[REACCIONES DE PRECIPITACIN] Lab Inmuno 2012

LABORATORIO 2: DETECCIN DE ANTGENOS DE SUPERFICIE Y ANTICUERPOS CIRCULANTES

LUEGO DE LEER ESTE DOCUMENTO DE APOYO, RESOLVER EL CUESTIONARIO Y RECIBIR TU LABORATORIO VAS A ESTAR EN CAPACIDAD DE:

Describir el procedimiento y fundamento de una prueba de antiglobulina humana.

Definir, describir y correlacionar una EHRN. Realizar una prueba de Coombs indirecta y una directa.

INTRODUCCIN: GRUPO SANGUNEO, 4 DUMMIES

La sangre es un tejido vivo y complejo que contiene muchos tipos de clulas y de protenas. La sangre corre a travs de nuestro cuerpo llevando a cabo muchas funciones importantes, como transportador, regulador y defensor.

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PROTENAS Y GRUPOS SANGUNEOS Distintas molculas conocidas como aglutingenos (un tipo de antgeno) se encuentran adheridas a la superficie de clulas sanguneas. Existen dos tipos diferentes de aglutingenos, los tipo A y los tipo B. Cada tipo tiene propiedades distintas. El sistema de clasificacin sangunea ABO utiliza la presencia o ausencia de estas molculas para categorizar la sangre en cuatro grupos: Otro nivel de especificidad es adicionado al grupo sanguneo tras la evaluacin de la presencia o ausencia de la protena Rh. Cada tipo sanguneo es ya sea positivo + (posee la protena Rh) o negativo - (no protena Rh). Por ejemplo, una persona cuyo tipo sanguneo sea A positivo, tiene dos protenas en la superficie de sus eritrocitos, la de tipo A y la Rh.

EL GRUPO SANGUNEO ES GENTICO Las molculas A y B (antgenos) en la superficie de las clulas rojas son producidas por dos enzimas distintas. Estas dos enzimas se encuentran codificadas por distingas versiones, o alelos, de un mismo gen: A y B Los alelos A y B codifican para enzimas que producen los antgenos de tipo A y B respectivamente. Una tercera versin de este gen, el alelo O, codifica para una protena que no es funcional y no produce molculas de superficie. Dos copias de este gen son heredadas, una de cada padre. Las combinaciones posibles de los alelos producen tipos sanguneos de la siguiente manera:

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CUANDO LOS GRUPOS SANGUNEOS SE MEZCLAN El plasma sanguneo se encuentra lleno de protenas conocidas como anticuerpos. El cuerpo produce una gran variedad de anticuerpos que reconocen y atacan molculas extraas que entran al organismo desde el mundo exterior. El plasma de una persona generalmente no contiene anticuerpos que se unan a molculas que sean parte de su propio organismo. Cuando se realiza una transfusin sangunea, es importante que se compatibilice con extremo cuidado la sangre del donador y del receptor. Si las clulas sanguneas del donador poseen molculas de superficie distintas a las del receptor, los anticuerpos en la sangre del receptor reconocern esta sangre como extraa. Esto lanzar una respuesta inmune que resultar en coagulacin de la sangre. Si las clulas del donador poseen molculas de superficie iguales a las del receptor, el receptor no las ver como extraas y no montar una respuesta inmune. Existen dos tipos especiales de sangre cuando hablamos de transfusin de clulas sanguneas. Las personas con el tipo O son donadores universales porque no existen molculas en la superficie de las clulas rojas que disparen una respuesta inmune. Las personas con el tipo AB son receptores universales de clulas sanguneas porque no poseen anticuerpos que reconozcan las molculas de tipo A o B. Nota: las clulas sanguneas estn cubiertas de una gran variedad de molculas de superficie, para simplicidad en esta figura te muestro nicamente el tipo A y B.

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FENOTIPO RH
El Rh (Rhesus) es un sistema de clasificacin sangunea (incluye al factor Rh) es uno de los 30 sistemas de clasificacin sangunea. Clnicamente, es el grupo ms importante despus del ABO. Actualmente, el sistema Rh consiste de 50 antgenos de grupo, dentro de los cuales los antgenos D, C, c, E y e son los ms importantes. El trmino comnmente usado como factor Rh o Rh positivo o negativo, se refiere nicamente a la presencia o ausencia del antgeno D. Adems, de su papel en la transfusin sangunea, el grupo Rh es utilizado para determinar el riesgo de enfermedad hemoltica del recin nacido. Un individuo tiene o no tiene factor Rhesus en la superficie de sus clulas sanguneas. Este trmino se refiere estrictamente al antgeno ms inmunognico, el D. El estado se indica como Rh positivo (Rh+ si posee antgeno D) o Rh negativo (Rh- si no posee el antgeno D) como sufijoo del grupo sanguneo ABO. De cualquier manera, otros antgenos de estos grupos sanguneos son tambin de relevancia clnica. En contraste al grupo ABO, la inmunizacin contra el Rh se da generalmente a travs de transfusin sangunea o exposicin placentaria durante el embarazo.

