Coenzimas NAD+ y NADH La nicotinamida adenina dinucletido (abreviado NAD+, y tambin llamada difosfopiridina nucletido y Coenzima I), es una

coenzima que se encuentra en todas las clulas vivas. El compuesto es un dinucletido, ya que consta de dos nucletidos unidos a travs de sus grupos fosfato con un nucletido que contiene un anillo adenosina y el otro que contiene nicotinamida. En el metabolismo, el NAD+ participa en las reacciones redox (oxidorreduccin), llevando los electrones de una reaccin a otra. La coenzima, por tanto, se encuentra en dos formas en las clulas: NAD+ y NADH. El NAD+, que es un agente oxidante, acepta electrones de otras molculas y pasa a ser reducido, formndose NADH, que puede ser utilizado entonces como agente reductor para donar electrones. Estas reacciones de transferencia de electrones son la principal funcin del NAD +. Sin embargo, tambin es utilizado en otros procesos celulares, en especial como sustrato de las enzimas que aaden o eliminan grupos qumicos de las protenas, en modificaciones post-traduccionales. Debido a la importancia de estas funciones, las enzimas que intervienen en el metabolismo del NAD+ son objetivos para el descubrimiento de medicamentos.

Coenzima NAD

En los organismos, el NAD+ puede ser sintetizado desde cero (de novo) a partir de losaminocidos triptfano o cido asprtico. Alternativamente, los componentes de las coenzimas se obtienen a partir de los alimentos, como la vitamina llamada niacina. Compuestos similares son liberados por las reacciones que descomponen la estructura del NAD +. Estos componentes preformados pasan luego a travs de una ruta que los recicla de vuelta a la forma activa. Algunos NAD+ tambin se convierten en nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NADP +), cuya qumica es similar a la de la coenzima NAD+, aunque tiene diferentes funciones en el metabolismo. PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS La nicotinamida adenina dinucletido tiene la frmula molecular C21H27N7O14P2, su masa molar es de 663.425 y su punto de fusin es de 160C. Consta de dos nucletidos unidos por un par de grupos fosfato puente. Los nucletidos consisten de anillos de ribosa, uno con adenina adjunta al primer tomo de carbono (la posicin 1') y el otro con nicotinamida en esta posicin. El grupo nicotinamida puede estar conectado en dos orientaciones a este tomo de carbono anomrico; debido a estas dos posibles estructuras, el compuesto existe como dos diestereoismeros. Es la -nicotinamida diestereoismero de NAD+ la que se encuentra en los organismos. Estos nucletidos estn unidos por un puente de dos grupos fosfato a travs de los carbonos 5'. En el metabolismo, el compuesto acepta o dona electrones en las reacciones redox. Estas reacciones (que se resumen en la frmula mostrada a continuacin) implican la eliminacin de dos tomos de hidrgeno del reactivo (R), en forma de ion hidruro, y un protn (H +). El protn se libera en solucin, mientras que el RH2 se oxida y el NAD+ se reduce a NADH mediante la transferencia del hidruro al anillo de nicotinamida.

RH2 + NAD+ NADH + H+ + R Del par de electrones del hidruro, un electrn es transferido al nitrgeno cargado positivamente del anillo nicotinamida del NAD+, y el segundo tomo de hidrgeno es transferido al tomo de carbono C4 opuesto a este nitrgeno. El punto medio potencial del para redox NAD + / NADH es 0,32 voltios, lo que hace al NADH un fuerte agente reductor. La reaccin es fcilmente reversible, cuando el NADH reduce otra molcula y es re-oxidado a NAD+. Esto significa que la coenzima puede ciclar de forma continua entre las formas NAD + y NADH sin que se consuman. En apariencia, todas las formas de esta coenzima son polvos amorfos de color blanco, higroscpicos y muy solubles en agua. Los slidos son estables si se conservan en seco y en la oscuridad. Las soluciones de NAD+ son incoloras y estables durante ms o menos una semana a 4C y pH neutro, pero se descomponen rpidamente en cidos o lcalis. Cuando se descomponen, forman productos que son inhibidores de la enzima. Tanto el NAD+ como el NADH absorben fuertemente en el ultravioleta, debido a la base adenina. Por ejemplo, el pico de absorcin del NAD+ se encuentra en una longitud de onda de 259 nanmetros (nm), con un coeficiente de extincin de 16900 M-1 cm-1. El NADH tambin absorbe a longitudes de onda mayores, con un segundo pico de absorcin ultravioleta a 339 nm, con un coeficiente de extincin de 6220 M-1 cm-1. Esta diferencia en el espectro de absorcin ultravioleta entre las formas oxidadas y reducidas de las coenzimas, a mayores longitudes de onda, hace que sea simple medir la conversin de una a otra en ensayos enzimticos, midiendo la cantidad de absorcin UV a 340 nm mediante un espectrofotmetro.

