Guia de Practica - Biologia Celular y Molecular

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular ________________________________________
Gua de Prcticas:
BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
Lima, Abril de 2013
Gua de prcticas - Curso de Biologa Celular y Molecular
PRACTICA N1 RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS Y LPIDOS
INTRODUCCION
Los carbohidratos son sustancias naturales compuestas de carbono, hidrgeno y oxgeno. Antiguamente se les conoca como hidratos de carbono. Estos componentes se clasifican de acuerdo a su grupo funcional, numero de carbonos y orientacin. La funcin de los azcares no consiste nicamente en producir o almacenar energa. Tambin se los utiliza como sostn mecnico. La molcula orgnica ms abundante en la Tierra la celulosa, forma parte de las paredes de las clulas vegetales y est compuesta de unidades de glucosa. Los carbohidratos forman parte de las protenas de membranas, originando glucoprotenas, que intervienen en el reconocimiento celular. Los lpidos son un grupo heterogneo de sustancias orgnicas, que se caracterizan por ser insolubles en agua y solubles en solventes orgnicos (ter, ter de petrleo, acetona, CHCl3, etc.). Son esenciales en la estructura celular y constituyen una reserva energtica en los animales. Existen muchas pruebas cuantitativas y cualitativas que pueden identificar la presencia de carbohidratos y lpidos, a continuacin se ensayaran algunas de ellas.
OBJETIVOS
Reconocer carbohidratos por mtodos cualitativos. Determinar los carbohidratos reductores mediante reacciones especficas. Reconocer un polisacrido por un mtodo colorimtrico. Identificar un azcar problema, sometindolo a pruebas que determinan sus caractersticas especficas. Identificar lpidos por un mtodo colorimtrico. Observar la solubilidad de los lpidos en diferentes solventes orgnicos e inorgnicos.
PRECAUCIONES Al trabajar con mecheros, en esta prctica no est permitido el uso de guantes. Por tanto, el manejo de los reactivos tiene que hacerse con especial cuidado. El calentamiento de las muestras hasta ebullicin se hace siempre en bao de agua. NUNCA se calentar directamente a la llama salvo que se indique lo contrario.
Facultad de Medicina Humana Hiplito Unanue - UNFV
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MATERIALES Reactivo de Molisch cido sulfrico cc. Reactivo de Benedict Lugol Soluciones: glucosa 1%, fructosa 1%, sacarosa 1%, maltosa 1% y almidn al 1% Aceite, cloroformo, alcohol etlico, acetona, ter y agua destilada Sudn III Tinta china roja Tubos de ensayo de 13x100, 15x150 y gradilla Mechero, trpode, rejilla de asbesto, vaso de precipitado 250 ml Pinza de madera Marcador indeleble
PROCEDIMIENTO 1. RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS Reconocimiento general de carbohidratos (Reaccin de Molisch) Con ayuda de un marcador, colocar en maysculas la letra inicial de cada muestra empleada en tubos de ensayo separados. Aadir 1mL de muestra a cada tubo. Inmediatamente aadir dos gotas de Reactivo de Molisch a cada tubo de ensayo. Inclinando cada tubo de ensayo, agregar 1mL de cido Sulfrico concentrado lentamente. Anotar las observaciones realizadas e interpretar.
Determinacin de carbohidratos reductores (Reaccin de Benedict) Con ayuda de un marcador, colocar en maysculas la letra inicial de cada muestra empleada en tubos de ensayo separados. Aadir 1mL de muestra a cada tubo. Aadir 1mL del reactivo de Benedict a cada tubo. Hervir durante 5 minutos. Anotar las observaciones realizadas e interpretar.
Determinacin de polisacridos Con ayuda de un marcador, colocar en maysculas la letra inicial de cada muestra empleada en tubos de ensayo separados. Aadir 3mL de muestra a cada tubo. Inmediatamente aadir dos gotas de Lugol a cada tubo de ensayo. Anotar las observaciones realizadas e interpretar.
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Hervir el (los) tubo (s) con reaccin positiva. Anotar las observaciones realizadas e interpretar.
2. RECONOCIMIENTO DE LPIDOS Tincin Colocar en tres tubos de ensayo muestras de aceite. Aadir 03 gotas de Sudn III a uno de los tubos. Aadir 03 gotas de Tinta china roja a otro de los tubos. Agitar y dejar reposar. Anotar las observaciones realizadas e interpretar. Solubilidad Colocar en tubos de ensayo 2mL de: cloroformo, alcohol etlico, acetona, ter o agua. Aadir a cada tubo 2mL de aceite. Agitar cada tubo. Anotar las observaciones realizadas e interpretar.
CUESTIONARIO 1. Mencione las caractersticas de los cuatro tipos de materiales de laboratorio (volumtricos, de contencin, de soporte y uso especfico), de ejemplos y dibuje dos materiales de cada tipo. 2. Qu tipo de seales de seguridad se encuentran en un hospital? 3. Cul es la diferencia entre una prueba cualitativa y una prueba cuantitativa? Clasifique las pruebas realizadas en la prctica. 4. Qu relacin hay entre un consumo excesivo de carbohidratos y la diabetes? 5. Cul es el uso de los dextranos en medicina? 6. Cul es la relacin entre los lpidos y la salud?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J. Biologa Celular y Molecular. 5a ed. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana, 2005: 41-49. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010: 45, 55-57.
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PRACTICA N2 RECONOCIMIENTO Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS INTRODUCCION Las protenas son macromolculas compuestas por C, H, O, N y S. Los monmeros que las conforman son los aminocidos y estn unidos por enlaces peptdicos. El orden y disposicin de los aminocidos en una protena est determinada por la secuencia nucleotdica que poseen los genes en el ADN. Estas macromolculas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no existe proceso biolgico alguno que no dependa de la participacin de este tipo de sustancias. El reconocimiento y cuantificacin de las protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica y se emplea en los esquemas de purificacin de protenas y para el diagnstico de enfermedades, entre otras aplicaciones. As, la determinacin de protenas sricas en sangre sirve para confirmar desrdenes relacionados con la sangre, riones, enfermedades hepticas, deficiencias proteicas y diagnstico de tumores. Los valores normales de protenas totales en sangre va desde 6.6 a 7.9 g/dl. Las principales protenas que componen el plasma sanguneo son: la albmina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, beta globina y la gamma globulina. De ellas la ms abundante es la albmina, responsable de ms del 70% de la presin onctica, as como del control del pH. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz UV, la formacin de derivados qumicos, o la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. En la Tabla 1 se recogen los mtodos ms comunes as como sus respectivas sensibilidades, ventajas e inconvenientes.
Tabla 1. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas, rangos de sensibilidad, ventajas e inconvenientes. Rango de Mtodo Ventajas Inconvenientes sensibilidad (g) Mtodo de absorcin No se pierden las Interfieren muchos compuestos A280 100 - 3000 muestras que absorben la luz UV Mtodos colorimtricos Especfico, pocas Biuret 500 - 2000 Poca sensibilidad interferencias, barato. Depende del contenido de Lowry 1 100 Alta sensibilidad tirosina y fenilalanina en la muestra. Muchas interferencias Bradford 1 - 30 Muy sensible Interferencias con detergentes Es el mtodo ms BCA 0.5 - 10 sensible y con menos Pocos inconvenientes reportados interferencias
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OBJETIVOS Reconocer protenas mediante mtodos cualitativos. Evidenciar la presencia de protenas en plasma sanguneo. Cuantificar protenas totales en plasma sanguneo humano.
