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RESUMO

Injeo de pilocarpina induz convulses epilpticas em roedores, um paradigma experimental amplamente utilizado para modelar epilepsia de lobo temporal em seres humanos. Ele inclui a morte neuronal evidente no trabalho anterior do crebro anterior e demonstrou um envolvimento da neurotrofina p75NTR receptor neste processo. Aps a identificao da galectina-1 (Gal-1) como um efetor a jusante de p75NTR, ns aqui examinar o papel desta lectina endgena na morte celular induzida por pilocarpina nos ratos. Encontramos adulto que mais somatostatina positivos neurnios tambm expressa a Gal-1 e que, em ratinhos sem o gene correspondente Lgals1, a morte neuronal induzida por pilocarpina foi essencialmente abolida na parte frontal do crebro. Descobrimos tambm que a lectina relacionada galectina3 (Gal-3) foi fortemente regulada pela pilocarpina em clulas da micrglia. Esta supra regulao estava ausente em Lgals1 mutantes e os nossos resultados com animais LGALS3 nulos mostram que a Gal-3 no necessria para a morte neuronal no hipocampo. Estes resultados fornecem novos insights sobre os papis e regulao das lectinas endgenas do adulto CNS e um papel pr-apopttica surpreendentemente seletiva de Gal-1 por uma subpopulao de interneurnios GABArgicos.

Introduo
A morte neuronal uma caracterstica significativa da epilepsia temporal os seres humanos, uma condio freqente, que pode ser til modelado em roedores por injetar o receptor agonista muscarnico pilocarpina (Curia et al., 2008). Como na epilepsia temporal pilocarpina induzindo convulses causar a morte das clulas e reduzir o nmero de interneurnios parvalbumina-positivas e somatostatina-positivo em o giro denteado de roedores, o que explica a inibio reduzida em clulas granulares (Kobayashi e Buckmaster, 2003). No que diz respeito a conhecimentos mecanicistas, tem sido relatado que, no hipocampo, o crtex entorrinal, e o crtex piriforme, pilocarpina induz a expresso elevada do receptor de neurotrofina p75NTR (Roux et al., 1999), uma molcula associada com a morte celular na sistema nervoso, tanto durante o desenvolvimento e em uma variedade de Patologias do SNC adulto (Dechant e Barde, 2002). Alm disso, morte celular demonstrou-se estar significativamente reduzida em animais carentes p75NTR (Troy et al., 2002) por mecanismos que envolvem a o p75NTR interactor neurotrofina receptor-interagindo fator (FNIR) (Volosin et al., 2008). Usando neurnios gerados a partir de clulas-tronco embrionrias de engenharia (Bibel et al., 2004), mostraram previamente que a galectina-1 (Gal-1) um efector a jusante de p75NTR, o que desencadeia a desintegrao dos axnios e celulares morte (Plachta et al., 2007). Gal-1 uma protena de 14 kDa que pertence ao uma famlia de lectina multimember com afinidade para pores-galactsido presentes numa vasta gama de glicoprotenas da superfcie celular (Barondes et ai., 1994). O seu papel reportado no sistema nervoso complexo e inclui ambos os efeitos positivos e negativos sobre neurognese, a sobrevivncia de clulas, e elongao axonal (para uma recente rever, ver Sakaguchi e Okano, 2012). Aqui vamos avaliar o papel de Gal-1 em convulses induzidas pela pilocarpina utilizando camundongos sem Lgals1.We tambm examinar o potencial envolvimento de galectina-3 (Gl-3), aps a constatao de que a pilocarpina tambm aumenta os nveis desta lectina no crebro.

Materiais e Mtodos
Estado de mal epilptico induzido pela pilocarpina e sees do crebro. Todas as experincias com animais foram aprovados pelas autoridades veterinrias locais que regulam experimentao animal, em Basileia. Camundongos adultos de trs meses de idade, de ambos os sexo foram injectadas com escopolamina metilo (1 mg / kg, ip) e 30 min depois com cloridrato de pilocarpina (320 mg / kg, ip). Os ratinhos foram do tipo selvagem C57BL/6J,