TEST DE ANTIGLUBULINA HUMANA (TEST DE COOMBS)

Mientras que el entrecruzamiento de los antgenos proteicos multivalentes con el anticuerpo produce una precipitacin, la interrelacin entre clulas o partculas de gran tamao con los anticuerpos dirigidos contra los antgenos de superficie produce una aglutinacin. Dado que la mayora de las clulas poseen cargas elctricas, se requiere una cantidad razonable de anticuerpos entre dos clulas antes de que se supere la repulsin mutua. Es por esta razn, que es difcil lograr la aglutinacin de clulas que slo posean un nmero pequeo de determinantes, a menos de que se utilicen mtodos especiales, como el tratamiento adicional con un reactivo antiglobulina. De manera similar, la mayor avidez del anticuerpo multivalente IgM con respecto a la IgG hace que el primero sea ms eficaz como agente aglutinante, molcula por molcula. Mir la figura. Figura: Mecanismo de aglutinacin de partculas recubiertas por antgeno, por entrecruzamiento para formar grandes agregados macroscpicos. Si se utilizan glbulos rojos, se necesitan varios entrecruzamientos para vencer la carga elctrica en la superficie celular. La IgM es superior a la IgG como aglutinante, dado a su unin multivalente y a que las clulas con carga elctrica pueden estar ms separadas.

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TEST DE COOMBS DIRECTO Cuando los anticuerpos se unen a un eritrocito, no siempre provocan su aglutinacin. Esto puede ser el resultado de que la relacin antgeno/anticuerpo comprenda ya sea un exceso de anticuerpo o un exceso de antgeno o incluso, en algunos casos, las cargas elctricas en la superficie de los eritrocitos previene la unin o anclaje adecuado para que las clulas aglutinen. Estos anticuerpos que se unen a las clulas, pero no ocasionan la aglutinacin de los eritrocitos son conocidos como anticuerpos incompletos. Sin embargo esto no quiere decir que el anticuerpo sea distinto en su estructura, a pesar de que por un tiempo se crey esto correcto. Ms que eso, es nicamente una definicin funcional. Para lograr detectar la presencia de un anticuerpo que no aglutina a las clulas rojas, simplemente se debe aadir un anticuerpo secundario dirigido contra la inmunoglobulina (anticuerpo) adherida a las clulas rojas. Esta anti inmunoglobulina puede lograr que las clulas rojas se unan y prov ocar una aglutinacin. Mir la siguiente figura, esta es conocida como el Test de Coombs Directo.

TEST DE COOMBS INDIRECTO En el caso de ser necesario conocer si una muestra de SUERO posee anticuerpos dirigidos contra las clulas rojas de una persona y se desea asegurar que se detecten anticuerpos que no aglutinen, se debe realizar un test de Coombs indirecto. Este test se realiza incubando las clulas rojas junto a la muestra de suero, lavando y desuniendo cualquier anticuerpo que se encuentre unido al eritrocito y luego agregando un anticuerpo secundario (reactivo de anti inmunoglobulina) para lograr el anclaje de las clulas. Mir la figura.

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VISIN CLNICA: ENFERMEDAD HEMOLTICA DEL RECIN NACIDO

La enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN), o eritroblastosis fetal, es una condicin aloinmune que se desarrolla en un feto cuando molculas de IgG producidas por la madre atraviesan la placenta. Dentro de estos anticuerpos existen algunos que atacan las clulas rojas en la circulacin fetal; estas clulas son lisadas y el feto puede desarrollar reticulocitos y anemia. Esta enfermedad fetal vara de leve a severa, e incluso muerte fetal por falla cardaca (Hydrops fetalis). Cuando esta enfermedad es moderada o severa, muchos eritroblastos se encuentran presentes en la sangre fetal y por esto a veces es conocida como etitroblastosis fetal. La EHRN es caracterizada por la presencia de anticuerpos IgG en la circulacin materna, dirigidos contra un antgeno heredado por parte del padre que se encuentra presente en las clulas rojas del recin nacido y que ocasionan hemlisis en el feto. Estos anticuerpos logran cruzar la placenta y sensibilizan las clulas rojas del neonato para su posterior destruccin por parte de los macrfagos en el bazo. Los test serolgicos para el diagnstico de la EHRN incluyen un test de coombs directo positivo (DCT) en las clulas rojas del neonato y la presencia de anticuerpos contra clulas rojas en el suero materno. La EHRN ms severa es causada por anticuerpos IgG dirigidos contra los antgenos D, c o K en las clulas rojas sanguneas; sin embargo, cualquier anticuerpo IgG puede ocasionar EHRN.