Espectros de absorbancia del NAD+ y el NADH

El NAD+ y el NADH tambin difieren en su fluorescencia. El NADH en solucin tiene un pico de emisin a 460 nm y una vida til de fluorescencia de 0,4 nanosegundos, mientras que la forma oxidada de la coenzima no fluoresce. Las propiedades de la seal de fluorescencia cambian cuando el NADH se une a las protenas, por lo que estos cambios pueden ser utilizados para medir constantes de disociacin, que son tiles en el estudio de la cintica de enzimas. Estos cambios en la fluorescencia se utilizan tambin para medir variaciones en el estado redox de las clulas vivas, mediante microscopa de fluorescencia. CONCENTRACIN Y ESTADO EN LAS CLULAS En el hgado de la rata, la cantidad total de NAD+ y NADH es de aproximadamente 1 mol por gramo de peso fresco, unas 10 veces la concentracin de NADP+ y NADPH en las mismas clulas. La concentracin de NAD+ en el citosol de la clula es ms difcil de medir, con estimaciones recientes en clulas animales que estn en torno a 0,3 mM, y aproximadamente de 1,0 a 2,0 mM en la levadura. Sin embargo, ms del 80% est enlazado a las protenas, por lo que la concentracin en solucin es mucho ms baja. Los datos correspondientes a otros compartimentos de la clula son limitados, aunque en la mitocondria la concentracin de NAD+ es similar al del citosol. Este NAD+ se transporta al interior de la mitocondria por una protena de transporte especfica de la membrana, ya que la coenzima no puede pasar a travs de las membranas.

El equilibrio entre las formas oxidadas y reducidas de nicotinamida adenina dinucletido se llama proporcin NAD+/NADH. Esta proporcin es un componente importante de lo que se llama estado redox de la clula, una medida que refleja tanto las actividades metablicas como la salud de las clulas. Los efectos de la proporcin NAD+/NADH son complejos, y controlan la actividad de varias enzimas, incluyendo la gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa y la piruvato deshidrogenasa. En los tejidos sanos de mamferos, la proporcin NAD +/NADH es aproximadamente 1, por lo que la concentracin de NAD+ y NADH son comparables. En contraste, la proporcin NADP+/NADPH es normalmente de 0,005, unas 200 veces menor que la proporcin NAD+/NADH. Por tanto, el NADPH es la forma dominante de esta coenzima. Las distintas proporciones son fundamentales para las diferentes funciones metablicas del NADH y el NADPH. BIOSNTESIS El NAD+ se sintetiza a travs de dos rutas metablicas: en una ruta de novo a partir de aminocidos, o en rutas de rescate mediante el reciclado de componentes preformados como nicotinamida convertida de nuevo a NAD+. Produccin de novo La mayora de los organismos sintetizan NAD+ a partir de componentes simples. El conjunto especfico de reacciones vara entre los organismos, pero una caracterstica comn es la generacin de cido quinolnico (QA) a partir de un aminocido, ya sea triptfano (Trp) en los animales y algunas bacterias, o bien cido Algunas rutas metablicas que sintetizan y consumen NAD+ asprtico en algunas bacterias y en los vertebrados. Las abreviaturas se definen en el texto. plantas. El cido quinolnico se convierte en cido nicotnico mononucletido (NaMN) mediante transferencia de un grupo fosforibosa. Un grupo adenilato se transfiere entonces para formar cido nicotnico adenina dinucletido (NaAD). Por ltimo, el grupo cido nicotnico del NaAD es amidado a un grupo nicotinamida (Nam), formando nicotinamida adenina dinucletido. En un nuevo paso, algunos NAD+ se convierten en NADP+ mediante la NAD+ kinasa, que fosforila el NAD+. En la mayora de los organismos, esta enzima utiliza ATP como fuente del grupo fosfato, aunque en las bacterias tales como Mycobacterium tuberculosis y en las arqueas comoPyrococcus horikoshii, el polifosfato inorgnico es una alternativa como donante de fosfato. Rutas de rescate

