PRCTICA N 2 FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMTICA INTRODUCCIN La determinacin de la actividad de una enzima consiste en averiguar cuanto de enzima activa

hay en una muestra, esta se expresa en Unidades de actividad enzimtica "U" principalmente, en Katales, como numero de recambio o como actividad especifica, dependiendo de la enzima y de las caractersticas del trabajo. Las Unidades de actividad enzimtica (U) vienen a ser los moles de sustrato transformados por minuto, bajo condiciones adecuadas y estrictamente controladas de pH y temperatura. Los Katales por su parte, son los moles de sustrato transformados por segundo, tambin bajo condiciones adecuadas de pH y temperatura; estas unidades de expresin de la actividad son utilizadas para enzimas o muestras enzimaticas muy activas. El nmero de recambio viene a ser el nmero de molculas de sustrato transformadas por una sola enzima (o un solo centro activo), en un segundo, esta forma de expresin es tambin para enzimas de alta actividad. La actividad especifica son las Unidades de actividad enzimtica por miligramo de protena, esta unidad es utilizada en procesos de purificacin de enzimas. Algunas veces es imposible utilizar alguna de estas formas de expresar la actividad enzimtica, al hacer la evaluacin de una enzima; esto ocurre cuando el sustrato es un polimero cuyo pero molecular es variable, como en el caso del almidn, el glucgeno, la quitina, la celulosa, etc., en donde no hay manera de determinar en molaridad el sustrato transformado, ya que no existe un peso molecular definido del mismo, al inicio de la reaccin. En tal sentido, se puede hacer la medida de una consecuencia de la accin de la enzima. A continuacin presentamos algunos ejemplos: ENZIMA Proteasas METODOLOGA Capacidad para coagular la leche. Liberacin de algn aminocido especifico. Accin sobre pelculas fotogrficas. Prdida de la capacidad de formar complejos de color yodo amilasa. Disminucin de la viscosidad inicial. Incremento del poder reductor. Capacidad para clarificar jugo de manzana. Disminucin de la viscosidad inicial. Incremento en el poder reductor. Disminucin del precipitado alcohlico del medio de reaccin

Amilasas

Pectinasas

Al hacer la determinacin de la actividad de una enzima, si no existe especificacin sobre las condiciones de la determinacin, muchas veces el trabajo requiere el establecerlas previamente. En tal sentido, se debe conocer perfectamente la reaccin qumica catalizada por la enzima en prueba; el sustrato o sustratos que participan, el producto o productos formados, la necesidad o no de cofactores, participacin de moduladores, condiciones de pH, temperatura y fuerza inica apropiadas, as como el valor de la KM, el cual nos permite saber cuanto de sustrato debemos utilizar para garantizar que estamos en una reaccin de orden cero, por lo menos el intervalo de tiempo que dura la medida de la actividad de la enzima. El siguiente problema por resolver, es la decisin sobre qu es ms conveniente medir, si el consumo de sustrato, la formacin de producto o alguna modificacin del cofactor, lo cual va a depender de 4 factores fundamentalmente, la precisin, la sencillez, la rapidez y el costo del mtodo de determinacin. Est en el investigador en enzimas decidir que es lo ms conveniente para su trabajo. Para expresar los resultados obtenidos en alguna de las unidades de medida propuestas, es fundamental realizar una curva de calibracin, para cualquiera de los mtodos de determinacin de actividad empleado; por esta razn en la presente practica, vamos a elaborar las curvas de calibracin para el mtodo qumico de ureasa desarrollado en la prctica 1 y la curva de amilasas utilizando como sustrato almidn de papa. OBJETIVOS: 1. 2. 3. 4. Que el alumno aprenda a elaborar una curva de calibracin. Que el alumno determine el intervalo de validez del mtodo empleado. Que el alumno sepa calcular y utilizar el factor de calibracin. Que el alumno sepa expresar sus resultados en alguna de las unidades de expresin propuestas.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO 1 DETERMINACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN DEL REACTIVO DE NESSLER EN LA CUANTIFICACIN DEL AMONIO Procedimiento En diez tubos de ensayo prepare soluciones acuosas de sulfato de amonio SO4(NH4+)2, las cuales contengan equitativamente entre 0,1 y 2 micromoles de la sal; a partir de una solucin madre de concentracin 5 x 1O-4M. Complete con agua destilada cada tubo hasta hacer un volumen final de 4,5ml (con la mxima precisin posible), mezclar bien. Aadir a cada tubo 0,5 ml de reactivo de Nessler y mezclar. Esperar diez minutos a temperatura ambiente y luego leer en el espectrofotmetro a una