Lgals1? /? sobre um fundo C57BL/6J, ou LGALS3? /? sobre um fundo C57BL/6J. O comportamento animal foi gravado para a prxima 2 h (Morrison et al., 1996), e, em seguida, os animais foram injectados com diazepam (10 mg / kg) para parar as convulses. Os ratinhos de controlo receberam o mesmo tratamento, excepto que eles foram injectados com soro fisiolgico (0,9% NaCl em H2O, i.p.) em vez de pilocarpina. Os animais foram injectados subcutaneamente com uma soluo de Hartman (NaCl 130 mM, KCl 4 mM, 3 mM CaCl, 28 mM lactato), durante o perodo de recuperao. Apenas ratos, atingindo um nvel de crise 5-6 (Morrison et al., 1996) foram includos na anlise. Fluoro-JadeB Neurnios (FJB)-positivos foram detectados em todo o tipo selvagem pilocarpine injected ratinhos. Vinte e quatro ou 72 horas aps a injeco de pilocarpina, os animais foram profundamente anestesiados (cetamina 100 mg / kg, 0,2% Rompun, ip) e transcardially perfundidos primeiro com PBS arrefecido com gelo e seguido por PFA a 4% em PBS. Os crebros foram removidos e ps-fixados durante 1-2 h na mesma soluo de fixao, cryoprotected com sacarose a 30%, embebidos em outubro (Optimal composto temperatura de corte) e gelo seco congelado. Serial cortes coronais (30? m) foram coletadas usando uma Leica 3050S criostato montadas em lminas de microscpio revestidas com laminina e armazenado a? de 70 C. Figura 1. A morte neuronal induzida pela epilepsia bloqueada no Lgals1 mutantes. A, colorao FJB mostrando os neurnios da degenerao em diferentes reas do crtex cerebral e no hipocampo, em camundongos selvagens injetada com uma soluo salina e em animais do tipo selvagem ou Lgals1 mutante injetados com pilocarpina. B, a quantificao do nmero total de neurnios FJB-positivas no crtex e hipocampo dos animais injetados, por 30m seo. Barra de escala, 200 m. Figura 2. A ausncia de morte celular programada em ratinhos mutantes Lgals1 aps convulses induzidas por pilocarpina. A, colorao TUNEL do crtex parietal, comparando ratinhos de tipo selvagem e mutante Lgals1 24 h depois da injeo de pilocarpina. Barra de escala, 100? Mb, quantificao de clulas TUNEL-positivos no crtex parietal. C, Coimmunostaining para NeuN e activo caspase-3 no crtex parietal. Barra de escala, 100 m. D, a quantificao da proporo NeuN positivo neurnio tambm positivo para ativa caspase-3 colorao. E de localizao de ativo da caspase-3 e Gal-1 na CA1 do hipocampo sequncia convulses induzidas pela pilocarpina. Barra de escala, 50 M. Figura 3. Degenerao provocada por injeo de pilocarpina paralelo ao padro de Gal-1 expresso em conditions.D basal, Inthe crtex parietal, thenumberof neurnios expressando Gal-1 diminui 24 e 72hafter induzido pela pilocarpina induzir crises .Scalebars: A, C, F, 200 m, D, 100 MNS, no estatisticamente significativa Figura 4 Neurnios Gal-1-positivos so tambm somatostatina positivo. A, co-localizao de Gal-1 neurnios positivos e somatostatina-positivo (asteriscos) no hipocampo de ratinhos de tipo selvagem. Note-se que os neurnios somatostatina ainda esto presentes no hipocampo de Lgals1? /? ratinhos. B, A maioria (setas), mas no todos (ponta de seta), os neurnios paravalbumin-positivos no expressam a Gal-1 (asteriscos). Figura 5. Gal-1 aumenta a expresso em astrcitos 72 h depois de convulses epilpticas. Um, Coimmunostaining para a Gal-1 e GFAP no crtex piriforme. B, a quantificao do nmero Gal-1 de clulas positivas tambm positivas para GFAP no crtex cerebral e o hipocampo. Barra de escala, 100 M.

Figura 6. Glia reactividade bloqueado em ratinhos mutantes Lgals1 aps a injeco com pilocarpina. Um, imunomarcao especfica de astrcitos GFAP no crtex cerebral e no hipocampo, comparando-tipo selvagem e ratinhos mutantes Lgals1, 24 e 72 h aps a injection.B, imunocolorao CD11b especfica Microglia no crtex cerebral e no hipocampo nos ratinhos de tipo selvagem vs Lgals1 mutante de 24 h aps a injeco. Barra de escala, 200 M.