CASO CLNICO
Paciente de 36 aos embarazada que concurri a nuestro laboratorio por presentar antecedentes obsttricos y transfusionales que indicaban un embarazo de riesgo. En el primer parto present complicaciones hemorrgicas que requirieron la transfusin de dos unidades de sangre. Su

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segundo embarazo fue normal, pero el recin nacido desarroll un cuadro de ictericia tratado con exanguinotransfusin, siendo muy difcil obtener sangre compatible. Posteriormente tuvo un embarazo ectpico con abundante prdida de sangre. La paciente no fue transfundida por no disponer de unidades compatibles. El cuarto embarazo se interrumpi por un aborto espontneo. Durante el quinto embarazo se estudi en nuestro laboratorio. La paciente tipificada de grupo sanguneo O RhD negativo, present un aloanticuerpo de ttulo 16 y con la prueba de la antiglobulina indirecta positiva. Estudios posteriores demostraron que era un anticuerpo reactivo a 37 C, de clase IgG y no fijador de complemento. Estudios confirmaron que los gbulos rojos de la embarazada presentaban una delecin de estos antgenos. Debido a las caractersticas complejas de este aloanticuerpo y considerando la posibilidad que la madre o el recin nacido requirieran una transfusin sangunea se propuso un plan de transfusin autloga.

CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Investig y defin todos los trminos que se encuentran en rojo. Investig los parmetros hematolgicos y bioqumicos de un neonato normal. Respecto al caso clnico, cul es el principal riesgo del neonato? Explic brevemente cmo se da la sensibilizacin (produccin de anticuerpos anti D) en una persona Rh-. Enumer los principales hallazgos hematolgicos que encontrars en el neonato en caso de sufrir EHRN. Justific tu respuesta. Por qu se le solicit a la madre una donacin autloga? Qu tipo de sangre se le debe transfundir al neonato en caso de que se requiera una exanguinotransfusin? Justific tu respuesta. Realiz un diagrama de flujo de la parte prctica.

PARTE PRCTICA
Finalmente lleg la hora del parto, los datos son los siguientes: El nonato naci luego de 38 semanas de gestacin y peso 2.8Kg. l bebe presento ictericia moderada con signos vitales normales al da de nacido; no exista evidencia que sugiriera otra causa de ictericia neonatal como infeccin intrauterina y su tamizaje de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa

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era normal. Los laboratorios mostraron que su bilirrubina total era de 198 umol/L y la hemoglobina de 19 g/dL. El Materiales: Gradilla Tubos de ensayo Pipeta pasteur grupo sanguneo del neonato era O RhD positivo. Se realiz un Coombs directo. A la madre se le realiz un test de Coombs indirecto. COOMBS DIRECTO: 1. Preparar una suspensin al 2% en solucin salina normal de las clulas probadas. 2. Agregue dos gotas de la suspensin de las clulas preparadas a un tubo de 13 x 75mm. 3. Lavar con solucin salina y centrifugue a 3500 r.p.m. durante 1 minuto. Efecte este lavado tres veces. 4. Despus del ltimo lavado, decante lo ms posible. 5. Agregue dos gotas de suero anti-humano 6. Mezcle bien y centrifugue por 1 minuto a 1500 r.p.m. por 15 segundos. 7. Resuspenda los eritrocitos de los tubos y examine el resultado. Centrfuga Interpretacin: La aglutinacin de los eritrocitos del paciente, por el anti-humano, indica que estos se encontraban sensibilizados por anticuerpos. PRUEBA INDIRECTA DE COOMBS: 1. Prepare una suspensin al 2% en solucin salina normal de las clulas seleccionadas para la prueba. 2. Agregue dos gotas del suero que va a probarse a un tubo de Khan. 3. Agregue dos gotas de la suspensin de las clulas preparadas, al tubo Khan 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Agregue dos gotas de albmina bovina solucin al 22% al tubo Incube en un bao mara a 37C por 15 minutos. (la incubacin puede prolongarse hasta 60 minutos si se desea). Saque el tubo del bao mara, llnela con solucin salina fresca, centrifugue a 3500 r.p.m. durante 1 minuto y decante. Lvese tres veces. Despus del ltimo lavado, decante lo ms posible. Agregue dos gotas de suero Anti-humano y mezcle bien. Centrifugue por 1 minuto a 1500r.p.m. durante 15 segundos. Resuspenda los eritrocitos con una agitacin moderada y examine el resultado.

Equipo:

Cronmetro
Termmetro Guantes Eppendorf Reactivo de Coombs

Incubadora

Muestra: Eritrocitos Suero