CURSO: Licenciatura em Qumica DISCIPLINA: Bioqumica II 2o semestre de 2009 DOCENTE: Profa. Dra.

. Maria de Lourdes Corradi da Silva 3a Aula prtica

AO DE ENZIMAS PROTEOLTICAS

Objetivos Introduo As proteases esto entre as enzimas hidrolticas mais importantes, sendo conhecidas h longo tempo. De acordo com a nomenclatura sistemtica, as proteases podem ser chamadas de C-N hidrolases, uma vez que catalisam o rompimento de ligaes peptdicas, isto , ligaes C-N: Demonstrar a ao de enzimas proteolticas (endopeptidase). Calcular a atividade enzimtica em moles de tirosina liberada.

As enzimas que rompem ligaes peptdicas so chamadas de exopeptidases e endopeptidases, de acordo com seu modo de ao. As exopeptidases rompem as cadeias peptdicas somente nas extremidades, removendo aminocidos terminais e podendo ser divididas em: carboxipeptidases e aminopeptidases, conforme a extremidade sobre a qual atuam. Como os substratos para as exopeptidases em geral so pequenos fragmentos de protenas, oligopetdeos e polipetdeos so elas chamadas simplesmente de peptidases. As endopeptidases rompem as protenas em pontos determinados das cadeias polipeptdicas no afetando suas extremidades. Elas tendem a atuar sobre protenas e polipeptdeos grandes, sendo chamadas de proteinases. Na tabela abaixo esto alguns exemplos de proteinases importantes.

Nome Quimotripsina Tripsina Pepsina A Papana Catepsina D Trombina Termolisina

Ocorrncia Intestino delgado Intestino delgado Estmago Frutos de mamoeiro Intracelular Plasma sanguneo Bacillus thermoproteo lyticus.

pH timo 7,8 7,5 - 8,5 1,3 - 3,0 5,0 3,0 - 4,6 7,4 6,0 - 10,0

Especificidade Tir Trp Fen Leu Arg Lys _Tir . Fen Arg Lys Leu Gli A mesma da pepsina. Arg (no fibrinognio). Leu, Fen

As proteases so encontradas em diferentes espcies de microorganismos, apresentando interesse no s para o entendimento de mecanismos enzimticos, como para aplicaes industriais. Estas enzimas so predominantemente extracelulares, podendo ser isoladas em forma ativa a partir de filtrados de cultura. Princpio A casena utilizada como substrato para a determinao da atividade proteoltica. Este substrato sofre protelise com todas as enzimas proteolticas conhecidas sem qualquer necessidade de desnaturao prvia. A enzima incubada com a casena durante um tempo determinado e a seguir, a protena hidrolisada precipitada pela ao do cido tricloroactico. Aps filtrao o filtrado lmpido tratado com o reativo de Folin-Ciocalteu. Este reduzido, em meio alcalino pela hidroxila fenlica dos resduos de tirosina, presentes nos peptdeos resultantes da hidrlise da protena, formando um composto azul, o xido de molibdnio. Quanto maior a atividade hidroltica da enzima, tanto mais intensa ser esta colorao. Utilizando-se um padro de tirosina pode-se avaliar quantitativamente a atividade da enzima, definindo-se como uma unidade de enzima, a quantidade da enzima que produz a cor equivalente a 1 mol de tirosina por minuto. Reativos 1) - Tampo fosfato 0,1 M - pH 7,0. (Podero ser usados outros tampes de acordo com o pH timo da enzima). 2) Soluo de casena (substrato). Dissolver 1,5g de casena em 30 mL de NaOH 0,1 N. Ajustar a pH 7,0 com H3PO4 0,1N, adicionar 20 mL de tampo fosfato 0.1M, pH 7,0 e completar o volume para 100 mL. Usar dentro de 24 horas. 3) cido tricloroactico 0,4 M. 4) Carbonato de sdio 0,4 M. Soluo recm preparada. 5) Soluo de enzima em tampo fosfato 0,1 M - pH 7,0. Diluir a enzima (pancreatina, proteases de fungos, etc) at que a mesma apresente de 0,2 a 0,9 unidades por mL . Quando se utilizar Pancreatina (Merck) dissolver 50 mg em 100 mL de tampo. 6) Padro de Tirosina (1 mM). Dissolver 18,1 mg de Tirosina em 100 mL de HCl 0,2 M. Para uso, diluir 5 vezes. 7) Reativo de Folin-Ciocalteu. Em um frasco de 1.500 mL , ao qual se possa adaptar um condensador de refluxo, colocar: 100g de tungstato de sdio (Na 2WO4.2H2 O) + 25g de molibdato sdio (Na2MoO4.2H2O) + 700 mL de gua destilada + 50 mL de cido fosfrico a 85% p/p + 100 mL de cido clordrico concentrado. Adaptar o condensador e ferver durante 10

horas. Adicionar a seguir, 150g de sulfato de ltio (Li 2SO4) + 50 mL de gua destilada e algumas gotas de bromo. Ferver durante 15 minutos sem condensador, para remover o excesso de bromo. (Ferver em uma capela para evitar irritao causada pelos vapores de bromo). Deixar esfriar e completar o volume para 1 litro. Este reativo deve ser amarelo-ouro sem reflexos verdes. Antes de usar, o reativo deve ser diludo de tal maneira que corresponda a um cido 1N, quando titulado com NaOH 1N. Tcnica 1. Marcar dois conjuntos de 4 tubos de ensaio: To, T1, T2, T3 ; Po, P1, P2, P3. Em cada um dos tubos pipetar 1 mL da soluo de casena e 1 mL de soluo das enzimas Tripsina (T) e Protease (P), respectivamente aos tubos T e P. Misturar bem e adicionar imediatamente aos tubos To e Po, 2 mL de TCA 0,4 M. Esse o tempo zero da reao. 2. Incubar os tubos T1, T2 e T3 ; P1, P2 e P3 em banho-maria a 40C e comear a marcar o tempo. 3. Decorridos os tempos de 10, 20 e 30 minutos, interromper respectivamente a reao enzimtica nos tubos T1, T2 e T3 ; P1, P2 e P3 pela adio de 2 mL de TCA 0,4 M aos tubos correspondentes aos respectivos tempos. 4. Filtrar o contedo de todos os 8 tubos utilizando funil de vidro e papel de filtro, recolhendo os filtrados em tubos de ensaio devidamente identificados. 5. A seguir, identificar 10 tubos de ensaio e proceder seguindo a orientao da tabela abaixo: TUBO Tempo Filtrado Padro de Tirosina 1 mL (0,2 mol) gua 1 mL destilada Na2CO3 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 0,4 M Folin1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL Ciocalteu 6. Misturar, esperar 15 minutos e ler no fotocolormetro (filtro vermelho) em 660nm. 7. Clculo em tirosina: mol de Tirosina na amostra /mL = D.O. amostra x concentrao do padro (0,2 mol/mL ) D.O. padro 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL BRANCO

To

Po

T1

P1

T2

P2

T3

P3

PADRO -

zero min.

10 min.

20 min.

30 min.

Referncias Bibliogrficas: KARLSON, P. Introducion to Modern Biochemistry. 4. ed. Academic, 1975. p. 164-70. THE ENZYMES. New York, P. D. Boyer. 886 p.v.3. ICHISHIMA, E. Purification and mode of Assay for Acid Proteinase of Aspergillus saitoi. In: Methods in enzymology. New York, G. E. Perlmain & Lorand New York, 1970. p. 397-406. v. 19. 3