UNIVERSIT DU QUBEC

MMOIRE PRSENT L'UNIVERSIT DU QUBEC A CHICOUTIMI COMME EXIGENCE PARTIELLE DE LA MATRISE EN RESSOURCES RENOUVELABLES

PAR MOHAMMED BOUHAJIB B.Sc. (CHIMIE)

ANALYSE DES GLYCOSIDES DE PICEA MARIANA (Mill.) B.S.P. MAI 1992

bibliothque
Paul-Emile-Bouletj

UIUQAC

Mise en garde/Advice
Afin de rendre accessible au plus grand nombre le rsultat des travaux de recherche mens par ses tudiants gradus et dans l'esprit des rgles qui rgissent le dpt et la diffusion des mmoires et thses produits dans cette Institution, l'Universit du Qubec Chicoutimi (UQAC) est fire de rendre accessible une version complte et gratuite de cette uvre. Motivated by a desire to make the results of its graduate students' research accessible to all, and in accordance with the rules governing the acceptation and diffusion of dissertations and theses in this Institution, the Universit du Qubec Chicoutimi (UQAC) is proud to make a complete version of this work available at no cost to the reader.

L'auteur conserve nanmoins la proprit du droit d'auteur qui protge ce mmoire ou cette thse. Ni le mmoire ou la thse ni des extraits substantiels de ceux-ci ne peuvent tre imprims ou autrement reproduits sans son autorisation.

The author retains ownership of the copyright of this dissertation or thesis. Neither the dissertation or thesis, nor substantial extracts from it, may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.

RSUM
Dans ce projet de recherche nous avons analys les glycosides de l'pinette noire. Cette analyse comporte deux parties:

1) - l'analyse des glycosides sans transformation chimique. Les glycosides sont extraits du matriel vgtal sec par solvant Par des techniques de chromatographie liquide (CCM, CLP et CLHP), quatre glycosides phnoliques sont purifis. Des structures bases sur des donnes spectroscopiques ( RMN XH et proposes. Dans les quatre glycosides, le sucre est le (5-D-glucose.
13

C et SM) sont

2) - l'analyse des aglycones des glycosides aprs hydrolyse. Une fois les substances volatiles limines de l'extrait des glycosides, ce dernier subit un hydrolyse enzymatique pour librer les aglycones. Deux enzymes sont utilises pour comparer leur efficacit de l'hydrolyse des glycosides. Les aglycones libres sont extraites par le pentane et le pentane et l'ther (l:l/v:v), et analyses par chromatographie en phase gazeuse sur deux colonnes capillaires (DB-5 et Supelco-10). La comparaison des pourcentages relatifs des aglycones a rvl que la (3-glucosidase est plus efficace pour hydrolyser les glucosides phnoliques et la cellulase est plus efficace pour hydrolyser les glucosides monoterpniques.

tant donn l'importance des glycosides comme source supplmentaire de produits volatils de l'pinette noire, l'objectif de ce travail tait d'valuer la qualit et la quantit des aglycones des glycosides et d'analyser la structure de certains glycosides par des mthodes spectroscopiques.

Ill

REMERCIEMENTS
Je tiens remercier trs sincrement toutes les personnes qui de prs ou de loin ont contribu la ralisation de ce projet Ces remerciements vont principalement mon directeur de thse, le professeur Franois-Xavier Garneau pour sa disponibilit, son esprit critique, son enthousiasme et son soutient financier manifests lors de la ralisation de l'ensemble du projet. Je remercie galement le professeur Guy J.Collin pour ses conseils et son support logistique qui m'ont permis de mener bien cette recherche.

J'offre galement mes remerciements au professeur Michel J. Gagon pour sa collaboration technique sur le CG-SM et le professeur John ApSimon pour sa collaboration sur le SM et RMN. Je tiens aussi remercier Mmes. Francine Belleau, et Hlne Gagnon et M. Andr Barrette pour leur soutien technique.

Ce travail a t ralis grce l'appui cit plus haut, mais aussi grce mes parents et mon frre Abdelah qui m'ont donn la chance d'entreprendre un tel travail hors de mon pays. Et je remercie grandement la fondation de l'Universit du Qubec Chicoutimi (FUQAC) pour avoir subventionn ce projet de recherche.

IV

TABLE DES MATIRES

RSUM REMERCIEMENTS LISTE DES FIGURES LISTE DES TABLEAUX LISTE DES ANNEXES LISTE DES ABRVIATIONS ii iii viii ix x xi

SECTION I : REVUE DE LITTRATURE ET MATRIEL CHAPITRE I : REVUE DE LA LITTRATURE SUR LES GLYCOSIDES
PRCURSEURS D'ARMES INTRODUCTION 1.2 MTHODES D'EXTRACTION DES GLYCOSIDES U MTHODES D'ANALYSE DES GLYCOSIDES CHAPITRE I I : DESCRIPTION BOTANIQUE DE P1CEA MARIANA (Mill) B.S.P. 2.1 GNRALITS

2 2 5 9

12 12 13 15 16

2.2 DESCRIPTION DE L'ARBRE. 2.3 DISTRIBUTION GOGRAPHIQUE 2.4 SITE D'CHANTILLONNAGE

SECTION II : MTHODES D'EXTRACTION E T D'ANALYSE DES GLYCOSIDES CHAPITRE I : QUELQUES PRINCIPES ET THORIES DES MTHODES D'EXTRACTION DE PURIFICATION ET D'ANALYSE. 1.1 MTHODES D'EXTRACTION

17

18 18

1.1.1 Extraction au Soxhlet 1.1.2 Extraction liquide-liquide 1.1.3 Extraction avec un appareil Likens-Nickerson 1.2 LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE 1.2.1 La chromatographie liquide sur couche mince (CCM) 1.2.2 Chromatographie liquide basse pression sur colonne preparative 1.2.2.1 Remplissage de la colonne preparative 12.22 Paramtres d'optimisation d'une sparation sur colonne 1223 Sparation sur la colonne preparative basse pression 12.3 Chromatographie liquide haute pression (CLHP) 1.2.3.1 Quelques principes et thorie de la chromatographie 1.2 LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CG) ET LA CG-SM 1.2.1 Chromatographie en phase gazeuse (CG) 1.2.2 La CG couple un spectromtre de masse (CG-SM) 1.3 LA RSONANCE MAGNTIQUE NUCLAIRE (RMN) *H et 13C a) Thorie de la RMN b) Dplacement chimique c) Couplage de deux spins CHAPITRE I I : MTHODES EXPRIMENTALES APPLIQUES L'TUDE DES GLYCOSIDES DE PICEA MARIANA 2.1 EXTRACTION DES GLYCOSIDES INTACTS 2.2 ANALYSE DES GLYCOSIDES INTACTS 2.2.1 Analyses et sparation des glycosides par CL 2.2.1.1 Analyse par CCM

19 19 21 22 24 28 28 31 32 33 36

41 41 42 44 45 46 48

50 50 53 53 53

VI

2.2.1.2 Sparation sur colonne preparative 2.2.1.3 Chromatographie CLHP 2.2.2 Analyse des glycosides par RMN (H et 13C) et SM 2.3 ANALYSE DES AGLYCONES DES GLYCOSIDES 2.3.1 Hydrolyse enzymatique des glycosides 2.3.2 Hydrolyse acide des glycosides 23.3 Analyse des aglycones par CG et CG-SM SECTION III : Rsultats CHAPITRE 1 : EXTRACTION, PURIFICATION ET ANALYSES DES GLYCOSIDES INTACTS 1.1 EXTRACTION ET PURIFICATION DES GLYCOSIDES INTACTS 1.1.1 Extraction et pr-purification des glycosides 1.1.2 Purification des glycosides par CLHP U ANALYSES DES GLYCOSIDES PAR LARMNDU^ET^CETSM CHAPITRE 2 : EXTRACTIONS ET ANALYSES DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSE ENZYMATIQUE 2.1 ANALYSE DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSE ENZYMATIQUE. 2.2 ANALYSE DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSE ACIDE SECTION IV : DISCUSSION

55 56 57 57 57 58 58 61

62 62 62 65

68

77 77

82 84 85 85

CHAPITRE I : EXTRACTION ET PURIFICATION DES GLYCOSIDES 1.1 EXTRACTION DES GLYCOSIDES

vii

1.2

PURIFICATION DES GLYCOSIDES

86

CHAPITRE I I : INTERPRTATION DES DONNES SPECTROSCOPIQUES 2.1 DTERMINATION DES STRUCTURES DES GLYCOSIDES

90 90

CHIMIQUES DU 1H et 13c 2.2.1 GLUCOSIDE#1 2.2.2 GLUCOSIDE#2 2.2.3 GLUCOSIDE#3 2.2.4 GLUCOSIDE#4 CHAPITRE III : ANALYSES DES AGLYCONES OBRES PAR HYDROLYSES 3.1 EXTRACTION ET ANALYSES DES AGLYCONES

99 99 107 111 115

119 119

3.2 AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSES ENZYMATIQUES.... 121 3.2.1 Comparaison de l'efficacit des deux enzymes 122 3.2.2 Nature et abondance des aglycones dans les conifres 123 a) Alcools aliphatiques non terpniques 123 b) Alcools aromatiques 124 c) Les monoterpnes 125

CONCLUSION ANNEXE BIBLIOGRAPHIE

131 134 169

VIII

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Voie de mtabolisme de d-nomenthyl-b-D-glucoside dans les rhizomes de la menthe Figure 2 : Voie de conversion du camphre en glucoside. Figure 3 : Photos des diffrentes parties de Picea mariana Figure 4 : Distribution naturelle de l'pinette noire Figure 5 : Site de l'chantillonnage de Picea mariana Figure 6 : Schma d'un extracteur de Soxhlet Figure 7 : Schma d'un extracteur de Iikens-Nkersori , Figure 8 : Montage de remplissage des colonnes haute pression Figure 9 : Les composantes principales d'un systme CLHP Figure 10: Mesure du degr de sparation entre deux pics Figure 11 : Plan d'extraction, de purification et d'analyse des glycosides intacts Figure 12: Plan d'extraction et d'hydrolyse des glycosides intacts et analyse des aglycones libres Figure 13: Analyse des fractions de CLP par CCM Figure 14: Optimisation de la sparation des fractions 32 42 regroupes Figure 15: Sparation des glycosides des tractions 74 109 regroupes Figure 16: Quelques glucosides aromatiques modles Figure 17: Mcanisme de fragmentation du glucose Figure 18: Les six structures possibles pour le glucoside #1 Figure 19: Structure complte du glucoside #1 Figure 20: Mcanisme de fragmentation de l'aglycone Figure 2 1 : Structure complte du glucoside #2 Figure 22: Mcanisme de fragmentation de l'aglycone Figure 2 3 : Structure complte du glucoside #3 Figure 24: Structure complte du glucoside #4

4 5 14 15 16 20 20 30 35 40 51 52 64 66 67 96 100 103 106 106 110 110 114 118

IX

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Comparaison entre deux mthodes d'extraction des aglycones aprs hydrolyse Tableau 2 : Conditions d'oprations typiques de la CLBP-P T a b l e a u 3 : Caractristiques des principaux dtecteurs de la CG Tableau 4 : Conditions chromatographiques Tableau 5 : Dplacements chimiques de RMN du Glucoside #1 Tableau 6 : Dplacements chimiques de RMN du Glucoside #2 Tableau 7 : Dplacements chimiques de RMN du Glucoside #2 et #3 Tableau 8 : Dplacements chimiques de RMN du Glucoside #4 Tableau 9 : Aglycones volatiles libres par hydrolyse enzymatique des glycosides des ramilles Tableau 10: Aglycones volatiles libres par hydrolyse enzymatique des aiguilles Tableau 11: Aglycones volatiles libres par hydrolyse acide des glycosides Tableau 12: Dplacements chimiques du 13C des glucosides aromatiques Tableau 13: Dplacements chimiques du 1 H et (constantes de couplages) de trois D-aldohexoses Tableau 14: Noyaux benzniques di-substitus en positions 1 et4 Tableau 15: Noyaux benzniques di-substitus en positions 1 et2 Tableau 16: Noyaux benzniques tri-substitus en positions I , 2 e t 4 Tableau 17: Valeurs calcules de d (ppm) des six structures possibles Tableau 18: Valeurs calcules de d (ppm) des six structures possibles Tableau 19: Aglycones volatiles libres par hydrolyses enzymatiques Tableau 20: Les aglycones terpniques libres par des hydrolyses enzymatiques Tableau 21 : Aglycones volatiles libres par hydrolyse acide des glycosides 8 31 43 60 70 73 74 76 78 80 83 83 94 95 95 97 97 98 104 113 127 129 130

LISTE DES ANNEXES

ANNEXE I : SPECTRES DES GLUCOSIDES PURIFIS ANNEXE I I : EXEMPLE DE CHROMATOGRAMMES DE CPG ANNEXE III: SPECTRES DE MASSE DES AGLYCONES 134 149 153

XI

LISTE DES ABREVIATIONS

CL : CLP : CLHP : CG : CG-SM :

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE PREPARATIVE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PRESSION CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE COUPLE UN SPECTRE DEMASSE

CCM :

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SUR COUCHES MINCES

REVUE DE LITTRATURE ET MATRIEL

CHAPITRE I

REVUE DE LA LITTRATURE SUR LES GLYCOSIDES PRCURSEURS D'ARMES

INTRODUCTION

Les armes ou les substances odorantes occupent une place trs importante dans la vie quotidienne de l'homme. Malgr la concurrence des armes de synthse il y a toujours une plus forte demande pour les substances d'origine naturelle. L'orientation actuelle des industries agroalimentaires et cosmtologiques implique un recours croissant l'aromatique. Les plantes aromatiques, les fruits et les fleurs constituent la source principale de ces produits. ct de cette source traditionnelle, le dveloppement des technologies et l'intrt croissant des scientifiques pour l'tude des formes lies des composs d'armes et/ou de parfums, offrent aujourd'hui des opportunits de cration de nouvelles mthodes de production des substances odorantes. Ces substances, lies un ou plusieurs sucres, sont restes longtemps inconnues. Les travaux de Francis et Allcock sur la dtection des glucosides de granyle, nryle et de citronellyle dans les ptales de rose1, signalaient le dbut de la recherche dans ce domaine. E. Stahl-Biskup2 a publi en 1987 un inventaire des tudes qui ont t ralises dans ce domaine et elle n'a rapport que 25 publications portant sur l'identification de vingt deux monoterpnes glycosides diffrents provenant de 25 plantes d'espces diffrentes. Certaines tudes ont t ralises pour comprendre le rle que ces substances jouent dans la plante, leurs liens avec les produits volatils qui ne sont pas lis des sucres et leur importance dans le mtabolisme de la plante.

1.1

LE RLE DES GLYCOSIDES DANS LA PLANTE

Les glycosides sont des substances constitues d'un ou plusieurs glucides et une substance non glucidique, l'aglycone. En ce qui concerne la nature des sucres qui constituent la partie glucidique de ces glycosides, les tudes bases sur l'utilisation des techniques de sparation et d'identification comme la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie liquide, la rsonance magntique nuclaire, la spectromtrie de masse... dmontrent que dans 80 % des cas les aglycones sont lies au glucose sous la forme "p-D-glucopyranoside" 2>5. Les aglycones identifies sont principalement des monoterpnes acycliques ou cycliques, des composs noyau aromatique et des molcules norisoprnodiques 13 atomes de carbone5. Stahl-Biskup2 a prsent vingt deux structures de monoterpnes qui sont trouvs sous forme de glucoside et qu'elle a class en deux catgories, quatorze monoterpnes habituels, ceux qu'on trouve souvent, et les non habituels. Cependant, le plus important c'est que certains produits sont retrouvs dans les plantes sous forme de glycosides plus souvent que les autres; le graniol, le nrol, le linalol, le a-terpinol ainsi que des alcools benzyliques. Les quatre premiers produits ont un rapport troit avec la biosynthse des monoterpnes libres dans les plantes. Quelques tudes ont t ralises pour dmontrer l'implication directe ou indirecte des glycosides dans la biosynthse des produits volatils libres dans les plantes.

Pour dterminer le rle des glycosides, R. Croteau3 a ralis des expriences sur les feuilles de sauge (Salvia et in officinalis) et de la menthe (Mentha piperi ta) in vivo

vi tro en introduisant des monoterpnes marqus, (d-)-camphre et le (Z-)-menthone,

pour dterminer leurs transformations dans diffrentes parties de la plante. Les rsultats ont dmontr une premire vidence, qui confirme les suggestions qui avaient t proposes auparavant par d'autres chercheurs, que les monoterpnes glycosides sont des drivs qui transportent les monoterpnes travers les tissus de la plante. Les monoterpnes libres sont des

substances lipophiliques; pour pouvoir se dplacer dans la plante des sites de production aux sites de stockage ils doivent tre solubles dans l'eau. La forme glycosidique leur confre cette proprit. La grande partie de /-menthone introduit dans la plante se transforme en tf-nomenthol puis en tf-nomenthyl glucoside par des enzymes spcifiques. Au niveau des rhizomes dans les feuilles de M. piper i ta le glucoside est hydrolyse et l'aglycone est reconvertie en menthone

avant de subir d'autres transformations (fig. 1).

CO-S-CoA

6 Acetate unit*

-Neomenthyl glucoside

rf-Neocnenthol

/-Mnthon

/-3,4-Menthon loetone

Figure 1:

Voie de mtabolisme de tf-nomenthyl-|3-D-glucoside dans les rhizomes de la menthe

Dans la sauge, le J-camphre se transforme en glucoside suivant le mcanisme indiqu dans la figure 2. Il est accept que les glandes de chaque espce sont capables de produire les constituants majeurs caractristiques de l'espce partir d'un prcurseur grce leurs enzymes spcifiques3. L'observation que les glycosides agissent comme drivs de transport des monoterpnes a t mise en vidence en injectant du graniol dans le trognon d'une pomme; le

graniol a t rapidement transform en granyl P-D-glucoside et transport dans la chaire de la pomme o il est mtabolis en d'autres produits4.

O-Glucose O C-O-Glucose Camphre 1,2-CamphoIide

Figure 2: Voie de conversion du d-camphre en glucoside.

Le rle des monoterpnes glycosides dans les plantes ne se limite pas seulement des drivs de transport de ces produits. Stahl-Biskup2 concluait en s'appuyant sur les travaux d'autres chercheurs, que les monoterpnes glycosides peuvent jouer plusieurs rles. Les monoterpnes glycosides ont un lien troit avec la biosynthse des monoterpnes libres. Dans les voies biosynthtiques suggres dans la littrature, les produits intermdiaires sont prsents sous forme d'ions qui ne peuvent pas exister dans la plante l'tat libre. C'est sous forme de glycosides que ces produits intermdiaires existent puisqu'ils prsentent aussi un moyen de transport.

1.2

MTHODES D'EXTRACTION DES GLYCOSIDES

Les glycosides, prcurseurs d'armes, sont des substances qu'on trouve dans les plantes caractristiques des huiles essentielles. Le matriel vgtal est une matrice de substances

organiques trs complexe. L'extraction des glycosides d'une plante ncessite l'limination d'un trs grand nombre de substances lipophiliques (huiles essentielles, lipides, alcanes, acides gras etc..) et d'autres produits hydrophiiiques (sucres, pigments etc..) dont certains peuvent tre solubles dans les mmes solvants que les glycosides. Lors de l'extraction des glycosides, la destruction des tissus de la plante est invitable provoquant ainsi l'activation de certains enzymes, surtout les hydrolases et les glycosidases, qui peuvent affecter la structure des glycosides2. Pour cette raison le broyage des tissus de la plante doit se faire dans des conditions qui permettent l'inactivation des enzymes. Le broyage du matriel vgtal dans le mthanol bouillant2 ou dans l'eau bouillante6 permet d'arrter immdiatement l'activit des enzymes. Cela peut se faire aussi dans de l'azote liquide pour viter l'hydrolyse des glycosides par les enzymes naturelles de la plante78. La prsence des acides organiques dans la plante peut aussi affecter la structure des aglycones ou provoquer une hydrolyse acide des glycosides. Par consquent la stabilisation du pH de la solution, dans laquelle la plante est broye est ncessaire. L'addition d'un sel stabilise le pH de la solution et vite l'hydrolyse des glycosides. Svendsen 6 a utilis 6 g de carbonate de calcium dans 21 d'eau bouillante pour 300 g de matire vgtale pour extraire et analyser les glycosides de quatre varits de plante, sans donner de dtails sur le pH. Williams et al 9 ' 10 utilisent du NaCl pour saturer la solution aqueuse dans laquelle le matriel vgtal est homognis et une solution de NaOH ou de KOH pour ajuster l'acidit de la solution pH 7 afin de prvenir l'hydrolyse des glycosides.

Une fois le matriel vgtal broy et que l'hydrolyse acide ou enzymatique est vite, il faut procder l'limination des substances indsirables et l'extraction des glycosides. La complexit du mlange obtenu et la faible quantit des glycosides dans la solution rendent la tche trs difficile. Plusieurs mthodes ont t dveloppes pour extraire et analyser les glycosides dans les plantes. Chaque mthode utilise pour l'extraction des glycosides d'une plante n'est pas ncessairement exclusive pour cette dernire. Les diffrences entre les mthodes

d'extraction se situent au niveau des techniques et des solvants utiliss. L'limination des produits volatils libres peut se faire par extraction exhaustive avec un solvant apolaire10 (le pentane, l'hexane, l'oxyde d'thyle, le fron FI 1 etc). L'hydrodistillation est aussi un moyen d'liminer les produits volatils libres, suivie par l'extraction de la phase aqueuse avec un solvant apolaire6'13. D'autres mthodes font appel la chromatographie en phase liquide. Stahl-Biskup et al7 ont utilis la chromatographie liquide pour liminer les substances volatiles. Un extrait de mthanol d'une plante broye dans l'azote liquide (Hyssopus officinal i s ) est rduit 5

mL et mlang avec du gel de silice, le tout est dpos sur une phase stationnaire de gel de silice d'une colonne preparative (1,5 X 10 cm). Les substances volatiles libres sont limines par lution avec un mlange de n-hexane-actate d'thyle (1:1) et de dichloromthane. Les glycosides sont rcuprs par lution avec des solvants plus polaires, l'actate d'thyle suivi du mthanol. Williams et ai9"12 ont procd par extraction exhaustive, avec le fron F i l , du matriel vgtal broy dans une solution aqueuse sature avec du NaCl. Le volume de la phase aqueuse est rduit et lue avec du mthanol sur une colonne preparative phase inverse Cig pour liminer le sel ainsi que d'autres produits et ne rcuprer que les glycosides. Svendsen13 a fait une tude comparative de deux mthodes d'extraction des glycosides de la mme plante (Mentha spicata ) et les rsultats qu'il a obtenus sont prsents dans le tableau 1. Dans la

mthode (A) 50 g de matriel vgtal est stabilis dans 500 mL d'eau bouillante avec 2,5 g de carbonate de calcium. Les produits volatils sont limins par distillation pendant 4 heures. La solution aqueuse est filtre et extraite avec 250 mL de pentane suivi de 250 mL d'oxyde d'thyle pour liminer les traces des produits volatils. Les solvants organiques qui restent dans la phase aqueuse sont limins par evaporation sur un vaporateur rotatif la temprature de la pice. Dans la mthode (B) la mme quantit de matriel vgtal est broye dans l'azote liquide et extraite avec deux quantits diffrentes de mthanol (100 mL et 200 mL). Aprs filtration, l'extrait brut est lav avec de l'eau et la solution aqueuse-mthanol est vapore sous vide 45 C pour vaporer le mthanol. La solution aqueuse est filtre et dilue avec de l'eau

100 mL. Pour les deux solutions aqueuses obtenues avec 100 mL et 200 mL de mthanol, les produits volatils sont limins par extraction avec (2 x 100 mL) de pentane suivi de (2 x 100 mL) d'oxyde d'thyle. Les solvants organiques dans chaque phase aqueuse sont vapors sur un rota-vapeur 45 C. D'aprs les rsultats des analyses des extraits obtenus par les deux mthodes, la mthode (A) est de loin la plus efficace pour extraire les glycosides (voir Tableau 1). Cette mme mthode a t utilise par Svendsen pour extraire et analyser les glycosides dans 16 conifres14.

Tableau 1 Comparaison entre deux mthodes d'extraction des aglycones de M. spicata aprs hydrolyse. (t<0,5%et- = 0%)

Procdures d'extractions Produit Hexan-1-ol trans-Hex-3-en-l-ol cis-Hex-3-en-l-ol Octan-3-ol Oct-l-en-3-ol Linalool no-Dihydrocarvol (?) Dihydrocarvol iso-Dihydrocarvol (?) no-iso-Dihydrocarvol (?) trans-Carvol cis-Carvol Benzyl alcool Non identifi p-Phnylthanol Eugnol Non identifi 2-Mthoxy-4-vinylphnol A (eau) t t 4,1 t 1,1 t 0,8 6,2 0,5 1,0 2,1 B (mthanol : 100 mL) B (mthanol : 200 mL) t 2,1 t 1,1 t 19,0 2,9 0,5 t 3,4 6,2 9,1 3,6 7,2 5,6 2,8 0,6

t t _ 3,0 1,9 5,4 5,6 9,2 2,0

6,3 8,1 3,8 18,0 6,5 1,1

163

2,2
6,7 -

13

MTHODES D'ANALYSE DES GLYCOSIDES

L'analyse des glycosides peut se faire de deux faons. On peut analyser les aglycones aprs les avoir sparer des sucres par hydrolyse acide ou enzymatique, ou analyser les glycosides intacts aprs les avoir purifier.

a) Analyse des aglycones aprs hydrolyse Le rsidu obtenu aprs l'limination des substances volatiles libres est soumis une hydrolyse enzymatique ou acide. Pour analyser les aglycones originales des glycosides, sans qu'elles subissent des transformations chimiques, l'hydrolyse enzymatique est de loin la plus utilise. L'hydrolyse dans un milieu acide provoque des rarrangements, des liminations et des cyclisations des aglycones15. Les systmes enzymatiques utiliss sont nombreux, cependant les plus utiliss sont ceux qui contiennent le 0-glucosidase ou la cellulase comme enzyme principale dans le systme. Des tudes de comparaison des systmes enzymatiques ont t ralises par certains auteurs. Fabre et al16 ont tudi l'activit enzymatique de quinze systmes enzymatiques produits industriellement La concentration en systme enzymatique est telle que l'activit (3glucosidasique est la mme dans tous les cas. Les rsultats obtenus ont dmontr que le systme Rohament CW , cellulase comme enzyme principal, est le plus efficace. Williams et al15 ont compar la performance de cinq enzymes: Emulsin, P-glucosidase, P glucouronidase, Pectinase et cellulase. La cellulase s'est avre encore la plus commode pour les analyses qualitatives. Svendsen13 par contre a compar la performance entre le |3-glucosidase et le Pctinol. La quantit des produits volatils librs par le Pctinol est trs faible par rapport celles libres par le {3-glucosidase. Une prparation d'une emulsion d'amandes douces dont le f3-glucosidase est l'enzyme active est utilise.

