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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

11 N umero de publicaci on: 51

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k kInt. Cl. : A61K 7/00

A61K 7/48 A61K 7/06

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kN umero de solicitud europea: 96929256.4 kFecha de presentaci on: 14.08.1996 kN umero de publicaci on de la solicitud: 0 845 972 kFecha de publicaci on de la solicitud: 10.06.1998

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

T3

54 T tulo: Utilizaci on de proteasa de subtilisina mutada en productos cosm eticos.

k k k k

30 Prioridad: 23.08.1995 DE 195 30 816

73 Titular/es:

k k k

Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien Henkelstrasse 67 40589 D usseldorf-Holthausen, DE

45 Fecha de la publicaci on de la menci on BOPI:

01.07.2002

72 Inventor/es: Weiss, Albrecht y

Maurer, Karl-Heinz

45 Fecha de la publicaci on del folleto de patente:

01.07.2002

74 Agente: D avila Baz, Angel

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Aviso:

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci on en el Bolet n europeo de patentes, de la menci on de concesi on de la patente europea, cualquier persona podr a oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici on deber a formularse por escrito y estar motivada; s olo se considerar a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi on de Patentes Europeas).
Venta de fasc culos: Ocina Espa nola de Patentes y Marcas. C/Panam a, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCION Utilizaci on de proteasa de subtilisina mutada en productos cosm eticos.
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La presente invenci on se reere a la utilizaci on de enzimas proteol ticas mutadas con potencial de irritaci on reducido con respecto a la piel, a saber, proteasas de subtilisina mutadas, en productos cosm eticos, en particular agentes de limpieza corporal y agentes del cuidado corporal as como agentes del cuidado de la boca. Se utilizan desde hace mucho tiempo enzimas como proteasas, pilasas, amilasas y celulasas en detergentes y agentes de limpieza esencialmente para soportar la prestaci on de lavado y de limpieza. Entre estas enzimas, las proteasas ocupan una posici on sobresaliente importante. Las proteasas son enzimas, que catalizan la hidr olisis de enlaces de p eptido en substratos de prote na y de p eptido y de enlaces de ester en algunos esteres terminales. Las subtilisinas son una familia de proteasas bacterianas, extracelulares con pesos moleculares de aproximadamente 20.000 a 45.000 Daltons, que se pueden obtener a partir de bacterias del suelo, por ejemplo Bacillus amyloliquefaciens. Las subtilisinas pertenecen al grupo de las proteasas de serina, que inician en ataque nucle olo sobre el enlace ( ester) p eptido a trav es de un resto serina en el lugar activo. Son enzimas bien caracterizadas desde el punto de vista f sico y qu mico. La estructura tridimensional de algunas subtilisinas ha sido explicada, en particular, a trav es de radiograf as de difracci on (C. Betzel, G. P. Pal y W. Saenger, (1988) Eur. J. Biochem. 178, 155-171; R. Bott, M. Ultsch, A. Kossiako, T. Graycar, B. Katz y S. Power, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7895-7906; D. W. Goddette, C. Paech, S. S. Yang, J. R. Mielenz, C. Bystro, M. Wilke y R. J. Fletterick, (1992), J. Mol. Biol. 228, 580-595; D. W. Heinz, J. P. Priestle, J. Rahuel, K. S. Wilson y M. G. Gr utter (1991) J. Mol. Biol. 217, 353-371; J. Kraut (1977) Ann. Rev. Biochem. 46, 331-358; D. J. Neidhart y G. A. Petsko (1988) Protein Eng. 2, 271-276; A. V. Teplyakov, I. P. Kuranova, E. H. Harutyunyan, B. K. Vainshtein, C. Fr ommel, W.- E. H ohne y K. S. Wilson (1990) J. Mol. Biol. 214, 261-279). Las subtilisinas se emplean en gran extensi on en productos de venta en el comercio, como por ejemplo en detergentes de lavadoras y detergentes de lavavajillas as como en agentes de limpieza de lentes de contacto, y en la qu mica org anica sint etica, pero en primer t ermino para nes de investigaci on. Un miembro de la familia de las substilisinas, a saber, una proteasa altamente alcalina, que se puede utilizar en agentes que contienen tensido, ha sido descrito en la solicitud de patente internacional WO 91/02792. Esta proteasa alcalina de Bacillus lentus (proteasa alcalina de Bacillus lentus) se puede obtener en cantidades utilizables comercialmente a partir de la cepa Bacillus licheniformis ATCC 53926, que lleva un pl asmido de expresi on, que expresa el gen BLAP bajo el control del promotor de la proteasa alcalina de Bacillus licheniformis ATCC 53926. Ha sido determinada la estructura de cristal de BLAP (D. W. Goddette y col. (1992) K. Mol. Biol.. 228, 580-595; WO 92/21760) y las coordenadas han sido depositadas en la base de datos de prote nas de Brookhaven. Cuando se iguala una homolog a de secuencia optima de BLAP (269 amino acidos) con la de subtilisina BPN (275 amino acidos), se obtiene el patr on siguiente: Las posiciones 1 a 35, 36 a 54, 55 a 160 y 161 a 269 de BLAP corresponden a las posiciones 1 a 35, 37 a 55, 57 a 162 y 167 a 275, respectivamente, en la subtilisina BPN. Si no se indica otra cosa, la numeraci on utilizada aqu de los amino acidos corresponde a la de BLAP. Para describir las variantes de proteasa, que se emplean en la presente invenci on, se utiliza la siguiente nomenclatura: [amino acido original; posici on del t ermino N de la enzima madura; amino acido sustituido]. Por ejemplo, la sustituci on de valina por isoleucina en la posici on 4 en BLAP se designa como V4I. La lista de las abreviaturas para los amino acidos habituales se representa en la Tabla 1. TABLA 1 Abreviatura de los amino acidos