MATERIALES Tubos VACUTAINER con anticoagulante EDTA (tapa lila). Aguja hipodrmica con jeringa de 10 ml, alcohol, algodn y guantes. Albmina 1% ( 10 mg/ml) Plasma sanguneo humano Agua destilada Tubos de ensayo 13 x 100 mm y de 16 x 150 mm Reactivo de Biuret cido ntrico concentrado Trpode, rejilla de asbesto, mechero y vaso de precipitado de 250 ml Papel milimtrico, lpiz, regla, calculadora y lapicero indeleble.
PROCEDIMIENTO 1. RECONOCIMIENTO DE PROTENAS Reaccin de Biuret
Las protenas en un medio fuertemente alcalino, junto con las soluciones de sulfato de cobre, producen una coloracin violeta. Esta reaccin no es especfica, sino que la dan todas las sustancias que tiene dos o ms grupos carbamnicos (-CONH2) en su molcula, as como pueden darla los grupos -CN2NH2 y -CSNH2. El mecanismo ntimo de la reaccin no est definitivamente esclarecido; pero la hiptesis ms probable es que se forme un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los electrones no compartidos del N del enlace peptdico y del O del agua.
Formacin del enlace peptdico
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Complejo de coordinacin entre el Cu2+ y el N
Protocolo: - Colocar 2 mL de la solucin de albmina 1% en un tubo de 13 x 100 mm. Rotular - Colocar 0.5 mL de plasma sanguneo humano ms 1.5 ml de agua destilada en un tubo de 13 x 100 mm. Mezclar agitando suavemente. Rotular - Agregar 2 mL de Reactivo de Biuret a cada tubo y agitar. Dejar reposar 5 minutos - Observar, esquematizar e interpretar los resultados.
Reaccin Xantoproteica
Las protenas que presentan aminocidos con anillos bencnicos, cuando son sometidos a la accin del cido ntrico, dan derivados nitrogenados que se colorean de amarillo.
Reaccin del cido ntrico con los aminocidos aromticos
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Protocolo: - Colocar 2 mL de la solucin de albmina 1% en un tubo de 16 x 150 mm. Rotular - Colocar 0.5 mL de plasma sanguneo humano ms 1.5 ml de agua destilada en un tubo de 16 x 150 mm. Mezclar agitando suavemente. Rotular - Adicionar 2 mL de cido ntrico concentrado y observar los cambios producidos. - Hervir por 3 minutos. - Observar, esquematizar e interpretar los resultados. 2. CUANTIFICACIN DE PROTENAS Preparacin de la solucin problema: En un tubo de ensayo de 16 x 150 mm colocar 100 l de plasma ms 3.9 ml de agua destilada (dilucin 1/40). Separar 0.5 ml en un tubo de 13 x 100 mm y agregarle 0.5 ml de agua destilada. Rotular como solucin problema.
Preparacin de la solucin estndar y tubo blanco: Mezclar 100 l de la solucin del albmina 1% ms 1.9 ml de agua destilada en un tubo de 16 x 150 mm (dilucin 1/20). Separar 1 ml en un tubo de 13 x 100. Rotular como tubo 1. Mezclar 200 l de la solucin del albmina 1% ms 1.8 ml de agua destilada en un tubo de 16 x 150 mm (dilucin 1/10). Separar 1 ml en un tubo de 13 x 100. Rotular como tubo 2. Mezclar 400 l de la solucin del albmina 1% ms 1.6 ml de agua destilada en un tubo de 16 x 150 mm (dilucin 1/5). Separar 1 ml en un tubo de 13 x 100. Rotular como tubo 3. Colocar en un tubo de 13 x 100 mm 1 ml de agua destilada. Rotular como blanco.
Completar el protocolo mediante la siguiente batera de tubos:

Tubo Blanco 1 2 3 Solucin problema Volumen de muestra 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Reactivo Biuret 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml Incubar 30 minutos Temperatura ambiente
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Complete la siguiente tabla:

Tubo Blanco 1 2 3 Solucin problema Concentracin de protena (mg/ml) --Absorbancia (550 nm) Abs tubo Abs blanco
Determinacin de la cuantificacin proteica del plasma humano: Realice una grafica de absorbancia a 550 nm (eje Y) versus concentracin de protena (eje X), y determine la ecuacin lineal de la recta. Extrapole mediante esta ecuacin el valor de concentracin del plasma sanguneo.
CUESTIONARIO 1. 2. Cul es la composicin del reactivo de Biuret? Esquematizar un hexapptido constituido por: - serina - cido asprtico - tirosina - lisina - alanina - cistena Cules son los aminocidos con anillo bencnico? Esquematizar su estructura e indicar sus principales funciones biolgicas Cules son las concentraciones plasmticas de las principales protenas de la sangre? Qu podra indicar un elevado nivel de protenas en la sangre? y qu indicara un nivel proteico inferior a los valores normales?
3. 4. 5.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010 Karp G. Biologa celular. 6a ed. Mxico, D.F.: Ed. Mac Graw Hill, 2011
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PRACTICA N3 ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO
INTRODUCCION Los antecedentes de los microscopios modernos datan de la Grecia clsica y los rabes, quienes ya conocan los mecanismos de la ptica. Pero la aparicin del microscopio compuesto se da en el Renacimiento y fue Galileo Galilei quien acopl dos lentes en un tubo, mismo que fue perfeccionado a fines del siglo XVI por los hermanos holandeses Jans y Zaccharias Jansen. Sin embargo, no debe restarse importancia al trabajo de Robert Hooke quien realiz la observacin de la estructura del corcho, a travs de un microscopio fabricado por el mismo. Una clula animal convencional mide entre 10 y 20 m de dimetro, es decir, unas cinco veces menos que la menor partcula a simple vista. Por ello, fue necesario disponer de buenos microscopios pticos para que naciera la Teora celular, que plantea que todos los tejidos animales y vegetales son agregados de clulas. Este descubrimiento marca el nacimiento de la biologa celular.
OBJETIVOS Identificar las distintas partes y sistemas de un microscopio ptico. Preparar lminas para su posterior observacin al microscopio ptico. Observar preparaciones a diferentes aumentos.
MATERIALES Laminas y laminillas Microscopio ptico compuesto Una hoja de peridico y tijeras Algodn y Lana Papel lente Aceite de inmersin Pinzas de punta fina y goteros
PROCEDIMIENTO 1. Identificar las distintas partes de un microscopio ptico y sus funciones. Realizar un esquema del microscopio ptico indicando sus partes. 2. Cortar de un peridico, la letra e y letra r. 3. Montar las letras en posicin de lectura sobre una lmina o portaobjetos. Colocar una gota de agua y una laminilla o cubreobjetos encima.
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4. Observar en un microscopio a diferentes aumentos. 5. Montar las hebras de algodn o las de lana sobre lminas. Colocar una gota de agua y una laminilla encima. 6. Observar en un microscopio a diferentes aumentos. 7. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Describa los distintos tipos de microscopios e indique su uso en medicina. Qu cuidados debe tenerse con un microscopio? Qu es un colorante? Qu tipos de colorantes existen? Esquematice y denomine la formacin de la imagen final en un microscopio simple y de un microscopio compuesto. 5. Defina: o Imagen real o Imagen virtual o Longitud de onda o Limite de resolucin o Poder de resolucin
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010. Junqueira LC, Carneiro J. Biologa celular y molecular. 6a ed. Santiago [Chile]: Ed. Mac Graw Hill, 1998. Karp G. Biologa celular. 6a ed. Mxico, D.F.: Ed. Mac Graw Hill, 2011.