Les produits volatils qui sont librs aprs hydrolyse sont extraits de la phase aqueuse

10

soit par un solvant apolaire, par hydrodistillation ou par un appareil de type Likens-Nickerson. La chromatographie en phase gazeuse est la technique principale utilise pour la sparation et l'analyse des aglycones. Un spectromtre de masse est souvent utilis comme dtecteur.

b) Analyse des glycosides intacts aprs purification L'analyse des glycosides intacts fait appel surtout aux techniques spectroscopiques, RMN (*H et
13

C), SM, IR et UV. La sparation et la purification des glycosides est une tape

dterminante. Les glycosides, qui ont t spars et analyss, constituent deux groupes; les glycosides dont la partie glycosidique est constitue d'un seul sucre et ceux qui ont plus qu'un sucre. La partie aglycone est en gnral un monoterpne cyclique ou acyclique, ou un phnol. L'examen d'une dizaine de travaux publis (rf. 17 26) sur les mthodes de sparation et de purification des glycosides par chromatographie liquide montre que la nature de la phase stationnaire utilise est trs souvent le gel de silice. Nous allons citer quelques exemples de purification des glycosides.

Miyakado et al 17 ont isol le (-)-cis-chrysanthnol O-0-D-Glucopyrannoside de Dicoria canes cens. Aprs extraction du matriel vgtal avec du CHCI3 pour liminer les

substances volatiles, 22 g de rsidu brut sont obtenus et spars sur une colonne de gel de silice (800 g) avec le systme de solvant CHCI3 : MeOH (9:1). La rcupration par fractionnement a donn 3,10 g de produit brut qui est recristallis deux fois par la suite pour donner 0,81 g de produit pur. Trois autres glucosides dont l'aglycone est un monoterpne non oxyd (non polaire) sont spars sur une colonne de gel de silice avec un systme de solvant CHCI3 : MeOH (20:1 et 10: l) 18 . La phlbotricoside, arbutine et la glucolutoline (aglycones polaires) sont isoles de la plante, viburnum phlebortrichum19. Le rsidu obtenu de l'extrait du MeOH (25 g) est

lue d'une colonne de gel silice (1 kg) avec CHCI3 : MeOH en augmentant progressivement le pourcentage du MeOH. Les fractions qui ont t lues avec CHCI3 : MeOH (19:1) sont

11

regroupes l'aide d'analyses sur couches minces. Le produit obtenu (7 g) est spar sur une deuxime colonne de gel silice (300 g) avec le mme systme de solvant. Une quantit de 1,1 g de phlbotricoside brut est obtenue. La purification est acheve par recristallisation dans le MeOH-CH- Le/wa-hydroxyquinone, arbutine et la glucolutoline sont obtenus par l'luant CHCI3 : MeOH (20:1-10:1). La phlbotricoside (phlbortrichine) a t isole de la mme plante mais en combinant la chromatographie liquide sur gel de silice et la chromatographie liquide contre courant, RLCCC (Rotation Locular Counter Current Chromatography)20. Le Sephadex LH-20 (luant: MeOH) est aussi utilis comme phase stationnaire pour purifier des fractions obtenues par chromatographie sur une colonne de gel de silice (CHCl3-MeOH-H2O) pour sparer des glycosides phnoliques et non phnoliques et dont la partie glycosidique est compose d'un ou deux sucres2123. Par contre des glycosides de mme nature que les prcdents ont t spars en utilisant strictement le gel de silice comme phase stationnaire22'24. Leong et al 25 ont compar la sparation de quatre glycosides phnoliques en utilisant des colonnes HPLC, une colonne phase inverse (Cig) et l'autre phase normale (gel de silice). Sur la colonne de gel de silice (CH2Cl2:CHCl3-8:l) les quatres glucosides sont parfaitement spars (Aglycone = vanilline, /wra-hydroxybenzaldhyde, acide vanillique et acide parahydroxy benzoque). Sur la colonne phase inverse Cis avec des conditions isocratiques (MeOH:H3PO4l0'3M-35:65), la sparation ne permettait pas de distinguer les quatres produits. Pour purifier six glucosides de Pinus sylvestris dont quatre sont phnoliques et deux ne

le sont pas, Andersson et al 26 ont eu recourt la chromatographie liquide sur colonne HPLC-Cig (35 % aq. MeOH et MeOH-HCO2H-H2O 25:1:75). Cependant le Sephadex LH-20 et gel de silice ont t utiliss respectivement pour fractionner l'extrait mthanolique brut de la plante.

Pour la dtermination des structures des glycosides purs, la combinaison des mthodes spectroscopiques, mentionnes plus haut, est utilise dans tous les cas.

12

CHAPITRE n

DESCRIPTION BOTANIQUE DE PICEA MARIANA (Mill.) B.S.P.

2.1

GNRALITS

Le Picea

mariana

(mill) B.S.P. fait partie des Spermatophytes qui comprennent la

masse des plantes vasculaires qui se divisent en deux sous-divisions: les Gymnospermes, avec 700 espces, et les Angiospermes, avec 200 000 espces. La plupart des Gymnospermes sont communment dsignes sous le nom des conifres. Au Qubec elles sont constitues du groupe des arbres toujours verts et le plus souvent rsineux. Ce groupe se rpartit en trois familles dans les genres27.

Plus prcisment, Picea

mariana

(mill) B.S.P., communment appele pinette

noire, fait partie de la famille d'pinettes qui comprend environ 40 espces, connu aussi sous le nom d'picas. On trouve sept espces en Amrique du Nord, et cinq au Canada. Outre les espces, plusieurs varits ont t signales dans diverses parties du Canada. On trouve gnralement des hybrides de l'pinette de S i tka, de l'pinette blanche et de l'pinette d'Engelmann l o leurs aires chevauchent. L'pinette noire et l'pinette rouge galement forment des hybrides dans les endroits o poussent en commun ces deux espces, mais on ne signale pas d'hybridation entre l'pinette blanche et l'pinette noire, ni entre l'pinette blanche et l'pinette rouge28.

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22

DESCRIPTION DE L'ARBRE HI

Le Picea

mariana

est un arbre de 8-20 m, en peuplement il a le tronc droit et

dpourvu de branches sur une grande partie de sa hauteur. La cime troite est forme de branches retombantes dont les bouts sont redresss. L'corce est mince, cailleuse et d'une couleur brun gristre fonc. Les rameaux sont d'une couleur brun fonc couverts de poils denses et cours; cailles extrieures des bourgeons gristres et duveteuses, pointe longue et troite dpassant le bout du bourgeon. Les cnes sont d'une longueur de 2 3 cm et d'une couleur violtre brun fonc. Ils sont ovodes et pointus, presque sphriques lorsqu'ils sont ouverts, contenant environ 30 cailles troitement imbriques et grossirement denticules. Les cnes peuvent persister 20-30 ans sur les branches, mais priodiquement ils librent des graines au cours de l'hiver. Toutefois il y a des graines qui restent dans les cnes pendant plusieurs annes. Floraison printanire. Les aiguilles sont persistantes et restent sur l'arbre cinq ans ou plus. Elle ont une longueur de 6-13 mm, trs fines, presque aciculaires, solitaires et disposes en spirale, formant une crte dcurrente et persistante la base. Leurs sections sont quadranguiaires et elles roulent facilement entre le pouce et l'index. Les crtes dcurrentes visibles sur les rameaux aident distinguer l'pinette des autres conifres. Seuls les Proches et les Ifs ont des feuilles dont la base ressemble celle des pinettes, mais leurs feuilles sont plates ou section semicirculaire. Les autres conifres feuilles plates, le sapin de Douglas (Pseudotsuga vrais sapins (Abies ), ont des rameaux lisses (fig. 3). ) et les

" 1 Informations prises des rfrences 27 et 28.

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Aiguilles assez droites, bout mousse

cailles de cne cicnticules; cne ferm (gauche) et cone ouvei*. i.dioiie!

La graine est presque noire

Noter la forte pubescence du rameau et les bases des aiguilles trs saillantes

A maturit, l'corce est mince et cailleuse

pinette noire en fort; quelques cimes un forme de plumeau

Figure 3: Photos des diffrentes parties de Pi cea

mariana

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23

DISTRIBUTION GOGRAPHIQUE

Le Picea

mariana

ou l'pinette noire est l'un des conifres les plus abondants du

nord de rAmrique. Son aire de distribution est trs vaste puisqu'on la retrouve dans toutes les provinces du Canada jusqu' la limite septentrionale des arbres29 (fig. 4). Elle est l'espce prdominante de la fort borale de l'est du pays. Sa distribution transcontinentale tmoigne de sa capacit s'adapter des conditions climatiques. Elle ne forme gnralement de peuplements purs que sur des sols superficiels, mal drains et froids o la comptition est faible. Une espce qui colonise un aussi vaste territoire a le potentiel de dmontrer une forte variabilit gntique de par ses populations qui possdent des stabilits gntiques ainsi que des capacits diffrentes coloniser des sites varis30. Cependant l'pinette noire trouvera son dveloppement optimal sur un sol assez bien ar et sous un climat frais et humide.
180

1609

140

120 100" 80

60

40

30 30
CHELLE APPROXIMATIVE 1:44 000 000 \ 130 120 110 100

80

70

Figure 4: Distribution naturelle de l'pinette noire29

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Dans la fort borale, l'pinette noire forme frquemment des peuplement purs qui occupent de vastes superficies. Dans la partie sud du Qubec, on retrouve les pessires pinettes noires dans des conditions daphiques particulires; elles occupent alors des superficies restreintes. De plus, l'pinette noire se trouve trs souvent associe au sapin baumier, au pin gris, l'pinette blanche, au mlze, au peuplier faux-tremble et au bouleau blanc29.

2.4

SITE D'CHANTILLONNAGE

La cueillette de Picea

mariana

(mill) B.S.P. a t effectue dans la rgion du

Saguenay et le Lac-St-Jean qui englobe, en les entourant, le Saguenay le Lac-St-Jean ainsi que les parcs Haute-Mauricie, Chibougamau et Chicoutimi. Elle est comprise entre les parallles 48 et 49 30' N et les mridiens 70 et 75 O 30 . Le site d'chantillonnage se situe au Lac Simoncouche, station de recherche de l'Universit du Qubec Chicoutimi, l'entre nord de la rserve faunique des Laurentides (fig. 5). SAGUENA Y LAC SAINT-JEAN CHARLEVOIX

Figure 5: Site de l'chantillonnage de Picea

mariana

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MTHODES D'EXTRACTION, ET D'ANALYSE DES GLYCOSIDES

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CHAPITRE I

QUELQUES PRINCIPES ET THORIES DES MTHODES D'EXTRACTION DE PURIFICATION ET D'ANALYSE

Ce chapitre dcrit quelques principes et thories de base des mthodes qui ont t utilises dans ce projet d'tude sur les glycosides de l'pinette noire. La chromatographie en phase liquide a t utilise comme mthode de sparation et de purification et la chromatographie en phase gazeuse a t utilise comme mthode de sparation et d'identification. La rsonance magntique nuclaire a t utilise pour dterminer la structure des produits purifis par chromatographie liquide.

1.1

MTHODES D'EXTRACTION

L'extraction par solvant est une technique trs utilise dans les laboratoires de chimie. Pour analyser n'importe quel produit naturel ou mlange de produits naturels, il faut d'abord procder par une extraction. Un mlange complexe qui contient des produits de diffrente nature peut tre simplifi. Par exemple, un solvant non polaire va extraire les produits non polaires. Les trois mthodes d'extraction qui ont t utilises dans ce travail sont dcrites dans les paragraphes suivants.

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1.1.1 Extraction au Soxhlet

L'extracteur de Soxhlet (fig. 6) est un appareil conu pour l'extraction continue solide liquide. Le matriel extraire est pulvris et mis dans une cartouche de papier pais et le tout est mis dans un rservoir siphon qui est surmont d'un rfrigrant. Sous l'ensemble, un ballon qui contient le solvant pour extraire les produits. Une fois prt le solvant est port ebullition pour procder l'extraction. Les vapeurs du solvant sont condenses dans le rfrigrant et le solvant s'accumule dans le rservoir siphon. Quand le solvant atteint un certain niveau, il amorce le siphon et retourne dans le ballon en entranant les substances dissoutes. La mme opration se rpte jusqu' ce qu'on arrte 1'ebullition du solvant. Cette mthode est efficace parce que le contact entre le matriel vgtal et le solvant est long (priode de remplissage du rservoir siphon); aussi elle est trs conomique au point de vue solvant mais ncessite plus de temps pour un rendement maximal.

1.12 Extraction liquide-liquide

L'extraction liquide-liquide est un moyen de faire passer une ou plusieurs substances d'un solvant, dans lequel elles sont souvent difficiles sparer, un autre, o elles seront facilement isolables. L'extraction est habituellement ralise dans une ampoule dcanter par agitation des deux solvants. Les deux solvants doivent tre trs peu ou pas miscibles l'un dans l'autre. Une fois que l'ampoule est au repos, les deux phases se sparent et on peut rcuprer les deux solvants. L'extraction est d'autant plus efficace que les substances extraire sont plus solubles dans le solvant d'extraction que dans leur solvant original.

20

Figure 6:

Schma d'un extracteur de Soxhlet

Figure 7:

Schma d'un extracteur de Likens-Nikerson

21

II arrive que la sparation entre deux phases n'est pas complte, mais qu'il se forme une emulsion, c'est--dire une zone intermdiaire contenant des gouttelettes d'une phase suspendue dans l'autre. Par exemple, la prsence d'agents tensioactifs (produits naturels, protines, etc. ) dans une phase aqueuse entrane la formation d'mulsion.

Diverses mthodes peuvent tre employes pour briser une emulsion31. - l'attente : en laissant reposer l'ampoule pendant une longue priode les deux phases peuvent se sparer; - filtration : 1'emulsion peut tre filtre sur la laine de verre ou simplement sur un filtre pliss. Il existe galement des papiers sparateurs de phase, imprgns d'un compos silicon, retenant la phase aqueuse et laissant passer la phase organique; - les agents chimiques : l'addition d'un sel inorganique ou l'introduction, directement dans l'mulsion, de quelques gouttes d'alcool peuvent provoquer la rupture d'une emulsion; - la centrifugation : l'mulsion, lorsqu'elle est importante, peut tre brise par centrifugation.

1.13 Extraction avec un appareil Likens-Nickerson

L'appareil Likens-Nickerson est utilis exclusivement pour l'extraction des produits volatils d'une solution aqueuse par un solvant organique non miscible et dont la densit est infrieure celle de l'eau (fig. 7). L'avantage majeur de cette technique est de pouvoir concentrer jusqu' mille fois les produits volatils en une seul tape32. En portant ebullition la solution aqueuse (ballon A) et le solvant organique (ballon B), la vapeur de l'eau se mlange avec les vapeurs du solvant organique (C) dans lesquels les produits volatils vont se dissoudre. Aprs condensation dans le rfrigrant, les deux phases sont spares (D). Les jonctions entre les deux ballons sont conues de manire ce que le solvant organique, dont la densit est infrieure celle de l'eau, revienne son point de dpart (ballon B) et l'eau aussi retourne son point de

22

dpart (ballon A) sans les produits volatils. Ainsi tout le long de l'extraction vapeur-vapeur les produits volatils passent de la phase aqueuse la phase organique o ils sont parfaitement solubles. C'est le fait d'utiliser un petit volume de solvant organique sans le changer au cours de toute l'opration de l'extraction qui rend cette technique trs efficace pour concentrer des produits volatils qui se trouvent en trs petite quantit dans un grand volume.

12

LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE (CL)

La sparation et la purification des produits organiques sont des tapes trs importantes qui prcdent la dtermination de leur structure par des mthodes spectroscopiques. Jusqu'en 1960, les techniques de cristallisation et de distillation trs efficaces taient largement utilises pour cette fin.

Ces mthodes qui sont lentes ncessitent des bonnes quantits de produits sparer. La distillation, limite aux produits volatils, est une technique exigeant beaucoup de dextrit surtout lorsqu'il s'agit de sparer des produits ayant des points d'bullition trs voisins. La cristallisation a aussi ses limites. Quand il s'agit de sparer deux isomres, ce n'est pas toujours facile raliser, mais surtout la purification d'un produit en trace (ex. un metabolite) dans un mlange complexe (ex. plasma) est une tche difficile raliser.

Bien que les premiers travaux sur la chromatographie liquide (CL), furent publis en 1906, par un botaniste Russe 33 , on considre, en gnral, que l'utilisation de cette technique a suivi la publication de Huber et Hulsman en 1967 34 . Jusqu' nos jours la chromatographie n'a pas cess de gagner en popularit. Cela est d son efficacit, sa rapidit rsoudre des problmes, ses sparations et analyses de mlanges complexes et sa simplicit d'utilisation.

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En chromatographie liquide, il y a toujours deux phases, une stationnaire (liquide ou solide) et l'autre mobile (liquide). La dsignation CL rfre l'tat physique de la phase mobile. On peut distinguer trois formes de CL: sur colonne, sur couches minces et sur papier. Mais les trois formes obissent aux mmes principes thoriques. Un des avantages majeur de la chromatographie liquide sur d'autres techniques de sparation se trouve dans la multiplicit des mcanismes diffrents avec lesquels la sparation chromatographique peut tre effectue. On peut choisir une forme de chromatographie en fonction des proprits physico-chimiques des diffrents constituants de l'chantillon analyser ou sparer. Les mcanismes de la chromatographie varient en fonction de la nature et de la forme du matriel qui est utilis comme phase stationnaire.

La nature de la phase stationnaire peut varier, de apolaire (ex. ODS: gel d'octadcyle silane) trs polaire (ex. gel de silice). Le mcanisme qui intervient dans la sparation est l'adsorption. Une phase stationnaire polaire a tendance retenir (adsorber) plus fortement les produits polaires que les produits non polaires ce qui est l'inverse d'une phase non polaire. On peut aussi utiliser des phases stationnants ioniques pour raliser une chromatographie d'change ionique, pairage ionique ou suppression ionique, dont les mcanismes reposent essentiellement sur des changes d'ions entre la phase stationnaire et l'chantillon sparer qui est transport par la phase mobile. Le choix appropri de pH des deux phases et des ions de la phase stationnaire est une tape trs importante qui doit tenir compte de la nature de l'chantillon et sous quelle forme on veut rcuprer les produits spars.

La chromatographie de permeation molculaire ou tamisage molculaire est une forme de chromatographie liquide o les soluts d'intrt sont spars par un mcanisme de permeation. Les plus grosses molcules ne sont pas retenues et dites totalement excluses; les plus petites sont dites totalement incluses. La sparation se fait donc uniquement selon la taille des molcules. Le

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support est en gnral un polymre (ex. polystyrne, polyacrilamide) dont on connat la taille des pores des particules. Plus les pores sont petits plus les petites molcules vont tre retenues.

Les diffrents types de chromatographies utiliss dans ce travail pour sparer et analyser les glycosides, extraits de l'pinette noire, vont tre traits dans les paragraphes qui suivent.

1.2.1 La chromatographie liquide sur couche mince (CCM)

La chromatographie liquide sur un support planaire comporte deux techniques populaires: la chromatographie sur papier (CP) et la chromatographie sur couches minces (CCM). La CP a prcd la CCM de 10 15 ans, et un grand nombre de sparations ont t ralises avec cette technique. Mais au dbut de 1957, la CCM a t dcouverte, et on a ralis que cette technique tait rapide, plus facile d'utilisation, plus reproductible et reprsentait moins d'inconvnients 33 .

Dans la chromatographie sur couches minces le dbit de la phase mobile ne peut pas tre contrl comme on peut le faire sur une colonne. Le dbit ou la vitesse de migration dpend de la tension de surface et de la viscosit de la phase mobile et aussi de la nature de la phase stationnaire. Cette dernire contient des capillaires, inter-relis, de diffrents diamtres. Au dpart la phase stationnaire est sche et une fois que la partie infrieure touche la phase mobile on a une migration du liquide vers le haut par action capillaire. L'homognit de la phase stationnaire mimmise les variations capillaires, ce qui permet une migration convenable du front de la phase mobile.

La phase stationnaire la plus utilise dans la CCM est le gel de silice. Une couche mince est applique sur une plaque de verre ou de plastique (rectangulaire ou carre). Pour avoir une

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couche stable l'addition d'unfixatifest ncessaire. En gnral on utilise du gypse (dsign par G) ou l'alcool polyvinyle (PVA).

L'utilisation de la CCM comporte quatre tapes : (a) le choix de la phase stationnaire et de la phase mobile, (b) l'application du produit, (c) le dveloppement et (d) la visualisation ou la rvlation des produits.

a) Le choix de la phase stationnaire Pour avoir une bonne sparation on doit optimiser l'affinit entre le mlange sparer, la phase mobile et la phase stationnaire. La premire chose considrer, c'est la nature des groupements fonctionnels des produits qu'on veut sparer et les solvants qu'on peut utiliser. Cela permettra de dfinir la nature de la phase stationnaire et mobile en se basant sur les informations qu'on peut trouver dans la littrature.

b) L'application des produits Le mlange des produits qu'on veut sparer doit tre compltement soluble dans la phase mobile. Le mlange, pralablement dissous dans un minimum de solvant, peut tre appliqu l'aide d'une micro-pipette ou d'un tube capillaire sur la phase stationnaire. L'application doit se faire sous forme de petites taches une distance de 1 1,5 cm du bord de la plaque (ct qui va tre introduit dans la phase mobile). Les taches ne doivent pas toucher la phase mobile. Comme solvant pour l'application on peut utiliser la phase mobile, mais de prfrence il faut choisir le solvant le plus volatil possible avec un minimum de volume. Ces deux dernires conditions facilitent la formation de petites taches: un solvant volatil sche plus rapidement, ce qui permet plusieurs applications trs rapproches et avec de trs petites quantits au mme endroit. Des taches plus larges, ou une grande quantit de produit appliqu, influence beaucoup la sparation.

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c) Le dveloppement de la couche mince Le dveloppement de la plaque se fait dans une chambre ferme, pralablement sature. Pour la prparer, on couvre les parois de la chambre (ex. un bocal transparent) par un papier absorbant (ex. papier filtre) et on laisse une fentre pour surveiller la plaque au moment du dveloppement. Une fois que la chambre est sature par la vapeur de la phase mobile, on peut introduire la plaque sche qu'on veut dvelopper. La plaque doit tre place d'une manire ce que le ct qui va tre dans la phase mobile soit horizontal, pour que le front de la phase mobile migre de faon gale sur la phase stationnaire. Cette condition nous permettra de comparer ou de mesurer avec plus de prcision les distances de migration des produits sur des plaques diffrentes.

d) Rvlation ou visualisation des produits Quand le front de la phase mobile atteint le niveau dsir, on retire la plaque. Il arrive parfois que les produits sont apparents par leur propre couleur, mais le plus souvent ce n'est pas le cas, alors il faut les rendre visibles. Avant de visualiser les produits, en gnral la plaque doit tre sche, surtout si le rvlateur utilis est un ractif. Les techniques de rvlation sont trs nombreuses. On peut visualiser des produits fluorescents en exposant la plaque sous une lampe UV. Quand ce n'est pas le cas, on peut utiliser une plaque qui contient du phosphore. En exposant la plaque une lampe UV, on peut voir les produits sous forme de taches non fluorescentes, mais cette fois nous ne pouvons pas voir les produits qui absorbent la lumire UV. Ce problme peut tre rsolu par l'utilisation des ractifs comme rvlateurs. Cette mthode de rvlation est largement rpandue. Touchstone et Dobbins ont dcrit l'utilisation de 207 ractifs 3S . Les ractifs en solution sont pulvriss sur la plaque par un atomiseur. En chauffant la plaque, les taches des produits spars apparaissent. Les ractifs universels sont le ractif de Liebermann ( I^SO^C^CO^O; (1:9) ), l'acide crique et l'iode. Ce dernier est utilis surtout sous forme de vapeur. Il suffit de mettre la plaque dans une chambre qui contient de la vapeur

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d'iode et les taches deviennent visibles. Le seul inconvnient est l'vaporation de l'iode aprs un certain temps, et les taches disparaissent.

La CCM est encore trs populaire. On l'utilise surtout pour l'analyse qualitative rapide des mlanges et comme moyen de choisir la phase mobile et la phase stationnaire en vue de sparer un mlange sur une colonne de mme que pour contrler l'efficacit d'une colonne preparative.

Pour un produit donn, l'indice de rtention (Rf) est toujours le mme si on utilise la mme phase mobile et le mme type d'adsorbant Cependant, mme en respectant ces conditions, le paramtre Rf peut tre influenc par l'activit de l'adsorbant. Cette dernire dpend du pourcentage d'eau que l'adsorbant peut absorber de l'atmosphre, et particulirement dans le cas des phases stationnaires polaires (ex: gel de silice et alumine). Pour les analyses qualitatives on peut remdier au problme de l'activit variable de l'adsorbant par l'utilisation d'un standard. Dans des cas o l'utilisation des standards n'est pas possible il faut garder les plaques dans un endroit sec ou les prparer en contrlant la quantit d'eau adsorbe pour viter ce problme.