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A C D E F G

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Ala Cys Asp Glu Phe Gly

= = = = = =

Alanina Ciste na Acido asp artico Acido glut amico Fenilalanina Glicina

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TABLA 1 (Continuaci on) H I K L M N P Q R S T V W Y = = = = = = = = = = = = = = His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr = = = = = = = = = = = = = = Histidina Isoleucina Lisina Leucina Metionina Asparagina Prolina Glutamina Arginina Serina Treonina Valina Tript ofano Tirosina

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Cuando aparecen varias mutaciones dentro de la misma mol ecula de prote na, esta se caracteriza por la suma de las mutaciones individuales, como por ejemplo S3T + V4I + A188P + V193M + V199I. La protecci on contra inactivaci on t ermica y qu mica y la mejora de la acci on de lavado y de limpieza as como la compatibilidad con la piel son tareas primarias, cuando se quiere desarrollar nuevas proteasas para aplicaciones t ecnicas e industriales. Una pluralidad de enzimas, entre ellas tambi en las proteasas del tipo subtilisina, han sido desarrolladas por medio de mutag enesis aleatoria o mutag enesis espec ca del lugar. Proporcionan algunas indicaciones sobre c omo se puede conseguir una estabilidad t ermica y qu mica mejorada por v a racional (D. A. Estell, T. P. Graycar y J. A. Wells (1985) J. Biol.. Chem. 260, 6518-6521; M. Matsumura, W. J. Becktel, M. Lewitt y B. W. Matthews (1989) Proc. Natl. Sci. US 86, 6562-6566; M. W. Pantoliano, M. Whitlow, J. F. Wood, M. L. Rollence, B. C. Finzel, G. L. Gilliland, T. L. Poulos y P. N. Bryan (1988) Biochemistry 27, 8311-8317; A. J. Russell y A. R. Fersht (1987) Nature 328, 496-500; R. J. Siezen, W. M. De Vos, J. A. M. Leunissen, y B. W. Dijkstra (1991) Protein Eng. 4, 719-737; J. H. van Ee (1991) Chimicaoggi (7/8), 31-35; J. A. Wells y D. A. Estell (1988) Trends Biochem. Sci 13, 291-287). En cambio, la modicaci on de la actividad enzim atica, en particular de la mejora u optimizaci on de la velocidad para algunos substratos, es un problema esencialmente m as complejo. El documento EP 0 260 105 publica la preparaci on de mutantes de subtilisina-BPN con relaciones modicadas de la velocidad de transestericaci on con respecto a la velocidad de hidr olisis y especicidades nucle olas a trav es de la modicaci on de restos amino acidos espec cos dentro de 15 A de la tr ada catal tica. A. J. Russell y A. R. Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193, 803-813, describen el aislamiento de una mutante de subtilisina-BPN (D099S), que presenta una modicaci on de la carga supercial en la distancia de 14 a 15 A desde el centro activo. Esta sustituci on inuye en la dependencia del pH de la reacci on catal tica de la subtilisina. Ninguna de estas publicaciones ense na si las modicaciones de los amino acidos provocan tambi en una modicaci on de la compatibilidad de la piel de las enzimas. Los documento EP 0 130 756, EP 0 247 647 y US 4 765 025 publican un procedimiento de mutaci on por saturaci on, en el que al menos se introduce una mutaci on en la subtilisina BPN en los restos amino acidos (numeraci on BPN) Asp32, Asn155, Tyr104, Met222, Gly166, His64, Ser221, Gly 169, Glu156, Ser33, Phe189, Tyr217 y/o Ala152., Utilizando este modo de proceder se obtuvieron proteasas mutadas, que muestran una estabilidad oxidativa mejorada, una especicidad modicada del substrato y/o una actividad de pH modicada. Estas publicaciones ense nan tambi en que las mutaciones en la regi on del centro activo de la porteada inuyen al m aximo sobre la actividad. