BILIRRUBINA

BIOQUMICA CLNICA

Tubos de ensaio. FINALIDADE Sistema colorimtrico para determinao das Pipetas graduadas. Pipetas semiautomticas 50L ou 200L. bilirrubinas no soro ou plasma. Ponteiras descartveis. Somente para uso diagnstico in vitro. gua destilada ou deionizada. Cronmetro. PRINCPIO A bilirrubina presente no soro constituida por 4 ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS fraes: REAGENTES DE USO Bilirrubina livre no conjugada - bilirrubina; Bilirrubina monoconjugada - bilirrubina; Soluo aceleradora: armazenar temperatura de Bilirrubina diconjugada - bilirrubina; 20-30oC. Estvel at a data de vencimento indicada Bilirrubina ligada covalentemente albumina no rtulo do frasco, obedecidas as condies de bilirrubina. armazenamento. As fraes , e so hidrossolveis e reagem Reagente sulfanlico: armazenar temperatura de diretamente com o diazo reagente e so chamadas no 20-30oC. Estvel at a data de vencimento indicada conjunto de bilirrubina direta. no rtulo do frasco, obedecidas as condies de A frao da bilirrubina insolvel na gua. Sua armazenamento. solubilidade alcanada com aditivos (cafeina, lcool, Nitrito de Sdio: armazenar temperatura de 20cetrimide, etc) chamados de aceleradores e representa 30oC. Estvel at a data de vencimento indicada o que se chama de bilirrubina indireta. no rtulo do frasco, obedecidas as condies de A bilirrubina dosada na presena de soluo aceleradora armazenamento. chamada de bilirrubina total pois representa a soma Soluo padro 10mg/dL: na forma liofilizada, das bilirrubinas direta e indireta. armazenar temperatura de 20-30oC. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco. PARTICULARIDADES DO SISTEMA Bilirrubina Doles uma modicao da tcnica de C UIDADOS E PRECAUES COM O USO DOS Sims-Horn permitindo a determinao da bilirrubina REAGENTES total e fraes em apenas 3 minutos. Os reagentes so Todos os reagentes so somente para uso diagnstico todos estveis temperatura ambiente. A simplicidade in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitandoda tcnica permite que o diazo-reagente seja preparado se o contato com pele e mucosas. Em caso de dentro do prprio tubo de reao, atravs de um contaminao acidental, lavar a rea afetada em gua sistema de conta gotas. corrente. O descarte do material utilizado dever ser feito obedecendo-se aos critrios de biossegurana METODOLOGIA estabelecidos pelo laboratrio, de acordo com as Sims-Horn normas locais, estaduais ou federais. REAGENTES Soluo aceleradora: soluo de Benzoato de Cafena tamponada. Contm por litro: Benzoato de Sdio 0,13M e Cafena 0,13M. Reagente sulfanlico: soluo de cido Sulfanlico 0,04M em cido Clordrico 0,45M. Nitrito de Sdio: cada frasco contm 0,45mmol de Nitrito de Sdio. Soluo padro 10mg/dL: cada frasco contm 0,00346mmol de N-1-naftiletilenodiamina liolizado.
Observar ainda a simbologia constante nos rtulos do produto:

Corrosivo

Irritante

AMOSTRA Soro ou plasma (colhido com heparina), isento de hemlise e lipemia. At a realizao do teste, o soro deve ser mantido refrigerado e ao abrigo da luz. Se protegida da luz, a bilirrubina permanece estvel por 3 dias, entre 2-8oC, e por 3 meses a 10oC negativos. Todas as amostras biolgicas devem ser APRESENTAO consideradas como sendo potencialmente Soluo aceleradora 1 x 210mL infectantes. Reagente sulfanlico 1 x 30mL Nitrito de Sdio 1 x 20mL PROCEDIMENTO TCNICO Soluo padro 10mg/dL (aps reconstituio) 1 x 5mL Soluo padro 10mg/dL: reconstituir a soluo NMERO DE TESTES Tcnica Macro - 104 testes Tcnica Micro - 208 testes EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSRIOS NO FORNECIDOS Espectrofotmetro ou fotocolormetro capaz de medir a absorvncia em 530nm ou ltro verde. pela adio de 5mL de gua destilada e agitar. Aps 10 minutos, a soluo est pronta para uso. Estvel por 8 dias, se armazenada entre 2-8oC. DETERMINAO DO FATOR (F) Como a diluio do soro diferente nas tcnicas macro e micro, faz-se necessria a determinao de um fator para cada modalidade.

