2 TORT-2 DORM-1 BCR 278 BCR 397 GBW 9101
a b

Metilmercrio Certificado NI 0,693 0,053 0,152 0,013 0,731 0,060 NI 0,87c NI Encontrado
a

Mercrio inorgnico Informado NI 1,45b 0,118b 0,129b NI 11,5 0,5 NI Encontrado 1,50 0,10 1,49 0,03 0,13 0,02 0,16 0,02 0,09 0,03 11,9 0,2 0,60 0,04

Encontrado 2,10 0,30 2,21 0,02 0,27 0,01 0,226 0,036 0,18 0,01 12,5 0,4 2,10 0,10

1,97 0,04 2,14 0,28 0,27 0,06 0,798 0,074 0,196 0,009 12,3 0,5 2,16 0,21

0,60 0,30 0,72 0,04 0,14 0,02 0,64 0,04 0,09 0,03 0,60 0,05 1,50 0,10

Calculado como a diferena entre a concentrao de Hg total menos a de Hg inorgnico. Calculado como a diferena entre a concentrao de Hg total menos a de CH3Hg+ como Hg. c Valor informado. NI: no informado.

50 5. CONCLUSES

So propostos trs mtodos muito simples e rpidos para a determinao de mercrio total e inorgnico em CRM biolgicos preparados na forma de suspenses por CV AAS. Todos permitem determinar a concentrao de metilmercrio sem manipulao de padro de metilmercrio, possibilitando a anlise de especiao sem o uso de qualquer tcnica cromatogrfica. Desta forma os mtodos se mostraram adequados para anlise rotineira e para determinar a concentrao das espcies de mercrio nas amostras propostas, sem necessidade de pr-concentrao. O mtodo no qual se empregou o tratamento dos CRM com gua e oxidao in situ com permanganato de potssio provou ser rpido, seguro, ambientalmente correto e confivel para a determinao proposta. O procedimento de preparo de amostra proposto minimiza as chances de contaminao, j que somente gua desionizada usada para preparar a suspenso. A maior vantagem deste procedimento que somente um mnimo de reagentes e etapas de manipulao da amostra so requeridos. Esse procedimento simples poderia ser til para anlise de rotina ou como um procedimento classificatrio de rotina para materiais biolgicos. O procedimento de pr-tratamento da amostra com TMAH promove um mtodo de solubilizao simples, seguro, rpido, reprodutivo e efetivo para amostras biolgicas. O procedimento proposto para a determinao de mercrio total a temperatura ambiente, depois da digesto cida da amostra em forno de microondas, garante um limite de deteco similar quele obtido para Hg2+. A etapa de medida de Hg total nos CRM digeridos mais rpida do que aquela com os mesmos tratados com TMAH quando o tubo de quartzo aquecido na chama de ar/acetileno. Alm disso a sensibilidade trs vezes menor quando o tubo de quartzo aquecido na chama de ar/acetileno.

51 6. REFERNCIAS

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56 7. ANEXOS: Artigos

Determination of inorganic and total mercury in biological samples treated with tetramethylammonium hydroxide by cold vapor atomic absorption spectrometry using different temperatures in the quartz cell Daiane Placido Torres, Mariana A. Vieira, Anderson S. Ribeiro and Adilson Jos Curtius; J. Anal. Atom. Spectrom., 2005, 20, 289-294.

A novel, simple and fast approach for the determination of inorganic and total mercury in aqueous slurries of biological samples using cold vapor atomic absorption spectrometry and in situ oxidation Daiane Placido Torres, Daniel L. G. Borges, Vera L. A. Frescura and Adilson Jos Curtius; J. Anal. Atom. Spectrom., 2009, No Prelo.

Simple mercury speciation in biological samples by CV AAS following microwave or TMAH pre-treatment Daiane Placido Torres, Vera L. A. Frescura and Adilson Jos Curtius; Em preparao.