_ Distance de migration d'un compos ~ Distance de migration du solvant

La valeur de Rf d'un produit varie avec la phase mobile. Si on prend le gel de silice (SiOH) comme phase stationnaire, la valeur de Rf augmente en augmentant la polarit de la phase mobile. Cette dernire peut tre compose de plus d'un solvant et on peut varier sa polarit en variant le pourcentage d'un solvant ou plus. Les solvants qui composent une phase mobile doivent tre obligatoirement miscibles. On peut utiliser deux solvants non miscibles avec un troisime, intermdiaire, miscible avec les deux pour obtenir un systme de solvant homogne.

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1.2.2 Chromatographie liquide basse pression sur colonne preparative

La CLBP- preparative est trs utilise comme moyen pour sparer les produits d'un mlange en plus grande quantit. La phases stationnaire et la phase mobile peuvent tre choisies l'aide de la CCM dcrite plus haut. L'optimisation de la phase mobile par CCM est acheve quand les valeurs des Rf des produits spars se situent entre 0,3 et 0,5. Afin d'assurer le succs du passage de la CCM la CLBP, il convient d'utiliser l'adsorbant provenant du mme fabriquant

La colonne utilise est souvent en verre transparent qui respecte, en gnral, le rapport hauteur : diamtre de 8 : 1 ou 10 : 1 . Les deux bouts de la colonne sont filts pour pouvoir les fermer avec des embouts en Tflon o l'on peut visser des adapteurs munis de tubes qui assurent la circulation du solvant Un embout est muni d'un injecteur pour introduire le mlange qu'on veut sparer sur la phase stationnaire.

1.2.2.1 Remplissage de la colonne preparative

Le remplissage de la colonne est trs important Pour obtenir un maximum de rendement, la granulomtrie des particules doit tre le plus homogne possible. Il ne doit pas y avoir des poches d'air dans la phase stationnaire pendant l'lution. Avant de procder au remplissage de la colonne, cette dernire doit tre propre. Le nettoyage peut se faire en cinq tapes 36 : (a) liminer les graisses et les particules, sur les parois internes de la colonne, avec une solution d'acide chlorhydrique (2 molaire), puis du chloroforme; (b) scher avec de l'azote; (c) laver avec une solution de dtergent l'aide d'une brosse ou du coton qu'on peut passer dans la colonne l'aide d'un fil; (d) liminer le dtergent avec de l'eau; (e) finalement, laver avec du mthanol et scher avec de l'azote.

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II y a deux techniques de remplissage de la colonne : remplissage sec et remplissage par suspension dans un solvant

Dans le cas du remplissage sec l'adsorbant est ajout par petites quantits dans la colonne maintenue dans une position verticale afin de favoriser un remplissage uniforme. Il faut bien compacter l'adsorbant en donnant des petits coups avec la colonne, sur le comptoir ou le plancher, en la tournant en mme temps. En peut aussi utiliser un moteur qui va gnrer des vibrations qui vont permettre aux particules de la phase stationnaire d'occuper les espaces vides. Cette dernire technique est non recommande pour le remplissage des colonnes destines des sparations plus difficiles. Les vibrations provoquent une sgrgation de la grosseur des particules et donnent une distribution granulomtrique non homogne le long de la colonne36. Une fois la colonne est remplie, il faut procder l'lution du systme de solvant pour dloger l'air de la phase stationnaire. Comme mentionn plus haut, il ne doit pas y avoir des bulles d'air dans la colonne pour maximiser son rendement. Nous avons constat que l'air est facilement limin si le solvant circule de bas en haut dans la colonne. Pour cela il faut maintenir la colonne verticale et faire circuler le solvant, l'aide d'une pompe, du bout infrieur vers le haut. Une fois la colonne remplie et les raccords instates, il suffit de la tourner 180 et commencer l'lution. Quand il ne reste aucune bulle d'air dans la phase stationnaire la colonne est prte pour sparer un mlange. Le temps ncessaire pour liminer l'air comme mentionn est trs court par rapport l'lution de solvant de haut en bas.

Le remplissage de la colonne par suspension de la phase stationnaire dans un solvant est plus facile. C'est la mthode la plus utilise pour le remplissage des colonnes. La phase stationnaire est mlange avec un solvant adquat (ex. l'alcool isobutylique pour le gel de silice) et le mlange est agit pendant cinq dix minutes. Une fois les particules dposes au fond, le solvant qui surnage la phase stationnaire est vers lentement pour liminer les trs petites

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particules qui restent suspendues. Cette opration augmente l'homognit des particules, on peut la rpter plusieurs fois jusqu' ce que le solvant qui surnage les particules dposes soit transparent avant de procder au remplissage de la colonne. La phase stationnaire peut tre introduite dans la colonne preparative de plusieurs faons. La faon la plus simple est d'utiliser deux colonnes de verre montes en srie l'aide d'un adapteur conu pour cette fin. En fermant le bout infrieur, on peut introduire la phase stationnaire, suspendue dans le solvant, par le bout suprieur. Lorsque cette tape est termine on procde l'lution du solvant (le mme utilis pour la suspension) l'aide d'une pompe. On peut utiliser un systme ferm pour que le solvant qui traverse la colonne revienne dans le mme contenant d'o il tait pomp. Quand le niveau de la phase stationnaire dans la colonne suprieure reste constant, cette dernire est enleve et le bout suprieur de la colonne remplie est ferm.

D'autres mthodes de remplissage font appel un systme compos de pompe haute pression et dbit lev pour pousser une suspension de la phase stationnaire dans un solvant appropri vers la colonne remplir (voirfig.8).

COLONNE A REMPLIR

EFFLUENT

RESERVOIR
INDICATEUR DE PRESSION

BUSE OE REMPLISSAGE

POMPE A AIR 10-11 pli

VANNE

200-300 ml/ml

Figure 8:

Montage de remplissage des colonnes haute pression

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1.2.2.2 Paramtres d'optimisation d'une sparation sur colonne

Avant de procder au remplissage d'une colonne, il faut considrer la quantit de produit qu'on veut sparer la fois. Si on veut sparer une grande quantit d'un mlange, il faut utiliser une plus grande quantit de phase stationnaire, donc une plus grande colonne. Le dbit de Flution est trs important pour avoir une bonne sparation. Pour optimiser les conditions d'une sparation, il faut bien choisir les paramtres de grosseur de la colonne en fonction de la quantit de l'chantillon et le dbit de rlution (voire Tab. 2).

Tableau 2 : Conditions d'oprations typiques de la CLBP-P

D.I de la colonne Longueur de la colonne Poids de la phase stationnaire Grosseur des particules Pression Dbit de la phase mobile Vlocit linaire Nombre de plateaux Quantit d'chantillon Volume inject

1 -4 cm 20-100 cm 50-500 g > 40 mm 10 300 kPa 2 20 mL/min 0,1 1,0 mm/sec 200 2000 0,1 10 g 0,5 20 mL

Tableau tir de la rfrence 33.

32

Une fois la phase stationnaire et la phase mobile dtermines l'aide de la chromatographie sur couches minces, on peut procder la sparation sur la colonne. Avant d'introduire l'chantillon dans la colonne, il est ncessaire de le nettoyer. Cette tape est trs importante pour liminer les substances indsirables, surtout si on veut utiliser la colonne plusieurs fois. titre d'exemple, un extrait aqueux d'un matriel vgtal est un mlange trs complexe. Il contient des substances trs polaires (ex: pigments, lignine, etc.). Si la phase stationnaire utilise est le gel de silice, on risque d'avoir une adsorption irrversible des substances trs polaires. De ce fait, les sites de l'adsorbant sont dsactivs et la colonne perd son efficacit de sparation.

Pour nettoyer un chantillon, avant la sparation, il y a plusieurs techniques et articles disponibles chez les fournisseurs du matriel de la chromatographie. Une colonne de quelques centimtres peut tre utilise pression atmosphrique pour nettoyer une bonne quantit d'un chantillon. Cependant, on peut tout simplement utiliser, environ, cinq grammes de la phase stationnaire (la mme utilise pour le remplissage de la colonne) pour un gramme de mlange. Ce dernier, dissous dans un petit volume du systme de solvant et mlang avec la phase stationnaire, est agite pendant quelque minutes. Le mlange est filtr et l'adsorbant est lav avec le mme solvant II faut s'assurer que les produits qu'on veut sparer sont tous rcuprs. La solution obtenue est vapore sec.

1.2.2.3 Sparation sur la colonne preparative basse pression

La colonne, pralablement conditionne avec le systme de solvant, est prte pour recevoir l'chantillon. Aprs avoir t pes et dissous dans un minimum de solvant, l'chantillon est prt tre inject dans la colonne. l'aide d'une seringue, le mlange est introduit sur la phase stationnaire. En actionnant la pompe, rgle au dbit dsir, le mlange est pouss

33

travers la phase stationnaire. La sparation des diffrentes substances constituant le mlange prend place dans la colonne. Les produits qui sont injects dans la colonne vont tre spars en fonction de leur nature et celle de la phase stationnaire utilise.

Pour rcuprer les produits qui ont t spars, il faut les dtecter au moment o ils sortent de la colonne. Cette tape fait appel un dtecteur et un collecteur defractions.Dans le prsent travail, la chromatographie sur colonne preparative est utilise pour des prpurifications. Les produits sont rcuprs parfractionnement.La phase mobile est rcupre la sortie de la colonne en fractions gales, l'aide d'un collecteur fraction automatique. Les fractions sont analyses par chromatographie sur couches minces. En comparant les Rf des produits, lesfractionsqui contiennent les mmes produits sont regroupes.

L'efficacit des colonnes preparatives est limite. Il est trs difficile de sparer des produits qui ont des structures chimiques ou des polarits semblables sur une colonne preparative. Cette limite est due la grosseur des particules et au remplissage de la colonne. Pour augmenter l'efficacit, il faut des particules de trs petites tailles et un remplissage une trs grande pression. Donc il faut une grande pression pour luer un solvant travers cette colonne. Cette ncessit d'avoir une grande efficacit a men la chromatographie haute pression (CLHP).

1.2.3 Chromatographie liquide haute pression (CLHP)

Les techniques chromatographiques modernes sont caractrises par leur critre de haute performance. La signification de ce terme prte parfois confusion37. Pourtant ce concept recouvre deux termes qui, additionns, caractrisent la haute performance: - haute rsolution, et - grande vitesse d'analyse.

34

Dans un dispositif chromatographique, la grande rsolution est le rsultat de la combinaison de deux termes : grande efficacit et grande slectivit33.

Pour des sparations difficiles, la CLHP est requise. Les deux caractristiques importantes d'une colonne CLHP sont : les particules de la phases stationnaires sont trs petites, de 2 20 mm, et le remplissage se fait une trs grande pression, de 10-12 000 KPa 38 ' 39 , d'o la ncessit d'une colonne en mtal (acier inoxydable). La grosseur des particules est trs importante. Plus une particule est petite plus le rapport surface/poids est grand. Le remplissage haute pression permet d'introduire une plus grande quantit de la phase stationnaire dans la colonne. Donc, dans une colonne de CLHP la surface active de la phase stationnaire est de loin plus grande que celle qu'on peut avoir avec une colonne de verre preparative, toutes choses tant gales par ailleurs.

La chromatographie liquide moderne (CLHP) doit son volution plusieurs domaines: la sophistication de l'quipement, le remplissage de la colonne et la comprhension des mcanismes de sparation et les paramtres qui l'influencent. La haute pression et le faible volume mort de l'quipement (colonne, conduits, raccords et la cellule du dtecteur) avec des dtecteurs sensibles jouent un rle vital dans l'efficacit du CLHP39. Un systme de CLHP se compose de six lments de base essentiels son fonctionnement: un filtre pour le solvant, une pompe haute pression pour pousser le solvant, un injecteur pour introduire le mlange sparer dans le colonne, une pr-colonne, la colonne, un dtecteur et finalement un enregistreur (voirfig.9).

Un solvant avant d'tre pomp dans un systme CLHP, doit tre dgaz et filtr par un filtre de 0,45 um. Comme les conduits du systme sont trs petits, des particules solides, mme microscopiques peuvent bloquer les conduits du systme en s'accumulant. De l'air dissout dans

35

le solvant peut former des bulles dans la pompe et empcher le passage du solvant.A la sortie de la colonne le solvant n'est plus sous une grande pression. S'il contient de l'air dissout, ce dernier peut former des bulles d'air. Comme le dtecteur ragit aux variations de l'absorption des ondes de la lumire (dtecteurs lampe), les bulles vont tre dtectes et enregistres comme s'il s'agit d'un produit. La pr-colonne (colonne de garde) qui en gnral contient la mme phase stationnaire que la colonne, joue un rle de protection pour la colonne. S'il y a des produits qui peuvent tre adsorbs irrversiblement ou des particules microscopiques, la pr-colonne va les empcher d'atteindre la colonne.

colonne (phase stationnaire)

phase mobile

injecteur Pmpe

dtecteur rejet ou rcupration

chantillon enregistreur

Figure 9:

Les composantes principales d'un systme CLHP

36

Le dveloppement de la thorie est l'origine de l'volution de la chromatographie. Dans ce travail le concept thorique ne va pas tre dtaill, par contre nous allons aborder les paramtres qui jouent directement sur la sparation des produits.

123.1 Quelques principes et thorie de la chromatographie M

En chromatographie linaire et idale, on suppose qu'il existe un quilibre du solut entre les phases en tout point de la colonne. Cet quilibre est caractris par le coefficient de distribution (ou coefficient de partage) K une temprature donne :

C8 et C m dsignant respectivement les concentrations du solut dans les phases stationnaires et mobiles.

Lorsqu'un solut (produit sparer) a une affinit nulle pour la phase stationnaire, il n'est pas retenu et sa vitesse de migration est celle de la phase mobile. Au contraire, pour un produit qui a une affinit non nulle pour la phase stationnaire le processus de migration est discontinu. La vitesse de migration moyenne observe est proportionnelle la fraction non retenue exprime par le terme C m . Le solut va tre plus retenu par la phase stationnaire lorsque son coefficient de partage va tre lev. Pour traduire quantitativement la rtention, l'une des trois grandeurs suivantes est utilise : - le temps de rtention 1 1 - le volume de rtention Vr - le facteur de capacit k'
t11 Ces informations sont prises dans les rfrences 36 38

37

a) Grandeur de rtention t r Le temps de rtention t r d'un compos correspond au temps pass par le compos dans la phase mobile (t m ) et le temps pass dans la phase stationnaire (t'r) :

t t

t1

o\
\r)

l r~ t m +> r

Les molcules progressent la vitesse de la phase mobile quand elles y sont en solution et restent immobiles quand elles sont dans la phase stationnaire. Le temps t m est le mme pour tous les composs. Par contre, le temps t r diffrent selon les composs.

Le volume de rtention V r d'un compos correspond au volume de la phase mobile ncessaire pour luer ce compos. Il est donn par la relation :

(3)

V m dsignant le volume de la colonne Vs dsignant le volume la phase stationnaire. Il peut tre aussi exprim par :

Vr = t r x F c

(4)

F c est le dbit de la phase mobile.

38

b) Facteur de capacit k' Le faaeur de capacit k' est dfini comme le rapport de la quantit de solut dans la phase stationnaire ms la quantit de solut dans la phase mobile m m . On l'exprime par :

., _ ms _ m ~

ce qui donne d'aprs les relations (1), (3) et (4)

Vr = V m ( l + k ' )
r

=tm(l+k')

(6)

Le facteur de capacit k' dsigne simplement le temps pass par le solut dans la phase stationnaire par rapport celui pass dans la phase mobile. Il reprsente le nombre de fois qu'il faut faire passer le volume de la phase mobile (Vm) pour luer le solut, l'talement du pic exclu. On peut dterminer k1 exprimentalement l'aide de la relation (7), une fois le temps mort (tm) est dtermine. Cette mesure, si elle est facile en CG, n'est pas vidente en CL pour des raisons de dfinition du compos non retenu. Sachant que le temps mort est dtermin par : t m = (8)

u est la vitesse linaire moyenne de la phase mobile et L est la longeur de la colonne. On peut dduire pour le temps de rtention : t r = - (1+k1) (9)

Le rapport Vm/Vs, tant dsign par B, on peut crire d'aprs la relation (5) :

39

(10)

- t

+ t

ri

La relation (11) a de nombreuse implications pratiques : - l'efficacit requise pour obtenir une sparation dpend du facteur de capacit k'. En gnrale, plus k' est petite plus la sparation est difficile raliser, - la capacit de travail de la colonne, c'est--dire la quantit de solut qui peut tre analyse sans surcharger la colonne, est directement fonction de la quantit de la phase stationnaire contenue dans la colonne.

G) Slectivit et rsolution La sparation de deux substances est dfinie par deux grandeurs : - rtention ou slectivit - rsolution

Si on considre deux substances 1 et 2 qu'on veut sparer, la slectivit a est dfinie par la relation :

_ te _ ^2 _ K2

Ces diffrences dans la distribution des soluts entre les deux phases rsultent de l'ensemble des interactions mises en cause. La rsolution entre deux pics est, par convention, fonction de deux termes : la slectivit et l'efficacit :

40 R = 2 tr2-trl
0)1 +0)2

(13)

o)i et (02 tant les largeurs la base des pics correspondant aux soluts 1 et 2 (fig. 10 ).

d) Efficacit L'aspect cintique de la chromatographie concerne la largeur ou "finesse" du pic chromatographique qui est souvent exprime par le nombre de plateaux thoriques de la colonne n :

(14)

5 tant la largeur d'un pic mi-hauteur.

temps

Figure 10:

Mesure de degr de sparation entre deux pics

41

Cette notion de plateaux thoriques, bien qu'elle repose sur un modle parfaitement thorique, est d'un usage gnral car elle reflte trs bien la finesse des pics. Aussi on peut l'utiliser pour s'assurer qu'une colonne ne reprsente pas de dfaut de fabrication ou qu'elle est encore en bonne tat pour tre utilise. Le nombre de plateaux thoriques de la colonne utilise dans ce travail pour la purification des glycosides est vrifi en utilisant les standards et les conditions de sparation du manufacturier.

L2

LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CG) ET LA CG-SM

1.2.1 Chromatographie en phase gazeuse (CG)

La chromatographie en phase gazeuse est surtout une technique de sparation des produits volatils ou semi-volatils selon les mmes principes que la CL. Cependant certains produits non volatils peuvent tre spars par la CG en les transformant, par ractions chimiques, en drivs volatils. Contrairement la CL o la phase mobile joue un rle trs important dans les processus de sparations, dans la CG la phase mobile est un gaz neutre et ne joue aucun rle dans les mcanismes de la sparation et c'est pour cette raison qu'on appelle la phase mobile le gaz porteur ou gaz vecteur. En gnral, l'hlium, l'hydrogne ou l'azote sont utiliss comme phase mobile.

La chromatographie en phase gazeuse moderne utilise principalement des colonnes capillaires, en verreflexible, trs petits diamtres (0,20 0,35 mm). La colonne capillaire offre le moyen de sparation le plus efficace et / ou le plus rapide. Dans ce type de colonne, la phase liquide stationnaire est rpartie sur la paroi interne du tube capillaire en une couche homogne de faible paisseur. La caractristique importante est que le tube est ouvert c'est--dire non occup par un remplissage37. Si le gaz vecteur ne joue aucun rle dans les mcanismes de

42

sparation des produits constituants un mlange, il en est tout autre avec le dbit et la temprature auxquelles l'analyse s'effectue. Pour une colonne capillaire prcise, l'optimisation de sparation est fonction du dbit du gaz vecteur et surtout de la temprature. La possibilit de programmer la temprature de la colonne a confr la CG un trs grand avantage pour la sparation des mlanges trs complexes et en un temps relativement court Les produits spars sur la colonne sont dtects la sortie par un dtecteur. Il existe plusieurs types de dtecteurs dont le choix est bas sur la nature et la quantit des produits sparer (tableau 3).

122

La CG couple un spectromtre de masse (CG-SM)

Le premier couplage CG/SM fut ralis en 1957 par HOLMES 5 0 en Sude ; depuis des progrs spectaculaires ont t raliss. De nos jours la CG-SM est la technique de premier choix pour l'analyse des produits volatils. Cela est d la grande spcificit des analyses effectues par un tel ensemble. La chromatographie en phase gazeuse en tant une mthode de sparation remarquable, la dtection des produits la sortie de la colonne, par des dtecteurs conventionnels, prsentait une limite de dtection ainsi que la spcificit de la rponse.

La CG et la SM sont deux techniques analytiques compatibles dans la mesure o elles analysent toutes deux des composs l'tat gazeux. Le couplage de ces deux techniques est rendu possible grce un dispositif qui permet de rduire la pression la sortie de la colonne de 760 torr jusqu' la pression de fonctionnement d'une source de SM qui est de l'ordre de 10-3 H)-* torr 37.

Le dispositif de couplage fonctionne trs souvent selon le principe de l'limination prfrentielle du gaz vecteur. Il en rsulte un enrichissement de celui-ci en solut. Cette opration n'a pas pour but direct d'amliorer la rponse du spectre de masse lequel a une rponse

43

Tableau 3 : Caractristiques des principaux dtecteurs de la CG.

Typededtecteur

Bmcipede dtection

secttvit

sensibilit (g/s)

Linarit

Conductivh themique(TCD)

Nfeuelaconductivit ihermiquedesgaz

Tout compos

10-10

10*

farsation de flamme Mssuedesionscrspar

Tout compos

10-12

107

danslaflamms deH2/Q2

200<t

Capturedectrons

Mssute des changements duawtatf dlectons caus par les produis qui ragissent avecteslectrons

Tbutprodutqut peutragjr avec les lectrons

10-14

103

Spedrede masse

Mesuelecourantonque

Toutcompos

10-12

ou tagmertation des produits

Information prise dans les rfrences 37 et 43.

44

qui dpend de la quantit de solut traversant par unit de temps et non pas de la concentration de solut dans le gaz porteur37. Contrairement aux autres dtecteurs, le spectre de masse a une rponse diffrente et spcifique pour chacun des composs qui ont t spars sur la colonne capillaire. Ce qui rend le couplage de la CG et SM trs efficace pour l'analyse des mlanges complexes qui contiennent des fois plus que trois cents produits est la possibilit de compiler les spectres des produits spars dans la mmoire d'un ordinateur et de les comparer individuellement avec des spectres de rfrence disponibles dans la mmoire de l'ordinateur.

13

LA RSONANCE MAGNTIQUE NUCLAIRE (RMN) lH et 13c 121

L'histoire de la spectroscopie de rsonance magntique nuclaire (RMN) est un exemple classique du dveloppement d'une dcouverte originale dans un seul domaine scientifique qui s'est transform en une technique de routine dans tous les domaines de la science de la chimie.

Depuis la premire dtection des signaux en 1945, par Bolch et al. en Californie et par Purcell et al. Harvard, nos jours, la spectroscopie de rsonance magntique nuclaire est devenue une mthode d'analyse de choix dans les laboratoires pour l'identification des structures des produits simples et complexes. Les techniques de la RMN se sont multiplies rapidement pour amliorer l'efficacit et tendre l'application d'autres domaines comme la biologie, pour les macromolcules, et la biomdicale, pour la reproduction des images. Dans ce chapitre nous nous intressons l'application de la RMN du proton ^H) et la RMN du Carbone (13C) dans la dtermination de structures chimiques des produits organiques.

Ces informations sont prises dans les rfrences 44 46

45

a) Thorie de la RMN

La spectroscopie de la RMN, la base, est une spectromtrie d'absorption qui ressemble la spectromtrie infrarouge ou ultraviolet. Sous des conditions appropries, un chantillon peut absorber des radiations radiofrquences des frquences dtermines par la nature de l'chantillon. Bien qu'en spectromtrie de RMN on utilise diffrentes techniques pour la dtection, la thorie de base est commune pour toutes les expriences. La proprit fondamentale du noyau atomique implique le spin nuclaire (I), qui prend les valeurs 0, - 1,1-, etc. La valeur du spin nuclaire dpend du nombre de masse et du nombre atomique du noyau d'un atome quelconque, comme suit:

nombre de masse impair pair pair

nombre atomique pair ou impair pair impair

spin nuclaire (I)

1 3 5 2'2'2""

0 1,2,3....

Le moment magntique nuclaire (u) est directement proportionnel au spin suivant l'quation: yl/t
2T

M=

ou Y, est la constante de proportionnalit, appel le ratio magntogrique, caractristique pour chaque noyau, et h est la constante de Planck. Dans un champs magntique Ho, suivant la direction d'un axe z, l'nergie du moment magntique nuclaire est donne par E.

46

2ir

Le spin nuclaire I peut prendre (21 + 1) valeurs permises Iz, de I -I, avec un intervalle de 1. Dans le cas de l'hydrogne et du
13

C (1% d'abondance dans la nature) I = 1/2. Une

radiation lectromagntique, d'une polarisation souhaitable et avec une frquence v respectant l'quation de Bohr, peut provoquer des transitions entre les niveaux d'nergie du systme.

h v = AE

Ce processus est appel rsonance magntique nuclaire. En combinant les deux dernires quations, on obtient la frquence d'absorption de la rsonance.

2T

Pour la dtection de l'tat de transition de n'importe quel noyau dont, |IZ| =1, il faut que le champ magntique appliqu et la frquence respectent l'quation suivante:

v =
2K

b) Dplacement chimique

Quand une molcule, qui contient le noyau sous observation, est place dans un champ magntique, d'aprs la dernire quation, tous les noyaux de mme spin nuclaire devraient

47

prsenter des rsonances de mmefrquences.En fait, ces valeurs dpendent de l'environnement lectronique (ou environnement chimique) de chaque noyau. Les lectrons dans la molcule forment un cran contre le champ magntique extrieur.

Le dplacement chimique est dfini par (ppm: partie par million): il est seulement fonction du noyau et de son environnement. On mesure ce dplacement par rapport un produit dont on connat son dplacement chimique, qu'on appelle rfrence interne. Le solvant lui mme peut tre considr comme rfrence interne. Le paramtre 5 est dfini pan

(Vrfrence-Vchantillon)

(frquence du spectromtre en Hz) Si on utilise un champ magntique de 60 MHz, par exemple dans la RMN du 1H, et si nous avons une diffrence de 60 Hz entre deux absorptions (deux pics), alors nous avons une diffrence de 1 ppm. Le dplacement chimique dpend seulement des conditions de l'chantillon, du solvant, de la concentration et la temprature, et non pas de la frquence du spectromtre.

