Hidratos de Carbono: Oligosacridos en Soja

Laboratorio N3

Alumna: Natalia Carabajal Lange Profesora: Lorena Valle

Objetivos:

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Extraer los oligosacridos hidrosolubles presentes en la semilla de soja. Identificacin de los mismos por mtodo de cromatografa en capa fina. Introduccin Los carbohidratos son componentes esenciales de los organismos vivos. Los monosacridos son subunidades que se unen mediante enlaces glucosidicos y forman polisacridos. Mtodo: Cromatografa de en placa fina (TLC) Se trata de una cromatografa de adsorcin Dipolo-Dipolo, donde la fase estacionaria es un slido adsorbente y la separacin se lleva a cabo en la adsorcin de los solutos en esa fase. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Materiales y reactivos: Solucin de carbohidratos de referencia al 1% m/v. Alcohol isopropilco. Acido sulfrico concentrado. Metanol. Cloruro de N-(1-naftil) etilendiamina. Placa TLC. Procesadora. Tubos de centrifuga. Ependorff. Guantes y antiparras. Papel de filtro. Secador de pelos. Lpiz. Regla. Centrifuga. Balanza. Preparacin de solventes de corrida. Se prepara tres das antes de la experiencia y se almacena a temperatura ambiente. Se utilizo: Alcohol isopropilico al 90:10 Acetato de etilo-isopropanol-agua-piridina (26:14:7:2) Acetato de etilo-isopropanol-agua-piridina (26:14:7:2) Se preparan tres cubas de vidrio donde se coloca en cada una un solvente de corrida diferente se rotulan y se tapan.

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Revelador de carbohidratos. Di fenilamina Acetona Anilina H3PO4 Preparacin de los extractos Extracto de soja: Se licuan los granos de soja con la procesadora. Se prepara un embudo con papel filtro y se filtra la preparacin. A lo filtrado, que contiene los hidratos de carbono y tambin protenas, se le adiciona acido actico para que las protenas precipiten y se recoge el sobrenadarte se lo coloca en un vaso de precipitado y se lo rotula como extracto de soja. Extracto de leche Colocar leche en un recipiente y hervirla unos minutos. De ste tomar una alcuota de 10 ml y agregarle 50 ml de agua destilada. Para lograr que las protenas precipiten, agregar 1ml de acido actico 1M.Puede verse como se forma una fase de suero sobre la leche. Para separar las protenas precipitadas se hace un filtrado continuo y lo recogido en un vaso de precipitados se rotula como extracto de leche. Armado del cromatograma y siembra de las muestras: Se prepar 3 rectngulos iguales de la placa de TLC 20x10 cm. Se trazo una lnea de siembra con puntos a una distancia de 2 cm. del borde y se marco 5 puntos de siembra en dos de los solventes y 4 puntos de siembra en el otro solvente. Se realizo este proceso en cada una de las placas. Se siembran los puntos y se coloca: Punto 1: Ext. Soja Punto 1: Glucosa Punto 2: Ext. Leche Punto 2: Ramnosa Punto 3: Lactosa Punto 3: Glucosa 6F Punto 4: Sacarosa Punto 4: Sacarosa Punto 5: Rafinosa Nota: La siembra se realiza un punto a la vez y se seca con secador.

Fructosa

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Ramnosa

Rafinosa

Glucosa

Una vez sembrada todas las muestras se coloca un cromatograma por cuba de manera vertical y se tapa. Dejar aproximadamente 1 horas. Como los cromatogramas que utilizamos fueron hechos por la ctedra, y la silica gel era de un espesor ms grueso que el de las silica comprada, demor mucho ms el solvente en subir. Transcurrido este tiempo, con guantes, se saca el cromatograma, uno a la vez, se marca la lnea donde llego el solvente, se seca con secador. Pasar el cromatograma por el revelador y secar nuevamente. Llevar a la estufa.