Colorao (Millipore Reagentes Bioscience Research), conforme descrito anteriormente (Schmued e Hopkins, 2000). Sees do crebro foram visualizados sob axioplan2 microscpio Zeiss epi-fluorescncia e posterior anlise utilizando o software Photoshop. TUNEL. TUNEL (desoxinucleotidil-transferase terminal mediada UTP nick final rotulagem) foi realizada utilizando o na morte celular Situ Detection Kit, TMR vermelho (Roche), seguindo as instrues do fornecedor. Consecutivo cortes coronais de todo o crebro (30 m;?? 1,82-2,18 hum posterior ao bregma) foram rotuladas e visualizados sob um axioplan2 Zeiss epifluorescncia microscpio. Imuno-histoqumica. Cortes coronais seriados foram processados para imuno-histoqumica. As seces foram lavadas em PBS, permeabilizadas por incubao em PBS contendo 0,2% de Triton X-100, e bloqueadas com Soro de cavalo inactivado a 10%, exceto para a colorao p75NTR examinado sob condio nonpermeabilizing omitindo o Triton X-100. As fatias Foram em seguida incubadas durante a noite a 4 C com os anticorpos primrios. usamos Cabra anti-Gal-1 em 1:500 (R & D Systems), cabra anti-Gal-3 em 1:1000 (R & D Sistemas), rato anti-NeuN a 1:200 (Millipore), coelho anti-p75NTR em 1:500 (Millipore Reagentes Pesquisa Bioscience), rato anti-ativo anticaspase- 3 a 1:100 (Millipore), rato anti-GFAP em 1:1000 (Sigma- Aldrich), de coelho anti-parvalbumina 1:200 (Swant), de coelho anti-somatostatina em 1:200 (Immunostar) e rato anti-CD11b (Abcam). Aps lavagens, secundrio Anticorpos fluorocromo-conjugados (1:500; Jackson Laboratory) Foram aplicados durante 1 h temperatura ambiente. Os cortes foram montados e as imagens coletadas em cada uma Zeiss axioplan2 epi-microscpio de fluorescncia ou em um laser confocal Leica SP1 microscpio confocal e processado e analisados usando o software Photoshop. A anlise dos dados. Todos os resultados aqui apresentados correspondem mdia do Quantificaes estabelecido para cada condio experimental (3-6 sees por animal e 3 ou mais animais para cada ponto de tempo). A variao entre os animais, como indicado e analisadas por SEM desemparelhado O teste t de Student. Um intervalo de confiana de 95% foi utilizado e os valores de p 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos. As mdias foram considerados significativamente diferentes de acordo com o valor de p indicado com a seguinte smbolos: * p? 0,05, ** p 0,01 e *** p 0.001. Clculos e Anlise estatstica foi feita com Excel e GraphPad Prism 4.0.

Resultados
Injeco de pilocarpina em ratinhos mutantes Lgals1 Camundongos sem Lgals1, o gene que codifica a Gal-1, no mostram qualquer fentipo evidente (Poirier e Robertson, 1993), e no foi encontrada diferena entre animais de tipo selvagem e mutante da indutibilidade e severidade das convulses desencadeadas por pilocarpina sistmica injeco (dados no mostrados). A morte neuronal no prosencfalo foi quantificados com colorao FJB em dois momentos diferentes aps injeco de pilocarpina. Aps injees de soluo salina no tipo selvagem animais, encontramos 1,0? 1.0 e 1.4? FJB 1,8 neurnios positivos aps 24 h, no hipocampo e no parietal e piriforme crtex, respectivamente, e nenhum aps 72 h (Fig. 1A, B). Vinte e quatro horas aps a injeco de pilocarpina, havia 1035? 17 e

3228? 66 neurnios FJB-positivas no hipocampo e as crtex, respectivamente. Aps 72 h, as contagens foram 510? 82 e 2977? 127 nas mesmas estruturas, o que sugere que muitos neurnios propensas morte aps a injeo de pilocarpina j tinha morrido Figura 7. p75 NTR abundante em Lgals1 ratos mutantes aps a injeo de pilocarpina. A, p75 NTR imunocolorao no crtex parietal e hipocampo, comparando de tipo selvagem e mutante Lgals1 ratinhos, 24 horas aps a injeco. Barra de escala, 200? M. B, p75 NTR expressa nos neurnios Gal-1-positivas (asterisco) 24 h aps a injeco de pilocarpina no hipocampo (setas). Figura 8. Gal-3 expressa em clulas microgliais aps crises epilpticas, mas no em ratinhos Lgals1 mutantes. Coimmunostaining para Gal-3 e CD11b no crtex parietal. Barra de escala, 100 M.