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones publica un procedimiento que posibilite prever si y qu e modicaciones en la secuencia de amino acidos mejoran la compatibilidad de la piel de las proteasas. La mayor a de las informaciones sobre la actividad catal tica de las subtilisinas ha sido recopilada en investigaciones de la hidr olisis de substratos de p eptidos peque nos, bien denidos. Hasta ahora se conoce s olo poca informaci on sobre interacciones con substratos de prote na grandes. Esto se aplica especialmente para las informaciones para la capacidad de lavado de las proteasas, cuando su substrato est a ligado a una supercie textil y la cat alisis debe tener lugar en presencia de substancias que interact uan con la enzima como blanqueadores, tensidos y formadores. Tampoco se conoce nada sobre la interacci on de las proteasas con las substancias que est an contenidas habitualmente en los agentes de cuidado de la piel y del cuidado del cabello as como en agentes de cuidado de la boca.

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El documento EP 0 328 229 publica el aislamiento y caracterizaci on de mutantes de subtilisina PB92 con propiedades mejoradas en la aplicaci on en detergentes, sobre la base de los resultados de ensayos de lavado. Este documento ense na que las propiedades bioqu micas no son par ametros ables para prever la potencia de la enzima durante el lavado. Los procedimientos presentados all para la selecci on de mutaciones contienen la sustituci on de amino acidos por otros amino acidos de la misma categor a (polar, apolar, arom atico, cargado, alif atico y neutral), la sustituci on de amino acidos polares como asparagina y glutamina por amino acidos cargados, y la elevaci on del car acter ani onico de la proteasa en los lugares de la mutaci on, que no pertenecen a los centros activos. No se describe ning un procedimiento con el que se pueda identicar qu e amino acidos espec cos deber an modicarse. Se conocen varias solicitudes de patente, en las que se describen modicaciones de enzimas de subtilisina para mejorar su modo de actuaci on en detergentes, por ejemplo las solicitudes de patentes internacionales WO 91/00345 y WO 92/11357.
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La solicitud de patente europea EP 0 571 049 publica determinadas enzimas proteol ticas mutadas. Estas enzimas deben ser hom ologas al menos un 70 % con la secuencia de amino acidos de la proteasa de serina PB92 y se diferencian de la proteasa de serina PB92 al menos por un amino acido en las posiciones 99, 102, 116, 126, 127, 128, 130, 160, 203, 211 y 212. La proteasa mutada se prepara por medio de cultivo de una cepa hu esped, que ha sido transformada con un vector de expresi on, que contiene una secuencia DNA y que codica la proteasa mutada deseada. En la solicitud de patente internacional WO 95/23221 no publicada anteriormente se describen proteasas mutadas, que, como aditivo a los detergentes y agentes de limpieza, mejorar su actividad.

