A comparao do kit Deidrogenase Lctica Doles (Y) com a metodologia acima mencionada (X) deu origem seguinte equao

o de regresso linear: Y= 3,49 + 1,002X, sendo o coeficiente de correlao 0,997. Testes de recuperao mostram que a mesma situa-se entre 96 e 104%. O erro da mdia foi de 2,24%. Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 2 amostras, obtendo-se os seguintes resultados:

Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%) Amostra 1 Amostra 2

Diluio da matriz: estudos sucessivos de diluio da matriz mostraram que no h interferncia na sensibilidade diagnstica da presente metodologia de Whitaker modificado. S u b s t n c i a s i n t e r f e r e n t e s : a m o s t ra s hemolizadas no devem ser utilizadas, pois as hemcias so ricas em DHL. Certas drogas interferem nos nveis de DHL. Para controle de tal interferncia, recomenda-se que o paciente seja questionado quanto a uso de medicamentos. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA Whitaker, J.F.: Clin. chim. acta, 24; l969, 23-27. Doles, J.: Mtodo simples, cintico para dosagem da deidrogenase lctica. VII Congresso Brasileiro de Patologia Clnica. Curitiba, 1972. Ravel R. Laboratrio Clnico, Aplicaes clnicas dos achados laboratoriais, 4a ed; 183-185; 1988. Pagana K.D.: Mosbys diagnostic and laboratoryt test reference, 450-451; 1993. Tibrcio, H.M.: Controle interno da qualidade analtica, 1aed. maro/1995. Doles: dados de arquivo TERMOS E CONDIES DE GARANTIA DA QUALIDADE DO PRODUTO As garantias do fabricante ao consumidor seguem estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1.990 - Cdigo de Defesa do Consumidor. Os reagentes que compem este sistema para diagnstico so garantidos na sua performance, reprodutibilidade e qualidade at a data de vencimento. Os produtos que apresentarem problemas tcnicos comprovados sero substitudos, sem nus para o consumidor. Doles Reag. Equip. para Laboratrios Ltda. CNPJ: 01.085.513/0001-05 Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07 Chcara Retiro, Conjunto Palmares. CEP: 74775-027 Goinia - GO Brasil e-mail: doles@doles.com.br M.S.: no 10231810022 Reviso: 15 (08/2011)

DEIDROGENASE LCTICA (DHL)

BIOQUMICA CLNICA

219,00 7,68 3,50

522,10 12,01 2,30

Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens, durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguinte resultados:

Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%) Amostra 1 Amostra 2

219,65 10,04 4,60

501,25 20,17 4,10

Especificidade: os estudos da tcnica de Whitaker apresentam boa correlao com as tcnicas espectrofotomtricas de Amador (37oC) e Henry (25oC). A tcnica de Whitaker especfica para determinao da DHL, contudo, os fatores tempo e temperatura so decisivos para uma boa reprodutibilidade da metodologia. A queda de 1oC na temperatura do banho maria condiciona uma diminuio de 7% na atividade do DHL. Um erro de 30 segundos leva a uma alterao de 10% na dosagem. Sensibilidade: a absorvncia encontrada, de 0,004, corresponde a 2 U.I./L de concentrao de DHL, quando realizados em espectrofotmetro, a 510nm. A sensibilidade do sistema est diretamente relacionada com a do aparelho utilizado no laboratrio. Na presente tcnica, uma unidade internacional (U.I./L) de DHL corresponde formao de 1mol de NADH por litro de soro por minuto, a 37oC.