Discusso
Os nossos resultados revelam que a Gal-1 desempenha um papel essencial na neurodegenerao processo desencadeado no crebro anterior seguinte administrao sistmica de pilocarpina. Gal-1 expressa predominantemente por interneurnios somatostatina-positiva e necessria para sua morte durante as crises. Por outro lado, a morte celular apenas marginalmente reduzido em animais que faltam Gal-3, e s no cerebral crtex, no hipocampo no, apesar de uma forte expresso de Gal-3 em todo o prosencfalo por clulas microgliais na sequncia pilocarpina injeo. A galectina-1 e a morte celular Gal-1 conhecida por induzir a morte de clulas no sistema imunitrio e para regular homeostase das clulas T durante o desenvolvimento no timo, bem como depois da sua ativao na periferia (Perillo et ai, 1995,. Rabinovich et al, 2007).. Por outro lado, ainda muito pouco conhecido sobre o papel das galectinas no sistema nervoso do rato, que parece desenvolver-se sem alteraes macroscpicas na ausncia tanto Gal-1 e Gal-3. Alm disso, camundongos sem os genes so frteis e no apresentam qualquer fentipo evidente. Aps um exame mais atento, animais constitutivamente falta Gal-1 mostra alteraes discretas nas projees de axnios olfativos (Puche et al., 1996) e em subconjuntos de aferentes sensoriais (McGraw et ai., 2005). Anterior Relatrios tambm notar-se que a Gal-1 pelas clulas de expresso de GFAP-positivos promove a proliferao basal e induzida por cainato neuronal progenitores no hipocampo (Sakaguchi et al, 2007;. Sakaguchi e Okano, 2012) e de recuperao aps acidente vascular cerebral (Ishibashi et al., 2007). Por outro lado, os nossos resultados preliminares indicaram que a Gal-1 promove causada pela degenerao axonal p75NTR superexpresso e que participa da morte celular excitotoxic seguindo ibotnico injees de cido em ratos, um tratamento que tambm inclui a regulao positiva de p75NTR (Plachta et al., 2007). No fcil neste momento para conciliar estes resultados um pouco diferentes. Eles podem, em parte, resultar do facto de Gal-1 interage com um nmero de membrana glicoprotenas, bem como com as molculas de matriz extracelular matriz (Camby et ai., 2006). Alm disso, a Gal-1 expresso apenas no prosenceflicas por uma pequena populao de neurnios maior parte correspondentes para interneurnios somatostatinapositivos, que uma subpopulao essencialmente eliminada durante o curso de convulses provocadas pela injees de pilocarpina. Este funcionalmente interessante como a perda de neurnios inibitrios foi anteriormente sugerida para ser parte de fisiopatologia da apreenso no roedor giro denteado (Kobayashi e Buckmaster, 2003).Os mecanismos pelos quais a Gal-1 mata os neurnios que expressam esta lectina permanecem obscuros e, dado o nmero de molculas que expressam metades?-galactoside, uma compreenso mais profunda destes mecanismos pode no ser simples. Na verdade, no mesmo claro como Gal-1 atinge a superfcie da clula, uma vez que no tem o caractersticas de uma protena secretora (Vasta, 2012). Embora seja concebvel que a Gal-1 pode actuar intracelularmente, no nosso anterior observaes in vitro indicam que acessvel a extracelular Os reagentes como a actividade de morte da Gal-1 pode ser impedida pela Alm dos anticorpos, ou de excesso de galactose em