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PRCTICA N4 OBSERVACIN DE CLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS INTRODUCCION La coloracin implica la penetracin del colorante por fenmeno osmtico y su fijacin se debe a fenmenos de absorcin de partculas o iones. Qumicamente, la coloracin es la unin de las molculas del colorante con los elementos constituyentes de la clula. Algunas regiones celulares tienen pH alcalino y se tien con los colorantes cidos; otros tienen pH cido y se tien con colorantes bsicos. Sin embargo, es necesario sealar que tanto el ncleo como el citoplasma tienen caractersticas anfotricas de manera que en algunos casos se pueden teir, el ncleo con algunos colorantes cidos y el citoplasma con algunos colorantes bsicos. El mecanismo de coloracin de las muestras biolgicas pueden ser afectados por: Pureza del colorante Concentracin del colorante pH de la solucin del colorante Temperatura del medio ambiente Sustancias adicionales (mordientes) Tiempo de coloracin
Los preparados microscpicos, constituyen una serie de preparados rutinarios de laboratorios que tienen por objeto identificar en forma rpida el contenido de un determinado tipo de muestra, con la con la finalidad de resolver algn problema de inters particular. Los preparados microscpicos ms frecuentes en Biologa son: Preparados en Fresco Preparados en Seco Los preparados en Fresco son preparaciones microscpicas acuosas, que se caracterizan por que la sustancia examen, no est adherida de un modo fijo a la superficie de la lmina portaobjeto y por lo tanto, al ser manipulada sta en diferentes posiciones se corre el riesgo de perder u estropear el preparado. Los preparados en Seco son aquellos que sufren un procesamiento previo (extensin, fijacin y coloracin), y se caracterizan porque la sustancia examen se halla adherida a la superficie de la lmina portaobjeto y por lo tanto, al ser manipulada en diferentes posiciones, la muestra no se estropea o pierde. Es importante ejercitar al estudiante en el manejo y aplicacin de estos factores que inciden bsicamente en la complementacin del aprendizaje del estudio de estructuras celulares, identificacin de tejidos y microorganismo.
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OBJETIVOS Diferenciar y explicar el fundamento de las distintas coloraciones Reconocer los distintos tipos de bacterias segn la Tincin de Gram. Observar y caracterizar clulas eucariotas de tipo fngico, animal y vegetal
MATERIALES Microscopio ptico compuesto Pipetas Agua destilada Azul de metileno Lugol Formol Sudan III Hisopos Lminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto Bistur u hoja de afeitar Materiales de diseccin: tijera, pinza, estilete. Lminas con preparacin de bacterias teidas con coloracin de Gram Agua de florero en frasco oscuro Levadura de pan Muestras de frutas o verduras contaminadas Cebolla Tocino Lminas con frotis sanguneo teido con colorante de Wright
PROCEDIMIENTO 1. Observacin y reconocimiento de clulas procariotas La tincin Gram consiste en poner en contacto las clulas bacterianas con colorantes bsicos como violeta de genciana, utilizando la solucin de lugol como mordiente. Esto forma un compuesto yodado que se fija fuertemente en determinadas bacterias. Segn la coloracin que adquieran, las bacterias se clasifican en: Gram positivas (+): se tien fuertemente con violeta de genciana y adquieren una coloracin violeta. Gram negativas (-): se tien muy superficialmente por lo que fcilmente se decoloran con solventes orgnicos (ej. acetona). Se utiliza adicionalmente la safranina o fucsina, que se emplea como colorante de contraste, adquiriendo una coloracin rosada. La diferente tincin de bacterias se debe a la composicin diferencial de sus paredes bacterianas. Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular con murena y cido
teitoico. En cambio, las Gram negativas tienen una pared de menor espesor y, adems del peptidoglucano, se asocia con protenas, lpidos y lipopolisacridos. Adems de la coloracin esta tcnica nos permite distinguir a) la morfologa de las bacterias: bacilos (A), cocos en cadena (B), cocos en racimo (C), diplococos (D), espirilos (E), vibrios (F), cocobacilos, etc. Realizacin del frotis: Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Puede ayudarse con el asa de siembra. Flamear el asa de siembra y, junto al mechero, tomar una pequea cantidad de cultivo bacteriano en medio slido, transferirlo a la gota de agua y extender la muestra en la lmina. Flamear el asa de siembra antes de dejar e utilizarlo. Alternativamente, con un mondadientes retirar sarro de los dientes y colocarlo en una gota agua previamente colocada en el centro de una lmina portaobjetos. Extender la muestra. Esperar a que el lquido se evapore o acelerar el secado colocando la lmina al costado de la llama del mechero.
Tincin Gram: Cubrir el frotis de la lmina portaobjetos con cristal violeta por 1 min. Lavar con abundante agua el exceso de cristal violeta. Cubrir con Lugol por 1 min. Lavar con agua el exceso de lugol. Decolorar con alcohol-acetona. Lavar con abundante agua. Cubrir con safranina por 1 min. Lavar con agua. Dejar secar la preparacin Observar las lminas en el microscopio ptico con el objetivo de inmersin.
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2. Observacin de clulas eucariotas La clula eucariota es ms compleja que la clula procariota y contiene, a diferencia de esta ltima, ncleo celular. Los organismos ms simples (protozoarios) estn constituidos de una sola clula eucariota mientras que los ms complejos o multicelulares estn formados por un gran nmero de clulas eucariota que se hallan organizadas en tejidos, rganos y sistemas. a. Observacin de levaduras del pan - Diluya un trocito de levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) con agua destilada, en un tubo de ensayo. - Colocar una gota del preparado en una lmina portaobjeto y cubrirlo con una laminilla cubreobjeto. - Observe con el objetivo de 4X, 10X y 40X. - Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. - Esquematizar la forma de estos organismos. b. Observacin de hongos filamentosos Los hongos filamentosos presentan dos tipos de estructuras: a) Estructuras asexuales, que corresponden a las hifas o filamentos, y b) Estructuras sexuales, que corresponden a los cuerpos fructferos que contienen numerosas esporas y que son liberadas al medio externo. - Realizar un raspado de la zona de crecimiento de hongos presentes en la superficie de verduras o frutas contaminadas, y colocarlo sobre una lmina portaobjeto. - Colocar una gota de azul de metileno, colorear por 5 min y cubrir el preparado con una laminilla cubreobjeto - Observe con el objetivo de 4X, 10X y 40X. - Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. - Esquematizar la forma de estos organismos. c. Observacin de clulas vegetales (catfila de cebolla, Allium cepa) - Separar una de las capas del bulbo de cebolla. Con ayuda de una pinza desprenda la membrana que cubre la parte interna de la cebolla (catfila). - Extender la membrana sobre una lmina portaobjetos y agregar una gota de lugol. Cuidadosamente colocar una laminilla cubreobjeto. - Observe con el objetivo de 4X, 10X y 40X. - Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. - Esquematizar la forma de estos organismos. Definir estructuras visibles con la indicacin del docente.
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d.