Le dplacement chimique du proton (*H) est un cas particulier, son noyau possde une seule couche lectronique (orbitale s), c'est pour cette raison que son lectron de valence ne possde pas de proprits paramagntiques. C'est la raison fondamentale pour laquelle l'chelle des dplacements chimiques ne dpassent pas 10 ppm, comparativement d'autres noyaux qui possdent la couche lectronique p et dont l'chelle est de 200 ppm ou plus, comme dans le cas

Dans une molcule, la densit lectronique d'un proton est affecte par des mcanismes inductives et msomriques. Les rotations des lectrons, induitent par le champ magntique

48

extrieur (Ho), des atomes et des groupements voisins vont provoquer une augmentation des moments magntiques, le. des champ secondaires qui influencent le champ magntique local du proton. De plus, des champs lectriques et les effets de van der Waals peuvent tre considrs. Par exemple, un hydrogne li un carbone, qui son tour est li un atome ou un groupement lectrongatif, va subir une diminution de la densit lectronique autour de son noyau, cela va lui permettre de rsonner un champ magntique bas, d'o une augmentation de la valeur du dplacement chimique ().

Dans un cycle aromatique, la contribution de la densit lectronique est trs importante. Si on considre le cycle du benzne, au moment o le plan de la molcule est perpendiculaire au champ magntique appliqu, les lectrons p sont libres et s'orientent dans le mme sens. La circulation des lectrons autour du cycle cre un courant circulaire qui son tour va crer un champ magntique isotropique (distribution sphriquement symtrique) oppos au champ appliqu iA. Les hydrognes du benzne qui se trouvent l'extrieur vont tre dblinds, ce qui se traduit par une rsonance dans un champ magntique plus bas. Le champ magntique du benzne (isotopique) est plus ou moins perturb par un substituant, selon la nature de ce substituant, et il devient anisotropique (distribution spatial non symtrique). De cela il rsulte un effet diffrent sur chaque proton du noyau, dpendament de sa position sur le cycle par rapport un ou des substituants.

c) Couplage de deux spins Dans une molcule donne, n'importe quel hydrogne peut avoir un spin + - o u - | . Si on considre deux hydrognes A et B sur deux carbones voisins, chaqu'un influence l'environnement magntique de l'autre. L'influence de l'un sur l'autre dpend de leurs spins45. Ils peuvent avoir tous les deux, en mme temps, les mmes spins ou des spins opposs. Le proton A

49

va tre dblind par le proton B, si le spin de ce dernier est align avec le champ magntique appliqu ce qui va crer un champ supplmentaire. Par contre si le spin du proton B est inversement align au champ magntique appliqu, on aura une diminution du champ magntique. De cela va rsulter un blindage au niveau du proton A. Dans chaque cas le proton A va avoir un dplacement chimique diffrent. Ce phnomne est appel couplage entre deux protons. La diffrence entre les deux dplacements chimiques, du proton A, donne la valeur de la constante de couplage. Bien entendu le proton A va avoir le mme effet sur le proton B. Pour que deux protons puissent se coupler, il faut qu'ils soient dans deux environnements magntiques diffrents. Leurs dplacements chimiques vont tre diffrents, mais les constantes de couplage entre eux vont tre les mmes.

Le couplage peut tre affect par l'lectrongativit des substituants, leurs orientations relatives aux protons coupls, l'hybridation des atomes de carbone, les angles des liaisons et les longueurs des liaisons46.

50

CHAPITRE

MTHODES EXPRIMENTALES APPLIQUES L'TUDE DES GLYCOSIDES DE PICEA MARIANA

Les glycosides de Picea mariana, ont t tudis pour identifier les produits volatils, lis aux sucres, qui ne sont pas extraits par les mthodes ordinaires d'extractions des huiles essentielles. Les sous-chapitres suivants dcrivent les procdures exprimentales qui ont t utilises pour l'extraction, la sparation et l'identification soit des glycosides intacts ou des aglycones spares des sucres.

La description des techniques et des principes des mthodes exprimentales qui sont utilises dans ce projet de recherche est donne au chapitre 1. Les mthodes d'extraction et d'analyse des glycosides ont t utilises pour les aiguilles et les ramilles individuellement. Pour simplifier, nous allons faire rfrence uniquement aux aiguilles pendant toutes les procdures exprimentales; les ramilles ont subi les mmes traitements. Les figures 11 et 12 rsument schmatiquement les tapes des procdures exprimentales.

2.1

EXTRACTION DES GLYCOSIDES INTACTS

Le matriel vgtale est sch la temprature de la pice pendant quarante huit heures. Une fois sches, les aiguilles et les ramilles sont spares. Les aiguilles sont broyes au malaxeur jusqu' l'obtention d'une poudre trs fine. La poudre, rcupre et pese (100 g),

51

Figure 11 PLANT D'EXTRACTION, DE PURIFICATION ET D'ANALYSE DES GLYCOSIDES INTACTS

Branches de l'pinette noire sches

- Aiguilles - Ramilles

Broyage en poudre fine

- Aiguilles - Ramilles

Extraction au soxhlet
1) - Extraction au tolune 2) - Extraction au mthanol

Tolune. Substances Lipophiliques

Mthanol Glycosides
Evaporation sec sous vide

Rsidu sec
1) Pr-purification sur colonne de gel de silice (17-23 ju ) MeOH-CHCl3-H2O 2) Regroupement des fractions contenant les mmes produits. % 3) Evaporation :

sec sous vide. \

Fractions regroupes
1) Purification par CLHP-C18 2) Analyse par RMN,
X

H et

13

C, et SM.

52

Figure 12 PLAN D'EXTRACTION ET D'HYDROLYSE DES GLYCOSIDES INTACTS ET ANALYSE DES AGLYCONES LIBRES

Branches de l'pinette noire sches

- Aiguilles - Ramilles

Broyage en poudre fine

- Aiguilles - Ramilles

Extraction au soxhlet
1) - Extraction au tolune 2) - Extraction au mthanol

Tolune Substances Lipophiliques Glycosides

Evaporation sec sous vide

1) Elimination des traces des produits volatils libres.

2) Hydrolyses enzymatiques 3) Extraction - (3 - Glucosidase - Cellulase des aglycones libres

Analyse des aglycones par CG( Indice de KOVATS) et CG-MS (Spectre de masse )

53

est extraite au tolune (500 mL), dans un Soxhlet pendant quarante huit heures. Aprs avoir retir le filtre qui contient la poudre, le Soxhlet est lav et sch. La poudre subit une deuxime extraction au Soxhlet, cette fois avec du mthanol (500 mL) pendant la mme priode de temps qu'avec le tolune.

Le mthanol rcupr est vapor sous vide dans un vaporateur rotatif 40 C jusqu' l'obtention d'un rsidu sirupeux. De l'actone (10 mL ) est additionn et le mlange est vapor sec. Le rsidu sous forme de mousse est pes avant de continuer les procdures d'analyses.

22

ANALYSE DES GLYCOSIDES INTACTS

Dans cette partie exprimentale les produits ne subissent aucune transformation chimique. La CCM est utilise pour dterminer la phase mobile qui sera utilise pour sparer les glycosides par la CLP, ainsi que pour regrouper les fractions qui contiennent les mmes produits. La CLHP est utilise pour la purification des produits obtenus par la CLP.

2.2.1 Analyses et sparation des glycosides par CL

2.2.1.1 Analyse par CCM

Pour les analyses qualitatives par la CCM, une petite quantit (environ 1 g) du rsidu est utilise. Les quatre tapes d'analyse par la CCM, dcrites dans le chapitre 1, sont utilises.

Pour le choix de la phase mobile, ou le systme de solvant, plusieurs mlanges de diffrentes proportions de mthanol, dichloromthane et d'eau sont tests. Dans chaque cas le

54

rsidu doit tre soluble au moins en parties. Le matriel non soluble est limin par filtration.

Le rsidu est solubilis dans le systme de solvant. Aprs rlimination du matriel non soluble, le filtrat est vapor sec sous vide dans un vaporateur rotatif 40 C. Le mlange sec obtenu est dissout dans un minimum de mthanoi. Sur une plaque de Gel de Silice (60 F-254 de BDH : 5x10 cm), un trs petit volume ( 3 5 mL ) est appliqu l'aide d'une micropipette. Le produit est appliqu sur une ligne trace 1,5 cm du bas de la plaque. Une fois les taches sches, la plaque est introduite dans la chambre de dveloppement pralablement sature avec le systme de solvant. Il faut se rappeler que le niveau de la phase mobile dans la chambre chromatographique n'atteint pas la ligne de l'application des produits.

Quand le front de la phase mobile atteint le niveau dsir ( 7 cm partir de la ligne d'application de produit sur une plaque de 10 cm) la plaque est retire de la chambre chromatographique. Dans un four chauff 80 C, la plaque est sche pendant environ une minute. Comme rvlateur une solution de 1% d'acide crique est vaporise, l'aide d'un atomiseur, sur la plaque pendant qu'elle est chaude pour ne pas avoir besoin de la chauffer une deuxime fois. Les produits apparaissent sous formes de taches de diffrentes couleurs et distances de migration (Rf).

Nous avons compar les plaques chromatographiques dveloppes en utilisant plusieurs systmes de solvants. Nous avons retenu le systme de solvant (CHCI3 : MeOH : H2O / 60:20 : 2) qui a donn la meilleure sparation des produits avec des valeurs des Rf entre 0,2 et 0,5 pour les produits majeurs (taches plus fonces).

55

22.12 Sparation sur colonne preparative: CLP

Une colonne de verre ( di. = 5 cm et L = 75 cm ) est remplie sec, avec une phase stationnaire du gel de silice 24-37 mm, suivant la mthode dcrite dans le chapitre I. La colonne est lue avec de l'eau dminralise l'aide d'une pompe (Altex), pour liminer l'air dans la colonne. Environ 500 mL d'eau ont t ncessaire avec un dbit de 2 mL/min. Il est trs important de placer la colonne l'envers de manire ce que l'eau circule par le bas vers le haut. Une fois l'air limin, la colonne est lue avec du mthanol ( 50 mL ), suivi du systme de solvant ( environ 300 mL ).

Une quantit de l'extrait des aiguilles ( 2 g) est dissoute dans 20 mL de la phase mobile (CHCb : MeOH : H2O / 60 : 20 : 2) laquelle sont additionns 10 g de la phase stationnaire. Aprs une agitation vigoureuse la suspension est introduite dans une burette de 10 mL dont le bout infrieur est rempli de fibres de verre. La solution est rcupre, et la phase stationnaire est lave avec 10 mL de la phase mobile. Les deux solutions sont regroupes et vapores sec 40 C. Le matriel sec est de nouveau dissout dans un minimum de volume da la phase mobile. La solution est injecte dans la colonne l'aide d'une seringue. Le dbit est de 2 mL/min. Des fractions de 10 mL sont rcoltes par un collecteur automatique de fractions (ISCO : Modle 568).

Quand l'lution est termine, aprs 1200 mL d'luant, les fractions sont analyses par la CCM avec le mme systme de solvant et de la mme faon que dans le paragraphe prcdent Lesfractionsqui contiennent des produits avec le mme Rf sont regroupes et vapores sec.

56

22.13 Chromatographie CLHP

Cette tape consiste purifier les produits obtenus par la chromatographie sur colonne preparative. Les fractions qui ont t regroupes, ( paragraphe prcdent), sont analyses individuellement. Une premire analyse est ralise par la CCM phase inverse (100 % CigGel de silice silil, diamtre moyen de pore de 60 , Sigma Chemical company ) en utilisant comme luant le MeOH : H2O/ 60 :40. Pour la sparation des produits sur la colonne plusieurs phases mobiles sont utilises. Des mlanges du mthanol et de l'eau des proportions variant de 60 : 40 80 : 20 / H2O : MeOH, en augmentant de 5 le premier et diminuant le deuxime de la mme proportion. Les dbits utiliss est de 1,5 mL/min.

Une petite quantit (0,1 mg) de la fraction sparer est dissoute dans 1 mL du systme de solvant Le mlange est filtr sur un Sep-Pak (Supelclean LC-18) et suivi de lmL du mme solvant. Schs et pess les produits sont nouveau compltement dissous dans un minimum de solvant Le volume inject est calcul pour avoir 10 mg de produit dans chaque injection.

Une colonne CLHP semi preparative phase inverse ( Cis - Spherisorbe 5 ODS 2 : d.i. = 1 cm et 1 = 25 cm, de la compagnie Phenomenex ) est utilise pour la purification des produits des fractions regroupes. Pour l'lution une pompe (LKB 2150 HPLC PUMP) et pour dtecter les produits un dtecteur UV (LKB 2238 UVICORD SII) sont utiliss. Les conditions de dtection sont : la longueur d'onde 254 um, Time const : 0,5 et TABS : range 2.

Les produits sont rcuprs individuellement lorsqu'ils sont parfaitement spars des autres produits. Dans le cas des pics larges de chromatogramme, la rcupration des produits se fait en trois parties, le dbut du pic, le centre et la fin. Les produits ainsi rcuprs sont injects de nouveau.

57

222

Analyse des glycosides par RMN (^H et 13C) et SM

Trois produits purs et un autre mlang avec un de ces trois produits sont obtenus par les procdures exprimentales dcrites prcdemment et analyss au Laboratoire d'Agriculture Canada Ottawa l'aide d'un spectromtre RMN de *H et 13C de 250 MHz, ainsi qu'un SM. Le solvant utilis pour les quatres produits est le mthanol.

2.3

ANALYSE DES AGLYCONES DES GLYCOSIDES

Cette partie dcrit les procdures exprimentales utilises pour l'extraction et l'analyse

des aglycones des glycosides extraits plus haut Pour analyser les aglycones sans les sucres nous avons eu recours des hydrolyses enzymatiques pour des analyses qualitatives et des hydrolyses acides pour des analyses quantitatives. Seulement les aglycones solubles dans le pentane ou iexane sont extraites et analyses par la CG et la CG-SM.

2.3.1 Hydrolyse enzymatique des glycosides

L'hydrolyse enzymatique du rsidu est ralis avec deux enzymes, le B-Glucosidase et la Cellulase. Une quantit de 4 g du rsidu est dissoute dans 100 mL d'eau dminralise. La solution aqueuse est extraite, dans une ampoule dcanter, avec du pentane et pentane et l'ther ( 1:1 ). Aprs les cinq premires extractions de 30 mL chacune, le pentane (de la sixime extraction) est rcupr et sch avec du MgSO4. Le volume est concentr 0,5 mL avec un vaporateur rotatif dans un bain de glace. Une fois l'analyse par CG confirme l'absence des produits volatils dans l'extrait de pentane, la solution aqueuse est vapore sec. Le produit sec rcupr est dissout dans une solution aqueuse ( 100 mL ) de 0,1 N d'actate de sodium pH 5 d'acide actique. Chaque enzyme, 25 mg de fi-Glucosidase (4,8 unit/mg, une unit hydrolyse

58

un mg d'un glucoside) et de 0,4 g de cellulase (0,6 u/mg), est utilise pour hydrolyser 4 g de rsidu. L'enzyme est additionne la phase aqueuse et la solution est incube 37 C pendant 24 heures. Aprs l'incubation, chaque solution est extraite par 3x50 mL de pentane. Les phases de pentane sont regroupes (pour chaque solution aqueuse) et le volume est rduit lmL.

232

Hydrolyse acide des glycosides

Pour des analyses quantitatives nous avons utilis les aiguilles sches ( 50 g ). Aprs broyage en poudre trs fine dans un malaxeur, le matriel vgtal est introduit dans un ballon de 11 qui contient 500 mL d'eau dminralise et 2 g de bicarbonate de calcium. Dans un extracteur du type Likens-Nickerson la solution est porte reflux pendant 20 heures. Les produits volatiles entrans par la vapeur d'eau sont rcuprs dans 50 mL d'hexane. La solution de l'hexane sche ( avec MgSO4 ) et additionne d'un standard interne ( ttradecane ) est analyse par la CG. Une deuxime extraction de la solution aqueuse est ralise de la mme manire que la premire pendant 6 heures.

La solution aqueuse est acidifie ( 2 M : HC1 ) et est extraite une troisime fois dans l'extracteur de type Likens-Nickerson. Les aglycones libres sont extraites dans 50 mL d'hexane. La phase de l'hexane est sche avec du MgSCU et additionne d'une mme quantit du standard interne que celle de l'extrait des produits volatils des aiguilles avant l'hydrolyse.

233

Analyse des aglycones par CG et CG-SM

L'extrait de chaque hydrolyse, soit acide ou enzymatique, est analys par la chromatographie en phase gazeuse. Toutes les analyses sont effectues sur deux colonnes capillaires, une a-polaire (DB-5, 30 m x 0,25 mm) et l'autre polaire (Supelcowax 10, 30 m x

59

0,25 mm). Les temps de rtentions des produits spars, sur les deux colonnes, sont transforms en indice de KOVATS (I.K.) pour identifier les produits en utilisant une banque de produits volatils, environ quatre cent cinquante, avec leurs I.K. sur les deux colonnes. Cette banque a t tablie par le groupe de recherche du laboratoire d'analyses des essences vgtales "LASVE" l'UQAC. L'identification des produits est complte par des analyses ralises sur deux CG-SM, VG 1250 MS l'UQAC et Finnigan-Mat 4500 du Laboratoire d'Agriculture canada Ottawa. Les spectres de masse des produits sont compars avec d'autres spectres retrouvs dans la littrature (40-42). Les conditions d'analyse sur le CG apparaissent au tableau 4.

60

TABLEAU 4 CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES Chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire Analyse non-polaire Chromatographes Injecteurs Temprature Colonnes Type Longueur Diamtre Film Analyse polaire

Hewlett-Packard (5890 A) Hewlett-Packard (5890 A) " On column " " Split-splitless " 200 C
D B - 5 (non-polaire)

30 mtres 0,25 mm 0,25 um

Polymthyl (5%Phnyl) Siloxane

40 C Supelcowax 10 (polaire) 30 mtres 0,25 mm 0,25 um

Polyethylene glycol

Dtecteur Temprature
G a z : Azote Air zro Hydrogne

ionisation de flammes ionisation de flammes 250 C 35 psi 40 psi 15 psi 45 psi Hlium 250 C 35 psi 40 psi 20 psi 45 psi

Gaz porteur Hlium Programmation de la temprature du four T. initiale T. finale Intgrateur Programmation

40 C pendant 2 min. 40C pendant 2 min. 2C/min. 2C/min. 210 C pendant 33 min. 210 C pendant 33 min. HP 3390 A HP 3390 A
Dbut: 0,00min Intgration: 6,00 120,00 min Dbut: 0,00min Intgration: 6,00 120,00min

Tableau tir de la rfrence 47.

61

Dans cette section les rsultats sont prsents en deux chapitres. Le chapitre 1 est consacr aux rsultats obtenus par la chromatographie liquide, la rsonance magntique nuclaire et la spectromtrie de masse des glycosides intacts. Le chapitre 2 est consacr aux rsultats des analyses par la CG et CG-SM des aglycones, obtenus par hydrolyse des glycosides.

62

CHAPITRE 1 EXTRACTION, PURIFICATION ET ANALYSES DES GLYCOSIDES INTACTS

Les rsultats obtenus sont prsents dans le mme ordre que les procdures exprimentales ( section II-Chap.2 ). Il faut se rappeler que les analyses qui ont t ralises ne sont pas des analyses quantitatives mais plutt qualitatives, c'est--dire il s'agit de la dtermination de structure de certains glycosides intacts qui ont t purifis par la chromatographie liquide ( CLP et CLHP ).

1.1

EXTRACTION ET PURIFICATION DES GLYCOSIDES INTACTS

Les extraits des aiguilles et des ramilles ont subi les mmes procdures exprimentales. Il faut se rappeler que dans cette partie les glycosides n'ont subi aucune transformation chimique. Toutes les procdures exprimentales ont t ralises dans des conditions qui permettent de conserver les produits dans leur tat original.

1.1.1 Extraction et pr-purification des glycosides

Les extractions par le soxhlet de 100 g de matriel vgtal sec, dcrites dans le chapitre 2 de la section II, ont donn 35,05 et 13,4 g de rsidus secs pour les aiguilles et les ramilles respectivement. Les aiguilles contiennent une plus grande quantit de produits que les ramilles.

63

Comme il est dcrit la partie exprimentale, une petite quantit du produit est analyse sur couches minces pour dterminer le systme des solvants qui peut nous donner une meilleure sparation sur une colonne preparative de gel de silice. Une quantit de 2 g de rsidu est injecte sur la colonne preparative de gel de silice dans un volume de 5 mL du systme de solvants CHCb : MeOH : H2O / 60:20:2 avec un dbit de 2 mL / min. Lesfractionsde 10 mL collectes sont analyses sur couches minces pour regrouper celles qui contiennent les mmes produits. Les rsultats de la CCM des fractions obtenues par la chromatographie sur colonne sont prsents la figure 13.

64

tt & &b' ii o OQ O.Q 9,9 c ' o s o o<::> o .

e>eD y o b > o ^ ---"'

#*

>;

Figure 13 : Analyse des fractions de CLP par CCM

65

1.1.2 Purification des glycosides par CLHP

Les fractions de la colonne preparative qui contiennent les mmes produits sont regroupes. Pour dterminer le systme de solvants dans le but de purifier les glycosides, nous avons fait appel la chromatographie sur couches minces phase inverse. Le systme de solvants qui a donn une meilleure sparation des produits des fractions 32 42 regroupes, se compose de MeOH : H2O / 30 : 70. Cependant, pour une sparation sur la colonne semi preparative CLHP- Cis le systme de solvants n'est qu'un seul paramtre parmi d'autres pour optimiser une sparation ( voir discussion). Une fois le systme de solvants est dtermin on doit chercher le dbit idal pour avoir une meilleure sparation. Un dbit de 1,5 mL a donn la meilleure sparation lors d'une tude d'optimisation de la sparation des fractions 32 42 regroupes (Fig. 15 ).

Les glycosides que nous avons purifis afin de les analyser ont t obtenus des fractions 74 109 regroupes. La figure 15 montre l'influence' du dbit sur la sparation de ces fractions. Un dbit de 1 mL / min a t utilis pour collecter les produits. Nous avons collect quatre fractions: le glycoside #1 ( Rt = 20,34 min ), le glycoside #2 et 3 ( Rt = 26min ) et le glycoside #4 ( Rt = 34,65 min ) (voir figure 15 ).

66

(I)

Figure 14 : Optimisation de la sparation des fractions 32 42 regroupes Dbit: 1 ( 1 mL/min);2 ( 1.5 mL/min);3 (2mL/min ) Systme de solvants : MeOH : H2O / 30 : 70

67

S B

z) * ; = a

Figure 15 : Sparation des glycosides des fractions 74 109 regroupes Dbit : 1 ( 1 mL / min ); 2 ( 1.5 mL / min ); Systme de solvants : MeOH : H 2 O / 30 : 70

68

12

ANALYSES DES GLYCOSIDES PAR LA RMN DU lH ET C ET SM

Les quatres chantillons dont trois sont des glycosides purs et l'autre un mlange d'un des trois et un autre glycoside, sont analyss dans les mmes conditions de solvant, le mthanol.

Les rsultats prsents dans le tableau 5, 6, 7 et 8 reprsentent les dplacements chimiques des glycosides. Pour chaque dplacement chimique il y a une ou des structures chimiques qui contiennent le carbone ou le proton qui peut lui correspondre. On peut trouver dans chaque tableau, les dplacements chimiques du 13C gauche et ceux du *H droite. Dans les deux cas on trouve les mmes structures partielles caractristiques de ces dplacements chimiques. Les dplacements chimiques ainsi que les constantes de couplage sont soit indiqus sur les spectres (voir annexe 1) ou ont t obtenus des tableaux de valeurs enregistres par l'appareil. Nous avons aussi analys trois glycosides par spectromtrie de masse ionisation chimique pour dterminer leurs masses molaires.

- Glycoside #1

Dans le tableau 5 les dplacements chimiques du

13

C ( 62,46 10,.22 ppm ) sont

caractristiques d'un hexose, sucre monomrique de six carbones. Les dplacements chimiques du *H ( 3,40 4,87 ppm) confirment aussi la prsence du hexose. La constante de couplage AJ ( 7,4 Hz ) 4,8 ppm est caractristique d'un sucre o l'hydrogne sur le carbone de l'actal est en position p, il s'agit du glucose (voir discussion). Le mthyle 26,36 ppm est li une ctone o le carbone un dplacement chimique 199,35 ppm. Les protons du mthyle ont un dplacement chimique sous forme de singulet 2,55 ppm (voir annexe 1; pages 137 et 138).

69
13

Les dplacements chimiques du

C qui se situent entre 117,08 et 154,35 ppm sont

caractristiques de carbones aromatiques. Dans la partie de dplacements chimiques du proton on trouve la mme information propos des protons aromatiques. Les constantes de couplage donnent plus de prcisions sur la nature de ces protons. Comme on peut voir nous avons deux doublets et un doublet ddoubl. Les valeurs de ces constantes confirment la prsence d'un noyau benznique tri-substitu, o deux substituants sont en ortho et l'autre est en meta avec un des deux. Les deux substituants qui sont en ortho ne peuvent tre dtermins en s'appuyant seulement sur ces rsultats. Nous allons discuter avec plus de prcision les diffrentes possibilits qui permettrons de trouver la structure complte du glycoside.

Bibliothque Universit du Qubec

70

Tableau 5 Dplacements chimiques de RMN du Glucoside^l

RMNdu 13 C " <ap (ppm) Nature des groupements
O

C3D

RMN du ^H i>pm),AJ(Hz)

Nature des group.

O
H

26,36

II

CH3 c

48,49 " 7 pics du MeOH Solvant . 49,51 62,46 71,38 74,90 " 77,67 > 78,50 104,22 117,08* 119,16
> \ C C
x
N

2,55 3H(s) 3,32 5H (m) 3,34, 3,40 3,57. 3,74' 3,77. 3,93' * 3,95. 4,86 4,87 6,92; 6,94. 7,66* 7,68 7,87

CH3"~ C

MeOH

2 -o

\c/
/

3H (m) lH(d,d) "

AJ = 5,6

\ C3I-OH

* H -0

AJ = 12,2 lH(d,d) AJ= 2,2 IH(d) AJ= 7,4

1 H (d) ~"

O H

c
\ H /

Actal

\S ^*

\c/ \, H
Ri

Aromatique

A J = 8,4

il

126,51 130,56, 146,63 154 35 199,35

1 H (d,d)
J

=2

)^ H

4\

R2

Ar-Y (Y = Subst. polaire)

0

AJ = 8,4 lH(d) AJ = 2,2 ^

AJ 5 6 R =6-10 AJ 2 ! 6 = 1-3 AJ 2)5 = O-1

II

Ctone a, (3 insat.