Adems de formar NAD+ de novo a partir de aminocidos precursores simples, las clulas tambin reciclan compuestos preformados que contengan nicotinamida. Aunque se conocen otros precursores, los tres compuestos naturales que contienen el anillo nicotinamida y usan las rutas de reciclaje son el cido nicotnico (Na), la nicotinamida (Nam) y la Las rutas de rescate utilizan estos tres precursores del NAD +. nicotinamida ribosida (NR). Los precursores son reciclados a NAD(P)+ a travs de reacciones de adenilacin y fosforibosilacin. Estos compuestos se pueden tomar a partir de la dieta, donde la mezcla de cido nicotnico y nicotinamida se conoce como vitamina B3 o niacina. Sin embargo, estos compuestos tambin son producidos en las clulas, cuando el grupo nicotinamida se libera a partir del NAD + en las reacciones de transferencia de ADP-ribosa. De hecho, las enzimas que participan en dichas rutas de rescate parecen estar concentradas en el ncleo de la clula, lo que puede compensar el alto nivel de reacciones que consumen NAD+ en este orgnulo. Las clulas tambin pueden tomar NAD+extracelular a partir de su entorno. A pesar de la presencia de la ruta de novo, las reacciones de rescate son esenciales en los seres humanos. Una carencia de niacina en la dieta provoca una enfermedad llamada pelagra. Esta elevada exigencia de NAD+ resulta del constante consumo de la coenzima en reacciones como las modificaciones post-traduccionales, ya que el ciclado del NAD+ entre las formas oxidadas y reducidas en las reacciones redox no cambia los niveles generales de la coenzima. Las rutas de rescate utilizadas por los microorganismos difieren de las de los mamferos. Por ejemplo, algunos agentes patgenos, como la levadura Candida glabrata y la bacteriaHaemophilus influenzae son auxtrofos de NAD+, es decir, no pueden sintetizar NAD + y dependen de las rutas de rescate. An ms sorprendente es el patgeno intracelular Chlamydia trachomatis, que carece de genes implicados en el rescate o en la biosntesis de NAD + y NADP+, y que en su lugar obtiene estas coenzimas de su anfitrin. FUNCIONES La nicotinamida adenina dinucletido tiene varias funciones esenciales en el metabolismo. Acta como coenzima en las reacciones redox, como donante de grupos ADP-ribosa en las reacciones de ADP-ribosilacin, como precursor del segundo mensajero de la molcula cclica de ADP-ribosa, as como sustrato para las ADN ligasas bacterianas y un grupo de enzimas llamadas sirtuinas, que usan NAD+ para eliminar los grupos protecos acetilo. Oxidoreductasas La principal funcin del NAD+ en el metabolismo es la transferencia de electrones de una reaccin redox a otra. Este tipo de reaccin es catalizada por un gran grupo de enzimas llamadas oxidoreductasas. Los nombres correctos para estas enzimas contienen los nombres de sus sustratos: por ejemplo, la NADH-ubiquinona oxidoreductasa cataliza la oxidacin del NADH por la coenzima Q. Sin embargo, estas enzimas son tambin conocidas como deshidrogenasas o reductasas, por lo que la NADH-ubiquinona oxidoreductasa tambin suele ser llamada NADH deshidrogenasa o, a veces, coenzima Q reductasa.

Cuando estn enlazados a una protena, el NAD+ y el NADH suelen mantenerse en un motivo estructural conocido como pliegue Rossmann. El nombre proviene de Michael Rossmann, que fue el primer cientfico en darse cuenta de lo comn que es esta estructura dentro de las protenas enlazadas a nucletidos. Este pliegue contiene tres o ms hebras beta paralelas enlazadas mediante dos hlices alfa en el orden beta-alfa-beta-alfabeta. Esto forma una hoja beta flanqueada por una capa de hlices alfa a cada lado. Debido a que cada pliegue Rossmann enlaza un nucletido, los dominios de enlace para el dinucletido NAD+ consisten de dos pares de pliegues Rossmann, con cada pliegue enlazando un nucletido dentro del cofactor. Sin embargo, este pliegue no es universal entre las enzimas dependientes de NAD, ya que se ha descubierto recientemente que una clase de enzimas bacterianas involucradas en el metabolismo de los aminocidos se enlazan a la coenzima pero carecen de esta forma de pliegue.