Observacin de clulas animales (Epitelio bucal) El azul de metileno tie intensamente el ncleo y con menos color el citoplasma de las clulas. ste suele ser algo granuloso. - Con un hisopo limpio extraiga suavemente la mucosidad de la cavidad bucal. - Deposite la mucosidad extrada en el centro de una lmina portaobjetos y extindalo con un frotis. - Agregue dos gotas de azul de metileno y espere 5 minutos. - Elimine el exceso de colorante utilizando agua destilada y coloque una laminilla cubreobjetos. - Observe con el objetivo de 4X, 10X, 40X y 100X aadiendo previamente aceite de inmersin. - Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. - Observar y esquematizar la forma de estos organismos.
e.
Observacin de clulas animales (Tejido adiposo) El Sudan III es un compuesto que colorea a los lpidos de un color intenso. En el tejido adiposo, que contiene gran cantidad de grasas (triglicridos), se observarn los adipocitos teidos por el Sudan III. Con ayuda de un bistur cortar una fina capa de grasa de tocino Colocarla en un portaobjetos y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 5 min. Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudn III. Dejar actuar 5 min. Volver a lavar la preparacin con agua y cubrirla con una laminilla cubreobjetos Observe con el objetivo de 4X, 10X y 40X. Observar y esquematizar la forma de estos organismos.
f.
Observacin de clulas animales (Sangre) Al analizar la sangre al microscopio se vern predominantemente los glbulos rojos, hemates o eritrocitos teidos de color rojo por la eosina. No tienen ncleo y son ms delgados por el centro que por los bordes. Los glbulos blancos o leucocitos se identifican fcilmente por la presencia de ncleo, teido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos: Leucocitos granulares a) Neutrfilos segmentados: presentan un ncleo con varios lbulos (2-5) unidos por bandas de cromatina. b) Neutrfilos en banda o abastonado: presentan un ncleo no segmentado en forma de S.
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c) Eosinfilo: redondos, voluminosos, con granulaciones acidfilas de color anaranjado o rojizo, ncleo con dos lbulos. Estos glbulos aumentan en nmero en caso de parasitosis o procesos alrgicos. d) Basfilos: escasos de 0-1, presentan un ncleo difcil de observar, pues est cubierto por una granulacin de color violeta o morado oscuro. Leucocitos agranulares a) Linfocitos: de forma redonda o irregular, su ncleo es morado, voluminoso y ocupa la mayor parte de la clula, el citoplasma es azul y sin granulaciones. Su nmero aumenta con las infecciones. b) Monocitos: de forma redonda u ovalada, ncleo variable generalmente en forma de rin, citoplasma sin grnulos. Constituyen los precursores de los macrfagos los cuales presentan una gran cantidad fagocitaria.
Diversidad de formas de las clulas sanguneas
Para la observacin de las clulas sanguneas se pueden seguir los siguientes pasos para las coloraciones de Wright y Hematoxilina-Eosina Con ayuda de una lanceta desechable, realice una puncin del pulpejo del dedo anular de la mano izquierda, previa desinfeccin con algodn y alcohol. Tome una gota de sangre y haga un frotis fino sobre la lmina portaobjeto. Colocar el frotis extendido ya seco, sobre una base plana en posicin totalmente horizontal.
Para la coloracin de Wright: - Coloree con unas gotas de colorante Wright por unos 10 min. - Lave con agua corriente y dejar secar al medio ambiente. - Observe al microscopio. Utilice el objetivo de 100X para la observacin de las clulas y ncleos.
- Diferencie las diferentes formas de ncleo en los neutrfilos, basfilos, eosinfilos, monocitos y linfocitos. - Dibuje cada forma de ncleo. Para la coloracin de Hematoxilina-Eosina: - Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tincin y aadir unas gotas de alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparacin. - Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 min. Evitar la desecacin del colorante agregando ms lquido. - Lavar la preparacin y aadir unas gotas de eosina dejndola actuar 1 min. - Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante. - Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero. - Observar al microscopio. Utilice el objetivo de 100X para la observacin de las clulas y ncleos. - Diferencie las diferentes formas de ncleo en los neutrfilos, basfilos, eosinfilos, monocitos y linfocitos. - Dibuje cada forma de ncleo.
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CUESTIONARIO 1. Por qu se emplea aceite de inmersin para la observacin de bacterias? 2. Qu funcin tiene el yodo en la coloracin Gram? 3. Qu es un colorante vital y un colorante no vital? Mencionar 3 ejemplos de cada uno. 4. Mencione 5 ejemplos de gneros de microorganismos Gram (+) y 5 ejemplos de gneros de microorganismos Gram (-). Indique a su vez la morfologa que presentan. 5. Cul es el fundamente de la tincin con el azul de metileno? Esquematizar la estructura de este colorante 6. Para qu se utiliza el formol en la coloracin de adipocitos? 7. Por qu los eritrocitos se tien con eosina y los leucocitos con hematoxilina?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a Ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010. Berkaloff AJ, Bourguet P, Favard SC, Lacroix J. Biologa y Fisiologa Celular. Editorial Omega, 1988.
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PRACTICA N5 OBSERVACIN DE ORGANELAS CELULARES
INTRODUCCIN En las clulas se observan diversas organelas de forma y tamao variado, que se encuentran en forma constante. Los constituyentes subcelulares son compartimentos independientes que se encuentran en relacin con el citosol, medio interno que les provee de los sustratos necesarios que se acumulan selectivamente para transformarse en productos que sern utilizados por la clula en sus diversas actividades metablicas. OBJETIVOS Identificar la estructura de cada organela celular. Comprender las caractersticas funcionales de las organelas celulares. Conocer las correlaciones clnicas ms representativas de las organelas celulares.
MATERIALES Laminas y laminillas Pipeta pasteur y gotero Estuche de diseccin con hojas de bistur. Verde de Janus Rojo neutro Muestras: Agua estancada, Elodea sp., aj amarillo, tomate, zanahoria, harina de arroz, harina de frejol, Papa, beterraga
PROCEDIMIENTO Observacin de mitocondrias 1. Raspar la cara interna de una mejilla con el extremo de una lmina limpia. 2. Extender la muestra obtenida por medio de un frotis. Secar al medio ambiente. 3. Agregar de 1 a 2 gotas de verde de Janus. Esperar 5 minutos y enjuagar cuidadosamente. Dejar secar al ambiente. 4. Observar al microscopio. 5. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda. Observacin de lisosomas 1. Colocar una muestra de agua estancada en una placa petri. 2. Agregar unas gotas de rojo neutro.
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3. Con ayuda de una pipeta Pasteur, colocar una gota de la muestra tratada en una lamina y cubrir con una laminilla. 4. Observar al microscopio. 5. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda. Observacin de cloroplastos 1. Colocar una hoja de Elodea en una lmina agregar una gota de suero fisiolgico y cubrir con una laminilla. 2. Observar al microscopio. 3. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda. Observacin de plastidios Cromoplastos: 1. Realizar cortes delgados y traslucidos de la cara interna del aj, tomate y zanahoria. 2. Colocar los cortes sobre lminas, agregar una gota de suero fisiolgico y cubrir con una laminilla. 3. Observar al microscopio. 4. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda. Leucoplastos: 1. Colocar una gota de suero fisiolgico sobre una lmina y agregar una pizca de la harina de arroz. Cubrir con una laminilla. 2. Colocar una gota de suero fisiolgico sobre una lmina y agregar una pizca de la harina de frejol. Cubrir con una laminilla. 5. Realizar un corte delgado y traslcido de la cara interna de una papa. Colocar el corte sobre una lmina, agregar una gota de suero fisiolgico y cubrir con una laminilla. 3. Realizar un segundo corte de papa y colocar sobre l una gota de Lugol. Cubrir con una laminilla. 4. Observar todas las lminas montadas al microscopio. 5. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda. Observacin de vacuolas 1. Realizar un corte delgado y traslucido de la cara interna de una beterraga. 2. Colocar el corte sobre una lmina, agregar una gota de suero fisiolgico y cubrir con una laminilla. 3. Observar al microscopio.