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TCNICA MACRO Rotular 3 tubos de ensaio de P (padro) e adicionar a cada um: Nitrito de Sdio Reagente sulfanlico gua destilada Soluo Padro 2 gotas 4 gotas 4 mL 200L

O kit de Bilirrubina Doles possui padro no intervalo de linearidade da metodologia de Sims-Horn. O laboratrio deve realizar o ensaio com o padro que acompanha o kit e calcular seu fator de calibrao (F), de acordo com o exemplo acima. O fator deve ser refeito a cada lote do produto. DETERMINAO DA AMOSTRA TCNICA MACRO Antes de iniciar as dosagens, ler atentamente os itens a seguir: A ordem de adio dos reagentes de fundamental importncia para a obteno de resultados satisfatrios. A alterao da adio dos reagentes compromete a formao do diazo-reagente tendo como consequncia resultados falsamente diminudos. No gotejamento dos reagentes nitrito de sdio e sulfanlico, o frasco deve ser mantido na posio vertical, afim de se evitar que a gota caia pelas paredes do tubo, o que levar ao comprometimento da formao do diazo-reagente. Identicar 3 tubos de ensaio com B (branco), BD (bilirrubina direta), BT (bilirrubina total). Proceder como segue:
B Nitrito de Sdio Reagente sulfanlico gua destilada Soluo aceleradora Amostra 4 gotas 4 mL 200L BD 2 gotas BT 2 gotas

Misturar, deixar repousar por 3 minutos e ler os tubos P, zerando o aparelho com gua destilada, em 530nm ou ltro verde. TCNICA MICRO Rotular 3 tubos de ensaio de P (padro) e adicionar a cada um: Nitrito de Sdio Reagente sulfanlico gua destilada Soluo Padro 1 gota 2 gotas 2 mL 50L

Misturar, deixar repousar por 3 minutos e ler os tubos P, zerando o aparelho com gua destilada, em 530nm ou ltro verde. CLCULO DO FATOR
Fator (F) =

4 gotas 4 gotas 4 mL 200L 4 mL 200L

10
absorvncia P

Leituras: Padro 0,396; 0,394; 0,395 Mdia aritmtica: 0,395 F= 10 0,395 = 25,31

CURVA DE CALIBRAO
Padro Absorvncia Conc.
(gm/dL)

1 2 3 4 5 6 7

0.000 0.078 0.198 0.395 0.590 0.800 0.910

0 2 5 10 15 20 25

Misturar por agitao o contedo dos 3 tubos e deixar repousar por 3 minutos (20-30oC). Ler as absorvncias de BD e BT, em espectrofotmetro ou fotocolormetro, ajustando o zero do aparelho com o respectivo branco em 530nm ou ltro verde. A cor nal permanece estvel por 30 minutos, temperatura de 20-30oC. A sensibilidade do sistema est diretamente relacionado com a sensibilidade do equipamento de leitura. TCNICA MICRO Antes de iniciar as dosagens ler atentamente os itens a seguir: Utilizar a tcnica micro somente para dosagens em amostras com bilirrubinas elevadas (amostras ictricas). Ateno! A tcnica micro inadequada para dosagem de bilirrubinas em amostras de soro com aspecto fsico normal. A ordem de adio dos reagentes de fundamental importncia para a obteno de resultados satisfatrios. A alterao da adio dos reagentes compromete a formao do diazo-reagente tendo como consequncia resultados falsamente diminudos. No gotejamento dos reagentes nitrito de sdio e

A curva de calibrao demonstra a linearidade da reao at uma determinada concentrao, na qual pode ser determinado um fator de calibrao (F),de acordo com a Lei de Beer. A reao linear entre 0 e 20mg/dL (ver curva acima). Obtendo-se valores mais elevados, dilui-se a amostra com soluo siolgica e procede-se nova dosagem. Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluio.