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El documento WO-A-9510591 publica un agente de limpieza con un contenido de proteasa, donde se elevan la actividad proteol tica, la especicidad del substrato y la estabilidad. La presente invenci on ten a el cometido de poner a disposici on proteasas mutadas, que presentan compatibilidades de la piel mejoradas frente a la proteasa original y que se pueden emplear en productos cosm eticos, especialmente agentes de limpieza y de cuidado del cuerpo as como en agentes de limpieza de la boca. Se ha encontrado de una manera sorprendente que especialmente las proteasas mutadas mencionadas en el documento WO 95/23221 cumplen este requerimiento.

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El objeto de la presente invenci on es la utilizaci on de proteasa de subtilisina mutada en productos cosm eticos, que se caracteriza porque la proteasa de subtilisina mutada contiene al menos una mutaci on en su secuencia de amino acidos, que conduce a una carga positiva reducida o a una carga negativa elevada en la proximidad de la regi on de la mol ecula ligada al substrato (punto de ligaz on del substrato).
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Entre los productos cosm eticos, en los que se puede emplear la proteasa mutada seg un la invenci on, se pueden mencionar especialmente agentes de limpieza y de cuidado del cuerpo as como agentes de cuidado de la boca, como por ejemplo jabones en forma s olida y l quida, cremas de peeling, cremas de manos, cremas suaves, cremas nutritivas, cremas de protecci on solar, cremas de noche, aceites cut aneos, lociones de cuidado y aerosoles para el cuerpo, desodorantes, cremas de afeitar y espumas de afeitar, champ us para el lavado de los cabellos, aclarados de cabellos y ba nos de espuma, aclarados bucales y pastas de dientes. Las proteasas mutadas a utilizar seg un la invenci on muestran de una manera sorprendente un potencial de irritaci on reducido con respecto a la piel y las mucosas y son adecuados, por lo tanto, de una manera sorprendente para el empleo de los productos mencionados anteriormente. Otro objeto de la invenci on se reere a la utilizaci on de las proteasas mencionadas anteriormente para la preparaci on de agentes para el cuidado de la piel, de los cabellos y del cuerpo. Para la preparaci on de estos agentes se mezclan los componentes individuales de una manera conocida en s . Los agentes, especialmente cuando contienen substancias lip olas, pueden estar presentes tanto como emulsiones de agua-en-aceite como tambi en de aceite-en-agua y pueden contener otros aditivos y substancias auxiliares habituales. Los agentes pueden contener, adem as de las proteasas empleadas seg un la invenci on, como componentes esenciales, especialmente tensidos, como tensidos ani onicos, no i onicos, cati onicos, anf oteros y/o zwitteri onicos. 4