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Resultados: 1) Alcohol isoproplico al 90%

90:10 Punto 1: Ext. Soja Punto 2: Ext. Leche Punto 3: Lactosa Punto 4: Sacarosa Punto 5: Rafinosa Anlisis Este cromatograma muestra que no es eficiente este solvente para la separacin de monosacridos debido a que estos tienen demasiada afinidad con la fase mvil y no logran separarse. Para el caso de la soja Observamos dos manchas vemos que la mas pequea esta a la misma altura que la rafinosa por lo que consideramos que esa es rafinosa y la mas grande es estaquinosa. Para el caso de la leche puede suponerse que est formada por lactosa porque las manchas estn relativamente a la misma altura y tienen el mismo color. Para comprobar los resultados, realizamos los clculos del coeficiente de retardo: Calculos
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Punto 1: Soja Punto 2: 0.25 Punto 3: 0.26 Punto 4: Punto 5: Leche

Estaquinosa Rafaniosa

1.5 cm/9.5 cm = 0.16 2.9 cm/9.5 cm = 0.3 2.4 cm/9.5 cm = 2.5 cm/9.5 cm = 3.2 cm/9.5 cm = 0.33 1.5 cm/9.5 cm = 0.16

Lactosa Sacarosa Rafinosa

2) Acetato de etilo-isopropanol-agua-piridina (26:14:7:2)

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Punto 1: Ext. Soja Punto 2: Ext. Leche Punto 3: Lactosa Punto 4: Sacarosa Punto 5: Rafinosa Anlisis Este solvente ayuda a separar mejor a los carbohidratos y a los componentes del extracto de soja, que finalmente estaba formada por otras tres manchas que se ven: Estaquiosa (tetra sacrido), Rafinosa (trisacrido) y Sacarosa (monosacarido), debido a que la Estaquiosa tiene mayor peso molecular entonces eluye menos que la Rafinosa y la sacarosa. Puede verse claramente que la leche contiene lactosa. Para comprobar los resultados, realizamos los clculos del coeficiente de retardo:

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Calculos Punto 1: Soja Estaquinosa Rafaniosa Sacarosa 2 cm/16.5 cm = 0.12 4 cm/16.5 cm = 0.24 6 cm/16.5 cm = 0.36 8.5 cm/16.5 cm = 8.2 cm/16.5 cm = 6 cm/16.5 cm = 0.36 2 cm/16.5 cm = 0.13

Punto 2: 0.51 Punto 3: 0.49 Punto 4: Punto 5:

Leche Lactosa Sacarosa Rafinosa

3) Acetato de etilo-isopropanol-agua-piridina (26:14:7:2)

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Solvente variado: Punto 1: Glucosa Punto 2: Ramnosa Punto 3: Glucosa 6P Punto 4: Sacarosa Anlisis Podemos observar que la glucosa esta formada por sacarosa ya que ambas se encuentran a la misma altura. Vemos tambien que en la linea de siembra de la glucosa hay tambien ramnosa, eso se debe quizas a que se realizo una mala siembra. Y podemos observar tambien que la glucosa 6P no eluyo. Para comprobar los resultados, realizamos los clculos del coeficiente de retardo:

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Calculos Punto 1: Punto 2: Punto 3: Punto 4: Glucosa Ramnosa Glucosa 6P Sacarosa 5.9 cm/16 cm = 0.37 8.5 cm/ 16 cm = 0.53 0 (porque no eluye) 5.8 cm/16 cm = 0.36

Conclusin: En este laboratorio aprendimos la importancia que tienen los solventes a la hora de hacer una cromatografa TLC debido a la polaridad que presentan cuando hay que separar hidratos de carbonos para su posterior identificacin. Tambin es muy importante tener en cuenta los sacridos con el que se trabaja porque influye la cantidad de oxidrilos presentes y son los que determinan la menor o mayor elusin. Con los coeficientes de retardo verificamos exactamente como estn compuestos los extractos.

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