71

-GIycosides#2et#3

Dans le tableau 6, les dplacements chimiques du *H et 13C reprsentent le glycoside #2 pur et le tableau 7 les deux glycosides #2 et 3 qui sont en mlange. Les valeurs qui sont soulignes dans le tableau 7 reprsentent le glycoside #2 pur ( voir annexe 1; Glyc.#2, pages 141 et 142 ) et en mlange avec le glycoside #3 (voir annexe 1: Glyc.#2 et #3, pages 143 et 144).

Dans la colonne du 13C ( tableau 7 ; colonne gauche ) le dplacement chimique 26,44 ppm est un mthyle li une ctone. On trouve dans la colonne de droite deux 5 2,55 2,58 qui sont caractristiques de mthyles lis une ctone. Nous avons onze carbones dans la rgion des dplacements chimiques du sucre. Ces carbones reprsentent les deux sucres des deux glycosides o deux carbones ont le mme dplacement chimique 71,34 ppm. Le spectre du lH montre aussi des ddoublements dans la rgion entre 3,42 et 5,05 ppm. Les plus importants sont les deux doublets 4,94 et 5,05 ppm qui confirment la prsence de deux sucres avec des constantes de couplage AJ de 7,5 et 7,4 Hz (respectivement) et qui sont caractristiques des deux hydrognes des deux glucoses en orientation p\ Dans le spectre du glycoside #2 pur, la constante de couplage 5,05 ppm est de 7,66 Hz.

Dans la zone des carbones aromatiques on trouve neuf carbones o les deux souligns appartiennent au glycoside #2. Pour les sept autres il y a ceux qui appartiennent au glycoside #2 et les autres au glycoside #3. Les dplacements chimiques de la colonne du *H confirment la prsence de noyaux aromatiques. On peut distinguer deux doublets ddoubls 7,19 et 7,99 ppm avec les mmes constantes de couplage de 2 et 8,9 Hz qui sont caractristiques d'un noyau benznique di-substitu en positions para qui reprsentent le glycoside ffl. Les autres dplacements 7,26, 7.48 et 7,52 ppm sous forme de deux doublets et un doublet ddoubl avec

72

des constantes de couplage de 8,4,2,1, et 8,5 et 2,2 Hz respectivement, sont caractristiques d'un noyau benznique tri-substitu aux positions 1,2 et 4 du glycoside #3.

73

Tableau 6 Dplacements chimiques de RMN du Glucoside #2

RMNdu 13 C
& q > (PPm) Nature des groupements RMN 5sq> (ppm), AJ (Hz) Nature des group.

o
26,40 47,97 50,00 62,44
H

CH 3 -C

2,58 3,32 3,34J

CH3-C

Solvant: 7picsduMeOH MeOH

R-CH 2 -o

71,26
75,00 78,00 78,30

V \

3,42] 3,56
y

3,71

Mmes dplacements chimiques que le Gly.#l

3,95 101,60
H

Actal 5,05 Aromatique ou olfine conj. lH(d)AJ = 7,66 AJ5j6=6-ld AJ2]6= 1-3

117,23 131,63

7,19 7,99

2H(d,d) AJ = 8,9,2 2H(d,d) AJ = 8,8,2

R3

74

Tableau 7 Dplacements chimiques de RMN des Glucosides #2 et #3

RMN du 13C (ppm) Nature des groupements
O

RMNduiH (ppm), AJ (Hz) 2,55 Nature des group.

26.44 48,49 49,51 62.461 62,50 71.34 74,78" 74.83 77,58 77.98 78r36 78,47J 101.65 [ 103,10 [ 116,80" 117,03 117.30 122,51 131.63 133,00 134,00., 149,00 151,50 163,10 199,40

ii

CH 3 -C

Solvant: 7picsduMeOH 3.32] 3.34 J 3.42] MeOH

R-CH2-O

/ \

5 ou 6H(m) Mmes dplacements chimiques que le Gly.#l 2H(m)

156J
-

\
Actal

121"
3.95. 4,94 5.05 l.\T 7.99 7,26 7,48 7,52 I

lH(d) AJ = 7,5 lH(d)AJ = 7,4 2H(d,d) AJ = 8,9,2 2H(d,d) AJ = 8,8,2 lH(d) AJ = 8,4 (d) AJ = 2,1 (d,d) A
AJ 5>6 =6-10 AJ 2 ,6= 1-3 AJ 2r5 =O-l |

c=c

Aromatique ou olfine conj.

Ar-Y (Y = Subst polaire) ou olfine conj.

o
_c Ctonea, insat.

75

-Glycoside#4

Le tableau 8 prsente les dplacements chimiques du glycoside #4 (voir annexe 1; pages 149 et 150). On trouve les mmes dplacements qui reprsentent le sucre dans les deux colonnes. Cependant il y a des groupements qui ne sont pas prsents dans les trois autres glycosides. Nous avons un mthoxyle dont les valeurs caractristiques sont 56,35 et 3,88 ppm pour le 13C et le *H respectivement Nous avons aussi huit signaux caractristiques de carbones aromatiques et de liaisons doubles conjugues. Le dplacement chimique du 13C 71,01 ppm reprsente un mthylne li un groupement polaire. Les deux protons sont dans deux environnements magntiques diffrents. Ils absorbent 4,33 et 4,51 ppm chacun sous forme d'un doublet deux fois ddoubls. Les deux protons 6,22 et 6,61 ppm avec leurs constantes de couplages reprsentent deux hydrognes en trans dont l'un d'eux est coupl avec les deux hydrognes du mthylne. Un noyau benznique tri-substitu est confirm par la prsence des trois protons 6,75, 6.88 et 7,04 ppm avec leurs constantes de couplages qui caractrisent les positions 2,5 et 6. Sur les spectres du 13C et *H on peut voir les dplacements chimiques d'un sucre. L'absorption 4,38 ppm avec une constante de couplage de 7,66 Hz correspond l'hydrogne du glucose en position |3.

76

Tableau 8 Dplacements chimiques de RMN du Glucoside #4

RMNdu 13 C a (ppm) Nature des groupements 47,98 49,68 56,35 62,82 71,01
Cs OU 2 " O

RMNduiH ^p (ppm), AJ (Hz) 3,24' MeOH et (CH3-O-) ? (S) CH3-O-R Nature des group.

Solvant: 7picsduMeOH CH3-OR-CH 2 -0

3,93. 3,88 4,33 et 4,51

(ddd)' AJ= 6,86,1,26 (ddd)^ AJ = 5,88

71,72, 75,15' 78,00 78,15 103,16

'

4,38
-ON

(d)

AJ = 7,66

6,22b"

1 1
c Actal 6,61e. 6,75' 6,88 7,04^

(ddd) AJ = 16,6,77,5,88 -CHc=CHb-CH2-O-? ( les deux H sont en cis) (d) AJ = 15,96 (d) AJ = 8,13
H

110,58 116,19 121,16 123,72 130,37 134,30

\ c= c /

/ \

Aromatique ou olfine conj.

J ^ H

(d,d) AJ=1,96
(d) et 8,16 AJ=1,93

H^Sf^R
R3 AJ5)6=6-10
A J 2 > 5 = 1-3

Ar-Y (Y = Subst. polaire)

&OOl

ou olfine conj.

77

CHAPITRE 2

EXTRACTIONS ET ANALYSES DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSE ENZYMATIQUE

Les rsultats des analyses des produits volatils librs par hydrolyses enzymatiques des aiguilles et des ramilles ne permettent pas une quantification globale ni individuelle de ces produits dans le matriel vgtal. Par contre les analyses des produits volatils obtenus par hydrolyse acide permettent une quantification de la masse relative des produits volatils l'tat libre ( voir discussion ).

2.1

ANALYSE DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSE ENZYMATIQUE

Les hydrolyses enzymatiques avec le (3-D-Glucosidase et la Cellulase, des aiguilles et des ramilles, prsentent un trs grand nombre de produits ( voir annexe 2, pages 152 et 153 ). Seuls les produits identifis sont prsents dans les tableaux 9 et 10. Les spectres de masses de ces substances sont reproduits dans l'annexe 3.

Les produits qui apparaissent dans les tableaux 9 et 10, sont ceux des hydrolyses enzymatiques pour chaque partie de la l'arbre, respectivement les ramilles et les aiguilles. Les produits sont identifis par CG et CG-SM avec leur pourcentage relative pour les deux hydrolyses enzymatiques (0-D-Glucosidase et Cellulase).

78

TABLEAU 9 Aglycones volatiles libres par hydrolyse enzymatique des glysides des ramilles

No

Identification

I.K.Spx-10

LK.DB-5

Santne 2,3-Dimthylpentan-2-ol 2-Mtfaylbut-2-n-l-ol Hexan-1-ol cis-Hex-3-n-l-ol Benzaldhyde 2,4-Dimthylheptane-2,4-diol Linalool Terpine-4-n-l-ol trans-Pinocarvoi CL, 4-Dfcnhyfcyclohex-3n-1-actaldhyde a-Terpinol Bornol Campholnal Citronellol Myrtnol Monoterpnol ? para-Cymn-8-ol Graniol Phnylmthanol 2-Phnylthanol Alcool perillique Eugnol

1124 1329 1357 1382 1522 1526 1571 1595 1642 1660 1684 1698 1767 1781 1784 1794 1842 1842 1871 1902 1993 2158

2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

891 7 ? 876 862 960 ?

1095 1176 1142 1112 1189 1166 1126 1231 1191 1198 1181 1258 1036 1120 1295 1358

3,49 0,41 0,29 4,22 2,25 0,10 2,78 18,42 0,49

0,13 0,06 0,17 2,04 0,59 0,11 0,12 3,61 5,89 1,58 0,06? 1,33 8,38 0,74 1,70 0,87 3,37 0,45 1,04 2,48 2,54 0,51 1,47

0,83 0,25 0,28 0,66 1,08 0,49 1,50 0,76 0,13 2,22 2,48 0,38 1,52

79
24 25 26 27 28 29 30 2-Hydroxy-5-mthylactophnone 2188 ? ? 1,59 0,79 3,33 4,79 8,70 1,08 1,62 0,65 1,48 1,23 1,99 3,33 0,31 1,19

p-(2-Mthylallyl-)2277 Phnol trans-Cinnamyl alcool 2284 1308 iso-Eugnol 2330 1460 Vanilline 2560 1389 4-Hydroxy-3-mthoxy2626 1482 actophnone 4-(4-Hydroxy2771 1640 3-mthoxyphnyl)-butan-2-one

% H.E. a % HE.
b

: % obtenu par hydrolyse enzymatique avec la 0-Glucosidase; : % obtenu par hydrolyse enzymatique avec la Cellulase; : Indice de KOVATS sur la colonne a-polaire DB-5; : Indice de KOVATS sur la colonne Supelcowax 10.

I.K.DB-5 LKJSpx

80

TABLEAU 10 Aglycones volatiles libres par hydrolyse enzymatique des aiguilles

No

Identification

I.K.Spx-10

I.K.DB-5

. * 5,17 0,32 0,12 0,23 0,17 0,98 1,80 1,03 20,08 1,38 0,09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Santne 2,3-Dimthylpentan-2-ol 2,4-Dimthylpentan-3-ol 2-Mthylbut-2-n-l-ol Hexan-1-ol 2-Mthylhexan-2-oI cis-Hex-3-n-l-ol Benzaldhyde Linalool Terpine-4-n-l-ol trans-Tinocarvol a , 4-dimlhylyclohex-3n-1-actaldhyde a-Terpinol Bornol Campholnal Citronellol Myrtnol Monoterpnol ? ara-Cymn-8-ol Graniol Phnylmtnanol 2-Phnylethanol Alcool perillique Eugnol

1124 1187 1329 1357 1362 1382 1522 1571 1595 1642 1660 1684 1698 1767 1781 1784 1794 1842 1842 1871 1902 1993 2158

891 ? ? ? 876 ? 862 960

1095 1176 1142 1095 1189 1166

0,50

1,12 1,88 0,07 7,42 0,13 0,13 1,24 0,22 9,49 1,26

5,92

0,28 0,89 0,09 0,38 5,20 0,09 0,06 1,99 0,19 0,73

?
1231 1191 1198 1181 1258 1036 1120 1295 1358

2,92 9,03 0,16 0,71 2,12 0,80 1,69 4,53

0^6

81 25 26 27 28 29 30 31
2-Hydroxy-5-mthylactophnone p-(2-Mthylallyl)Phnol trans-Cinnamyl alcool iso-Eugnol Vanilline 4-Hydroxy-3-mthoxyactophnone 4-(4-Hydraxy2188 2277 2284 2330 2560 2626 2771

? ?
1308 1460 1389 1482 1640

0,85 0,26 1,71 0,15 3,30 26,90 4,38

0,65 0,30 0,67

2,17 12,89 2,16

3-mthoxyphnyl)-butan-2-one

% H.E. a % H.E. b I.K.DB-5 LKJSpx

: % obtenu par hydrolyse enzymatique avec la 0-Glucosidase; : % obtenu par hydrolyse enzymatique avec la Cellulase; : Indice de KOVATS sur la colonne a-polaire DB-5; : Indice de KOVATS sur la colonne Supelcowax 10.

82

12

ANALYSE DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSE ACIDE

Les rsultats de l'hydrolyse acide de l'extrait des glycosides sont prsents dans le tableau 11 ( voir annexe 2; page 154 ). Seuls les produits identifis sont prsents avec leur pourcentage relative dans les aiguilles et les ramilles. Les extractions des aglycones sont faites par l'extracteur Likens-Nickerson et les analyses sont effectues dans les mmes conditions que les aglycones libres par hydrolyse enzymatique. Pour dterminer le pourcentage relatif des produits volatils dans les aiguilles, nous avons hydrolyse les glycosides de 50 g d'aiguilles sches aprs avoir extrait pendant 20 et 6 heures les produits libres. Les produits volatils libres reprsentent 2,33 % , et ceux librs par hydrolyse acide ne reprsentent que 033 % du poids des aiguilles sches. Les produits volatils libres sont sept fois plus importants en poids que les produits sous forme de glycosides.

Contrairement l'hydrolyse enzymatique, l'hydrolyse acide ne donne pas la composition relle des produits volatils. Dans le milieu acide les produits subissent des transformations structurales. Comme les aglycones sont des alcools, certains constituants peuvent subir l'limination d'une molcule d'eau, un rarrangement de la structure ou une perte de tout autre groupement.

83

TABLEAU 11

Aglycones volatiles libres par hydrolyse acide des glycosides

No

Identification Santne Ppara-Cymne Hexan-1-ol cis-Hex-3-n-l-ol Citronllal Benzaldhyde Linalool Terpine-4-n-l-ol trans-Pinocarvol a-terpinol Bornol Pipritone Campholnal Phnylmthanol 2-Phnylthanol Carvacrol ?

I.K.Spx-10 1275 1357 1382 1483 1521 1571 1595 1642 1684 1698 1716 1767 1871 1902 2210

LK.DB-5 891 1024 876 862 1162 960 1095 1176 1142 1189 1166 1257 ? 1036 1120 1308

%Ra. 1,46 5,89 1,82 1,26 1,61 4,07 5,61 0,32 0,40 2,43 3,11 2,64 1,48 3,38 0,28 2,26

% AL 4,03 5,80 0,08 3,36 2,50 10,82 0,04 1,06 1,11 2,38 2,31 0,21 0,86 1,89 0,42

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

% Ra. % AL I.K.DB-5 I.K.Spx

: % obtenu par hydrolyse acide de ramilles; : % obtenu par hydrolyse acide des aiguilles; : Indice de KOVATS sur la colonne a-polaire DB-5; : Indice de KOVATS sur la colonne Supelcowax 10.

84

85

CHAPITRE

EXTRACTION ET PURIFICATION DES GLYCOSIDES

1.1

EXTRACTION DES GLYCOSIDES

Les glycosides sont des substances constitues de deux parties distinctes: une partie glycosidique et l'autre non glycosidique. Dans une plante on trouve une multitude de produits de nature diffrente ( huiles essentielles, lipides, alcanes, acides gras etc.). L'extraction des glycosides ncessite l'limination de ces substances. Les mthodes d'extractions utilises par diffrents chercheurs quoiqu'elles font appel plusieurs techniques, ont toutes un point commun: la conservation intacte de la structure des glycosides au cours des diffrentes tapes de l'extraction. La destruction des tissus de la plante est invitable pour extraire ces produits provoquant ainsi l'activation de certains enzymes, surtout les hydrolases et les glycosidases 2 . Le rle de ces derniers en temps normal est de librer les aglycones des glycosides. En broyant le matriel vgtal dans le mthanol2 ou l'eau 6 une temprature proche de leur point d'bullition, les enzymes sont inactives immdiatement. Aussi, temprature trs basse, les enzymes ne sont pas actives. Le broyage du matriel vgtal dans l'azote liquide est aussi une mthode courante 78. Pour prvenir l'hydrolyse des glycosides par les enzymes de la plante, nous avons utilis du matriel pralablement sch. La pulvrisation de la plante est ralise sec dans un malaxeur. Les glycosides ne sont pas affects par la prsence des enzymes puisqu'ils ne sont pas en solution. L'extraction des glycosides partir du matriel pulvris est ralise dans un extracteur Soxhlet avec du mthanol pendant quarante huit heures. Les substances lipophiliques sont limines en premier lieu avec du tolune de la mme manire. Cette mthode ne ncessite

86

pas de grande quantit de solvant, surtout pour liminer les traces des substances lipophiliques qui persistent dans la matrice vgtale. La rutilisation d'une mme quantit du solvant par distillation et condensation rend cette mthode trs conomique. Toutefois il faut toujours qu'il reste une quantit suffisante dans le ballon o les produits extraits s'accumulent pour viter la destruction de ces derniers par effet de chaleur qui doit tre juste suffisante pour faire bouillir le solvant.

La dtermination de la quantit relle des glycosides ne peut se baser sur la quantit de l'extrait des glycosides. Non seulement parce que le rsidu se compose de plusieurs substances qui ne sont pas toutes des glycosides, mais aussi parce que la mthode d'extraction utilise n'est pas ncessairement efficace pour extraire la totalit des glycosides. Svendsen 13 a fait une tude comparative entre deux mthodes d'extraction ( Section I : revue de littrature ). Dans la mthode (A) les glycosides sont extraits dans l'eau et la mthode (B) dans le mthanol ( 100 mL et 200 mL ). La premire mthode est de loin la plus efficace ( voir tableau 1, page 8 ). La quantification des glycosides ou les substances volatiles sous forme de glycosides est base surtout sur l'analyse des produits volatils librs par hydrolyse ( Voir Chapitre 3 ).

PURIFICATION DES GLYCOSIDES

Pour analyser les glycosides intacts il est primordiale de les sparer individuellement. Cette opration ncessite plusieurs oprations. L'extrait des glycosides est souvent un mlange complexe de d'autres substances. Mme s'ils sont solubles dans le mme solvant d'extraction, ils ont des structures et des poids molculaires trs diffrents. Pour sparer les produits d'un mlange, la chromatographie solide-liquide est la technique par excellence pour arriver cette fin. Cependant les produits doivent tre assez semblables pour tre retenus sur la mme phase stationnaire ( adsorbant ) et assez diffrents pour tre spars sur cette dernire. Une sparation

87

de deux substances est possible quand la rsolution est optimale. L'expression suivante reprsente la relation entre la rsolution et certains paramtres chromatographiques:

Comme on peut le constater, le facteur de capacit (k1) ( celui du produit qui a le temps de rtention le plus lev ), la slectivit (a) et le nombre de plateaux thoriques (N) sont les paramtres qui peuvent influencer la rsolution 38 . Comme nous avons vu dans le paragraphe des principes et thorie de la chromatographie ( page 43 ), k1 se traduit par le temps pass par une substance ( solut ) sur l'adsorbant par rapport celui pass dans la phase mobile ( luant ). Un solut qui a une plus grande affinit pour l'adsorbant va mettre plus de temps tre lue qu'un autre qui a plutt une plus grande affinit pour F luant. On peut varier le facteur de capacit ( k' ) d'un solut pour un adsorbant donn, en changeant la composition de l'luant. Un solut apolaire va avoir une grande affinit pour une phase inverse ( apolaire ) avec un luant polaire. Par contre, plus on diminue la polarit de l'luant plus l'affinit du solut pour ce dernier va augmenter, et cela va entraner une diminution de la valeur du facteur de capacit. Mais pour un mme luant la composition de deux adsorbants de mme nature a une grande influence sur k'. Un adsorbant poreux va donner une valeur de k" plus grande qu'un adsorbant pelliculaire poids gal pour un mme solut 38 . La raison est qu'un adsorbant poreux a une plus grande surface de contact avec le solut.

La slectivit ( facteur de sparation ) a une influence plus importante sur la rsolution. Une faible variation de ce paramtre peut entraner un changement considrable sur la sparation d'un mlange 38 . La slectivit est influence directement par la nature et la composition de l'luant, la nature de l'adsorbant et la temprature. Pour sparer un mlange de deux produits ou plus, la nature de l'adsorbant est choisie en fonction de leur nature. En rgle gnrale, les

88

produits polaires sont spars sur un adsorbant non polaire et vice versa. Quand le choix de l'adsorbant est fix, c'est l'luant qui va tre le paramtre dterminant pour optimiser la slectivit sans varier la temprature. La slectivit est le rapport des facteurs de capacit de deux produits qu'on vise sparer. S'ils ont des k' gaux, il n'y a pas de sparation ( a = 1 ). Pour les sparer il faut changer la composition de l'luant jusqu' ce que le rapport soit suprieur 1. Finalement, pour optimiser la rsolution il faut maintenir k1 entre 2 et 8 et a entre 1,5 et 2,0 38 . Une valeur de k' suprieure 8 n'amliore pas beaucoup la rsolution, mais elle augmente le temps ncessaire pour hier les produits.

Le dbit de l'luant est aussi un paramtre important pour optimiser la sparation de produits dans un mlange. La figures 14 ( page 66 ) illustre bien l'influence de ce paramtre. On peut voir la variation de la sparation des produits en fonction du dbit pour un mme systme de solvant, le meilleur dbit tant 1,5 ml / min.

Comme dj mentionn plus haut, les glycosides sont composs de deux parties, un ou plusieurs sucres et une aglycone qui est principalement un monoterpne acyclique ou cyclique, un compos noyau aromatique ou molcules norisoprnoques 13 atomes de carbones 5 . Comme l'aglycone est en gnral une molcule non polaire ou peu polaire et le sucre est trs polaire, le glycoside se trouve avec deux ples qui lui permettent d'tre spar sur un adsorbant polaire ou apolaire. Cependant la phase stationnaire qui est la plus utilise par les chercheurs est le gel de silice phase normale ( voir revue de littrature, page 10 ).

Pour sparer les glycosides extraits de l'pinette noire, nous avons eu recours la chromatographie liquide preparative phase normale pour simplifier le mlange. Une colonne de verre ( d.i. = 5 cm, et 1 = 75 cm ) remplie sec avec du gel de silice 24 - 37 um. Nous avons remarqu que pour liminer l'air de l'adsorbant plus facilement il faut que l'luant circule de bas

89

en haut dans la colonne qui est maintenue verticalement. Si l'luant circule dans le sens contraire, c'est--dire de haut en bas, l'air rsiste plus longtemps puisqu'il a tendance monter cause de sa faible densit par rapport l'luant aussi pour liminer les bulles d'air qui sont emprisonnes dans l'adsorbant, il faut une trs grande quantit de l'luant

L'extrait des glycosides ( 2 g ) a t fractionn sur la colonne avec l'luant ( CH3CI : MeOH : H2O / 60 : 20 :2 ) dont la composition est dtermine par des analyses de l'extrait sur des couches minces de gel de silice. Pour avoir une bonne sparation sur la colonne des produits viss, il faut que leur Rf soit infrieur 0.4. Plusieurs luants sont tests en augmentant ou en diminuant leur polarit. Le dbit tait de 2 ml/min, et nous avons utilis la chromatographie sur couches minces pour identifier les fractions qui contiennent les produits qui ont les mmes Rf. Les fractions 74 109 ont t regroupes et spares sur une colonne semi-prparative CLHPCig. Les conditions de sparation des produits ont t dtermines en suivant les principes d'optimisation de la rsolution. L'adsorbant que nous avons choisi est le gel de silice phase inverse Cig malgr que la plupart des chercheurs ont utilis le gel de silice phase normale pour sparer les glycosides extraits des plantes 17 " 19 ' 22 24 . Leong et al ^ ont compar des colonnes CLHP, une phase inverse ( Ci8 ) et l'autre phase normale ( SiOH ), pour sparer quatre glycosides phnoliques (polaires ). Ils ont ralis une sparation parfaite sur le gel de silice. Par contre il n'y a pas eu de sparation sur la phase inverse. Cependant, Andersson et al 2 6 ont ralis la sparation de glycosides phnoliques sur une colonne semi-prparative phase inverse.

90

CHAPITRE

INTERPRTATION DES DONNES SPECTROSCOPIQUES

2.1

DTERMINATION DES STRUCTURES DES GLYCOSIDES

Le dplacement chimique de chaque noyau, proton ou carbone, dpend de son environnement magntique qui est dtermin par la nature des autres noyaux qui l'entourent L'intensit de chaque dplacement chimique dpend du nombre de noyaux qui absorbent au mme endroit pour la RMN *H et 13C. Aussi elle dpend du nombre de protons lis au carbone dans le cas de la RMN du 13C.