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Como aditivos y substancias auxiliares son adecuados, por ejemplo, emulsionantes, componentes oleosos, grasas y ceras, espesantes, sobreengrasantes, substancias activas bi ogenas, formadores de pel cula, arom aticos, colorantes, agentes perabrillantadores, agentes conservantes y reguladores del pH.
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Entre los componentes oleosos habituales se pueden mencionar substancias como aceite de parana, aceites vegetales, esteres de acido graso, aceites de silicona, dialquil eteres, alcoholes grasos y alcoholes de Guerbet, escualeno y 2-octildodecanol, mientras que como grasas y ceras encuentran aplicaci on, por ejemplo, esperma de ballena, cera de abejas, cera de montano, parana y alcohol cetilestear lico.
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Como emulsionantes se pueden emplear, por ejemplo: esteres de sorbitano, monoglic eridos, polisorbatos, esteres del acido mono/digraso de polietilenoglicol, esteres de a cido graso altamente etoxilado as como compuestos de silicona de alto peso molecular, como por ejemplo dimetilpolisiloxanos con un peso molecular medio de 10.000 a 50.000.
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Como agentes sobreengrasantes se pueden utilizar substancias como derivados de lanolina polietoxilados, derivados de dicitina y alcanolamidas de a cido graso, donde estos u ltimos sirven al mismo tiempo como estabilizadores de la espuma.
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Los agentes espesantes adecuados son, por ejemplo, polisac aridos, especialmente goma de xantano, guar, agar-agar, alginatos y tilosas, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa, adem as de mono y di esteres de polietileno glicol de alto peso molecular de acidos grasos, poliacrilatos, alcohol de polivinilo y polivinilpirrolidona as como electrolitos como cloruro de sodio y cloruro am onico. Por substancias bi ogenas se entienden, por ejemplo, extractos vegetales, hidroxilatos de alb umina y complejos vitam nicos. Los formadores de pel cula habituales son, por ejemplo, polivinilpirrolidona, copolimerizados de vinilpirrolidona - acetato de vinilo, pol meros de la serie del acido acr lico, derivados cuaternarios de celulosa y compuestos similares. Como agentes conservantes son adecuados, por ejemplo, soluciones de formaldeh do, esteres del acido p-hidroxi-benzoico o a cido s orbico.

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Como agentes perabrillantadores se contemplan, por ejemplo, esteres del acido glicoldieste arico como dietilenglicoldiestearato, pero tambi en monoglicol esteres de acido graso. Como colorantes se pueden emplear las substancias adecuadas y autorizadas para nes cosm eticos, como se compendian, por ejemplo, en la publicaci on Kosmetische F arbemittel de la Comisi on de Colorantes de la Sociedad Alemana de Investigaci on, publicada en Verlag Chemie, Weinheim, 1984. Estos colorantes se emplean habitualmente en concentraciones de 0,001 a 0,1 % en peso, con respecto a la mezcla total. Especialmente en las cremas pueden estar contenidos, dado el caso, adem as de los aditivos ya mencionados, tambi en antioxidantes, como por ejemplo butilhidroxitolueno y tocoferol, agentes de mantenimiento de la humedad, como por ejemplo glicerina, sorbitol, 2-pirrolidin-5-carboxilato, dibutilftalato, gelatinas, poliglicoles con un peso molecular medio de 200 a 600, substancias tamp on de pH, como, por ejemplo, el sistema a cido l actico / trietanolamina o a cido l actico / NaOH, tensidos suaves, como por ejemplo alquiloligoglucosidos, etersulfatos de alcohol graso, isetionatos, tauridos y sarcosinatos de acido graso, a cidos etercarbox licos, sulfosuccinatos, hidroxilatos de alb umina y condensados de a cido graso de alb umina, respectivamente, sulfotriglic eridos, glucamidas de cadena corta, fosfol pidos, extractos vegetales, por ejemplo de Aloe vera, agentes protectores solares, como por ejemplo di oxido de titanio ultrano y substancias org anicas como acido p-aminobenzoico y sus esteres, ester del acido etilhexil-pmetoxicin anico, ester del acido 2-etoxietil-p-metoxicin amico, butilmetoxidibenzoilmetano y sus mezclas as como los llamados aceleradores de la substancia activa, especialmente aceites et ereos, como por ejemplo eucaliptol, mentol y similares. Para poder emplear proteasas en los agentes del tipo descrito anteriormente, no deben provocar ninguna o s olo irritaciones reducidas con respecto a la piel y las mucosas, respectivamente.

