Agrobiotecnologa

Curso 2007

Marcadores moleculares y mejoramiento gentico

Carlos A. Sala Mariano Bulos Mariel Echarte
Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario
Introduccin
- La necesidad de producir ms - Interaccin entre progreso gentico y manejo - Mejoramiento gentico: definicin, procesos y factores - Mejoramiento y marcadores

Seleccin asistida por marcadores moleculares

- Implementacin, consideraciones y ejemplos

Conversiones
- Mtodo convencional de retrocruzas: implementacin y consideraciones genticas - Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Diversidad gentica
- Cuantificacin y estructuracin de la diversidad gentica: mtodos de anlisis y relacin entre ellos - Anlisis por marcadores moleculares Agrobiotecnologa
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Mejoramiento molecular El mejoramiento hoy Referencias

Introduccin

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La necesidad de producir ms

Los agricultores del mundo de hoy estn alimentando a ms del doble de gente que en 1950 con la misma cantidad de tierra. El incremento de los rendimientos de los cultivos se ha logrado por ganancia gentica (Gg), ganancia por manejo (prcticas agronmicas, Gm) y por la interaccin entre ambas (Ig*m).

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IR = Gg + Gm + Ig*m

Interacciones entre progreso gentico y manejo

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Se ha mejorado y se debe continuar mejorando par obtener genotipos que permitan maximizar el aprovechamiento de la interaccin entre la oferta edafoclimtica y las tecnologas biolgicas, qumicas y agronmicas.

Una definicin de mejoramiento gentico

Conjunto de principios cientficos, mtodos, tcnicas y estrategias aplicadas a la obtencin de genotipos o grupos de genotipos con caractersticas deseables segn objetivos previamente definidos Proceso fundamental: cambio adaptativo por sustitucin allica bajo seleccin, seguido por el aislamiento de los productos diferenciados

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Etapas del mejoramiento gentico

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Factores determinantes del progreso gentico

Ecuacin de Ganancia Gentica por seleccin:

Gy =

k A y P

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En que: Gy: ganancia gentica o progreso gentico anual K: diferencial de seleccin A: varianza aditiva Y: nmero de aos P: varianza fenotpica

Mejoramiento y marcadores

Aplicaciones:
- Seleccin asistida - Conversiones - Organizacin, mantenimiento e incremento de la diversidad gentica

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Seleccin asistida por marcadores moleculares

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Seleccin asistida por marcadores moleculares

Cmo se implementa la seleccin asistida en un programa de mejoramiento?

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Consideraciones para implementar la seleccin asistida

El tipo de marcador:
- Basado en hibridacin o en PCR - Dominante o codominante - Dificultades y resolucin

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La distancia entre el marcador y el gen de inters. Eleccin de la fuente para el carcter o gen de inters.

Cuando usar marcadores para seleccin asistida

Seleccin en enfermedades de baja

heredabilidad

Ausencia de mtodos efectivos de

seleccin

Ausencia de patgeno o presencia errtica Seleccin individual en generaciones

tempranas

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Piramidizar genes

Ejemplos de seleccin asistida en diferentes cultivos

Especie Soja

Carcter Resistencia a Cercospora sojina Resistencia a Nematodo del Quiste Resistencia a Phytophtora sojae

Tipo de marcador SSR SSR y SNP SSR SCAR SSR HMWG y SCAR SSR SSR SCAR SSR SSR

Referencia (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11)

Trigo

Resistencia a Puccinia graminis Resistencia a Puccinia striiformis Calidad panadera Porcentaje de proteina en el grano Resistencia a Fusarium graminearum Dureza del grano

Maz Sorgo

Resistencia a Mal de Rio IV Factores de restauracin de la fertilidad polnica Factores de restauracin de la fertilidad polnica Resistencia a Puccinia helianthi

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Girasol

SCAR SCAR

(12) (13)

Conversiones

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Mtodo convencional de retrocruzas

Definicin:
Mtodo de mejora consistente en el cruzamiento repetido de la progenie hbrida derivada de una cruza con uno de sus parentales.