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sulfanlico, o frasco deve ser mantido na posio vertical, afim de se evitar que a gota caia pelas paredes do tubo, o que levar ao comprometimento da formao do diazo-reagente. Identicar 3 tubos de ensaio com B (branco), BD (bilirrubina direta), BT (bilirrubina total). Proceder como segue:
B Nitrito de Sdio Reagente sulfanlico gua destilada Soluo aceleradora Amostra 2 gotas 2 mL 50L BD 1 gota 2 gotas 2 mL 50L BT 1 gota 2 gotas 2 mL 50L

Amostras com teor de Hemoglobina acima de 30 mg/dL produzem resultados falsamente elevados na Bilirrubina total e falsamente diminuidos na determinao da Bilirrubina direta. Avaliao da concentrao de Hemoglobina em uma amostra hemolisada (estimativa): 1- Adicionar 50 L da amostra em 2,0mL de soluo siolgica. 2-Ler a absorvncia em 405nm. Zerar o aparelho com gua. Hb (mg/dL) Absorvncia
405

x 601

Misturar por agitao o contedo dos 3 tubos e deixar repousar por 3 minutos (20-30oC). Ler as absorvncias de BD e BT, ajustando o zero do aparelho com o respectivo branco em 530nm ou ltro verde. A cor nal permanece estvel por 30 minutos, temperatura de 20-30oC. CLCULO DA AMOSTRA
Bilirrubina total (mg/dL) = absorvncia BT x F Bilirrubina direta (mg/dL) = absorvncia BD x F Bilirrubina indireta (mg/dL) = BT - BD Exemplo: BD: 0,010 BT:0,040 Bilirrubina total (mg/dL) = 0,040 x 25,31 = 1,01 Bilirrubina direta (mg/dL) = 0,010 x 25,31 = 0,25 Bilirrubina indireta (mg/dL)= 1,01 - 0,25 = 0,76

A bilirrubina extremamente fotossensvel, devendo o soro ser mantido ao abrigo da luz e refrigerado. O uso de plasma cujo sangue foi colhido com anticoagulante base de EDTA contra-indicado. O sal EDTA reage com Benzoato de Sdio formando-se cido Benzico. Este, insolvel, precipita-se e turva a soluo. leitura, no espectrofotmetro, teremos resultados falsamente elevados. CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA 1. A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado so de fundamental importncia para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos. Resqucios de produtos de limpeza nos tubos de ensaio podem ocasionar resultados falsamente elevados. 2. A gua utilizada na limpeza do material, no preparo dos reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade. 3. Colunas deionizadoras saturadas liberam ons diversos, aminas e agentes oxidantes, que deterioram os reagentes. 4. As pipetagens devem ser precisas. 5. O uso de soro controle de referncia deve ser uma prtica rotineira do laboratrio. Recomenda-se utilizar um soro controle com valor na faixa de normalidade (soro controle N - Doles) e outro soro controle de valor elevado (soro controle P - Doles). 6. A sensibilidade do sistema est diretamente relacionada com a sensibilidade do equipamento de leitura. VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Como orientao sugerimos os seguintes valores: Bilirrubina direta at 0,4mg/dL Bilirrubina total at 1,2mg/dL SIGNIFICADO CLNICO A bilirrubina o produto final da degradao da hemoglobina. Como esse processo ocorre nas clulas hepticas, nveis alterados de bilirrubina indicam alteraes hepatocelulares, obstruo biliar ou ictercia hemoltica. A hiperbilirrubinemia ocorre nas seguintes condies: no recm nascido, podendo atingir 12mg/dL, na ictercia obstrutiva, na ictercia hepatocelular (parenquinatosa), nas hepatites por vrus e na necrose heptica aguda, havendo predominncia da bilirrubina direta (BD). As ictercias por hemlise so secundrias anemia hemoltica, hemoglobinria paroxstica, policitemia, malria, transfuso de sangue incompatvel e anemia

LIMITAES DO SISTEMA Para se obter timo desempenho do sistema, necessrio que o procedimento tcnico seja rigorosamente seguido conforme instrues de uso. Qualquer alterao poder levar a resultados errneos. A bilirrubina indireta no hidrossolvel e para reagir com o diazo-reagente necessrio a adio de um componente que a torne hidrossolvel. A soluo aceleradora torna a frao indireta hidrossolvel, possibilitando a reao com o diazo-reagente. Alm da aceleradora fatores interferentes podem torn-la hidrossolvel antes mesmo de proceder a reao, o que levaria neste caso uma BD alterada no por motivos biolgicos. Os interferentes mais conhecidos so luz e temperatura. A literatura relata que a bilirrubina possui uma estrutura conformacional chamada trans . Na presena de luz a conformao desta molcula muda de trans para cis (posio que torna a bilirrubina hidrossolvel). Nestas condies, pores de bilirrubina indireta, solubilizadas, reagem de maneira idntica bilirrubina direta. Em pacientes anictricos pode haver um aumento articial da bilirrubina direta, tendo resultados nais de bilirrubina direta prxima ou at superior a total. Amostras com teor de Triglicrides maior de 200mg/ dL produzem resultados falsamente diminuidos.