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El tipo de proteasa original, del que se derivan las proteasas mutadas a utilizar seg un la invenci on, es con preferencia una proteasa Bacillus lentus alcalina (BLAP) descrita anteriormente, que se obtiene de 5

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la cepa DSM 5483 y que presenta 269 unidades de amino acidos, una masa molecular de 26.823 Daltons y un punto isoel ectrico calculado de 9,7, con respecto a valores normalizados pK. El gen BLAP se puede obtener de una manera conocida por medio de aislamiento del ADN cromos omico de la cepa B. lentus DSM 5483, preparaci on de muestras de ADN con una homolog a con respecto a las secuencias de ADN de las regiones que codican la proteasa B. Lentus, preparaci on de librer as de genomas a partir del ADN cromos omico aislado y selecci on de las librer as para los genes de inter es a trav es de hibridaci on de las muestras. Los mutantes de la BLAP mencionada con estabilidad mejorada frente a carga t ermica y tensidos han sido descritos en la solicitud de patente internacional WO 94/221760. Como se ha encontrado ahora, se puede conseguir un potencial de irritaci on reducido con respecto a la piel y las mucosas cuando se realizan modicaciones de amino acidos dentro de la regi on de ligaz on del substrato de la enzima, que conducen a una elevaci on de la carga negativa. Seg un la presente invenci on, esto se puede realizar, por ejemplo, por medio de una propagaci on de restos amino acidos cargados negativamente o una reducci on de restos amino acidos cargados positivamente en la regi on de ligaz on del substrato en el per metro de 7 A, pudiendo determinarse el lugar de la ligaz on de substrato con la ayuda de una mol ecula de substrato ligada, como por ejemplo AAPF. Especialmente las modicaciones de amino acidos en las posiciones 99, 154 y 211 dentro de las variantes-BLAP M130 y M131 conocidas por el documento WO 94/21760 de Bacillus lentus conducen a un potencial reducido de irritaci on con respecto a la piel y las mucosas. La mutante M130 contiene cuatro modicaciones de amino acidos en comparaci on con la BLAP nativa: S3T, A188P, V193M y V199I. La mutante M131 contiene cinco modicaciones de amino acidos en comparaci on con la BLAP nativa: S3T, V4I, A188P, V193M y V199I. La secuencia de amino acidos para la proteasa M130 y M131, respectivamente, est a reproducida en la SEQ ID N 2: y SEQ ID N 1, respectivamente, de la solicitud de patente internacional mencionada WO 94/221760. M130 y M131 pueden servir como base para otras modicaciones de amino acidos para obtener proteasas con potencial reducido de irritaci on. Las mutantes de proteasa preferidas para la utilizaci on seg un la invenci on son aqu ellas que se obtienen por medio de la sustituci on de al menos un amino acido de las proteasas M130 y M131, donde el amino acido es seleccionado del grupo que consta de arginina en posici on 99, serina en posici on 154 y leucina en posici on 211. Tales mutantes y su preparaci on se publican en la solicitud de patente internacional WO 95/21221 y se designan all como F11 (S3T + R99S + A188P + V193M + V199I), F43 (S3T + V4I + R99G + A188P + V193M + V199I), F44 (S3T + V4I + R99A + A188P + V193M + V199I), F45 (S3T + V4I + R99S + A188P + V193M + V199I), F46 (S3T + V4I + S154E + A188P + V193M + V199I), F47 (S3T + V4I + S154D+ A188P + V193M + V199I), F49 (S3T + V4I + A188P + V193M + V199I + L211D), F54 (S3T + V4I + R99G + A188P + V193 + V199I + L211D) y F55 (S3T + V4I + S154D + A188P + V193M + V199I + L211D). La actividad proteol tica se puede medir en conexi on con el m etodo descrito en Tenside 7 (1970), 125, por medio de una determinaci on discontinua utilizando case na como substrato de la siguiente manera: las concentraciones de la soluci on de substrato son 12 mg por ml de case na (preparada seg un Hammarsten; proveedor: etica (soluci on acuosa de 0,029 % Fa. Merck, Darmstadt, N 2242) y 30 mM Tris en agua del grifo sint (peso/V) de CaCl2 2H2 O, 0,014 % (peso/V) de MgCl2 6H2 O y 0,021 % (peso/V) de NaHCO3 ) con una dureza de 15 grados dH (dureza alemana). La soluci on de substrato se calienta a 70C y el pH se ajusta on de proteasa se prepara con 2 % (peso/V) de tripolifosfato con NaOH 0,1 N a 50C a pH 8,5. La soluci pentas odico libre de agua en agua del grupo sint etica, siendo ajustado el pH con a cido clorh drico a 8,5. A 600 l de la soluci on de substrato de case na se a naden 200 l de la soluci on de enzima. La mezcla se on se termina por medio de la adici on de 600 l incuba en el transcurso de 15 minutos a 50C. La reacci de a cido trocloroac etico 0,44 M (TCA), acetato de sodio 0,22 M en 3 % (V/V) de a cido ac etico. Despu es del enfriamiento hasta hielo dentro de 15 minutos se elimina la prote na insoluble TCA por medio de centrifugaci on, se mezcla una parte al cuota de 900 l con 300 l de NaOH 2 N y la extinci on de esta mezcla, que contiene el p eptido soluble TCA, en absorbida a 290 nm. Se preparan valores de control por medio de la adici on de 600 l de la soluci on de TCA a 600 l de soluci on de case na, seguido por 200 l de soluci on de enzima. Por denici on, una soluci on de proteasa, que provoca, en las condiciones de este ensayo, una modicaci on de la extinci on de 0,500 OD a 290 nm, posee una actividad de 10 PE por ml. Ejemplos
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Ejemplo 1 Determinaci on del potencial de irritaci on