longitud de onda de 420 o empleando filtro azul. Nota: no olvide considerar un blanco y asimismo, descarte todo tubo que no sea totalmente transparente. Resultados Coloque en la siguiente tabla los resultados obtenidos: Ttulo: ________________________________________________________________
ml de sulfato de amonio ml de H2O moles de SO4(NH4+) Absorbancia neta moles de amonio moles de urea

Absorbancia

Blanco: _______________ En el siguiente espacio, pegue el papel milimetrado donde a graficado moles de urea vs Absorbancia neta:

INTERROGANTES 1. Entre qu concentraciones de amonio la curva cumple con la ley de Lambert y Beer?

2. Calcule el Factor de calibracin promedio, para urea:

__ FC = _______________ EXPERIMENTO 2 ELABORACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN PARA EL FERRICIANURO DE POTASIO EN LA CUANTIFICACIN DE MALTOSA Fundamento El ferricianuro en presencia de carbonato de sodio concentrado es muy sensible a la reduccin a ferrocianuro, por pequeas cantidades de azcares reductores; por esta razn, es utilizado como mtodo qumico en determinaciones enzimticas de hidrlisis de polisacridos. Su utilidad se debe a que mientras est oxidado es de color amarillo y cuando se reduce se vuelve transparente. Procedimiento Preparar 6 tubos de ensayo que contengan entre 0,01 y 0,18 mg de maltosa (se emplea este azcar reductor porque es el principal producto de las amilasas que estudiaremos posteriormente, sobre el almidn; se debe preparar la curva de calibracin con el azcar reductor que se forme durante la catlisis, pues cada uno de ellos tiene distinto comportamiento). Completar con agua destilada hasta un volumen final de 1,5 ml. Adicionar a cada tubo, 2 ml de reactivo de color (0,5g de ferricianuro de potasio en un litro de carbonato de sodio 0,5M). Cubrir cada uno de los tubos con un trozo de papel aluminio (sin estropearlo), para evitar el ingreso del oxgeno, el cual puede reoxidar al ferrocianuro cuando este, est a altas temperaturas Llevar los tubos a bao mara hirviente por exactamente 15 minutos. Enfriarlos, luego descubrirlos y leer sus absorbancias a 420 nm (o filtro azul). Considerar que el color es estable entre 10 a 30 minutos. Preparar adicionalmente un tubo blanco con 1,5 ml de agua destilada o el buffer que se emplear en las determinaciones enzimticas, y 2 ml del reactivo. Una buena lectura para el

blanco es de 0,850; si no es as, es que est fallando el cromgeno o la sensibilidad del espectrofotmetro. Resultados Coloque en la siguiente tabla sus resultados: Ttulo: ________________________________________________________________ ml de maltosa _________ ml de agua destilada mg de maltosa Absorbancia Absorbancia neta

Blanco: ____________ A continuacin plotee mg de maltosa vs Absorbancia neta en papel milimetrado y pguelo en el espacio siguiente:

INTERROGANTES 1. Cul es el rango de utilidad del reactivo para maltosa?

2. Calcular el factor de calibracin promedio, para miligramos de maltosa:

___ FC = _______________ INTERROGANTES: 1. Cul de los dos mtodos es ms conveniente? Por qu?

2. Exprese los resultados del experimento 1 de la prctica 1 en unidades de actividad enzimtica (U) TUBOS Absorbancia neta Actividad enzimtica (U) 3. Cul sera la unidad de expresin de la actividad enzimtica en el experimento 2 de esta prctica? 1 2 3 4 5

