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Manual de Monitorizao Microbiolgica Ambiental

Curso de Especializao Tecnolgica em Qualidade Ambiental

2012

Manuela Abelho

Manuela Abelho

Manual de Monitorizao Microbiolgica Ambiental


Curso de Especializao Tecnolgica em Qualidade Ambiental

ndice
Parte 1. Noes bsicas de microbiologia prtica Conceitos .................................................................................................................................... 6 O que uma clula?................................................................................................................ 6 Microbiologia e microrganismos............................................................................................ 7 Esterilizao e assepsia .......................................................................................................... 7 Meios de cultura ..................................................................................................................... 8 Observao de clulas microbianas ....................................................................................... 9 Cultura e isolamento de microrganismos ............................................................................ 10
Mtodo das estrias ou de riscado em placa ......................................................................................... 10 Mtodo das diluies decimais sucessivas .......................................................................................... 10

Avaliao quantitativa de populaes .................................................................................. 10


Atividade dos microrganismos ............................................................................................................ 10 Massa celular ......................................................................................................................................... 11 Nmero de clulas ................................................................................................................................. 11 Unidades formadoras de colnia (UFC) .............................................................................................. 11

Protocolos bsicos.....................................................................................................................12 Protocolo 1.1 - Preparao e distribuio de um meio de cultura .........................................12


Material ................................................................................................................................................. 12 Procedimento........................................................................................................................................ 12

Protocolo 1.2 - Elaborao de um esfregao fresco ...............................................................13


Material necessrio .............................................................................................................................. 13 Procedimento........................................................................................................................................ 13

Protocolo 1.3 - Colorao de Gram........................................................................................13


Material ................................................................................................................................................. 13 Procedimento........................................................................................................................................ 13

Protocolo 1.4 - Diluies decimais sucessivas .......................................................................14


Material ................................................................................................................................................. 14 Procedimento........................................................................................................................................ 14

Protocolo 1.5 - Sementeira por incorporao ........................................................................ 15


Material ................................................................................................................................................. 15 Procedimento........................................................................................................................................ 15

Protocolo 1.6 - Sementeira por espalhamento em placa .......................................................16


Material ................................................................................................................................................. 16 Procedimento........................................................................................................................................ 16

Protocolo 1.7 - Isolamento por riscado em placa ..................................................................16


Material ................................................................................................................................................. 16

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Procedimento........................................................................................................................................ 16

Protocolo 1.8 - Contagem de clulas viveis (UFC) em placas .............................................. 17


Material ................................................................................................................................................. 17 Procedimento........................................................................................................................................ 17

Parte 2. Qualidade microbiolgica do ar e de superfcies Ar ambiente.............................................................................................................................. 18 Legislao sobre qualidade do ar ambiente ......................................................................... 18 Ar interior ................................................................................................................................ 20 Microrganismos no ar interior ............................................................................................. 20 Legislao sobre qualidade do ar interior ............................................................................ 20 Definio dos parmetros microbiolgicos a considerar na avaliao da qualidade do ar interior...................................................................................................................................21
Bactrias................................................................................................................................................ 21 Fungos ................................................................................................................................................... 21 Legionella ............................................................................................................................................. 22

Procedimentos gerais ........................................................................................................... 22 Superfcies ................................................................................................................................ 23 Procedimentos gerais ........................................................................................................... 24 Avaliao da qualidade do ar interior e de superfcies .......................................................... 24 Protocolo 2.1 - Amostragem do ar por sedimentao .......................................................... 24
Material ................................................................................................................................................. 25 Procedimento........................................................................................................................................ 25

Protocolo 2.2 - Amostragem do ar por filtrao .................................................................. 25


Material ................................................................................................................................................. 26 Procedimento........................................................................................................................................ 26

Protocolo 2.3 - Amostragem de superfcies pelo mtodo da zaragatoa ............................... 26


Material ................................................................................................................................................. 26 Procedimento........................................................................................................................................ 26

Parte 3. Qualidade microbiolgica da gua O conceito de qualidade da gua ............................................................................................ 28 Os conceitos de poluio e contaminao da gua................................................................. 29 Microrganismos e qualidade da gua .................................................................................... 30 Os microrganismos como poluentes .................................................................................... 30 Microrganismos como indicadores de poluio....................................................................31 gua destinada ao consumo humano .................................................................................. 33
Legislao aplicvel .............................................................................................................................. 33 Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 306/2007) ............................................................... 35

guas para produo de gua para consumo humano, para suporte de vida aqucola e guas de rega ........................................................................................................................ 36

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Legislao aplicvel .............................................................................................................................. 36 guas doces superficiais e subterrneas destinadas produo de gua para consumo humano .. 37 guas para suporte de vida aqucola ...................................................................................................38 guas de rega ........................................................................................................................................38 Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 236/98) ....................................................................38

guas balneares.................................................................................................................... 39
Legislao aplicvel .............................................................................................................................. 39 Ponto de amostragem, recolha e conservao das amostras .............................................................40 Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 135/2009) ................................................................ 41