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Se investigaron los potenciales de irritaci on de las porteadas a utilizar seg un la invenci on en el ejemplo de F49 y para la comparaci on de BLAP. Se determinaron en Conejillos de Indias en el marco de ensayos de hallazgo de dosis del ensayo Buehler (E. V. Buehler, Arch. Dermatol. 1965, 91, 171-177). A tal n, se aplic o t opicamente una soluci on al 10 % de la proteasa sobre la piel afeitada y se j o durante seis ho6

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ras por medio de un vendaje (Scotchpak R -Non-Woven-Patch, producto comercial; fabricante Minnesota Mining and Manufacturing Company). Las partes afectadas de la piel fueron evaluadas 24, 48 y 72 horas despu es de la retirada del vendaje.
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Estos ensayos fueron realizados, en cada caso, en cuatro Conejillos de Indias (raza: Pirbright white), siendo aplicadas las soluciones, por animal, en al menos dos puntos de aplicaci on. Los resultados est an reproducidos en las Tablas 2 y 3 siguientes y representan valores medios sobre la formaci on de eritema y edema. Los resultados muestran que la proteasa mutada a emplear seg un la invenci on muestra un potencial de irritaci on claramente m as reducido que la proteasa no modicada BLAP. En las tablas: Las cifras 0, 1 y 2 signican el n umero de las zonas de la piel en un animal, en las que se observaron irritaciones de la piel, signica ligera formaci on de costra en el borde de las zonas tratadas de la piel, signica inamaci on. TABLA 2 Aplicaci on epid ermica de F49
Animal Peso corporal Concentra- Actividad N 6 d a - 5 (g) ci on (p/p) (PE/ml) Evaluaci on de la piel despu es de la retirada de vendaje Despu es de 24 horas Despu es de 48 horas Despu es de 72 horas Peso corporal D a - 7 (g)

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25

30

Eritema Edema Eritema Edema Eritema Edema 5 347 10,52 5,26 20000 10000 20000 10000 5000 2500 1000 500 5000 2500 1000 500 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2a 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2a 1a 1a 1a 1 0 0 0 1a 0 0 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 393 416 403 359

35

391

10,52 5,26

40

400

2,63 1,31

45

0,52 0,26 8 379 2,63 1,31 0,52

50

55

0,26

S ntomas sist emicos observados: ninguno

60

ES 2 169 258 T3
TABLA 3 Aplicaci on epid ermica de BLAP (comparaci on)
5

Animal Peso corporal Concentra- Actividad N 6 d a - 5 (g) ci on (p/p) (PE/ml)