4. Realizar esquemas de sus observaciones indicando el aumento utilizado, muestra utilizada, organismo y colorante, cuando corresponda.
CUESTIONARIO 1. Cul es la diferencia entre un peroxisoma y un lisosoma? 2. Realice un esquema en donde se represente el aparato de Golgi y el trnsito vesicular. Explique con sus propias palabras el esquema. 3. A qu se denomina retculo sarcoplsmico y en qu tipo celular es comn est denominacin? 4. Investigue tres enfermedades relacionadas con alguna patologa de las organelas celulares.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a Ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010. Berkaloff AJ, Bourguet P, Favard SC, Lacroix J. Biologa y Fisiologa Celular. Editorial Omega, 1988.
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PRCTICA N6 PERMEABILIDAD CELULAR: DIFUSIN Y SMOSIS INTRODUCCION Una molcula tiene el mismo nmero de probabilidades de moverse, en un medio acuoso, en un sentido que en otro. Si las molculas en una sustancia estn distribuidas uniformemente dentro de un recipiente, el movimiento en una direccin se equilibra con el movimiento de otras molculas en sentido opuesto, no habiendo por lo tanto movimiento neto de la sustancia. Si sacamos todas las molculas del recipiente y reintroducimos cierto nmero de ellas en determinado punto, el movimiento al azar har que se dispersen en el recipiente. Las molculas que se mueven hacia las paredes sufrirn colisiones con stas y sern desviadas, lo mismo que las que choquen entre s; las que se mueven en otros sentidos iniciarn el desplazamiento y pasarn a otras reas del recipiente. Este movimiento de las molculas de un zona de mayor concentracin hacia otras de menor concentracin se llama DIFUSIN. La difusin de molculas de agua a travs de una membrana semipermeable (que slo deja pasar el solvente) se denomina SMOSIS, y se puede demostrar con membranas inertes como el celofn. Este es un proceso pasivo, ya que no hay consumo de energa en el movimiento de molculas a travs de la membrana. Las membranas celulares, por el contrario, no son semipermeables, sino DIFERENCIALMENTE permeables, debido a que permiten el paso de ciertas molculas, adems de las molculas del solvente. As, las sustancias pueden entrar a la clula mediante uno de los tres mecanismos: - Por difusin simple a travs de la membrana (o al menos el caso del agua, a travs de poros en la membrana). - Por difusin facilitada en que un transportados se combina con la sustancia en un lado de la membrana y la libera en el otro. - Por transporte activo, el cual tambin emplea transportadores pero acopla el transporte con la utilizacin de energa. Este ltimo mecanismo permite la acumulacin citoplasmtica de un sustrato libre a niveles mucho mayores que su concentracin externa.
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OBJETIVOS Comprobar algunos fenmenos fsicos que se producen en la materia viva organizada, formado estructuras, tomando en consideracin su composicin qumica.
MATERIALES Microscopio compuesto Pipetas pasteur y vasos de precipitado Agua destilada Azul de metileno Lugol Sal de mesa Soluciones de NaCl 0.2%, 0.9% y 5%. Lminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto Bistur u hoja de afeitar y materiales de diseccin: tijera, pinza, estilete. Lancetas de puncin 01 cebolla 05 huevos sumergidos en vinagre (por lo menos 3 a 4 das previos a la prctica)
PROCEDIMIENTO Permeabilidad de las membranas celulares - Previamente a la prctica, seis huevos en un frasco de 1 L y verter vinagre hasta cubrir completamente los huevos. Debe realizarse este proceso 5 das antes de la prctica. - Al momento de la prctica lavar con mucho cuidado con agua de cao. - Frotar cuidadosamente con los dedos para sacar la cscara hasta tener los huevos completamente libres de cscara. - En tres vasos de precipitacin de 100 mL, colocar: (1) agua destilada, (2) agua de cao, (3) agua saturada con sal de mesa. - Adicionar a cada frasco 3 gotas de azul de metileno. - Sumergir los huevos en las respectivas soluciones y dejarlos reposar por 1 hora. - Luego de finalizado el tiempo observar la membrana y analizar el contenido interno del huevo. Esquematizar el procedimiento y los resultados obtenidos. smosis en clulas animales y vegetales Muestra 1: glbulos rojos - En tres tubos de ensayo numerados coloque: (1) 1 mL de solucin de NaCl 0.2 % (2) 1 mL de solucin de NaCl 0.9% (3) 1 mL de solucin de NaCl 5%
Obtener 2 mL de sangre venosa con una lanceta en un tubo con heparina. Dejar caer 5 gotas de sangre en cada uno de los tubos con un gotero. Agite los tubos y dejar en reposo durante 5 minutos. Con un gotero coloque en tres lminas portaobjeto, una gota de cada uno de los tres tubos y cubrirlas con una laminilla cubreobjeto. - Observar al microscopio utilizando los objetivos de 10X y 40X. Muestra 2: catfila de cebolla - Obtener una capa delgada de la catfila de cebolla y extenderla sobre tres lminas portaobjeto. - Agregar 3 gotas de las respectivas soluciones e incubar la muestra por 5 minutos: (1) Solucin de NaCl 0.2 % (2) Solucin de NaCl 0.9% (3) Solucin de NaCl 5% - Cubrir las muestras con una laminilla cubreobjeto. - Observar al microscopio utilizando los objetivos de 10X y 40X.
CUESTIONARIO 1. Cules son las caractersticas generales de la difusin simple, difusin facilitada y del transporte activo? 2. Defina solucin hipertnica, solucin isotnica y solucin hipotnica. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a Ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010. Berkaloff AJ, Bourguet P, Favard SC, Lacroix J. Biologa y Fisiologa Celular. Editorial Omega, 1988.
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PRACTICA N7 GRUPO SANGUINEO Y FACTOR RH INTRODUCCIN Las dos clasificaciones ms importantes para describir grupos sanguneos en humanos son los antgenos y el factor RH. Estos corresponden al sistema ABO o al sistema Rhesus, respectivamente. Existen cuatro grupos sanguneos en el sistema ABO: Grupo O, Grupo A, Grupo B y Grupo AB. El grupo ms comn en nuestro pas es el Grupo O. En tanto, de acuerdo al sistema Rhesus, las personas pueden ser Rh positivo o Rh negativo. Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccin inmunolgica que puede desembocar en hemolisis, anemia, fallo renal, shock, o muerte. Por lo que conocer a qu grupo sanguneo pertenece una persona es importante al realizar operaciones o en otras ocasiones en que sea necesaria una transfusin sangunea.
OBJETIVOS Entender la clasificacin de los grupos sanguneos humanos de acuerdo al sistema ABO Determinar el grupo sanguneo de los estudiantes
MATERIALES Placas de microtitulacin Mondadientes Algodn, alcohol y lancetas Suero anti-A Suero anti-B Suero anti-AB Suero anti-D
PROCEDIMIENTO Limpiar el dedo ndice del donante con un algodn humedecido en alcohol. Pinchar el dedo con la lanceta estril. Dejar caer una gota en cada pocillo de una placa de microtitulacin. Un total de 4 pocillos por cada donante. Agregar una gota de suero anti-A, anti-B, anti-AB o anti-D a los pocillos. Mezclar con mondadientes de manera independiente. Dejar reposar un minuto Leer los pocillos. Dividir los resultados en positivos o negativos. Determinar el grupo sanguneo y factor Rh de cada paciente.