Les constantes de couplage sont trs importantes pour dterminer la structure d'un produit Nous pouvons distinguer les orientations spatiales relatives de chaque noyau (ici c'est le
1

H) en s'appuyant sur les valeurs de leurs constantes de couplage. Dans la littrature les

constantes de couplage sont donnes pour la majorit des orientations possibles. L'interprtation des dplacements chimiques d'une substance est trs difficile quand il s'agit de diffrencier entre deux isomres qui ont des dplacements chimiques trs proches et des constantes de couplage semblables. Lorsqu'on est en prsence de plusieurs protons qui ont des dplacements chimiques confondus et des constantes des couplages diffrentes, il devient difficile de dterminer avec prcision les constantes de couplage pour chaque proton.

Un des objectifs dans le prsent travail est de dterminer les structures des glycosides intacts extraits de l'pinette noire. Chaque structure est constitue d'un sucre et d'une aglycone.

91

L'identification ou la dtermination des structures des sucres, monosaccharides ou oligosaccharides, avec la spectroscopie de RMN du *H n'est pas chose facile. La localisation des protons la priphrie des molcules cause des effets de blindage et de dblindage trs importants 49 . Dans le cas des sucres monomriques, on peut obtenir des rsultats satisfaisants en utilisant un spectromtre de RMN avec un champ magntique lev qui permet d'obtenir les constantes de couplage (AJ) avec prcision. La configuration d'un sucre peut tre identifie en se basant sur les valeurs des (AJ) qui sont caractristiques pour chaque orientation. Dans un cycle six membres, on peut diffrencier un hydrogne axial d'un hydrogne equatorial en sachant la valeur de la constante de couplage de celui-ci avec un hydrogne li au carbone adjacent: la valeur de Ja,a est en gnral observe dans l'intervalle 8-13 Hz, par contre les valeurs de J^e et Je,e sont plus faibles, ils se situent entre les valeurs 2-6 Hz et 1-4 Hz, respectivement4. Comme on peut le constater, il est difficile de dterminer l'orientation d'un hydrogne si la constante de couplage se trouve dans les deux intervalles (Ja,e et Je,e)- Contrairement aux (AJ) les (5) sont plus affects par la nature du solvant et de la temprature et il faut en tenir compte. Pour certaines structures on peut calculer les dplacements chimiques du 13C ou/et du *H en sachant les valeurs diffrentielles des substituants qui entrent enjeux dans une structure. Les valeurs de ces derniers sont donnes dans la littrature 45 48 .

La RMN du

13

C est trs utilise pour l'identification des sucres. Les carbones ne

produisent pas les effets de blindage et de dblindage que produisent les protons 49 . Les valeurs des dplacements chimiques (13C) des sucres sont plus frquemment compares avec celles des sucres modles pour dterminer leurs structures que dans le cas de la RMN du *H 49 . Cependant, il faut s'assurer que les valeurs (5) des structures modles sont obtenues dans des conditions de solvant et temprature similaires celles du sucre qu'on veut identifier. Dans la littrature la valeur des dplacements chimiques des sucres de glycosides sont souvent obtenues dans des solvants diffrents. L'identification de la structure d'un sucre par comparaison avec des

92

structures modles peut tre trs difficile si la nature des deux solvants est trs diffrente. Cependant, en combinant les valeurs obtenues par la RMN du *H et 13C et en tenant compte de l'effet du solvant, on peut identifier la structure d'un sucre monomrique.

Dans ce travail, les spectres de RMN du *H et 13C des glycosides ont t pris dans le mthanol comme solvant. tant donn que ce dernier a une polarit proche de celle de l'eau, nous avons pu comparer nos rsultats avec ceux des structures modles prises dans la littrature pour identifier les sucres. Les structures modles sont choisies en fonction des structures possibles dtermines par l'interprtation du RMN OU et
13

C) des glycosides obtenus

exprimentalement. Les valeurs de ces modles sont prsentes dans les tableaux 12 et 13.

Pour nous aider dterminer la structure des aglycones des quatres glycosides, nous avons utilis des structures modles dont nous avons calcul les dplacements chimiques ( voir les tableaux 14,15 et 16 ). Ces structures modles sont toutes des glucosides aromatiques o le 0-D-glucopyrannoside est un des substituants ( Figure 16; rf. 19, 20, 24, 25, 52 ). Dans la littrature les valeurs diffrentielles du |3-D-glucoside sont obtenues dans l'eau comme solvant 51 . Les valeurs diffrentielles des autres substituants sont" obtenues dans le chloroforme 45> 48 . Ces valeurs diffrentielles sont obtenues d'une faon approximative en appliquant le principe d'additivit des substituants.

Dans les tableaux 14, 15 et 16, les colonnes de A expriment la diffrence entre le dplacement chimique exprimental et calcul pour chaque carbone du noyau benznique dans chaque structure. La valeur de A qui correspond au carbone Ci est toujours positive et elle est suprieure 5 ppm dans la moiti des structures. Dans le cas des autres carbones dans toutes les structures, sans exception, la valeur absolue de A est toujours infrieure 5 ppm. Pour les carbones Ci et C dans chaque structure, c'est--dire en positions ortho avec le substituant de Ci,

93

les valeurs de A sont ngatives quelques exceptions prs. Pour le carbone C4, position para, les valeurs de A sont presque toujours positives. Ces valeurs de A nous servent d'exemples des carts attendus entre les valeurs calcules et exprimentales de diffrents glycosides.

Les dplacements chimiques exprimentaux de chaque glucoside extrait de l'pinette noire peuvent correspondre plusieurs structures. Pour pouvoir distinguer entre elles nous avons calcul leurs dplacements chimiques de la mme faon que nous avons fait pour les glucosides modles 45> 48.51 Le S valeurs calcules des diffrentes structures possibles sont compares avec les valeurs exprimentales des glucosides de l'pinette noire. Les structures modles qui ont des valeurs proches des valeurs exprimentales sont retenues.

94

Tableau 12: Dplacements chimiques du 13 C des glucosides aromatiques a

Sucre orgb.

Ci

c2
72,5 75,1 69,4 72,9 72,0 75,8 73,6

c3
73,8 76,7 70,2 73,8 73,3 79,5 76,4

c4
70,6 70,6 70,3 69,7 70,2 72,4 71,3

c5
72,3 76,8 71,4 76,0 73,9 79,3 78,3

c6
61,6 61,7 62,2 62,0 61,1 63,6 63,7

92,9 96,7 93,2 97,3

fat
a-gal.

a-gbhnyl 97,9 PgJu-phnyl 103,1 104,0

a

Valeurs tires de la rfrence 49.

95

Tableau 13: Dplacements chimiques du *H et (constantes de couplages) de trois D-aldohexoses a

Sucre a-glu.

Hi 5,09 (3,6)

H2
3,41 (9,5) 3,13 (9,5) 3,79 (3,8) 3,85 (3,8) 3,72 (10,0) 3,41 (10,0)

H3
3,61 (9,5)

H4 3,29 (9,5) 3,30 (9,5) 3,52 (9,8) 3,44 (9,8) 3,90 (1,0) 3,84 (1,0)

H5 3,72

H6 3,72 (2,8) 3,75 (2,8) 3,74 (2,8) 3,74 (2,8) 3,70 (6,4) 3,70 (3,8)

Hs
3,63 (5,7,12,8) 3,60 (5,7,12,8) 3,63 (6,8,12,2) 3,60 (6,8,12,2) 3,62 (6,4) 3,62 (7,8)

3,35

P-ghi.

4*51 (7,8)

337
(9,5) 3,72 (10,0) 3,53 (10,0) 3,77 (3,8) 3,56 (3,8)

3,70

a-man.

5,05 (1,8)

3,25

3-man.

4,77

(U)
a-gal.
5,16 (3,8)

4,00

3,61

p-gaL

4,48 (8,0)

a Valeurs tires de la rfrence 49; Valeurs mesures 400 MHz dans D2O.

96

Noyau benznique di-substitu.

O-Gluc. O-Gluc. O-Gluc. CH2QH O-Gluc. CH 2 -OOH COCH3 Q,

Arbutine
Prod, l, l ' e t l "

Picine
Prod.2 Prod. 4a

Salicin
Prod.3

Salicortine
Prod.5

O-Gluc. C-O 2
H

Herayoside

O OH Gluc.-O Prod4b

Noyau benznique tri-substitu.

O-Gluc.
OCH3

OH O PQ-C-OCH2
11

CHO

Ghic.-O

Gluc.-O

Glucovanilline
Prod. 6

Trichocarpine
Prod.7

Salireposide
Prod. 8

Figure 16 : Quelques glucosides aromatiques modles

97

Tableau 14 : Noyaux benzniques di-substitus en positions 1 et 4

(ppm) Cari>.

Prod. I (MeOH-^)52 Itodl'CCsHsN-Ps)

cal. exp. 152,4 119,4 116,6 153,8 116,6 119,4

Prod. 1" (D2O)19

cal. exp. 152,4 119,4 117,2 151,4 117,2 119,4

ftod.2(DMSCXWa
cal. 157,7 119,0 1323 133,7 1323 119,0 exp. 161,0 115,8 130,2 130,8 130,2 115,8

A
+ 6,2 -1.0 -2,9 + 23 -2,9 -1.0

cal. 146,2

exp. 154,0 116,9 118,8 151,8 118,8 116,9

A
+ 7,8 -3,5 -0,7

A
+ 6,2 -1,0 -2,3 -0,1

A
+ 33 -3,2 + 0,6 -2,9 -2,0 -3,2

Ci

146,2 120,4 1194 1514 1194 120,4

146,2 120,4 1194 1514

c2 c3 c4 c5 c6

120,4 1194 1514 1194 120,4

-0,7 -34

1194 120,4

-23 -1.0

Tableau 15 : Noyau benznique di-substitu en positions 1 et 2

(ppm) Carb.

Prod. 3 (D2O)52
cal 152,1 1313 130,8 123,2 130,8 117,6 exp. 154,9 129,7 130,0 123,6 130,0 115,6

Prod. 31 (D2O) 24
caL 152,1 1313 130,8 123,2 130,8 117,6 exp. 1554

Prod. 4b (D2O) 24
cal. 1534
126,7 exp. 155,8 1254 1314 124,1 1314

Pro&SODMSOd)52
caL 1534 126,7 132,2 124,6 132,2 119,0 exp. 154,9 1244 129,4 121,7 128,8 115,0

A
+ 2,8 -1.6 -0,8 + 0,4 -0,8 -2,0

A
+3,4

A + 23

A
+ 1,4 -2,2 -2,8 -2,9 -3,4 -4,0

Ci

c2 c3 c4 c5 c6

-U
-0,7 -0^ -0,7 -2,5

1304 124,2 1304 1163

-0,3 + 1,0 -03 -13

132,2 124,6 132,2 119,0

1164

98

Tableau 16 : Noyau benznique tri-substitu en positions 1,2 et 4

(ppm) Caib.

Prod.6(Me^C>d^5 ProdTCMe^CO^ Prod.8(MeaCX>d6)S2 Prod. 4a (D2O)24

cal. 144,6 151,0 116,4 134,2 125,8 106,2 exp. 151,7 1493 1144 1304 125,4 1104

A5
+ 7,1

caL 145,7 121,7 119,0 151,0 123,0 119,9

exp. 152,2 116,9 121,4 150,2 122,6

A
+ 64 -4,8
+ 2,4 -0,8 -0,4 + 0,4

cal. 146,2 128,1 1194 1514 1194 120,4

exp. 152,4 1274 116,4 148,9 118,7 116,0

A
+ 6,2 -0,6 -3,1 -2,6 -0,8 -4,4

caL 154,4 107,6 158,6 111,4 137,1

exp. 156,0 111,1 156,8 111,9 134,2 108,0

A
+ 1,4 + 3,7 -1,8 + 04 -2,9 -3,2

Cl

c2 c3 c4 c5 c6

-1,7 -1,9 -3,7 -0,4 + 43

1203

11U

99

22 INTERPRTATION DES DPLACEMENTS CHIMIQUES DU ^H et

2.2.1 GLUCOSIDE#1

a) Spectre de masse

Le spectre de masse obtenu par ionisation chimique prsente trois ions caractristiques de l'ionisation chimique avec le mthane, M + H+ (315), M + C2Hs+(343) et M+ C3H5+(355). On peut dduire que le produit a une masse molaire M (314) (Fig. 20).

Le spectre de masse obtenu par ionisation lectronique prsente desfragments(m/z=163, 145 et 127) qui peuvent tre celles d'un sucre monomrique, un hexose (Fig. 17).

Nous pouvons aussi distinguer des ions qui peuvent provenir de l'aglycone (la partie lie au sucre), Ma (152), et Ma+l(153), Ma+2(154) et le fragment Ma-15(137).

b) Spectres de RMN du *H et 13C

Sur le spectre de la RMN du

13

C on distingue les dplacements chimiques de six

carbones qui peuvent tre ceux d'un hexose (62,46 104,22 ppm). Pour la dtermination de la structure du sucre, nous avons procd par comparaison avec des modles trouvs dans la littrature (tableaux 12 et 13; rf.49). Les comparaisons au niveau du 13C suggrent que le sucre peut tre soit le p-D-glucose ou le f-D-galactose avec le dplacement chimique du C'i (13C) de 104 ppm qui est typique de la configuration p\ La comparaison des valeurs des dplacements chimiques des protons ne peut donner plus de prcision que celles du 13C.

100

H2CH Agiycone

HO

f
OH

HO 1

CH2GH

OH CH2OH

CH 2 0H

-HP
OH HaCH

OH m/z=163

-6

OH m/z=127

HO

OH

m/z=145

Figure 17 : Mcanisme defragmentationdu glucose

101

Contrairement aux dplacements chimiques les constantes de couplages sont plus prcises: elles sont moins affectes par la nature du solvant utilis (voir tableau 5). Cela a permis de proposer comme sucre, le 0-D-giucose en se basant d'abord sur le proton qui absorbe vers 4,8 ppm avec une constante de couplage (AI = 7,4 Hz) qui reprsente le couplage de l'hydrogne axial sur C'i et l'hydrogne axial sur C '2 aussi, les deux protons du C' qui absorbent entre 3,74 et 3,95 ppm ont une constante de couplage (AJ = 12 Hz) caractristique de deux protons gmins non quivalents magntiquement, et deux autres qui reprsentent les couplages diffrents de chaqu'un d'eux avec l'hydrogne axial sur C'5 (AJ = 2,2 et 5,6 Hz).Ces derniers couplages plus voisins de ceux du P-D-glucose (AJ = 2,8 et 5.7 Hz) que ceux du P-D-galactose (AJ = 3,8 et 7,8 Hz)

Les dplacements chimiques du spectre 13C qui se situent entre 117,08 et 154,34 ppm correspondent des carbones aromatiques. Le dplacement 26,36 ppm est caractristique d'un mthyle li un groupement polaire. Nous avons aussi une ctone 199,4 ppm.

Les rsultats obtenus par le spectre de la RMN du *H donnent plus d'informations sur la structure de l'aglycone. La prsence de trois protons aromatiques avec leurs constantes de couplage nous confirment la prsence d'un noyau benznique tri-substitu en position 1,3 et 4. Le doublet ddoubl entre 7,66 et 7,68 ppm (tableau 5) reprsente un proton (H) coupl avec un deuxime (H5) en position ortho avec AJ = 8,4 Hz et avec un troisime (H2) en position meta avec AJ = 2 Hz. Le proton H5 coupl avec H, AJ = 8,4 Hz, a un dplacement chimique de 6,93 ppm. Et le H2 7,87 ppm est coupl avec H, AJ = 2,2 Hz On ne voit pas la constante de couplage entre les protons H5 et H2 en position para. Le mthyle sous forme de singuiet 2,55 ppm est li un groupement polaire (le carbonyl), ce qui explique son dplacement chimique vers un champ magntique plus bas.

102

Le nombre de pics distincts, sur le spectre du 13 C, est de quatorze (sans compter les 7 pics du mthanol). Si on considre qu'il n'y a pas de carbones quivalents magntiquement dans la structure, nous pouvons conclure que l'aglycone possde huit carbones, ce qui reprsente le noyau benznique, la ctone et le mthyle (six carbones appartiennent au hexose). Les dplacements chimiques de trois carbones (130.56, 146.63 et 154.35 ppm) et deux protons (7,66 7,87 ppm ) indiquent la prsence de substituants polaires. Toujours en se basant sur le fait qu'il y a seulement quatorze carbones, on peut dire que l'un des trois substituants du noyau aromatique est la ctone lie au mthyle.

La majorit du temps, l'aglycone d'un glucoside est lie au sucre par un oxygne. La somme des masses des structures partielles, le hexose (163), le benzne tri-substitu (75) et la ctone avec le mthyle (43), donne une masse de (281). Nous avons une diffrence de (33) avec la masse molaire du glucoside intact (314), ce qui reprsente l'oxygne qui lie le glucose et l'aglycone, et un hydroxyle (OH). Donc liiydroxyle se trouve tre le troisime substituant. Il y a six possibilits pour placer trois substituants sur le benzne en respectant les constantes de couplage ( Fig. 18 ).

Pour distinguer entre les six structures possibles nous avons calcul les dplacements chimiques des carbones du noyau benznique dans chaque structure en se servant de l'effet des substituants da la mme faon que nous avons fait pour les glycosides modles (Fig. 16; tableaux 14, 15 et 16). Pour chaque structure, les dplacements chimiques calculs et exprimentaux sont compars entre eux ( Tableau 17 ). Les valeurs exprimentales sont celles du glycoside H mais places dans un ordre pour les faire correspondre autant que possible avec les valeurs calcules de chaque structure possible. Comme on peut le voir, en examinant les valeurs de A5, les structures m et V sont les moins probables. Elles prsentent des diffrences significatives entre les valeurs calcules et les valeurs exprimentales au niveau de plusieurs

103

H3C

Y
4J

H3C

KJ

1.3V^ ^ ^

Sue

>

V <\
I

O H V
Sue OH

' j1
1

Sue

Y
OH

I' C > 1 i^
^.O Suc.^
Sue

H 1 .O

IV

VI

Figure 18 : Les six structures possibles pour le glucoside #1

104

Tableau 17 : Valeurs calcules de (ppm) des six structures possibles

Structurel Carb.
Ci
caL exp.

Structure II

caL exp.

Structure m A
caL exp.

A -8,4 + 5,7

145,0 154,4 145,9 146,6

+ 9,4 + 0,7 -0,4 -4,6 + 1,5

140,8 154,4 + 13,5 155,0 146,6 150,1 119,5 126,1 146,6 117,1 126,5 -3,5 -2,4 + 0,4 -3,5 120,8 126,5 133,7 130,5

c2 c3 c4 c5
C6

119,6 119,2 135,1 130,5 125,0 126,5 120,4 117,1

-3a
+ 7,3 -8,9

111,9 119,2 163,3 154,4

134,0 130,5 120,5 119,2 Structure V

-33

-13

106,3 117,1 + 10,8 Structure VI

Structure IV Carb.
Ci
caL exp.

A + 03 + 1,0 -2,5 + 2,9 + 2,8

cal.

exp.

caL

exp.

A + 0,4

146,3 146,6 129,5 130,5 119,6 117,1 151,5 123,7 154,4 126,5

159,1 146,6

-12,5

146,2 146,6 119,2

c2 c3 c4 c5
Ce

106,3 119,2 + 12,9 120,5 159,2 154,4 -4,8 + 5,5

-13
+ 1,9 + 2,8 -2,4 + 1,9

128,6 130,5 151,6 119,5 154,4 117,1

121,0 126,5 133,7 130,5

-3a
+ 5,4

120,4 119,2

-u

111,7 117,1

124,6 126,5

105

carbones. Dans te cas des deux structures I et II, les valeurs absolues de A sont infrieures 5 ppm sauf pour le carbone Ci qui a une valeur de 9,4 et 13,5 ppm pour les structures I et II respectivement. Pour les structures modles, la valeur de A pour le carbone Ci la plus leve est de 7,8 ppm ( tableau 14; produit 1' ). Parmi les six structures possibles, les deux structures IV et VI sont les plus probables. Elles ont des valeurs absolues de AS infrieures 3 ppm, c'est dire que les dplacements chimiques calculs sont trs proches des dplacements chimiques exprimentaux. Cependant, la distinction entre les deux structures pour dterminer la structure la plus probable du glucoside *1, en comparant les valeurs de A, n'est pas possible.

Si on tient compte du fait que les glucosides # 1 et # 3 sont deux isomres ( voir glucoside # 3 ) o les deux substituants, l'hydroxyle et le (3-O-D-glucopyrannoside, sont intervertis, on peut les distinguer en se basant sur leur temps de rtention sur la colonne CLPHCi8 . Le glucoside #1 a un temps de rtention de 20,34 min et le glucoside *3 a un temps de rtention de 26 min ( voir figure 15, page 67 ). Donc le glucoside # 1 est plus polaire que le glucoside #3 puisque sur la colonne de CLHP-Cis les produits polaires sont moins retenus que les non polaires. Dans la structure VI, l'hydroxyle est en position ortho par rapport l'actyle ce qui favorise la formation d'un pont hydrogne dans un cycle de six membres. La formation de ce pont hydrogne rend la structure VI moins polaire que la structure IV. Donc le glucoside #1, de formule brute CuRisOz, de masse molaire 314 g/mole et de nombre d'insaturation six (14 18/2+1), est identifi comme tant le 5-hydroxy-2-0-|3-D-glucopyrannosylactophnone (Fig. 19).

106

H
8

Carbone

bexp
(ppm)

5 cal
(ppm)

% / -C

7,87 (d) AJ(2,2)

146,63

f
H A^ycone -<

c2
c3
c4 c5

130,51 117,08 15435 126,51 119,16 199,40 2636 104,22 74,90 78,50 7138 77,67 62,47

1463 129,5 119,6 151,5 123,7 120,4 -

S*
H
4,86 (d) AJ(7,4) 6,93 (d) AJ(8,4)

\^-

HO H H 5
i

"T

c6 c7 cr c2. c. B-D-glucose- 3 c4.

a

a 103,1 75,8 79,5 72,4 79,3 63,6

7,67 (d,d) AJ(2et8,4)

Phnyl-P-D-glucopyrannoside

Valeurs tires de la rfrence 49

Figure 19 : Structure complte du glucoside #1

m/z=152

Figure 20 : Mcanisme de fragmentation de l'agiycone

107

222

GLUCOSIDE #2

a) Spectre de masse

Le spectre de masse obtenu par ionisation chimique prsente les trois ions caractristiques, comme dans le cas du glucoside # 1 , M + H+(299), M + C2Hs+(327) et M + C3H5+(339). Nous avons un glucoside de masse molaire M(298)(Fig. 22).

Sur le spectre obtenu par ionisation lectronique on voit les mmes fragments (163,145 et 127) qui proviennent du glucose, comme dans le glucoside *1. Nous pouvons aussi distinguer Ma(136) et Ma45(121). La masse molaire de l'aglycone peut tre Ma (136).

b) Spectre RMN du *H et

Les dplacements chimiques prsents dans le tableau 6 (Section rsultats; Glyc. #2 ) reprsentent le glucoside *2 pur. On trouve aussi les dplacements chimiques du glucoside #2 dans le tableau 7 qui reprsente les dplacements chimiques des deux glucosides *2 et *3 non spars ( voir annexe 1, pages 145 et 146; Glucosides *2 et *3: RMN lVL et 13C ).

Sur le spectre du 13C nous avons les mmes dplacements chimiques des six carbones du glucose (voir glucoside #1). Il y a une lgre diffrence (2,62 ppm) au niveau du carbone C'i. Donc nous pouvons dj dire que le sucre du glucoside #2 est le p-D-glucopyrannoside puisque les spectres des deux produits sont pris dans les mmes conditions exprimentales.

Les dplacements chimiques des protons 7,99 et 7,19 ppm en deux doublets ddoubls, avec les mmes constantes de couplages (AJ = 2 et 8,9 Hz) correspondent aux hydrognes d'un

108

noyau benznique di-substitu en position 1 et 4, dans tel cas on a un plan de symtrie. Les quatres hydrognes sont quivalents deux deux et les carbones auxquels ils sont lis le sont aussi. Sur le spectre du 13C (Voir annexe 1, page 142; glucoside #2 RMN 13C ), nous pouvons distinguer seulement la prsence de deux carbones aromatiques (117,23 et 131,63 ppm) cela est d au fait que la quantit de produit utilise est insuffisante puisque les signaux des trois autres carbones (ctone et deux carbones aromatiques) n'apparaissent pas. Le dplacement chimique d'un mthyle 2,55 ppm (spectre du 1H) et 26,4 ppm (13C) correspond au mthyle de l'actyle.

Sur le spectre du 13C des glucosides #2 et #3), on distingue parfaitement la prsence de deux hexoses. Les diffrences des dplacements chimiques des carbones sont trs faibles. Les deux C'4 sont confondus (7,34 ppm) et la diffrence entre les deux carbones C'i est seulement de 1,45 ppm (101,65 et 103,10 ppm), donc il s'agit de deux glucoses. Dans la zone des carbones aromatiques, on distingue 10 carbones qui reprsentent les aglycones des deux glucosides. La prsence d'un mthyle 26,44 ppm li une ctone (199,40 ppm) confirme la prsence de l'actyle.

Les rsultats obtenus par la RMN du *H, des deux produits non spars, nous confirment ceux obtenus par la RMN
13

C. La prsence de deux singulets (2,55 et 2,58 ppm) qui

reprsentent deux mthyles confirme l'existence de deux actyles dont les carbonyles sont confondus sur le spectre de l3 C (on peut voir un lger ddoublement du pic 199,40 ppm) et les deux mthyles le sont aussi (26,44 ppm). Nous avons donc deux glucosides qui contiennent chacun une ctone et qui se trouvent dans des environnements magntiques semblables. Les protons situs 4,94 ppm (AJ = 7,5 Hz) et 5,05 ppm (A J= 7,4 Hz) correspondent aux deux protons (HiO des deux P-D-glucoses. Les pics qui se trouvent entre 3,42 et 3,94 ppm qui reprsentent les protons (en position axial) du cycle du glucose, sont tous ddoubls si on les

109

compare avec le spectre du *H (glucoside #1). Cela dmontre la prsence de deux (3-Dglucosides.