FINALIDADE EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSRIOS Sistema colorimtrico para determinao de NO FORNECIDOS deidrogenase lctica no soro, plasma e lquor. Espectrofotmetro ou fotocolormetro capaz de Somente para uso diagnstico in vitro. medir a absorvncia em 510nm ou filtro verde. Tubos de ensaio. PRINCPIO Pipetas graduadas. A deidrogenase lctica (DHL) determinada Pipetas semiautomticas 25L. em mistura de reagentes contendo lactato Ponteiras descartveis. (substrato), difosfopiridino nucletido (NAD), gua deionizada ou destilada. fenazina metosulfato (FMS), almen frrico e Banho maria (370C). 1,10-fenantrolina, de acordo com o seguinte Cronmetro. esquema: ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES 1. Lactato + NAD NADH + piruvato Substrato: armazenar temperatura de 2-8oC. 2. NADH + FMS NAD + FMS reduzido Estvel at a data de vencimento indicada no 3. FMS red. + almen frrico FMS + almen ferroso 4. Almen ferroso + 1,10-fenantrolina complexo corado rtulo do frasco, obedecidas as condies de armazenamento. Soluo estabilizadora: ar mazen ar PARTICULARIDADES DO SISTEMA temperatura de 2-8 oC. Estvel at a data Doles modifica a conhecida tcnica de Whitaker, utilizando a reao lactato piruvato, com de vencimento indicada no rtulo do frasco, determinao quantitativa e simultnea do NADH obedecidas as condies de armazenamento. formado na reao enzimtica. Simples e prtica, Alumen Frrico: armazenar temperatura de a presente tcnica alia as vantagens de um 2-8oC. Estvel at a data de vencimento indicada mtodo espectrofotomtrico com as facilidades no rtulo do frasco, obedecidas as condies de instrumentais de um mtodo fotocolorimtrico. armazenamento. As concentraes de substrato e coenzima Soluo padro 350 U.I/L: armazenar apresentam-se otimizadas e os reagentes temperatura de 2-8 oC. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco, instveis, liofilizados. obedecidas as condies de armazenamento. NAD: armazenar temperatura de 2-8oC e ao METODOLOGIA abrigo da luz. Estvel at a data de vencimento Whitaker modificado. indicada no rtulo do frasco, obedecidas as condies de armazenamento. REAGENTES Substrato: soluo 0,1M de Lactato, 0,005M de FMS: armazenar temperatura de 2-8oC e ao abrigo da luz. Estvel at a data de vencimento o-Fenantrolina em Tris 0,2M pH 8,8, 37oC. Soluo estabilizadora: cido Clordrico 0,5M. indicada no rtulo do frasco, obedecidas as Almen Frrico: soluo 0,012M de Sulfato de condies de armazenamento. Reagente NAD-FMS: armazenar temperatura Ferro amoniacal. o NAD: cada frasco contm 130mg de NAD, sob de 2-8 C e ao abrigo da luz. Estvel por 18 meses aps o preparo. forma liofilizada. FMS: cada frasco contm, sob forma liofilizada, CUIDADOS E PRECAUES COM O USO DOS 4mg de Fenazina Metasulfato. Soluo padro 350 U.I/L : cada 25 L REAGENTES Todos os reagentes so somente para uso corresponde a 350 U.I/L de DHL. diagnstico in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se contato com pele e APRESENTAO Substrato 1 x 57mL mucosas. Em caso de contaminao acidental, Soluo estabilizadora 1 x 57mL lavar a rea afetada em gua corrente. O Alumen Frrico 1x 5mL descarte do material utilizado dever ser feito FMS (liofilizado) 1x 4mg obedecendo-se aos critrios de biossegurana NAD (frasco conta-gotas) 1 x 130mg estabelecidos pelo laboratrio, de acordo com Soluo padro 350 U.I/L 1x 3mL as normas locais, estaduais ou federais. NMERO DE TESTES Observar ainda a simbologia constante 28 testes - 25L amostra nos rtulos do produto: Irritante Corrosivo

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SAC: (62) 3269 0000 (Grande Goinia) SAC: 0800 644 6433 (Demais localidades)

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AMOSTRA Soro, plasma (colhido com heparina), lquor. As amostras devero ser separadas rapidamente (1 hora). No usar amostras hemolisadas, pois os eritrcitos contm 100 a 150 vezes mais DHL que o soro. A atividade enzimtica permanece estvel por 3 dias sob refrigerao (2-8oC). Todas as amostras biolgicas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. PROCEDIMENTO TCNICO Preparo do reagente NAD-FMS Abrir o frasco envolto em papel rotulado FMS (contm Fenazina Metosulfato, extremamente sensvel luz). Adicionar 3,5mL de gua destilada e agitar. Abrir o frasco conta-gotas rotulado NAD e transferir para ele, imediatamente, toda a soluo de FMS, que deve apresentar-se com tonalidade amarela intensa. Colocar o batoque conta-gotas e agitar durante alguns minutos at dissoluo. Aps reconstitudo, tem-se soluo 15,82mmolar de NAD e 3,73mmolar de FMS. Essa soluo permanece estvel durante 18 meses, sob refrigerao e ao abrigo da luz. Identificar 2 tubos de ensaio com T (teste) e B (branco). Proceder como segue:
T Substrato Almen Frrico Amostra 1,0mL 1 gota 25L B 1,0mL 1 gota -

DETERMINAO DO FATOR (F) Identificar 03 tubos com P (padro). Proceder como segue:
P Substrato Soluo Padro 1,0mL 25L P 1,0mL 25L P 1,0mL 25L