El pliegue de Rossmann en la zona de la lactato deshidrogenasa de Cryptosporidium parvum, con el NAD+ en rojo, las lminas beta en amarillo y las hlices alfa en prpura.

Cuando se enlaza al sitio activo de una oxidoreductasa, el anillo nicotinamida de la coenzima se coloca de modo que pueda aceptar un hidruro del otro sustrato. Ya que el carbono C 4 que acepta el hidrgeno es proquiral, esto puede ser explotado en la cintica de enzimas para dar informacin sobre el mecanismo enzimtico. Esto se hace mediante la mezcla de una enzima con un sustrato que tiene tomos de deuterio sustituidos por los hidrgenos, de tal forma que la enzima reducir el NAD+ mediante la transferencia de un deuterio en lugar de un tomo de hidrgeno. En este caso, una enzima puede producir uno de los dos estereoismeros de NADH. En algunas enzimas, el hidrgeno se transfiere desde el plano superior del anillo de nicotinamida (las oxidoreductasas clase A), mientras que en otras enzimas (las oxidoreductasas de clase B) la transferencia se produce desde abajo. A pesar de esta similitud en la forma en que las protenas se unen a las coenzimas, las enzimas casi siempre muestran un alto nivel de especificidad, ya sea por el NAD+ o el NADP+. Esta especificidad refleja las distintas funciones metablicas de las dos coenzimas, y es el resultado de diferentes clases de residuos de aminocidos en los dos tipos de sitios de unin al coenzima. Por ejemplo, en el sitio activo de las enzimas dependientes de ADP, se forma un enlace inico entre una cadena lateral de aminocidos bsico y el grupo fosfato cido del NADP +. Por el contrario, en las enzimas dependientes de NAD, la carga en este bolsillo se invierte, impidiendo el enlace del NADP+. Sin embargo, Aspecto del NAD en 3D. hay algunas excepciones a esta regla general, y enzimas como la aldosa reductasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y la metilentetrahidrofolato reductasa pueden utilizar ambas coenzimas en algunas especies. Papel en el metabolismo redox

Las reacciones redox catalizadas por oxidoreductasas son vitales en todo el metabolismo, pero una esfera particularmente importante es la liberacin de energa de los nutrientes. Los compuestos reducidos, como laglucosa, se oxidan, liberando as la energa. Esta energa se transfiere al NAD+ mediante reduccin a NADH, como parte de la glucolisis y el ciclo del cido ctrico (ciclo de Krebs). En eucariotas, los electrones transportados por el NADH que se produce en el citoplasma mediante glucolisis son transferidos al interior de la mitocondria por lanzaderas mitocondriales, como la lanzadera malato-aspartato. El NADH es oxidado a su vez por la cadena de transporte de electrones, que bombea protones a travs de la membrana y genera ATP a travs de la fosforilacin oxidativa. Estos sistemas de lanzadera tambin tienen la misma funcin de transporte en los cloroplastos.

Esquema del metabolismo redox

Dado que tanto las formas oxidadas como reducidas de nicotinamida adenina dinucletido se utilizan en estos conjuntos de reacciones enlazadas, la clula mantiene aproximadamente concentraciones iguales de NAD+ y NADH. Una proporcin alta de NAD+/NADH permite a este coenzima actuar como agente oxidante y como reductor. En contraste, la funcin principal del NADP+ es como agente reductor en el anabolismo, estando la coenzima implicada en rutas como la sntesis de cidos grasos y la fotosntesis. Dado que el NADPH es necesario para conducir las reacciones redox como un fuerte agente reductor, la proporcin NADP +/NADPH se mantiene muy baja. Aunque es importante en el catabolismo, el NADH se utiliza tambin en las reacciones anablicas, como la gluconeognesis. Esta necesidad de NADH en el anabolismo plantea un problema creciente para los procariotas que crecen en nutrientes que liberan slo una pequea cantidad de energa. Por ejemplo, las bacterias nitrificantes como Nitrobacter oxidan el nitrito a nitrato, lo que libera energa suficiente para bombear los protones y generar ATP, pero no la suficiente como para producir NADH directamente. Como el NADH sigue siendo necesario para las reacciones anablicas, estas bacterias utilizan una nitrito oxidoreductasa para producir la suficiente fuerza motriz de protones como para ejecutar parte de la cadena de transporte de electrones en sentido inverso, generando NADH. Funciones no redox La coenzima NAD+ se consume tambin en las reacciones de transferencia de ADP-ribosa. Por ejemplo, las enzimas llamadas ADP-ribosiltransferasas aaden la fraccin ADP-ribosa de esta molcula a las protenas, en una modificacin postraduccional llamada ADP-ribosilacin. Esta reaccin implica la adicin de un solo grupo ADP-ribosa (mono-ADP-ribosilacin), o la transferencia de ADP-ribosa a las protenas en cadenas largas ramificadas (poli-ADP-ribosilacin). La mono-ADP-ribosilacin se identific por primera vez como el mecanismo de un grupo de toxinas bacterianas, en particular la toxina del clera, pero tambin participan en la sealizacin celular normal. La poli-ADP-ribosilacin es llevada a cabo por las polimerasas poli-(ADP-ribosa). La estructura de poli-(ADP-ribosa) est implicada en la regulacin de varios eventos celulares, y es ms importante en el ncleo celular, en procesos como la reparacin del ADN o el mantenimiento del telmero mantenimiento. Adems de estas funciones dentro de la clula, se ha descubierto recientemente un grupo de ADP-ribosiltransferasas extracelulares, pero sus funciones an no estn claras.