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hemoltica do recm nascido (eritroblastose fetal). Nessas situaes a BD est pouco elevada, havendo ntida predominncia da bilirrubina indireta (BI). A determinao da bilirrubina no lquido amnitico de importncia fundamental no diagnstico pr natal da enfermidade hemoltica. Valores menores que 0,1 mg/dL so considerados normais, enquanto que valores entre 0,1 e 0,27mg/dL so encontrados somente em presena de eritroblastose fetal. CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO Foram realizados 44 testes em amostras cujo teor de bilirrubina se situava no intervalo de 0,45 a 23mg/dL. Esses ensaios foram realizados em paralelo com uma metodologia de referncia. A comparao do kit de Bilirrubina Doles (Y) com a metodologia mencionada (X) deu origem seguinte equao de regresso linear: Y= 0,30 + 1,01X, sendo o coeciente de correlao 0,99. Testes de recuperao mostraram ndice de recuperao equivalente a 97 3,5%. O erro da mdia foi de 1,96%. Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 2 amostras, obtendo-se os seguintes resultados:
Amostra 1 Amostra 2 Concentrao (mg/dL) Desvio padro Coeciente de variao (%) 1,21 0,06 4,96 16,00 0,32 2,00

Substncias interferentes: a dosagem de bilirrubina total em plasma contendo EDTA apresenta resultados elevados. O EDTA existente no plasma reage com Benzoato de Sdio, com formao de cido Benzico. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA Jendrassik, L., e Grof, P.: Biochem. Z.297,81, 1938. Sims, F.H., Horn, C.: Am.J. Clin. Path.29: 412, 1958. Malloy, H.T. e Evelyn, K.A., J.: Biol. Chem. 119, 481, 1973. Tibrcio, H.M.: Controle Interno da Qualidade Analtica, 1aed. maro/1995. Henry, J.B.: Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 19a ed, 258-260, 1996. BURTIS, Carla., ASHWOOD, Edward R. Tiez Textbook of Clinical Chemistriz. 3a ed. Philadelphia: Saunder, 1999.p.1133-1136. Doles: dados de arquivo. TERMOS E CONDIES DE GARANTIA DA QUALIDADE DO PRODUTO As garantias do fabricante ao consumidor seguem estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1.990 - Cdigo de Defesa do Consumidor. Os reagentes que compem este sistema para diagnstico so garantidos na sua performance, reprodutibilidade e qualidade at a data de vencimento. Os produtos que apresentarem problemas tcnicos comprovados sero substitudos, sem nus para o consumidor. Doles Reag. Equip. para Laboratrios Ltda. CNPJ: 01.085.513/0001-05 Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07 Chcara Retiro, Conjunto Palmares. CEP: 74775-027 Goinia - GO Brasil e-mail: doles@doles.com.br M.S.: Reviso: no 10231810035 16 (04/2010)

Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens, durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes resultados:
Amostra 1 Amostra 2 Concentrao (mg/dL) Desvio padro
Coeciente de variao (%)

1,21 0,06 4,96

17,90 0,54 3,01

Especificidade: A metodologia de Sims-Horn especca para determinao de bilirrubina, sendo a mesma detectada em baixas concentraes. Sensibilidade: a absorvncia encontrada, de 0,005, corresponde a 0,125mg/dL de bilirrubina direta e a absorvncia encontrada, de 0,010, corresponde a 0,25mg/dL de bilirrubina total, quando realizados os testes em espectrofotmetro, a 530nm. A sensibilidade do sistema est diretamente relacionada com a do aparelho utilizado no laboratrio. Diluio da matriz: estudos sucessivos de diluio da matriz mostraram que no h interferncia na sensibilidade diagnstica da presente metodologia de Sims-Horn.

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