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CUESTIONARIO 1. Qu es un antgeno? 2. Qu es un anticuerpo? 3. Cul es el fundamento de la prueba de titulacin empleada en el reconocimiento de grupos sanguneos? 4. Cul es la diferencia entre el antgeno A, el antgeno B y el factor Rh? 5. Cul es el fenotipo Bombay? 6. Qu es la eritroblastosis fetal?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Abbas A., Lichtman, A; Pillai Shiv.: Inmunologa Celular y Molecular. 6a ed. Madrid: Editorial Elsevier, 2008. Thews G, Mutschler E, Vaupel P. Anatoma, Fisiologa y Patofisiologa del hombre. Manual para farmaceticos y bilogos. Barcelona: Editoral Revert, 1983. Gal B, Lpez M, Martn AI, Prieto J. Bases de las fisiologa. 2a ed. Madrid: Editorial Tebar, 2007.
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PRCTICA N8 MITOSIS: ndice de fases INTRODUCCION El ciclo celular es un proceso que consiste en la replicacin de material gentico y formacin de clulas hijas. Compromete dos etapas: La primera llamada interfase, donde no ocurre divisin celular propiamente dicha y la segunda de divisin celular. Dependiendo del tipo de clulas donde se lleve a cabo, la divisin celular toma el nombre de mitosis (si ocurre en clulas somticas) o meiosis (si ocurre en clulas germinales).
La mitosis es un proceso exacto que permite controlar la transmisin de los rasgos de la herencia de un ncleo a otro durante la divisin celular. Es un mecanismo que genera nuevas clulas y reemplaza las clulas daadas en los organismos multicelulares. La mitosis implica cuatro etapas: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. En las dos primeras ocurre la condensacin y ordenamiento de los cromosomas y en las dos ltimas se lleva a cabo la distribucin de los cromosomas. El resultado final son dos clulas hijas diploides (2n).
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OBJETIVO Reconocer las distintas fases del ciclo celular en clulas meristemticas de la raz de Allium cepa cebolla. En este sistema, la poblacin celular est en equilibrio dinmico y los cromosomas son relativamente grandes. Las clulas presentan un nmero diploide 2n = 16.
MATERIALES Lunas de Reloj Plumones marcadores Material de diseccin: pinzas, tijeras, bistur Orcena actica Pinzas de madera Microscopio Mechero de alcohol Etanol Papel lente y papel filtro Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO Con 5 das de anticipacin a la prctica preparar el cultivo de cebolla de la siguiente manera: En un vaso con agua colocar una cebolla mediana de tal manera que haga contacto la parte terminal de la cebolla con el agua y dejar en lugar semioscuro. El agua del envase debe ser cambiada cada 24 horas.
Preparacin de la muestra: - Disponer de gran nmero de races de cebolla, haciendo cortes de la parte terminal (aproximadamente de 0.5 cm) y depositar en una luna de reloj. - Colorear con orcena actica por 10 minutos. - Luego calentar la muestra hasta que emanen vapores blanquecinos por 2 veces consecutivas con intervalos de enfriamiento. Evitar que la muestra se seque. - Trasladar las races a diferentes portaobjetos, separar solo el pice (parte terminal de la raz) y agregar una gota de orcena y cubrir con el cubreobjeto. - Apretar la muestra suavemente a fin de esparcir la muestra de forma homognea. - Secar el exceso de colorante con papel filtro y llevar al microscopio para su observacin a diferentes aumentos.
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Interfase
Profase Temprana
Profase Tarda
Metafase
Anafase Temprana
Anafase Tarda
Telofase Temprana
Telofase Tarda
Citocinesis
Determinacin de ndice mittico y de fases: Evaluar a 40X seis campos diferentes de una lmina. Contabilizar el total clulas observadas, y determinar de ese total cuntas clulas estn en interfase y en mitosis. Contabilizar el total de clulas en profase, metafase, anafase y telofase. Determinar el ndice mittico sumando los diferentes estados morfolgicos de la mitosis multiplicado por 100 y divididos entre el nmero total de clulas meristemticas. Los ndices de fases (profase, metafase, anafase, telofase) se calcularn multiplicando el nmero de clulas de cada fase por 100 y dividindolos entre el total de clulas en mitosis.
CUESTIONARIO 1. Estn las clulas repartidas en forma homognea en el preparado que usted ha realizado? Explique. 2. Por qu es esencial que cada clula resultante de la mitosis reciba exactamente la misma cantidad de material nuclear? 3. Por qu la mitosis se describe como un proceso de igual transmisin de material nuclear? Explicar mediante un esquema utilizando como modelo una clula animal con nmero diploide 2n = 4. Considerar que el par I es metacntrico y el par II es telocntrico. Adems enfatizar los cambios en: cantidad de ADN, cantidad de cromosomas y cantidad de cromtides hermanas y homlogas.
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4. Qu tcnicas celulares se emplean para la observacin del huso acromtico y sus cambios durante la mitosis? Qu drogas empleara para evitar su formacin o acelerar su despolimerizacin? Explique. 5. Qu es el ndice interfsico y qu es el ndice mittico? 6. Qu es la cariocinesis y qu es la citocinesis? 7. Al comparar los ndices mitticos y de fases de sus compaeros Qu conclusiones puede obtener?
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologa molecular de la clula. 5a Ed. Barcelona: Ediciones Omega, 2010. Lpez-Sez JF & Ferndez E (1965), Mitotic partial index and phase indices. Experientia 21.
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PRACTICA N9 ACTIVIDAD ENZIMTICA Y FERMENTACIN
INTRODUCCIN En 1926, James Summer obtuvo la evidencia directa de la naturaleza proteica de las enzimas, cuando critaliz la enzima ureasa extrada del haba y determino su composicin. Desde entonces se han purificado ha estado homogneo muchas enzimas de origen animal, vegetal y microbiano utilizando procedimientos como cromatografa de afinidad, cromatografa en capa fina, centrifugacin y electroforesis. Las enzimas alteran las velocidades de reaccin por medio de: 1) abatir la energa de activacin para formar estados de transicin, 2) servir como plantillas para incrementar las concentraciones locales de sustrato y 3) proporcionar aminocidos cuyos grupos funcionales cumplan con funciones especificas en la catlisis. La fijacin y catlisis del sustrato se produce en el sitio activo (cataltico). Como las enzimas son catalizadores, presentan caractersticas similares a ellos. Sin embargo, las enzimas son catalizadores orgnicos, a diferencia del Dixido de magnesio que es un catalizador inorgnico. Existen tres tipos de fermentacin, principalmente: fermentacin lctica, fermentacin alcohlica, fermentacin actica. La fermentacin alcohlica (o fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de oxgeno, originando por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono para obtener como productos finales un alcohol (etanol), dixido de carbono y ATP.
OBJETIVOS Comprobar la actividad enzimtica de la catalasa de origen animal y vegetal. Evidenciar el proceso de fermentacin.