clulas cultivadas (Plachta et al., 2007). Os resultados tambm indicam que a expresso de Gal-1 no est limitada aos neurnios. Aps a injeco de pilocarpina, a maioria dos astrcitos se fortemente imunorreativas para Gal-1, embora este um processo relativamente tardia, atingindo concluso 72 h aps a iniciao apreenso, significativamente mais tarde do que o aparecimento da morte neuronal. Alm disso, este aumento de atraso no causa a morte de astrcitos reativos. De facto, o nmero de clulas GFAP-positivos aumenta marcadamente, s 72 horas (Figuras 5, 6A) e, como observado em muitos modelos experimentais de leso cerebral (Barres, 2008), este astrocitrios reaco pode ser uma consequncia, em vez de um motivo, dos neuronal morte e no observado em Lgals1 mutantes depois pilocarpina injeco (Fig. 6) Convulso induzida por pilocarpina, Gal-3, e p75NTR Gal-3 est intimamente relacionado com a Gal-1, e tambm foi mostrado para provocar a morte de clulas T ativadas, ainda que por meio da ativao de superfcie celular Os receptores que diferem daqueles usados por Gal-1 (Stillman et al., 2006). Descobrimos que, embora exista muito pouca expresso em 3 Gal- o SNC, em condies de controlo, as clulas microgliais tornar fortemente positivas para a Gal-3 aps a pilocarpina. No entanto, este um processo que estritamente dependente da Gal-1 (Fig. 8). A concluso Gal-3, que expressa por clulas microgliais aps a injeco de pilocarpina est de acordo com os resultados publicados recentemente por Lalancette- He'bert e colegas (2012). Depois da artria cerebral mdia ocluso, Gal-3 foi encontrado para ser marcadamente regulado positivamente em Iba-1clulas positivas utilizadas como marcadores da microglia. Em LGALS3 mutantes, esta lectina tambm mostrou-se necessria para a ativao da microglia e proliferao aps a isquemia. No entanto, neste paradigma, a falta da Gal-3 tambm correlacionada com o aumento da morte celular, que foi aumentada por? duas vezes aps ocluso da artria temporria (Lalancette- He'bert et al., 2012). Isto muito diferente do que observamos no paradigma de convulso induzida por pilocarpina: existe uma modesta diminuio da morte celular no crtex do mutante com LGALS3 nenhuma alterao no hipocampo (Fig. 9). Aparentemente, portanto, a papel de Gal-3 no sistema nervoso central patologias tambm depende do tipo de leso infligida com isquemia susceptvel de gerar muito mais elevado nveis de morte celular no crebro, em seguida, crises convulsivas localizadas de curta durao. Enquanto que o papel funcional da Gal-3 expressa por micrglias aps convulses ainda no est claro, poderia ser relacionado com a fagocitose de neurnios mortos ou detritos celulares resultante da morte neuronal. Esta hiptese tambm apoiada pelo padro de Gal-3 e de expresso neuronal degenerao (Fig. 9), e a observao de que alguns Gal-3- micrglias positivos foram observados para engolfar os neurnios moribundos (Dados no apresentados). Notamos que no perifrico lesionado sistema nervoso, Gal-3, ento conhecida sob o nome da MAC-2 antignio, foi sugerida no incio para facilitar a remoo remoo de detritos de axnios lesionados e, assim, promover axonal regenerao (Rotshenker, 2011). No nosso paradigma experimental apreenso, Gal-1 parece ser um preditor mais precisa da morte celular do que como muitos mais p75NTR clulas expressam este receptor pan-neurotrofina e sobreviver pilocarpina injeo que o caso para os neurnios que expressam tanto p75NTR e Gal-1. Alm disso, a morte neuronal induzida por pilocarpina essencialmente abolida no Lgals1 mutante enquanto uma proporo de neurnios ainda morrem em mutantes que faltam p75NTR (Troy et al., 2002). Em Lgals1 mutantes injetados com pilocarpina, p75NTR superexpresso no parece ser marcadamente reduzida, o que sugere que a Gal-1 no necessria para a expresso deste receptor e que a superexpressop75NTR sozinho no um indicador fiel do neuronal morte. Em concluso, nossos resultados demonstram que a Gal-1 desempenha uma chave papel na morte de interneurnios no seizureinducing pilocarpina modelo, trazendo novas perspectivas para o entendimento da neurodegenerao causada pela atividade neuronal excessiva. Interferente com a atividade da Gal-1 na epilepsia temporal pode ento representam uma nova possibilidade de reduzir a perda de neurnios em humanos. Isto de especial interesse,