Evaluaci on de la piel despu es de la retirada de vendaje Despu es de 24 horas Despu es de 48 horas Despu es de 72 horas

Peso corporal D a - 7 (g)

10

Eritema Edema Eritema Edema Eritema Edema 1

15

351

8,60 4,30

20000 10000 20000 10000 5000 2500 1000 500 5000 2500 1000 500

1a 1 1a 1 1 1 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2as 1 2as 1 2 0 0 0 2 1 1 0

2 0 2 1 1 0 0 0 2 0 0 0

2as 1s 2as 1s 2s 0 0 0 2s 1s 1 0

2 0 2 0 2 0 0 0 1 0 0 0

355

2
20

325

8,60 4,30

345

372

2,15 1,07

368

25

0,42 0,21
30

362

2,15 1,07

377

35

0,42 0,21

S ntomas sist emicos observados: ninguno

40

45

50

55

60

ES 2 169 258 T3
REIVINDICACIONES 1. Utilizaci on de proteasa mutada del tipo subtilisina, que lleva al menos una mutaci on en su secuencia de amino acidos, que conduce a una carga positiva reducida o a una carga negativa elevada en la regi on de ligaz on del substrato de la mol ecula, en productos cosm eticos. 2. Utilizaci on seg un la reivindicaci on 1, caracterizada porque la proteasa mutada se deriva de proteasa alcalina Bacillus lentus.
10

3. Utilizaci on seg un la reivindicaci on 2, caracterizada porque la proteasa mutada es una proteasa alcalina mutada M131 (S3T +V4I + A188P + V193M + V199I) o una proteasa alcalina mutada M130 (S3T + A188P + V193M + V199I). 4. Utilizaci on seg un la reivindicaci on 2 o 3, caracterizada porque la proteasa presenta al menos una mutaci on en su secuencia de amino acidos seleccionada de las posiciones 99, 154 y 211. 5. Utilizaci on seg un una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque el resto amino acido 99, arginina, est a sustituido por un resto glicina, alanina o serina.

15

20

6. Utilizaci on seg un una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque el resto amino acido 154, serina, est a sustituido por un resto a cido glut amico o un resto a cido asp artico. 7. Utilizaci on seg un una de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque el resto amino acido 211, leucina, est a sustituido por un resto a cido glut amico o un resto acido asp artico.

25

8. Utilizaci on seg un una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la proteasa mutada presenta una o varias de las mutaciones R99G, R99S, R99A, L211D, L211E, S154D, S154E. 9. Utilizaci on seg un una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque los productos cosm eticos son seleccionados de jabones en forma s olida y l quida, cremas para la piel, cremas suaves, cremas nutritivas, cremas de protecci on solar, cremas de noche, aceites cut aneos, lociones de cuidado, aerosoles para el cuerpo, desodorantes, cremas de afeitar, espumas de afeitar, cremas de Peeling, champ us para el lavado de los cabellos, aclarados de cabellos, ba nos de espuma, aclarados bucales y pastas de dientes. 10. Procedimiento para la preparaci on de productos cosm eticos, caracterizado porque se mezcla proteasa mutada del tipo subtilisina, que lleva al menos una mutaci on en su secuencia de amino acidos, que conduce a una carga positiva reducida o a una carga negativa elevada en la regi on de ligaz on del substrato de la mol ecula, con otros ingredientes de productos cosm eticos. 11. Procedimiento seg un la reivindicaci on 10, caracterizado porque como otros ingredientes se utilizan tensidos ani onicos, no i onicos, cati onicos, anf oteros y zwitteri onicos, respectivamente, emulsionantes, componentes oleosos, grasas y ceras, espesantes, sobreengrasantes, substancias activas bi ogenas, formadores de pel cula, arom aticos, colorantes, agentes perabrillantadores, agentes conservantes y reguladores del pH.

30

35

40

45

50

55

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir an ning un efecto en Espa na en la medida en que coneran protecci on a productos qu micos y farmac euticos como tales. Esta informaci on no prejuzga que la patente est e o no inclu da en la mencionada reserva.

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