4. Cmo se usa el factor de calibracin promedio? Cul es su beneficio?

5. Qu importancia tiene la elaboracin de un mayor nmero de estndares en estos mtodos?

6. Escriba las frmulas del ferricianuro y del ferrocianuro:

PRCTICA N 3 MTODOS EXPERIMENTALES DE PARMETROS CINTICOS INTRODUCCIN Los bioqumicos alemanes Leonor Michaeles y Maud Menten el ao 1913 propusieron por primera vez la ecuacin que hoy lleva su nombre: vo = Vmx [S] Ks + [S] Esta es la misma que la ecuacin propuesta por Henri el ao de 1903, pero sustentada con ms solidez, pues por primera vez se emple el trmino velocidad inicial (vo). Esta tena el inconveniente de considerar a la constante de velocidad K2 , con un valor mucho menor que K-1, lo cual es solo vlido para algunas enzimas. Posteriormente en 1925 Briggs y Haldane mejoraron el concepto, considerando a la constante K2 de un valor igual o mayor que K-1, con lo cual aparece el principio del estado estacionario, propio de la mayora de enzimas. El trabajo de Michaelis y Menten fue tan importante para entender el comportamiento de las enzimas, que la ecuacin en su actual concepcin lleva su nombre y la constante que considera, toma esa abreviacin en honor a ellos: vo = Vmx [S] KM + [S] El gran inconveniente de esta ecuacin es que la velocidad mxima no es un valor real, pues por definicin de hiprbola rectangular, que es la grfica de sta expresin matemtica, se entiende que Vmx solo se alcanzar en el infinito. Por esta razn algunos aos despus, empezaron a aparecer en los trabajos de investigacin sobre enzimas, un gran nmero de ecuaciones que resolvan este problema. Dentro de ellas cabe destacar las siguientes:

Ecuacin de Lineweaver-Burk o ploteo de los inversos: 1 = KM vo Vmax 1 [S] + 1 Vmax

Ecuacin de Eadie-Hoffstee: vo = -KM vo [S]

+

Vmax

Ecuacin de Hanes: [S] = 1 [S] + KM vo Vmax Vmax

Ecuacin de Eisenthal y Cornish-Bowden: Vmax vo = KM [S] + 1

A pesar que estos mtodos son difundidos por los especialistas en cintica enzimtica, el mtodo de Lineweaver-Burk es el ms ampliamente empleado; lo importante es obtener buenos resultados experimentales que cubran un amplio rango de concentraciones de sustrato, seleccionadas de modo que se encuentren homogneamente distribuidas en el grfico. Seleccin de las concentraciones de sustrato: Se piensa siempre que los ensayos enzimticos se deben ejecutar a altas concentraciones de sustrato (mayores que la KM), porque se obtienen velocidades constantes por mas tiempo de incubacin; pero tambin hay desventajas como la que, slo una pequea cantidad del total del sustrato, se est utilizando en ese instante; esto es derrochador y costoso cuando el sustrato usado es caro. Asimismo, el sustrato a altas concentraciones puede actuar como inhibidor de la enzima. Por esta razn es recomendable hacer las determinaciones a concentraciones de sustrato en las inmediaciones de la KM; por esta razn, se emplea como criterio de seleccin la siguiente frmula: vo2 / [S]; y se toman en cuenta los valores ms altos de esta relacin. PARTE EXPERIMENTAL En la presente prctica se exponen resultados experimentales de una enzima pero en condiciones ideales: [S] (mM) 1000 100 10 5 2 1 0,5 0,2 0,1 0,01 0,001 vo (mol/min) 10 9,9 9,1 8,3 6,7 5,0 3,3 1,67 0,91 0,099 0,010 vo2 / [S]

Seleccione de estos datos solo 7, luego de calcular para cada uno el valor de vo2/[S]

Los siete datos seleccionados colquelos en la siguiente tabla y haga los clculos que la misma le exige:

[S] (mM)

vo (mol/min )

1/[S]

1 vo

vo [S]

[S] vo

Una vez completada la tabla, en hojas de papel milimetrado, haga las grficas de MichaelisMenten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hoffstee, Hanes y Eishental-Cornish y adjntelas al informe. Calcule los valores de KM y Vmax en cada una de ellas, tanto usando las respectivas frmulas, como grficamente.

INTERROGANTES 1. Cul de los mtodos permite graficar ms fcilmente los resultados? Por qu?

2. Con cul de los mtodos se calcula ms fcilmente Vmax y KM? Explique

3. Cul de los mtodos manifiesta mejor los errores experimentales? Por qu?