CLCULOS 350 Fator (F) = absorvncias P (mdia) DHL (U.I./L) = absorvncia T x fator (F) Exemplo: Leituras: (P) = 0,590; 0,589; 0,590 (T) = 0,200 0,590 + 0,589 + 0,590 Mdia aritmtica (P) = 3 350 Fator (F) = = 593 0,590 DHL (U.I./L) = 0,200 x 593 = 118 Uma Unidade Internacional (U.I.) de DHL corresponde formao de 1mol de NADH por litro de soro por minuto, a 37oC. EXPRESSO DOS RESULTADOS EM UNIDADES S.I. Na presente tcnica os resultados finais j so calculados em unidades S.I. LIMITAES DO SISTEMA Para se obter timo desempenho do sistema, necessrio que o procedimento tcnico seja rigorosamente seguido conforme instrues de uso. Qualquer alterao poder levar a resultados errneos. Os fatores tempo e temperatura so crticos. A queda de 1oC na temperatura do banho maria condiciona uma diminuio de 7% na atividade do DHL. Um erro de 30 segundos leva a uma alterao de 10% da dosagem. Soro hemolisado no pode ser utilizado. As hemcias so ricas em DHL. Nveis elevados so observados na maioria dos pacientes com infarto do miocrdio, infarto pulmonar, cirrose e ictercia obstrutiva. Para um diagnstico mais preciso, recomendase, paralelamente, a dosagem dos nveis de CK. CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA 1.A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado so de fundamental importncia para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos. 2.A gua utilizada na limpeza do material, no preparo dos reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade. = 0,590

Homogeneizar e repousar por 2 minutos temperatura ambiente (20 a 30C).

Soluo Estabilizadora 1,1mL 1,1mL 1,1mL

3.Colunas deionizadoras saturadas liberam ons diversos, aminas e agentes oxidantes, que deterioram os reagentes. 4.As pipetagens devem ser precisas. 5.O nvel da gua do banho maria deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio. A temperatura (37oC) deve ser rigorosamente observada. 6.O uso de soro controle de referncia deve ser uma prtica rotineira do laboratrio. Recomenda-se utilizar um soro controle com valor na faixa de normalidade (soro controle N - Doles) e outro soro controle de valor elevado (soro controle P - Doles). VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Como orientao, sugerimos os seguintes valores: Soro 80 - 220 U.I./L Lquor 5 - 35 U.I./L SIGNIFICADO CLNICO Deidrogenase lctica (DHL): a DHL encontrada no msculo cardaco, fgado, eritrcitos, pulmes, musculatura esqueltica e nos rins. No infarto agudo do miocrdio, a DHL torna-se elevada dentro de 24-48 horas aps o infarto, atingindo um valor mximo entre 48-72 horas. A partir de ento, lentamente (de 5 a 10 dias), retorna aos valores normais. Na leso hepatocelular aguda, o valor total da DHL no to sensvel quanto o da AST. Na congesto heptica passiva, aguda ou crnica, de grau leve, a DHL apresenta-se muitas vezes normal, ou apenas levemente aumentada. Na congesto moderada ou grave, a elevao dos nveis de DHL varia, podendo ocorrer em menor ou maior grau. As prteses valvulares cardacas podem produzir grau suficiente de hemlise, a ponto de alterar os valores sricos de DHL. Alm disso, a DHL mostra-se anormal em muitos pacientes com anemia megaloblstica e com anemias hemolticas moderadas ou graves. A DHL pode estar elevada em pacientes com embolia pulmonar, neoplasias malignas, leucemia ou uremia. CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO Foram realizados 44 testes em amostras cujos nveis de DHL situavam-se no intervalo de 40 a 618 U.I./L. Os mesmos testes foram realizados em paralelo com uma metodologia de referncia.

Homogeneizar e ler as absorvncias do padro em espectrofotmetro ou fotocolormetro, em 510nm ou filtro verde, zerando o aparelho com um branco representado por gua destilada. Registrar as absorvncias e calcular a mdia aritmtica, que dever ser utilizada para o clculo do fator. CURVA DE CALIBRAO
Padro Absorvncia Conc. (U.I/L) 1 0.000 0 2 0.240 140 3 0.590 350 4 1.175 700 5 1.340 800 6 1.610 1000

Colocar em banho maria, a 37oC, durante 2 minutos.

NAD-FMS 1 gota 1 gota

Misturar e incubar a 37oC, durante 5 minutos.

Soluo estabilizadora Amostra 1,0mL - 1,0mL 25L

Homogeneizar e ler a absorvncia de (T) em espectrofotmetro ou fotocolormetro, em 510nm ou filtro verde, zerando o aparelho com o tubo B (branco). A cor desenvolvida permanece estvel por 30 minutos, temperatura ambiente (20-30oC).

A reao linear at 800 U.I./L (ver curva acima). Obtendo-se valores mais elevados, dilui-se a amostra com soluo fisiolgica e procede-se nova dosagem. Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluio. O kit de Deidrogenase Lctica Doles possui padro no intervalo de linearidade da metodologia adotada. O laboratrio deve realizar o ensaio com o padro que acompanha o kit e calcular seu fator de calibrao (F), de acordo com o exemplo estabelecido nos clculos. O fator deve ser refeito periodicamente e a cada lote do produto. Os padres utilizados na montagem da curva de calibrao foram ajustados segundo trabalho original Whitaker, J.F. Clinical Chemistry. Acta, 24, 23-27, 1969.

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SAC: (62) 3269 0000 (Grande Goinia) SAC: 0800 644 6433 (Demais localidades)

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