En s'appuyant aussi sur les rsultats obtenus par la RMN du lH et 13C du glucoside #2 pur, nous avons identifi le produit 4-O-P-D-glucopyrannosyl actophnone. Sur le spectre du
13

C du mlange nous pouvons voir les dplacements chimiques (163.1,131.63,1173 ppm) qui

correspondent aux carbones du noyau benzniques (C4, C2 et C3 respectivement). Le carbone Ci (quaternaire) peut tre assign au petit pic vers 133 ppm (ou 143 ppm) qui n'a pas t signal. La comparaison des dplacements chimiques du 13C du glucoside *2 et ceux du produit 2, dans le tableau 14 (voir figure 21, rfrence 52) suggre qu'il s'agit de la picine. Tous les dplacements chimiques entre les deux produits sont similaires. La diffrence la plus importante est de 3.2 ppm au niveau du dplacement chimique du carbonyle (C7).

Le glucoside *2, de formule brute C14H18O7, de masse molaire 298 g/mole et de nombre d'insaturation six (14-18/2+1), est identifie comme tant le 4-O-p-D-glucopyrannosylactophnone ou Picine 5 2 ( Fig. 21).

110

H
CH2OH

Aglycone

Carbone exp (ppm) 163,10 % 117,30 C2 131,63 C3 133,00 Q 131,63 Cs 117,30 Q 199,40 C7 26,44 Cr r C3. C4. Cy Ce 101,65 74,83 78,47 7U4 7834 62,46

litt. (ppm) 161,03 115,83 130,21 130,82 130,21 115,83 196,37 26,40 99,81 73,13 77,14 69,59 76,53 60,58

8CH1

P-D-glucose
5,05 (d) AJ(7,4) 7,19 (d,d) AI(2et8,9) 7,99 (d,d) AI(2et8,8)

litt. : Valeurs tires de la rfrence 52 (Sol. DMSO)

Figure 21 : Structure complte du glucoside #2

-CO
m/z = 93

OH m/z=136|

3-C=0+ m/z=43

Figure 22 : Mcanisme de fragmentation de l'aglycone

111

223

GLUCOSIDE^

a) Spectres RMN !H et 13C.

Sur le spectre RMN *H du mlange, les dplacements chimiques qui correspondent au glucoside #3 reprsentent un noyau benznique tri-substitu en position 1,2 et 4 avec les mmes constantes de couplage que celui du glucoside *1. Les dplacements chimiques des protons aromatiques des deux glucosides (#1 et #3) prsentent des diffrences significatives. Nous sommes en prsence de deux noyaux aromatiques o les protons sont dans deux environnements magntiques diffrents. Si on compare les dplacements chimiques situs entre 2,5 et 5,0 ppm, en excluant celles du glucoside *2, il n y a pas de diffrences significatives, c'est--dire qu'il s'agit du p-D-glucose et le mthyle de l'actyle dans les deux structures.

Au niveau des dplacements chimiques du 13C de l'aglycone, nous avons seulement trois carbones aromatiques qui sont signals (carbones tertiaires). Par contre nous pouvons distinguer trois pics trs faibles (133,0 ou 134,0, 149,0 et 151,5 ppm) qui sont probablement ceux des trois autres carbones aromatiques (carbones quaternaires). Comme pour les valeurs du RMN du 1H, celles du
13

C prsentent aussi des diffrences significatives avec ceux de l'aglycone du

glucoside *1. Ces diffrences entre les deux aglycones ne se situent pas au niveau de la nature des trois substituants, mais plutt au niveau de leurs positions relatives sur le noyau du benzne puisqu'il n'y a aucun autre dplacement chimique d'un carbone ou d'un proton.

Comme nous avons vu dans le cas du glucoside # 1, il y a six possibilits pour placer trois substituants diffrents sur le benzne en respectant les constantes de couplage (voir figure 18). Les dplacements chimiques calculs, des carbones du noyau benznique de chaque structure

112

(voir tableau 17), sont compars avec les dplacements chimiques exprimentaux du glucoside # 3 (voir tableau 18). Comme dans le cas du glucoside #1 les structures IV et VI sont les plus probables. Donc le glucoside *3 peut avoir la structure VI.

Le glucose a les mmes valeurs des dplacements chimiques (lH et 13C) dans les deux glucosides #1 et #3 sauf pour les deux carbones C'i et les deux hydrognes H*i qui reprsentent des diffrences trs faibles. Ces diffrences sont dues au fait que la ctone comme groupement polaire a tendance influencer la valeur de (5) des protons et des carbones qui sont sous son influence. Le glucose en position meta par rapport la ctone dans le glucoside # 3 subit moins d'influence que dans le cas du glucoside #1 o il est en position ortho.

Le glucoside # 3 est identifi comme tant le l-hydroxy-5-O-P-D-gIucopyrannosylactophnone ( Fig. 23 ).

113

Tableau 18 : Valeurs calcules de 5 (ppm) des six structures possibles

Structurel Carb.
cal.
exp.

Structure II

Structure m A5 + 8,2 + 1,4 -2,7 -3,6

cal.

A
+ 4,0 + 5,6 -2,8

caL

exp.

exp.

A5 -6,0 + 1,7

Ci

145,0 149,0 145,9 151,5 119,6 116,8

140,8 149,0 150,1 151,5 119,5 116,8 126,1 122,5

155,0 149,0 120,8 122,5

c2 c3 c4 c5 c6
Carb.

133,7 133,0* -0,7 111,9 117,0 + 5,1

135,1 133,0* -2,1 125,0 122,5 120,4 117,0

-2,5 -3,4

134,0 133,0* -1,0 120,5 117,0 Structure V -3,5

163,3 151,5 -11,8 106,3 116,8 + 10,5 Structure VI

Structure IV
caL
exp.

A
+ 2,7

caL

exp.

caL

exp.

Ci

1463 149,0

159,1 149,0 -10,1

146,2

149,0 117,0

+ 2,8 -3,5

c2 c3 c4 c5 c6

129,5 133,0* + 3,5 119,6 116,8 151,5 151,5 123,7 122,5 120,4 117,0
-2,8 0,0

106,3 116,8 + 10,5 120,5 159,2 151,5 121,0 122,5 -7,7 + 1,5

128,6 133,0* + 4,4 151,6 119,5 124,6

151,5 116,8 122,5

-0,1 -2,7 -2,1

-u
-3,4

133,7 133,0* -0,7 111,7 117,0 + 5,3

* ou 134.0

114

Carbone 7,48 (d)

Ci

exp
(ppm)

Seal
(ppm)

c3
Aglycone < c4

c5 c6

c7

149,00 117,03 133,00 ou 134,00 151,50 116,80 122,51 199,40 26,44 103,00 74,83 78,47 7134 77,58 62,50

146,2 120,5 128,6 151,6 119,5 124,6 a 103,1 75,8 79,5 72,4 79,3 63,6

op-D-glucose ,
726 (d) AJ(8,4)
a Cy

c4.

4,94 (d) AJ(7,5)

7,52 (d,d)

s*

Fhnyl-f-D-glucopyrannoside Valeurs tires de la rfrence 49

Figure 23 : Structure complte du glucoside #3

115

2.2.4 GLUCOSIDE #4

a) Spectre de masse.

Avec l'ionisation chimique (IC) du glucoside H, avec le mthane, nous n'avons pas pu identifier des ions caractristiques qui peuvent nous permettre de dterminer la masse molaire du produit

L'ionisation lectronique (IE) du produit laisse prsager que la masse molaire du produit peut tre 342 et cela par la prsence d'un ions cet endroit. Sur le spectre de masse IC, nous avons un pic important 343 qui peut reprsenter l'ion molculaire du glucoside plus un hydrogne qui provient du mthane.

b) Spectres RMN du *H et 13C

Nous pouvons facilement reconnatre les dplacements chimiques des trois protons du noyau benznique tri-substitu aux positions 1,3 et 4, (1H: 6,75 ppm, d, AJ = 8,13 Hz), (1H:

6,88 ppm, dd, AJ = 1,96 et 8,16 Hz) et (1H: 7,04 ppm, d, AJ = 1,93 Hz) (voir tableau 8). En tenant compte du fait que toutes les conditions d'analyse sont identiques pour tous les glucosides que nous avons purifis nous sommes en prsence d'un noyau aromatique tri-substitu o les substituants sont de nature diffrente de ceux du glucoside *1, base en partie sur les dplacements chimiques diffrents des hydrognes des deux noyaux benzniques.

Nous avons aussi deux protons oifiniques conjugus (6.61 ppm, d, AJ = 15,96 Hz et 6,22 ppm, ddd, AJ = 5,88, 6,77 et 16 Hz). La constante (AJ = 1,96 Hz) reprsente le couplage entre deux hydrognes en trans d'une double liaison non cyclique. L'hydrogne 6,22 ppm est

116

coupl avec les deux hydrognes du mthylne (-CH2-O) non quivalents magntiquement ( 1H 4,51 ppm avec AJ= 5,88 Hz et 1H 4,33 ppm avec AS =6,86 Hz) et l'hydrogne 6,61 ppm. Cela explique la prsence d'un doublet deux fois ddoubls (ddd) 6.22 ppm. Nous avons identifi le dplacement chimique du mthoxyle en singulet 3.88 ppm. Nous n'avons pas observ le couplage de l'hydrogne 6.61 ppm avec les deux hydrognes non quivalents magntiquement (-CH2-O-) via la double liaison.

Les rsultats obtenus par le spectre du

13

C prsentent un carbone 56.35 ppm qui

correspond au mthyle d'un mthoxy-phnol dont les protons absorbent vers 3.8 ppm, par contre ils absorbent vers 3.2 ppm quand le mthoxyle est li un groupement aliphatique 45 . Le carbone signal 71.72 ppm correspond au mthylne li d'une part la double liaison (voir couplage H-H) et d'autre part un oxygne.

Nous avons huit pics (110.58 148.88 ppm) qui reprsentent les dplacements chimiques des carbones du noyau benznique tri-substitu et les deux carbones de la double liaison conjugu avec le benzne ( 123.72 et 130.37 ppm).

L'identification du sucre, le p-D-glucose est base surtout sur la comparaison des dplacements chimiques du 13C avec le glucose des glucosides #1 et *2. Nous avons les mmes pics avec des diffrences infrieures 0,5 ppm pour tous les carbones du glucose sauf pour le carbone Cr qui a 1,06 ppm de moins que celui du glucoside # 1.

Jusqu' prsent nous avons dtermin la prsence d'un noyau benznique tri-substitu en position 1, 2 et 4 o, en supposant que la masse molaire du glucoside est 342, les trois substituants peuvent tre soit les groupements -HC=CH-CH2O-H ( les deux H de la double liaison sont en trans ), le mthyle et le P-D-glucose ou le groupement -HC=CH-CH2O-|3-D-

117

glucose, le mthoxyle et un hydroxyle (phnol). La comparaison des dplacements chimiques du *H avec ceux de la rfrence 26 suggre qu'il s'agit de guaiacylpropnyl glucoside (un phnol) qui diffre de la conifrine o l'hydroxyle est li avec le mthylne de la chane latrale et le glucose est li au benzne. Tous les dplacements chimiques des hydrognes de l'aglycone sont similaires aux dplacements chimiques de la guaiacylpropnyl glucoside La diffrence la plus importante est de 0,04 ppm. L'hydrogne H'i du glucose absorbe 4,38 ppm avec une constante de couplage de 7,66 Hz et dans la rfrence 26, il absorbe 4,36 ppm avec AJ = 7,8 Hz.

Le glucoside # 4 est identifi comme tant le guaiacylpropnyl glucoside de formule brute C16H22O8, de masse molaire 342 g/mole et de nombre d'insaturation six (16-22/2+1).

118

e
H_/H
H

\s

CHIOH

3V CH3O

\
H

H
1 OH H
TT

4,38 ppm (7,66 Hz) 4,36 ppm (7,80 Hz)

exp
(ppm)

Proton

exp (ppm)

litt

Couplages Hz

Carbone

5 cal
(ppm)

H2
H5 Hg H7 Hg

7,04 6,75 6,88 6,61 6,22 4,51 4,33

7,01 6,73 6,85 6,58 6,19 4,49 4,29

1,93 8,13 1,96,8,16 15,96 5,88, 6,77, 16 5,88 6,86

a

Aglycone <

c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8

13430 11048 148,00 147,72 116,19 121,16 13037 123,71 71,01 103,16 75,15 78,15 71,73 78,00 62,82

131,7 113,5 147,4 140,5 117,0 120,2

a

H9 &>'

p-D-glucose -

c3. c4Cy

Lcff

103,1 75,8 79,5 72,4 79,3 63,6

litt: Valeurs tires de la rfrence 26, MeOH comme solvant

Phnyl-p-D-glucopyranoside Valeurs tires de la rfrence 49

Figure 24 : Structure complte du glucoside #4

119

CHAPITRE III ANALYSES DES AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSES

3.1

EXTRACTION ET ANALYSES DES AGLYCONES

Pour analyser les glycosides quantitativement et qualitativement nous avons eu recours deux mthodes. La premire mthode est qualitative et consiste librer les aglycones par hydrolyse enzymatique des glycosides pralablement extraits du matriel vgtal. La deuxime mthode est quantitative et consiste librer les aglycones par hydrolyse acide.

L'hydrolyse enzymatique des glycosides ne permet pas une analyse quantitative, puisque les glycosides ne sont pas hydrolyses en totalit. Cela est mis en vidence par le pourcentage relatif obtenu de chaque aglycone pour chacune des deux enzymes utilises, c'est--dire qu'une enzyme va hydrolyser plus efficacement une substance qu'une autre (voir plus loin). Cependant un hydrolyse enzymatique permet une analyse qualitative puisque les structures des aglycones ne sont pas supposes d'tre affectes pendant et aprs l'hydrolyse. Une fois libres par hydrolyse enzymatique, les aglycones sont extraites partir de la solution de l'hydrolyse avec du pentane et pentane et Tether ( l:l/v:v ). Nous avons choisi le pentane et l'ther comme solvants d'extraction parce que leur point d'bullition est trs bas et permet d'viter de perdre des aglycones trs volatiles pendant l'vaporation pour rduire le volume 0,5 mL avant de procder l'analyse par chromatographie en phase gazeuse. Comme le pentane est apolaire et ne peut pas extraire efficacement les aglycones trs polaire, l'utilisation de l'ther nous a permis d'extraire des aglycones phnoliques polaires (voir tableau 19).

120

La deuxime mthode est quantitative et qualitative et repose sur l'analyse des aglycones libres par hydrolyse acide (HC1 : 2M) complet des glycosides contenus dans 50 g d'aiguilles. Les aiguilles sches sont broyes en poudre fine et les substances volatiles sont extraites par l'extracteur Likens-Nickerson dans l'hexane. Aprs acidification de la solution qui contient les glycosides, les aglycones libres sont extraites leurs tours de la mme faon que les substances volatiles. Les substances rcupres dans l'hexane avant et aprs l'hydrolyse acide sont quantifies par la mthode d'addition d'un standard interne (ttradcane) et analyses par chromatographie en phase gazeuse. Les fraction des substances libres reprsente 2,33 % et la fraction lie 0,33 %. Comme on peut le constater la fraction lie des substances volatiles ne reprsente que le un septime de la fraction libre. Cela ne nous permet pas de dire que la fraction des substances lies ne reprsente pas un potentiel additionnel de substances volatiles puisqu'il est dmontr, dans le cas d'autres plantes, que cette dernire varie au cours des saisons et du dveloppement de la plante 59. Les substances volatiles qui ont t libres par hydrolyse acide subissent des transformations chimiques importantes. Si on compare les substances identifies dans l'hydrolyse enzymatique (tableau 19) et l'hydrolyse acide (tableau 21), on constate que certaines substances disparaissent au profit d'autres. Dans cette tude nous n'avons pas cherch identifier les mcanismes de transformation des structures des aglycones aprs hydrolyse dans un milieu acide. Comme mentionn plus haut, la raison pour laquelle nous avons utilis l'hydrolyse acide, qui assure un hydrolyse plus efficace, est de quantifier les substances volatiles de la fraction lie. Cependant, il faut prciser que les aglycones, aprs hydrolyse acide, sont extraites par l'extracteur Likens-Nickerson o les substances volatiles sont entranes par la vapeur d'eau qui se mlange avec la vapeur de l'hexane dans le rfrigrant et aprs condensation et sparation des deux phases, les aglycones sont rcupres dans l'hexane. Autrement dit, seules les substances trs peu solubles dans l'eau sont extraites, c'est dire les substances qui constituent les huiles essentielles. Les substances qui sont plus ou moins solubles dans l'eau ne sont pas entranes par la vapeur d'eau. C'est la raison pour laquelle les aglycones phnoliques

121

(tableau 19; #25 #31) extraites aprs l'hydrolyse enzymatique par des extractions liquideliquide sont absents dans le cas de l'hydrolyse acide o les aglycones sont entranes par la vapeur d'eau avant d'tre extraites par l'hexane.

32

AGLYCONES LIBRES PAR HYDROLYSES ENZYMATIQUES

Dans le tableau 19, seules les aglycones identifies sont prsentes avec leur pourcentage relatif dans les aiguilles et les ramilles. Dans chacune des deux parties de la plante les glycosides sont hydrolyses sparment par deux enzymes, la 0-glucosidase et la cellulase. Nous avons identifi 31 aglycones dont 14 monoterpnes. l'exception du santne (#1) et du campholnal (#15) les autres monoterpnes sont des alcools. Le reste des aglycones sont des alcools aliphatiques et des phnols.

Sur l'ensemble des 31 aglycones quatre ne sont pas des alcools (#1,8,12 et 15). Deux de ces aglycones ont un pourcentage relatif important: le santne (#1) et le a.,4-dimthylcylohex-3n-1-actaldhyde (#12) sont respectivement 5,17 % et 5,92 % dans les aiguilles obtenus avec la p-glucosidase. La prsence de ces aglycones qui ne sont pas des alcools est un phnomne trs peu rencontr lorsque les glycosides d'origine vgtale sont hydrolyses avec une enzyme. Le rle principal d'une enzyme glycosidase est de couper le lien entre le sucre et l'aglycone en gardant les structures de ces derniers intactes. Le sucre et l'aglycone sont lis par un oxygne o l'enzyme attaque pour sparer les deux molcules. Aprs hydrolyse, l'aglycone se retrouve avec une fonction alcool. Les conditions de l'hydrolyse enzymatique, 37 C et pH 5, ne justifient pas la prsence de substances qui n'ont pas au moins un hydroxyle. l'exception du santne (#1) les trois autres aglycones (#8,12 et 15) sont des aldhydes. Cela peut laisser croire qu'il y a eu transformation des alcools en aldhydes correspondants. Feron
5

a compil 26 aglycones

odorantes libres aprs hydrolyse des glycosides extraits des plantes dont deux sont des

122

ctones, le cyclohexenone et le cyclohexadinone, et un aldhyde, le 3-oxo a-ional. StahlBiskup 7 a identifi le a-ionone aprs hydrolyse des glycosides, avec la P-glucosidase, dans les feuilles et les tiges de Hyssopus officinals L.

3.2.1 Comparaison de l'efficacit des deux enzymes

Dans chacune des parties de l'pinette noire, aiguilles et ramilles, nous pouvons comparer l'efficacit de chacune des deux enzymes, pour une aglycone donne, en se basant sur le pourcentage relatif obtenu par chaque enzyme. Dans les aiguilles comme dans les ramilles, en gnral, l'efficacit de chaque enzyme varie dans le mme sens pour une aglycone donne. Prenant l'exemple du 4-hydroxy-3-mthoxyactophnone (#30), il est 26,90 % et 12,89 % avec la (3-glucosidase et la cellulase respectivement. Comme on peut le voir la -glucosidase est deux fois plus efficace que la cellulase. Cette tendance est principalement respecte pour les aglycones phnoliques di-substitues: 2-hydroxy-5-mthoxyactophnone (#25), vanilline (#29) et 4-(4-hydroxy, 3-mthoxyphnyl)-butan-2-one (#31). Pour les autres aglycones aromatiques, phnylmthanol (#21) et 2-phnylthanol (#22), l'efficacit des deux enzymes est comparables sauf dans le cas de l'eugnol (#24) qui est 0,56 % pour la (3-glucosidase et 4,53 % pour la cellulase dans les aiguilles. Stahl-Biskup et a l 7 ont tudi les aglycones volatiles des glycosides dans les feuilles, les tiges, les fleurs et les racines de Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae). Les aglycones ont t libres par hydrolyse enzymatique en utilisant sparment la {3-glucosidase et la Pectinol C. La (3-glucosidase s'est avre plus spcifique et elle a une grande affinit pour les glycosides phnoliques que les autres substances. Svendsen 13 a aussi compar l'efficacit de ces deux enzymes pour hydrolyser des glycosides d'origine vgtal. Il a trouv que la Pectinol libre trs peu d'aglycones en terme de quantit que la |3-glucosidase. Dans notre investigation, le pourcentage relatif des aglycones terpniques libres par hydrolyse enzymatique est nettement plus lev avec la cellulase que la P-glucosidase l'exception du santne et le linalool. Cette

123

efficacit est trs marque pour le bornol (#14), dans les aiguilles, qui est de 9,49 % avec la cellulase et 0,28 % avec la p-glucosidase. Quoique les diffrences entre les pourcentages dans chacune des deux parties de la plante pour les autres terpnes sont moins importantes, la cellulase est plus efficace que la P-glucosidase. Williams et al 1 5 ont compar cinq enzymes dont la p-glucosidase et la cellulase. Ils ont qualifi la cellulase comme tant la plus commode pour des analyses qualitatives des aglycones volatiles des glycosides d'origine vgtale. Dans une autre tude comparative de l'efficacit de quinze systmes enzymatiques produits industriellement, compte tenu des rsultats obtenus, le Rohament CW avec la cellulase dont l'activit enzymatique dominante est le plus efficace. Pour les aglycones qui ne sont ni aromatiques ni terpnique (#3 #7), la p-glucosidase est plus efficace.

3.2.2 Nature et abondance des aglycones dans les conifres

Svendsen et al 1 4 ont tudi les aglycones libres par hydrolyse enzymatique avec la Pglucosidase dans les feuilles et les aiguilles de 16 conifres dont trois sont des pinettes ( Picea abies (L.) Karst., Picea omorika (Panic) Purkyne et Picea pungens Engelm.). Seulement 8 aglycones sont identifies pour l'ensemble des 16 conifres. Quatre d'entre elles sont des aglycones aliphatiques, deux aromatiques et deux monoterpnes. Nous allons comparer les aglycones que nous avons identifi dans l'pinette noire ( Picea mariana ) avec ceux identifies par Svendsen dans les 16 espces de conifres.

a) Alcools aliphatiques non terpniques Les alglycones, ( cis-hex-3-n-l-ol, hexan-1-ol, oct-l-n-3-ol, octan-3-ol ) identifies par Svendsen, sont dtectes dans presque toutes les espces de conifres tudis 14. Dans l'pinette noire qui est le sujet de notre recherche, nous n'avons pas dtect le oct-l-n-3-ol et le octan-3ol. Par contre nous avons identifi d'autres alcools ramifis, le 2,3-dimthylpentan-2-ol (#2), 3,4-

125

d'autres chercheurs semble conduire aux mmes conclusions; que sous forme de glycosides les phnols sont plus stables et plus solubles dans l'eau que les phnols libres, et une fois spars des sucres ils sont oxyds et se polymrisent en lignine.

c) Les monoterpnes

Sur les 16 espces tudies par Svendsen le oc-terpinol est dtect seulement dans cinq d'entre elles. Dans les trois pinettes, seulement un des deux monoterpnes est dtect, le octerpinol un pourcentage infrieur 0,5 %. Dans Picea Mariana qui est le sujet de notre investigation, le oc-terpinol est dtect dans les aiguilles seulement avec la cellulase 0,22 %. Dans les ramilles il est de 1,33 % libr avec la cellulase et il n'est que de 0,25 %avec la 0glucosidase. Le deuxime monoterpne, le terpine-4-n-l-ol, est dtect dans la moiti des conifres mais il n'est dtect dans aucune des trois pinettes. Dans l'pinette noire nous l'avons dtect 5.89 % dans les ramilles, avec la cellulase.

Contrairement certaines tudes des substances volatiles sous forme de glycosides dans les plantes, la prsente tude rvle un grand nombre de monotepnes sous forme de glycosides. Le fait le plus important souligner est relatif aux structures de ces monoterpnes glycosides dtects dans l'pinette noire (voir tableau 20). Dans la majorit des plantes tudies, on trouve au mois un de ces monoterpnes sous forme de glycoside. Stahl-Biskup 2 en 1987 a fait une tude statistique des monotepnes glycosides et les a numr avec le nombre de fois dtectes dans les plantes. Parmi ces monoterpnes on trouve, le graniol (10 fois), le linlool (7 fois), le aterpinol (4 fois), le citronellol (3 fois), le terpine-4-n-l-ol(l fois) et le bornol (1 fois). Il est accept que ces monoterpnes jouent un rle cl dans la biosynthse des monoterpnes qu'on trouve dans les huiles essentielles 7 . Il est intressant qu'un grand nombre de substances volatiles glycosidiques ne se trouvent pas sous forme libre dans une plante 6 . Le groupe de recherche

126

"LASEVE" a tudi la composition de l'huile essentielle de l'pinette noire chantillonn dans le mme site que celui tudi dans le prsent travail, et 39 terpnes ont t identifis 54 . Aucune des aglycones aliphatiques non terpnique ou phnolique n'a t dtecte dans l'huile essentielle. Dans notre investigation dans l'pinette noire, nous avons trouv seulement six monterpnes (#1, 9, 10, 13, 14 et 20) sur quatorze qui sont prsents dans l'huile essentielle (voir tableau 20). Cependant, il est noter que l'actate de bornyle reprsente jusqu' 41,8 % de l'huile essentielle, et il est de 9,49 % sous forme de glycoside (dans les aiguilles hydrolyse avec la cellulase). Le monoterpne qui reprsente une diffrence trs importante est le linalool. On le trouve sous forme de glycoside 20,08 % (dans les aiguilles hydrolyses avec la (3-glucosidase) et il est infrieur 0,1 % dans l'huile essentielle. La diffrence entre les pourcentages des monoterpnes sous forme lie et libre, principalement pour le bornol et le linalool dans l'pinette noire, soutient le rle suggr pour les monoterpnes glycosides.