MATERIALES Muestras: Papa, hgado de pollo, frutas, canela, azcar Perxido de hidrogeno Estuche de diseccin, hojas de bistur Mortero y piln Agua destilada Mechero Fsforos Hisopos de madera
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PROCEDIMIENTO Actividad enzimtica En tubos de ensayo limpios colocar un trozo de papa, un trozo de hgado, hgado triturado, hgado triturado y cocido o dixido de magnesio. Agregar gotas de perxido de hidrogeno a uno de los tubos. Inmediatamente prender los palillos con ayuda de un mechero e introducirlos en el tubo. Observar que sucede con la llama. Repetir el mismo procedimiento con el resto de los tubos. Interpretar.
Fermentacin Trozar la fruta Triturar la canela y mezclar con la fruta trozada. Meter todo dentro de la botella de plstico. Agregar azcar y agua. Colocar el globo en la boquilla de la botella y sellarlo. Esperar y anotar sus observaciones y percepciones. Interpretar.
CUESTIONARIO 1. Qu es el sitio activo? 2. Qu es un zimgeno? 3. Qu enzimas son utilizadas en el diagnostico clnico? De una breve explicacin de cada una. 4. Describa y de ejemplos de los tipos de fermentaciones.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Karp G. Biologa celular. 6a ed. Mxico, D.F.: Editorial Mac Graw Hill, 2011. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Bioqumica de Harper. 14a ed. Mxico, D. F.: Editorial El Manual Moderno; 1999.
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PRACTICA N10 EXTRACCION Y ELECTROFORESIS DE ADN
INTRODUCCION El cido desoxirribonucleico (ADN) es quizs la molcula ms relevante dentro de una clula ya que contiene en su secuencia toda la informacin necesaria para su metabolismo, desarrollo e incluso su muerte. Esta macromolcula est formada de cuatro nucletidos: adenina, guanina, citosina y timina, cuya alternancia produce la codificacin de todas las protenas existentes. El estudio molecular de enfermedades implica el anlisis de la secuencia de ADN del paciente, para lo cual el primer paso es purificar esta macromolcula. Para poder extraer el ADN a partir de una muestra celular se debe tener en cuenta la naturaleza de sus cargas negativas, la cual permite que esta molcula interacte con iones salinos, facilitando as su disolucin y posterior purificacin. El primer paso consiste en la lisis de las clulas mediante la accin de un detergente que permita la disolucin de los fosfolpidos de las membranas celulares y nucleares. Posteriormente el ADN es liberado al medio y se disuelve en un medio tamponado, arrastrando adems otros componentes celulares como ARN, carbohidratos, protenas y diversas sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de esta molcula por accin del detergente. En algunos casos se deben utilizar solventes orgnicos como el cloroformo, el cual extrae a las protenas dejando insoluble el ADN. Finalmente, la extraccin del ADN a partir del medio tamponado y su separacin del detergente se realizan por solubilidad diferencial en alcohol y a bajas temperaturas. El estudio del ADN incluye averiguar su secuencia, y el primer tipo de secuenciacin de ADN, el mtodo de Sanger, empleaba la electroforesis de ADN. La electroforesis del ADN est basada en la migracin de molculas de acuerdo a su tamao y carga; y es una tcnica usual en laboratorios de biologa molecular. OBJETIVOS Adiestrar al alumno en las tcnicas que permitan la extraccin y visualizacin del ADN a partir de un tejido animal, comprobando su estructura fibrilar y gran longitud.
MATERIALES Para extraccin de ADN Hgado de pollo fresco Tubos de ensayo (16 x 150 mm) Vasos de precipitacin (100 mL) Baguetas de vidrio delgadas
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Embudo de vidrio Mortero con piln Pipetas de 10 mL Gasa estril Bao de incubacin a 60 C Etanol puro (4C)
Medio de Homogenizacin (1 L): SDS 50.000 g NaCl 8.770 g Citrato de Sodio 4.110 g EDTA 0.292 g Para electroforesis de ADN Agarosa Buffer TBE y Buffer de carga Marcador de peso molecular Bromuro de etidio Camara electrofortica Fuente poder
PROCEDIMIENTO 1. Extraccin de cidos nucleicos Homogenizacin del tejido El mtodo para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las caractersticas de ste. Para grandes volmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domsticas. Para volmenes menores, en general es suficiente un mortero y un piln. Para tejidos ms resistentes, como por ejemplo hueso o diente, se necesitan tratamientos mecnicos especiales. Aquellos tejidos con clulas cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, se requieren adems condiciones drsticas como la congelacin de la muestra en nitrgeno lquido y, mantenindola as congelada, pulverizarla con un mortero. De esta forma, adems de desintegrar la muestra, se logra que sta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la accin de enzimas endgenas que pudieran degradar el material de inters. En esta prctica se emplear un mtodo de ruptura con mortero (sin congelamiento). La principal ventaja de este mtodo es que se adapta bastante bien a tejidos muy diversos. Asimismo, dado que se opera a temperatura ambiente, las ribonucleasas celulares pueden degradar parcialmente las molculas de ARN. Para ayudar a la solubilizacin de los componentes celulares, a la ruptura de membranas y de complejos proteicos, el medio de homogenizacin contiene al SDS (dodecil sulfato de
sodio), el cual es un detergente inico que dispersa los componentes de las membranas facilitando su ruptura y separa a las protenas asociadas a la cromatina desnaturalizndolas. El NaCl produce el estallido de los ncleos para liberar las fibras de cromatina. Adems EDTA, el cual es un agente quelante de cationes divalentes, y que impide la accin de las DNasas (dependientes de Mg2+), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas. Para esta seccin, seguir los siguientes pasos: - Es OBLIGATORIO antes de realizar la prueba: (1) limpiar la zona de trabajo con abundante alcohol y papel toalla; (2) usar guantes de latex durante todo el procedimiento para evitar la contaminacin de la muestra con DNasas provenientes del sudor de las manos, las cuales pueden degradar nuestras muestras de ADN. - Fraccionar el tejido utilizando mortero y piln agregando 10 mL del medio de homogenizacin por cada gramo de tejido con que se inicia el proceso. - Una vez que se haya homogenizado la mezcla, transferirla a un vaso de precipitado de 100 mL e incubar el preparado en un bao de temperatura a 60C por 15 min. El calor ablandar el tejido permitiendo que los componentes del medio de homogenizacin ingrese a la clula. Adems, esta temperatura denatura muchas enzimas que podran interferir con el procedimiento. - Finalizado el tiempo, filtrar el homogenizado empleando la gasa estril y colectar en tubos de ensayo (16 x 150 mm) - Colocar la preparacin filtrada en una cubeta con hielo por 10 minutos a fin de detener cualquier proceso degradativo del ADN.
Precipitacin del ADN La precipitacin de los cidos nucleicos es un procedimiento que permite su purificacin y concentracin. Se basa en la neutralizacin de las cargas negativas y en la deshidratacin de la molcula, lo cual posibilita su agregacin y precipitacin. Este fenmeno se caracteriza por ser reversible (el cual permite la resuspensin del ADN en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalizacin (potencialmente reversible), ni con la degradacin (irreversible) de los cidos nucleicos. Para esta seccin, seguir los siguientes pasos: - Lentamente y por las paredes de los tubos de ensayo, agregar etanol puro (4 C) hasta que se aprecie que la muestra adquiere una consistencia blanquecina. Esto significa que el ADN ha precipitado. - Reconocer en las soluciones la formacin de 3 fases: (1) alcohol (fase superior), (2) ADN precipitado (fase intermedia) y (3) contenido celular (fase inferior). - Suavemente girar una bagueta de vidrio enrollando el ADN precipitado en una sola direccin. El ADN en la bagueta se apreciar de forma similar a una madeja de hilo sumamente fino o como copos de algodn.