Otra funcin de esta coenzima en la sealizacin celular es como precursor de la ADP-ribosa cclica, que se produce a partir de NAD+ por ADPribosil ciclasas, como parte de un sistema de segundo mensajero. Esta molcula acta en la sealizacin de calcio mediante la liberacin de calcio de las reservas intracelulares. Esto lo hace mediante el enlace y apertura de una clase de canales de calcio llamados receptores de rianodina, que se encuentran en las membranas de los orgnulos como el retculo endoplasmtico.

Estructura de la ADP-ribosa cclica

El NAD+ tambin es consumido por las sirtuinas, que son deacetilasas dependientes de NAD, como la Sir2. Estas enzimas actan mediante la transferencia de un grupo acetilo de sus protenas sustrato a la fraccin ADP-ribosa del NAD+; esto rompe la coenzima y libera nicotinamida y Oacetil-ADP-ribosa. Las sirtuinas parecen estar implicadas en la regulacin de la transcripcin a travs de histonas deacetilantes y alteracin de la estructura del nucleosoma. Aunque las protenas no histonas pueden ser desacetilizadas tambin por las sirtuinas. Esta actividad de las sirtuinas es especialmente interesante debido a su importancia en la regulacin del envejecimiento. Otras enzimas dependientes de NAD son las ADN ligasas bacterianas, que unen dos extremos de ADN mediante el uso de NAD+ como sustrato para donar un grupo adenosina monofosfato (AMP) al fosfato 5' de un extremo de ADN. Este intermediario es atacado luego por el grupo hidroxilo 3' del otro extremo de ADN, formando un nuevo enlace fosfodister. Esto contrasta con las ADN ligasas eucariticas, que utilizan el ATP para formar intermediarios ADN-AMP. NADP+ y NADPH El NADP+ (nicotinamida adenina dinucletido fosfato) se utiliza en las reacciones anablicas, como la sntesis de lpidos y cidos nucleicos, que requieren NADPH como agente reductor. El NADPH es la forma reducida de NADP+. En las plantas En los cloroplastos, el NADP se reduce mediante la enzima ferredoxina-NADP+ reductasa, en el ltimo paso de la cadena de electrones durante las reacciones luminosas de la fotosntesis. El NADPH producido se utiliza como poder de reduccin para las reacciones de biosntesis en el ciclo de Calvin de la fotosntesis. Los iones NADP en la fotosntesis pueden considerarse como iones de hidrgeno 'arrastrados' (en los ciclos dependientes de luz), que se utilizan en los ciclos independientes de la luz (ciclo de Calvin) para producir carbohidratos. En los animales La fase oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato es la principal fuente de NADPH en las clulas. NADP

El NADPH proporciona los equivalentes reductores para las reacciones biosintticas y de oxidacin-reduccin involucradas en la proteccin contra la toxicidad de las especies de oxgeno reactivas. El NADPH se utiliza tambin en las rutas anablicas, como la sntesis de lpidos, sntesis decolesterol y elongacin de la cadena de cidos grasos. Asimismo, es la fuente de equivalentes reductores en la hidroxilacin de compuestos aromticos, esteroides, alcoholes y otras sustancias.