127

TABLEAU 19 Aglycones volatiles libres par hydrolyses enzymatiques

Aiguilles No Identification Ramilles % H.E.b % H.E. a *jfc H.E.b

% H.E.* 5,17 0,32 0,12 0,23 0,17 0,98 1,80 1,03 20,08 5,92 0,28 0,89 0,09 0,38 5,20 0,09 0,06 1,99 0,19 0,73 0,56

1 2

Santne 2,3-Dimthylpentan-2-ol 2,4-Dimthyl-pentan-3-ol 2-Dthylbut-2-n-l-ol Hexan-1-ol 2-Dthylhexan-2-ol cis-Hex-3-n-l-ol Benzaldhyde Linalool Terpine-4-n-l-ol trans-Pinocarvol ar.4-DimhyJcyclohex-3n-1 -actaldhyde a-Terpinol Bomol Campholnal Citronellol Myrtnol Monoterpnol ? para-Cymn-8-oI Graniol Phnylmthanol 2-phnylthanoi Alcool erillique Eugnol

3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

1,38 0,09 0,50 1,12 1,88 0,07 7,42 0,13 0,13 1,24 0,22 9,49 1,26 2,92 9,03 0,16 0,71 2,12 0,80 1,69 4,53

3,49 0,41

0,29 4,22

2,25 0,10 18,42 0,49

0,83 0,25 0,28 0,66 1,08 0,49 1,50 0,76 0,13 2,22 2,48 0,38 1,52

0,13 0,06 0,17 2,04 0,59 0,11 3,61 5,89 1,58 0,06 1,33 8,38 0,74 1,70 0,87 3,37 0,45 1,04 2,48 2,54 0,51 1,47

128

25 26 27 28 29 30 31

2-Hydroxy-5-mtfiylactophnone p-(2-Mthylallyl)Phnol trans-Cinnamyl alcool iso-Eugnol Vanilline 4-Hydroxy-3-mthoxyactophnone 4<4*ydtoxy, 3-mthoxyphnyl)-Butan-2-one

0,85 0,26 1,71 0,15 3,30 26,90 4,38

0,65 0,30 0,67 2,17 12,89 2,16

1,08 1,62 1,59 0,79 3,33 4,79 8,70

0,31 1,19 0,65 1,48 1,23 1,99 3,33

% H.E. a % UJ&P

: % obtenu par hydrolyse enzymatique avec le (3-Glucosidase; : % obtenu par hydrolyse enzymatique avec la Cellulase; Les produits souligns ne sont pas des alcools.

129

TABLEAU 20 LES AGLYCONES TERPENIQUES LIBRES PAR HYDROLYSES ENZYM ATIQUES

No

* * * * *

Formule (M*)

%(CeL)

%HJE.

1
9 10 11 12 13
14 15 16 17 18 19 20 21

Santne Linalool Terpine-4-n-l-ol

G)Hi4(122) CioHi80(154) CioHi80(154)

5,17 20,08 5,92 0,28 0,89 0,09 0,38 5^0 0,09 0,06 0,73

1,38 7,42 0,13 0,13

1,9 <0,l <0,l -

CioHifiO(152) Trans-pinocarvol <x,,4-DimthylCyclohex-3- CioHieO (152) n-1 -actaldhy de a-Terpinol Bornol Campholnal Citronellol Myrtnol Monoterpnol ? para-Cymn-8-ol Graniol Alcool perillique CioHi80(154) CioHigO(154) CioHi60(152) CioH2oO(156) CioHi60(152) CioHi60(152) CioHi40(150) CioHigO(154) CioHi60(152)

U4
0,22 9,49 1,26 2,92 9,03 0,16 0,71 1,69

0,5
0,8 ? <0,l -

M+ % ( P-glu.) % ( CeL) % HE.

: Poids molculaire; : % obtenu par hydrolyse enzymaticpie avec la P-Glucosidase; : % obtenu par hydrolyse enzymatique avec la Cellulase; : Monoterpnes identifis dans l'huile essentielle de l'pinette noire.

130

TABLEAU 21 AGLYCONES VOLATILES LIBRES PAR HYDROLYSE ACIDE DES GLYCOSIDES

No

* * * * *

Formule (M*)

1
2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Santne para-Cymne cis-Hex-3-n-l-ol Citronellal Benzaldhyde Linalool Terpine-4-n-l-ol trans-Pinocarvol a-Terpinol Bornol Pipritone Campholnal Phnylmthanol 2-Phnylthanol

C9Hi4(122) CioHi4(134) C6H12O (100) QoHigO (154) C7H6O(106)

C9H18Q2 (158)

4.03 5.80 0.08 3.36 2.50 10.82 0.04 1.06 1.11 2.38 2.31 0.21 0.86 1.89

1.9 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 0.5 0.8 <0.5 -

CioHi80(154) CioHiO (152) CioHi80(154) CioHi80(154) CioHi<jO(152) CioHifiO (152) C7H8O(108) C8HioO(122)

M+ % % HE.

: Poids molculaire; : % obtenu par hydrolyse acide des aiguilles; : Monoterpnes identifis dans l'huiles essentielle de l'pinette noire.

131

132

Tel que cit dans le titre du projet, celui-ci portait sur l'analyse chimique des glycosides extraits de Piceae mariana (Mill.) B.S.P. L'analyse et la nature des rsultats obtenus ne nous permettent pas d'tablir une conclusion unique et dfinitive, mais plutt de prsenter diffrentes conclusions possibles dont la rponse finale ncessiterait une continuit au projet.

Ainsi, l'analyse chimique des extrais de l'pinette noire nous a rvl la prsences de substances volatiles sous forme de glycosides qui ne sont pas extraites par les mthodes conventionnelles utilises pour l'extraction des huiles essentielles.

Les rsultats obtenus par les deux mthodes d'analyse des glycosides, avec ou sans transformation chimiques, ne nous permettent pas de faire un lien entre les deux. Par contre, cela nous permet d'appuyer le fait que le sucre majeur qui constitue les glycosides est le 0-Dglucose. Dans les quatres glycosides qui sont purifis et analyss, le sucre est le (3-D-glucose. Nous avons propos une structure pour chacun de ces quatres giucosides base sur des donnes spectroscopiques, en I'occurence la spectromtrie de masse et la rsonance magntique nuclaire du proton et du carbone 13. Qoique ces donnes ne nous permettent pas d'identifier difinitivement les glycosides, les structures proposes pour les giucosides #1 et H, des produits connus, sont conformes aux donnes de la littrature. Aussi les substances libres par hydrolyse enzymatique sont supposes tre des substances lies au (3-D-glucose puisque les deux enzymes utilises, la 0-glucosidase et la cetlulase, sont spcifiques pour hydrolyser les f3D-glucopyrannosides. Il reste que la 0-glucosidase est plus efficace pour hydrolyser les giucosides phnoliques et la cellulase les giucosides terpniques.

Les substances hydrolyses et extraites, des aiguilles et des ramilles, ne prsentent pas de diffrences au niveau des structures. Cela nous permet de conclure que les mmes glycosides se trouvent dans les deux parties de la plante. Nous avons identifi 31 aglycones comparativement

133

Svendsen

14

qui a identifi huit aglycones dans 16 conifres. Comme nous l'avons indiqu

dans la discussion, la mthode d'extraction liquide-liquide permet d'extraire plus efficacement les aglycones polaires et non polaires que l'extracteur Likens-Nickerson. Dans ce dernier, les substances sont entranes par la vapeur d'eau qui est porte ebullition et par consquence on court le risque de transformer les structures chimiques des aglycones.

Dans l'ventualit d'une poursuite de l'tude des glycosides de l'pinette noire, il serait intressant d'explorer: - La variation de la nature et de la concentration, au cours des saisons, des substances volatiles lies aux sucres, dans les aiguilles comme dans les ramilles, par rapport celle des produits qui ne sont pas lies des sucres. - L'influence de l'hydrolyse enzymatique sur les structures de certaines aglycones qu'on ne trouve pas sous forme d'alcools. - L'analyse spectroscopique de glucosides monoterpnes purifis par chromatographie en phase liquide.

Dans la ralisation de ce projet de recherche, les objectifs personnels ont t atteints. En plus de me permettre la finalisation de ma Matrise en Ressources Renouvelables, j'ai acquis et approfondi des connaissances dans certaines techniques d'extraction, de purification et d'analyses spectroscopiques. Mais le plus important c'est de raliser que sans la patience et la persvrance, que tout chercheur ou chercheuse doivent possder, on ne peut mener terme un projet de recherche dans lequel il y a toujours des obstacles qu'il faut franchir pour avancer.

Mohammed Bouhajib, Mai 1992.

134

ANNEXE I SPECTRES DES GLUCOSIDES PURIFIS.

135

Glucoside '1: Spectre de masse ionisation chimique.

DATA: 9FIN92 165 SCANS I TO RIC CALIi FC43J17 #3 31/24/38 18:53:00 SAMPLE: il CONOS.: SOLID PROBE CI-ME RANGE: G 1,3999 LABEL: N 6. 4.8 QUAN: A 1, 1.0 J 0 BASE: U 48, ? 205 109.0-1

338

RIC

398 7:30 100.0-,

315

50.0

343

355

265

299 219 237

.2?.'. 273.. 2311 [335

25 309

32? 353

371 :

M/Z

156

286

136

Glucoside hi Spectre de masse ionisation lectronique.

DATA! 90FIN89 RIC 90FINS9 #2 #1 SCANS 1 TO 345 CftUI: FC43JA22 #2 01/24/90 8:43:08 SAMPLE: #1 CONOS.: SOLID PROBE RANGE: G 1-3399 LABEL: N 8, 4.8 QUAN: A 1, 1.8 J 8 BASE: U 48, 7 243

RIC

32 53 1:15 iee.e-i

152 8S 13?

50.8-

9? 109 127 145

1S3

132 193 207 31S I

fVe

50

100

137
Glucoside *1: Spectre de RMN *H.

5LYCC1SIDE

3.C:

7 . 5

7.0

6 5

6.0

5.5

5.0

i 4 . 0

ri 3 . 5

3 . 0

ri 2 . 5

2 . 0

ri 1 . 5

1 . 0

i . 5

138

Glucoside H: Spectre de RMN

r-

GLYCOSIDE

#|
lO
f'l

01

CO

li

u
ri

o1 u
UJ

to ~"
Oi

UJ

^>

i,

200

190

160

140

120

100

60

40

20

PM

139

Glucoside *2: Spectre de masse ionisation chimique.

RIC OATAs 3eFIN98 #1 SCANS I TO 34? 61/24/90 14:16:00 CALI: FC43J2? #3 SAMPLE: #8 CONOS.: SOLID PROBE CI-ME RANGE: G 1,9999 LABEL: N 9, 4.8 QUAN: A 1, 1.0 J 0 BASE: U 46, 7 100.0-1

RIC

59 1:15 108.0-1 138

30 7:38

127 145 165 155

50.8-

233
177

221

251

273,
i, - ' - I

316 / 339
> . J , I ,

r i i ii i i

435

140

Glucoside ^2: Spectre de masse ionisation lectronique.

OATA: 96FIN84 1 SCANS 1 TO 423 RIC CALI: FC43JA22 #2 01/23^90 14:32:00 SAMPLE: X CONOS.: SOLID PR06E RANGE: G 1,9999 Lfi8EL: N 0, 4.0 QUAN: A 1, 1.9 J 8 BASE: U 40, 7

IVZ

141

Glucoside # 2: Spectre de RMN *H.

GLYCQS1DE
nl n i/i r> in 10 r ca en cn <s en en CM
in ts

3,
to co

n
N

Cl CM CS CD

pi

c ww

CS Ul m C3 f*" P~ f " C9 ' r CO

r-

en

o:
X

cs en CO r-

0 1 CD in 10 LT) r M CM N CM (NJ (VJ M

n cs
M

CO CO CD 0)

m m CO n n C\J (^ en en en en CO

m N CO in U l 01 _ CM o CO <"> N 01 es co CO 0 1 CM n r w CO 3- PJ en CD r~ CO n CO in r n n en n CM CM CM r en CO CD CO CD CD CO CO CO m CO CD CD LD CO
-~

en

m
C M

s*

\i

J
8.0 7.5 7.0 6.S 6.0 5.S 5.0 <. S ". 3 3.5

^- #<*

II

3.0

2.5

2.0

142

Glucoside #2: Spectre de RMN 13 C.

.- oo
GLYCQSIDE
n

m
w =

ai

CD

\n

m o T
N U)

O(0 n 01 C D

a. n

/ 8
vi

m^
130

! 20

110

103

90

80

70 PPH

60

50

^0

30

20

10

143

Glucosides #2 et # 3: Spectre de RMN lU.

GLYCOSIOE

H.
i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

JM
1 1 1 1

9 . "5

8 . 0

7.5

7.0

6 . "5

6.0

5 . 5

5.0

4 . 5
PPM

4.0

3 . "5

3.0

2.5

2.0

1 . "5 1 . 0

144

Glucosides #2 et # 3: Spectre de RMN

GLYCOSIDE

J . . .u .1

tl

200

180

160

140

120 PPM

100

30

60

40

145

Glucoside # 4: Spectre de masse ionisation chimique.

RIC DATA: 9eFIN95 tt SCANS I TO 383 8 W 4 ' 9 0 12:28:68 ' CALI: FC43J17 #3 SAMPLE: H GONDS.: SOLID PR08E Cl-NE RANGE: G 1,9999 LABEL: N 8, 4.8 QUAN:fit1, 1.8 J 8 BASE: U 48, 7 l 108.8^ ?3

R I C

100.0-

258 50 188 158 288 6:15 1:15 2:38 3:45 5:08 SAMPLE: # CONOS.: SOLID PROBE CI-ME #214 10 #219 AVERAGED - #148 TO #156 - #262 TO #270 XI.00 183

388 7:38

358 8:45

117 137 164

o 50.0127 196 325

211

487

237 2 6 1
..il., .lin. nli.

291 I.L...IIIII..I I. 561

146

Glucoside #4: Spectre de masse ionisation lectronique.

RIC DATA: 9<FIN8e il SCfiNS 1 TO 516 01/23/90 12:42:09 CALI: FC43JA22 #2 SAMPLE: #lf CNDS.: SOLID PROBE RANGE: G 1,9999 LABEL: N 0, 4.8 QUAN: A 1, 1.8 J 0 BASE: U 48, ? 100.9
194

RIC

10.0 -

iWIFLt: 4 CONOS.: SOLID PROBE #194 TO #203 AUERAGED - #102 TO #112 - #284 TO #292 XI.60 73

12:39

193
35

131

91

119

i
II1II,IJ11||.|II|I|||||I||I1|I,I,1,I,M

149

..ij,,!!,, J l j

269
-r-t-r

236

342
i ' I ' i ' i

350

147

Glucoside H: Spectre de RMN

GLYCOS1DE
te e s
10

n
269
-

in

n r

in

ai in ui

nm
CD

ta

r r fi m co tu
21B
921 122

in

e s- m

7
971 970
082 982

) e sr

? S
r

s we

( V I

927 812

725 723 717

B37

5G2

222

262 212

963 932

092

' r

'

I
7.3 6.5 6.0 5.S

B32

659 613 569

836

e s

(S m

r ci

C D

522

S.0

-4.5

t.0 PPM

3.5

3 .0

2.5

2.0

1 .5

148

Glucoside # 4: Spectre de RMN 13 C.

GLXCQ51DE
I\J

m M

(S

(0

m
in "

(S

n
IL

r-

n n

m
co

rIS

IS

n
M (y

n
(S

^y#^^
i

1 -40

1 20

1 00

PPM

80

B0

149

ANNEXE II EXEMPLES DE CHROMATOGRAMMES DE CPG.

150
Hydrolyse enzyraatique avec la P-glucosidase de l'extrait des aiguilles.
R

151

Hydrolyse enzymatique avec la 0-glucosidase de l'extrait des ramilles.

G
S

r
aC

ae 5
5

...1.'.''/. i

152

Hydrolyse acide des glycosides de 50 g d'aiguilles

J Vik

153

ANNEXE HI SPECTRES DE MASSE DES AGLYCONES.

154

Aglycone # 1 :

Santne

C9H14 (122)

HH3I528 xl Bgd=ai8 I=2S8v TIC=75258BB 188, ? 94

6-SEP-98 12=13*8=88=84 El flcnt=

88.

28.

1 2 2

S8

187 88

J 128 148 1S8 188 288 228 < 188

Aglycone #2 :

2,3-dimthylpentan-2-ol
nOHI484 8Pn=8

C7Hi6O(116)
EN

ni Bgd=197 17-SEP-91 89 = 85*8 = 86 = 42 12-258 I=lB2v H=8 TIM5378B8 Rent

CC

,88

68

48

28.

72
188 158 288

155

Aglycone # 3 :

2,4-dimthyl-pentan-3-ol

C7H16CKII6)

H0HIG86 8p(1=8
188,

xl I=92*v

8gd=197 17-SEP-91 89=85*0^83=59 12-358 El* H=8 TICM136888 Rcnt = GC= 55

G8. 5 5 48.

28.

58

188

158

288

258

Aglycone # 4 :

2-mthylbut-2-n-l-ol
1CHI! 318 8pfl=8

C5HioO(86)
12-258
= GC= 78'

xl
V

8gd=197
H=8

17-SEP-91 83 = 85*8 17=15

flcnt

El*

TIC=832B88

188,

88.

48. 53 28.

86

58

188

158

288

258

156

Aglycone # 5 :

Hexan-1-ol

flOHU462 xl Bgd=197 17-SEP-91 0 9 0 5 BDB=8 J=S2V H*=8 TIC=788888

12-258 El* flcntGC= 73

inn

48.

69 28.

58

188

ISS

288

258

Aglycone # 6 :

2-mthylhexan-2-ol C7Hi6O(116)
HHIH86 Bprt=0 xl Bgd=197 17-SZP-31 89 0 5 - 8 3 3 18 12-258 I=289v H=8 TIC=3875808 ftcnt^ El*

100.,

68.

48. 181 28.

83
58 188 158 208 258

157

glycone # 7 :

Cis-hex-3-n-l-ol

C6H12P (100)

H0HI1613 xl Bgd=137 17-SEP-91 89=95*0^28=47 12-358 El* Bpfl=8 I=239v H=8 TIC=5541888 flcnt = GC= ?7 a 188, 67

68.

55 82

48.

28.

58

il

188 i 188

158

288

2 5 8

Aglycone # 8 :

Benzaldhyde

C7H6CKIO6)
El* flcnt =

H0HI2278 188,

xl Bgd=197 17-SEP-91 89 v Hn=8 TIC=324488B

GC= 92
186

68. 5 1

29.

S3 58 188 158 288 258

158

Aglycone # 9 :

Linalool

CioHigO(154)

HH112899 xl Bgd=2882 7-SEP-98 I=38Bv TIC=13877888 fl 188, 71

8-9=26 25 EI

68.

48. 5 5

9 3 8 6 7 9 1 2 1 1 1 1

1;UL
68

88

188 12B 148 168 188 288 228

Aglycone # 1 0 :

Terpine-4-n-l-ol

CioHigO(154)

SHH4I2753 xl Bgd=t I=85 TIC=2817888 188,

13-SEP-98 18 81*8:34=83 El* fl

88.

68. 9 3 1 1 1 28. 9 6 m 136 68

154

48.

98 188 128 148 168 188 288 228

248

159

Aglycone # 1 1 :

Trans-pinocarvol

CIOHIO(152)

SI1HU3812 188,55

xl TIC=899888

Bgd=l

12-SEP-98 13 34- 8 3784 EI

88.

91

88.

78 83

48. 28.
13

18!
a SB

1 1 9 1 3 4

1 88 188 128 148 168 188 288 228 248 i

Aglycone # 12 :

3-CycIohexne-l-actaldhyde,.a.,4-dimthyle

H0HI3842 BpH=8 108,

xl

Bgd=2555 17-SEP-91 89 B5-9 3?:3S 12-258 El* Hn=8 TIC=S187B88 flcnt: GC= 118

7 9

68.

29. 1 3 8
I V fiS I I !0C J

i 111, I I I

1 2 3

160

Aglycone # 1 3 :

cc-Terpinol

CioHi80(154)

AH3I1549 xl 8gd=1533 6-SEP-98 12=13*0=28=83 ElJ=3?7nv TIC=iaG4908B 189, 5

88. 9 3 48. 67 8 1 1 2 1 1 3 6 1 8 7

1 1 SB
Aglycone # 1 5 :

SB

m1BB

1 4 9 128 148 168 1B8 288 228

Campholnal

CIQHI6O(152)

H0HI3564 xl Bgd=3831 17-SEP-91 89 05*8 43 38 12-258 El BpH=8 I=113v H=8 TIC=3134888 flcnt= S GC= 122 C 108, 188

88.

9 3

4B.

28.

67 5 5

58

LI

'?7 158 288 258

188

161

Aglycone # 1 6 :

CitroneUol

CioH2oO(156)

SHH4I3622 xi Bgd=36U I=302v TIO18863888 188, 69

13-SEP-98 18 01-8 44= 11 EI fient ^

55 68. 8 1 48. 95

188 123

11 !
68

138 1 88 188 128 148 168 188 288 228

248

Aglycone # 17 :

Myrtnol
SBH4I3696 xl Bgd=3Bl1 13-SEP-98 18 81-8 45 8 I=184v TIC=4177080 H E l

188,

68. 9 1

48. 28.

188 119

8 .lib. 68

I ,lll .,11. 134 152

88 188 12B 148 168 188 288 228 248 c

162

Aglycone # 1 8 :

Monoterpnol?
nOHI3G95 Bpfl=8

CioHi60(152)

108,

xl Bgd=3831 17-SEP-91 99^95*8=45'02 12-250 ElI - l B U v HK=8 TIO5886089 Rent GC= 125 93 121 79

68.

48.

28.

55 106 m 152 50 100 150 200 259

Aglycone #20 :

Graniol
flH4UG45 xl

CioHigO (154)'
Bgd=1539 S-SEP-98 15 22-8 = 21 89 El*

!=78v
188, S3

TIC=2522000

G0.

48.
55

189
81

28.

93 1 2 1

88

88

108 128 149 160 188 208 228

163

Aglycone #21 :

Phnylmthanol

C7Hi8O(108)

H0HI4858 xl Bgd=3B8S 17-SEP-91 8pfl=8 I=l86v H=8 TIC=5037888 108, 188

9=16 12-258

El*

GC= 134

S8.

48.

S I
28. 58 99 188 158 280 258

Aglycone #22 :
nOHI4288 108, 9

2-phnylthanol
xl Bgd=3686 17-SEP-91 8985-8 blui ic-c GC- 13;"

68.

48.

28. 5 1 58

1 2 2 65

77

1 8 7 188 158 288

2 5 8

164

Aglycone #23 :

Alcool prillique

CioHi60(152)

nCHI69G Bpfl=8 188. SB

xl I=52PV

Bgd=3B9S 17-SEP-S1 89 85-0 55 39 12-258 El* HM8 T1O3199888 flcntGC= 14?

55
68.

93

121

28.

185

134

152

58

188

I 158

288

258

Aglycone #24 :

Eugnol

Q0H12O2 (164)

S11H1I5373 xl Bgd=5316 I=23Ev TICM2822888 188,

12-SEP-98 13 34-1 = 84 34 Rcnt =

El*

S8. 1 8 3

9 1
48. 1 3 1 1 4 9

6 5
28.

B8

i_JL 88 188 128 148 188 188 288 228 248

2 1

165

Aglycone #25 :

2-Hydroxy-5-mthyl-actophnoneC9Hio02(150)

M0HI5432 xl Bgd=368S 17-SEP-91 89 = 85-1 = 95= 16 12-258 El 8pfl=8 I=!64v H=8 TIC=4353888 fient: GC- 16G 100, 158

1 3 5 68.

48.

7 7 1 8 7

28. 5 1 8 9 58 180 150 288 250

Aglycone #26 :

p-(2-Mthylallyl)-phnol
xl I=74BW

CioHi20(148)

PIOHI5806 8pn=0 100,

8gd=5549 17-SEP-91 89 = 85*1=89 = 37 12-258 El* H=8 TIC=4849888 fient: GC= 175 148

79 SB. 91 187

48. 133

57
28.

71

58

188

158

288

258

166

Aglycone #27 :

trans-Cinnamyl alcool

C9HIQO(134)

HH4I1768 xl I=53sv TIC=4586888 188,

BgdMSSS

6-SEP-98 15 22-8 22 30 flcnt^

Eh

I <

S9 7?
68.

187

55
48.

91

as.

S8

88

18B

128

148

168

188

288 228

Aglycone #28 :

Iso-eugnol

CioHi202(164)

SHH1I6888 xl Bgd=5316 12-SEP-98 13 34-T 12 = 54 El* I=34v TIC=1374888 flcnt= 100,

1S4

68.

'fi 77

48. S5

9 11 8 3 1 3 1 1 4 9

28.

1 1 1
S8 88 188 128 148 168 188 288 228 248 2 1

167

Aglycone # 2 9 :

Vanilline

CgH8O3 (152)

I1S809IG809 xl 8gd=6788 I7-SEP-91 89 = 85-1 BpH=l51 l=930*v H=154 IC=I7829888 SU

3118

12-258 El* fient! GC= 198 I

138,

151

68.

48.

28
53

81

58

li

65

189 123

93
188

137 158 288

258

Aglycone # 3 0 :

4-Hydroxy-3-mthoxy-acophnone

C9H10Q3 (166)

n7884S7084 xl Bgd=7854 17-SEP-91 89=85*1=24=38 12-258 El* Bpn=151 1 = 1.4v H M 1 6 8 T!C=27674888 SU flcnt = GC= 288 108, 1 1

G8. 1 6 6
48.

20.

1 2 3

52

G 57 7

1 0 8
1 3 S 150 280 ' "

II
4

2 5 0

168

Aglycone #31 :

4K4-Hydtoxy,3-mthoxyphnyl)-2-butanone
xi aga=/yau z-ste-ai t=536nw H=19S TlC=l84l2888 MV* SU tm El*

Bpfl=l37 188,

137

C C = 199

68 J

194

20 J
31
SI S5 V luJ.
l8;

119

151
il

ffl.il
50

100 i

Illl

1S6 158 800

258

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