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2. Electroforesis de ADN Disolver agarosa en buffer TBE 1X. Tomar en cuenta que se desea preparar una solucin al 0.1%. Calentar hasta su disolucin Agregar a una cmara electrofortica y esperar 30 minutos hasta su gelificacin. Llenar la cmara electrofortica con buffer de corrida hasta cubrir el gel. Mezclar las muestras con buffer de carga. Colocar las muestras en los pocillos de la cmara electrofortica. Cubrir la cmara y correr a 100V por 45 minutos. Retirar el gel y colocarlo en bromuro de etidio. Esperar 15 minutos. Retirar y colocar en la solucin de enjuague. Observar en un transiluminador.
CUESTIONARIO
1. Cul es la relacin entre la concentracin de agarosa y la migracin de las molculas? 2. En qu ocasiones se recomienda usar geles de poliacrilamida?
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3. Si la siguiente es una corrida electrofortica de una secuenciacin por el mtodo de Sanger Determine la secuencia nucleotdica original. Secuencia de 5 a 3:___________________________________________ Secuencia de 3 a 5:__________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS De Robertis EDP. Biologa Celular y molecular. 15a ed. Buenos Aires: El Atenero; 2005: 71-73.
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PRCTICA N11 CDIGO GENTICO Y TRADUCCIN DE PROTENAS
INTRODUCCION El ADN contenido en el ncleo celular almacena toda la informacin hereditaria bajo la forma de genes. Estos elementos para expresarse deben ser transcritos en una molcula (ARN mensajero), que sea capaz de llevar la informacin al citoplasma e interactuar con los ribosomas, donde se efectuar su traduccin en la respectiva protena. Son estas protenas a su vez las que van a determinar las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas que un organismo uni o pluricelular presenta. Teniendo en cuenta que el ADN posee 4 bases nitrogenadas distintas y que por lo menos existen 20 aminocidos diferentes capaces de ligarse para formar las protenas, es evidente que la traduccin est regida por una clave. Por lo tanto, la existencia de caracteres hereditarios no es sino la expresin de ciertas regiones del ADN a travs del Cdigo Gentico. En dicho cdigo consideramos los siguientes aspectos fundamentales: El ARNm (ARN mensajero) tiene los codones o tripletes de bases, por ejemplo UUU. El ARNt (ARN de transferencia) unido a un aminocido especfico lleva el anticodn que debe ser complementario al codn, ejemplo AAA. El ARNr (ARN ribosomal) que reconoce el extremo del ARNm, por donde se debe iniciar la sntesis de protenas. El cdigo gentico es la combinacin de tripletes que tienen la informacin necesaria para codificar un aminocido. Existen 64 codones en el cdigo gentico, que codifican para los 20 aminocidos que forman las protenas y que adems contiene 1 codn de inicio de la traduccin y 3 codones de finalizacin de la misma. Una enzima especfica une el aminocido a su respectivo ARNt. El ARNt con su aminocido, reconoce el codn del ARNm. Por ejemplo el ARNt que lleva el aminocido fenilalanina, tiene el anticodn AAA y reconocer el codn UUU del ARNm. Los aminocidos se ligan uno a uno a medida que aparecen los codones formando una cadena de protenas. El proceso de sntesis proteica se realiza en el citoplasma, con la participacin de los ribosomas y diversos elementos esenciales. El crecimiento de la cadena contina hasta que aparezcan codones que indiquen terminacin.
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OBJETIVOS Indicar los elementos que intervienen en la sntesis proteica. Describir el mecanismo de la sntesis de protenas. Explicar el cdigo gentico y como la informacin almacenada puede ser utilizada para elaborar una cadena polipeptdica. Reconocer los codones y anticodones posibles para los aminocidos que forman las protenas. Analizar posibles mutaciones en los codones que alteren la secuencia de una protena y con ello su funcin.
MATERIALES - Tabla del cdigo gentico nuclear (Tabla 1). - Tabla de las alteraciones del cdigo gentico en mitocondrias y otros organismos (Tabla 2). - Tabla de aminocidos (Tabla 3). - Secuencias nucleotdicas para el anlisis por grupos (Tabla 4).
PROCEDIMIENTO a) Completar la siguiente informacin analizando la Tabla 1. - Codones de inicio y finalizacin:
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- Aminocidos codificados por 1 slo codn: - Aminocidos codificados por 2 codones: - Aminocidos codificados por ms de 3 codones:
b) Por qu algunos aminocidos son codificados por 1 slo codn mientras que otros son codificados por 2 o ms codones? c) Qu cambios se han producido en el cdigo gentico de mitocondrias en humanos? Utilizar la Tabla 2. d) Asumiendo que la secuencia de nucletidos proporcionada en la Tabla 4 corresponde a la cadena codificante de un gen, determinar: - Secuencia de la cadena no codificante (5-3): - Secuencia de la cadena de ARNm transcrito (5-3): - Secuencia de aminocidos deducida utilizando la Tabla 1: - Secuencia de aminocidos deducida utilizando la alteraciones de la Tabla 2: e) Tomando en cuenta los dos ltimos resultados, comparar las secuencias de aminocidos e indicar los cambios ms relevantes en la composicin de aminocidos.
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TABLA 1 CDIGO GENTICO NUCLEAR
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TABLA 2 ALTERACIONES PRESENTES EN EL CDIGO GENTICO MITOCONDRIAL
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TABLA 3 LISTA DE AMINOCIDOS CON SIMBOLOGA DE TRES LETRAS Y UNA LETRA
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TABLA 4 SECIUENCIAS NUCLEOTDICAS PARA EL ANLISIS POR GRUPOS
GRUPO 1
SECUENCIA 5atccaccctcccagtattgtcatgcgtatgaaaagtgatgatcgtaaccataacat tcct aacacagtgacaccttataaagattattcctttcatttttttttctgaggcaatt ggggt 3 5taatgtgacttgcccagggtcacacagctaagaagtgttaagtatctgagaccaga tttgaactcagatcctcctgacttcagggctggtgctcttcttccccttttcccactggc tacac 3 5cctagcaatgtgtaacttacttccttgcatatatctcatacttcgcctagtatatattgg agcctgaatagagacttaaggatatccataagtaaggaatattatatggatcttta taca 3 5gcaaagaaaactgcaattatcccctaaataatggtaagttttttgggcgcatgga atatgtgatttttttcatttcacttgcttgccaactgagcaatctcctctacacaaaaga gatac 3 5ttaataaatattggaagaattgagcatttatgaagcattgttctccctaacacattta aagcaataagaaactagaccaacaatttcattggttagagaattttcagtgcatgga atgct 3 5ttaataaatatggaagaattgagcatttattaagcattgttctccctaacacatttaaa gcaataagaaactagaccaacaatttcattggttagagaattttcagtgcatgga atgct 3 5ttcatgactaatacttgtcatcatattaaatgaaaattttagtcttagagcattgtgtg gagcactgagaggctaaaaaaatcttgtccaggattagacatctaatatgttcagagg aaaac 3 5atccaccctcccagtattgtcatgcgtatgaaaagtgatgatcgtaaccataacat tcct aacacagtgacaccttataaagattattcctttcatttttttttctgaggcaatt ggggt 3
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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular ________________________________________

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Lima, Abril de 2013

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