Objetivo:
Mejorar al recurrente en una caracterstica para la cual es deficiente.
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Mtodo convencional de retrocruzas

Esquema general

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Mtodo convencional de retrocruzas

Recuperacin del trasfondo gentico del padre recurrente (RPR) En ausencia de seleccin y ligamiento: RPR= (1-0,5(n+1))*100
Generacin F1 Porcentaje de genoma recurrente 50,00 75,00 87,50 93,75 96,88 98,40 99,20

Resultados de la conversion
BC1F1 BC2F1 BC3F1

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BC4F1 BC5F1 BC6F1

Mtodo convencional de retrocruzas

Implementacin
Control gentico del carcter a incorporar

Caso 1:
Herencia monognica, carcter favorable controlado por alelo dominante, seleccionable antes de la floracin.
- Estacin 1: Padre R (rr) x Dador (RR) - Estacin 2: F1 (Rr), x Recurrente - Estacin 3: RC1F1 (Rr:rr), Rr x Recurrente - Estacin 4: RC2F1 (Rr:rr), Rr x Recurrente - Estacin 5: RC3F1 (Rr:rr), Rr x Recurrente - Estacin 6: RC4F1 (Rr:rr), Rr x Recurrente - Estacin 7: RC5F1 (Rr: rr), Rr x Recurrente - Estacin 8: RC6F1 (Rr:rr), @ Rr - Estacin 9: RC6F2 (RR: Rr:rr), @ RR y Rr, cosecha individual - Estacin 10: Familias RC6F3, descartar segregantes, seleccionar los restantes y reemplazar al recurrente

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Mtodo convencional de retrocruzas Caso 2:

Seleccin del carcter despus de floracin
- Idem Caso 1, pero primero se cruza y luego se evala y se descarta.

Caso 3:
Carcter controlado por alelo recesivo
- Incluir @ o testcross y anlisis de progenie en cada generacin para diferenciar los individuos Rr y RR

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Cmo permiten hacer ms eficiente y rpido el mtodo de retrocruzas los marcadores moleculares?

D R

Segregantes en retrocruza 1 (RC1) El gel muestra la variacin existente entre individuos segregantes de la retrocruza 1 para un locus de microsatlite determinado. Se observan individuos heterocigticos (llevan los fragmentos del dador y del recurrente) e individuos homocigticos para el fragmento del recurrente.

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Variacin dentro de la misma generacin de retrocruzas

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Implementacin de una conversin

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Esquema del genoma de la lnea elite o recurrente y de la lnea dadora.

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Mejoramiento por retrocruzas: recuperacin del padre recurrente

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Mejoramiento por retrocruzas: arrastre por ligamiento

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Conversiones asistidas por marcadores moleculares

Resultados experimentales

65 proyectos finalizados

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Conversiones Ejemplo 1
Conversiones para un carcter complejo: Resistencia al Mal de Ro Cuarto en maz
- Dificultades de seleccin por tolerancia - Necesidad de sembrar en zonas endmicas - Presencia del vector y su variabilidad - Variabilidad ambiental - Dificultad para discernir entre escape y tolerancia
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- Dificultades en la cra del vector

Conversiones Ejemplo 1

Diseccin de un carcter complejo mediante marcadores moleculares

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Conversiones Ejemplo 1

Marcadores SSRs flanqueantes de un QTL

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Conversiones Ejemplo 1

Anlisis fenotpico de los productos de conversin

Hbrido AX888 AX888 M1 Descripcin Original Susceptible a MRCV % de ataque severo 27,8 19,3 9,4

Resultados de la conversion
Heterocigoto para los 3 QTLs hallados Homocigoto para los 3 QTLs hallados

AX888 MRCV

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Conversiones Ejemplo 2

Conversiones para otro carcter complejo: Calidad panadera en trigo - Genes involucrados - Marcadores para tales genes - Resultados de conversiones

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Conversiones Ejemplo 2

Ubicacin genmica de algunos genes relacionados con la calidad panadera en trigo

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Conversiones Ejemplo 2

Anlisis de gluteninas de alto peso molecular en SDS-PAGE

Contribucin de cada alelo para W:

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2* = 1 > nulo 13/16 > 7/8 > 7/9 = 17/18 > 7/0 > 6/8 5/10 > 3/12 = 2/12 > 4/12

Conversiones Ejemplo 2
Deteccin de la translocacin trigo/centeno (1BL/1RS)

1,5Kb

P
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Conversiones Ejemplo 2

Anlisis fenotpico del producto de conversin

Genotipo Original Gluteninas de alto PM Translocacin 1B/1R W Volumen de pan 870 980

Resultados de la conversion 0 , 6+8 ,2+12 Presente 190

1 , 7+8 , 5+10 Ausente 350

Convertido

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Diversidad gentica

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Diversidad gentica Estimacin cuantitativa de la diversidad

global - PIC = 1- pi - D = 1- pi

Similitud gentica entre genotipos

- SMC = m/(m+n) - Construccin de MBD y anlisis multivariado
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Diversidad gentica y diversidad fenotpica

Comparacin entre Distancias Morfologicas y Moleculares

0.2500 0.2000
D ist. Molecular

0.1500 0.1000 0.0500 0.0000 3.0000 8.0000 13.0000

Dist. Morfologica
Rivero et al., 2003, no publicado.

18.0000

23.0000

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Relacin entre las estimaciones genelgicas y las estimaciones moleculares

Mtodo

Aporte de los genomas parentales

Contribucin de 40 -3-2 Genealoga Molecular

Derivados de F2

Resultados de la 0,50 conversion0,211**

0,25 0,25 0 ,25 0,058** 0,263ns 0,263 ns
Tomado de Sala et al., Euphytica, 2005.

Retrocruza modificada Modificada Derivados de BC1 RC1

** y ns indican diferencias altamente significativas y ausencia de diferencias significativas entre los valores de conttribucin parental de la lnea 40-3-2 estimados por genealoga y a travs de marcadores

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Anlisis por marcadores moleculares

Anlisis de germoplasma de soja

Vy VI VII, VIII y IX III y IV

Coeficiente
Tomado de Echarte et al., 2004.

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Anlisis por marcadores moleculares

Investigacin de impacto de estrategias de mejora sobre la diversidad o sobre la estructuracin de la diversidad: El caso de la soja transgnica resistente a glifosato.

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Anlisis por marcadores moleculares

Diversidad gentica en variedades de soja convencionales y resistentes a glifosato

-

Los cultivares transgnicos muestran una diversidad (D = 0,474) similar a la de los cultivares convencionales (D = 0,445; t = 0,134 ns) El promedio de similitud gentica (SG) entre cultivares resistentes es similar a la SG existente entre cultivares resistentes y susceptibles. Los cultivares transgnicos actuales presentan una diversidad (D = 0,493) similar que la que presentaban las variedades de soja en Argentina antes de 1996 (D = 0,469; t = 0,456).

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El transgn para resistencia a glifosato fue introgresado en todos los grupos de madurez cultivados en la Argentina manteniendo un mnimo de contribucin de la lnea 40-3-2 y, por ende, manteniendo la performance agronmica y la diversidad gentica del germoplasma original.

Mejoramiento molecular

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Diseo de germoplasma
Se basa en la armonizacin de trasfondos genticos de alto rendimiento, creados por seleccin en ambientes agronmicos de mxima oferta potencial, con caracteres que incrementan el rango de adaptacin, la estabilidad o la calidad del producto de esos trasfondos. Esos caracteres estn gobernados por genes mayores y su introgresin se monitorea por tecnologa de marcadores moleculares.

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Diseo de germoplasma

Conversiones y recombinacin de germoplasma de alto rendimiento

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Interaccin entre los programas de mejoramiento convencional y molecular

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El mejoramiento hoy

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Estrategia actual de un programa de mejoramiento gentico

Anlisis de la diversidad

Germoplasma base

Genotipos elite deficientes en uno o ms caracteres

Caracteres (genes/QTLs)

C o n v e r s i o n e s

Recombinacin

Seleccin asistida

Evaluacin

Seleccin

Nuevas Variedades Nuevas Variedades Convertidas

Referencias

2.

Cubero, J. Introduccin a la Mejora Gentica Vegetal. Mundi Prensa, 1999. De Vienne, D. (ed.). Les marquerurs molculaires en gntique et biotechnologies vgtales. Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), 1998. Ferreira, M.E. y Grattapaglia, D. Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. Embrapa, 1996. Moctezuma, E.V. y Kahl, G. Huellas de ADN en genomas de plantas. Mundi Prensa, 2000, 147p. Paterson, A. (ed.). Molecular Dissection of Complex Traits. CRC Press, 1998.

3.

4. 5.

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