Avaliao da qualidade das guas ..........................................................................................41 Protocolo 3.1 - Recolha de amostras de gua ........................................................................41
Norma: EN 25667-2 | ISO 5667-2:1991 .............................................................................................. 41 Material para uma amostra ................................................................................................................. 41 Recolha de amostras de gua de uma torneira ................................................................................... 41 Recolha de amostras de gua de um curso de gua, de um reservatrio ou de uma praia .............. 42

Protocolo 3.2 .......... Enumerao de microrganismos cultivveis: contagem de colnias por sementeira em meio extrato de levedura agar ..................................................................... 43
Norma: EN ISO 6222 | ISO 6222:1999 ............................................................................................... 43 Material para uma amostra ................................................................................................................. 43 Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura agar extracto de levedura .................................... 43 Segundo tempo: recolha, diluio, sementeira e incubao das amostras ....................................... 43 Terceiro tempo: contagem das colnias .............................................................................................. 44

Protocolo 3.3 - Deteo e enumerao de Escherichia coli e de bactrias coliformes pelo mtodo da filtrao por membrana ..................................................................................... 44
Norma: EN ISO 9308-1 | ISO 9308-1:2000 ....................................................................................... 44 Material para uma amostra ................................................................................................................. 45 Primeiro tempo: elaborao dos meios de cultura agar de lactose TTT com heptadecilsulfato de sdio, caldo de triptofano e agar triptonado de soja (TSA) ............................................................ 45 Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras ........................................................... 46 Terceiro tempo: exame e repicagem ................................................................................................... 46 Quarto tempo: diferenciao e contagem ........................................................................................... 47

Protocolo 3.4 - Deteo e enumerao de coliformes totais, coliformes fecais e Escherichia coli pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ............................................................ 47
Material para uma amostra .................................................................................................................48 Primeiro tempo: elaborao dos meios de cultura caldo blis verde brilhante e caldo peptonado ...............................................................................................................................................................48 Segundo tempo: recolha das amostras e teste presuntivo ................................................................. 49 Terceiro tempo: verificao da existncia de coliformes e teste final ............................................... 50 Quarto tempo: verificao da existncia de coliformes fecais e de E. coli ........................................ 50

Protocolo 3.5 ..... Deteo e enumerao de enterococos intestinais pelo mtodo da filtrao por membrana ....................................................................................................................... 51
Norma: EN ISO 7899-2 | ISO 7899-2:2000 ....................................................................................... 51 Material para uma amostra ................................................................................................................. 51 Primeiro tempo: elaborao dos meios de cultura Slanetz e Bartley, soluo TTT e agar blis esculina-azida ...................................................................................................................................... 52 Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras ........................................................... 52

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Terceiro tempo: confirmao e contagem ........................................................................................... 53

Protocolo 3.6 - Deteco e enumerao de estreptococos fecais pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ........................................................................................................... 53
Material para uma amostra ................................................................................................................. 53 Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura caldo bagg ............................................................ 53 Segundo tempo: recolha das amostras e incubao ........................................................................... 54 Terceiro tempo: verificao da existncia de estreptococos fecais .................................................... 54

Protocolo 3.7 - Deteo e enumerao de Clostridium perfringens (incluindo esporos) pelo mtodo da filtrao por membrana ..................................................................................... 54
Material para uma amostra ................................................................................................................. 54 Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura agar m-CP ............................................................ 54 Segundo tempo: recolha das amostras e incubao ........................................................................... 55 Terceiro tempo: diferenciao ............................................................................................................. 55

Protocolo 3.8 - Deteo e enumerao de Clostridium perfringens (incluindo esporos) pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)........................................................................... 56
Norma: EN 26461-1:1993 | ISO 6461-1:1986 ..................................................................................... 56 Mtodo da inoculao de tubos mltiplos e contagem segundo o NMP ........................................... 56 Material para uma amostra ................................................................................................................. 56 Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura agar reinforced clostridial e das solues sulfito de sdio e ferro amoniacal ................................................................................................................ 57 Segundo tempo: recolha das amostras, inoculao e incubao ....................................................... 57 Terceiro tempo: leitura de resultados ................................................................................................. 58

Bibliografia citada ................................................................................................................... 58

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Parte 1.Noes bsicas de microbiologia


Conceitos
O que uma clula?
A clula a unidade estrutural, funcional e biolgica de todos os seres vivos. uma unidade autnoma, auto replicvel que pode existir como uma unidade funcional independente (como no caso dos organismos unicelulares) ou como uma subunidade de um organismo pluricelular (como nas plantas e nos animais) especializada numa dada funo. Existem dois tipos distintos de clulas (Figura 1): as clulas procariotas e as clulas eucariotas. As clulas procariotas no tm organelos intracelulares individualizados por membrana (incluindo ncleo) e so unicelulares. As clulas eucariotas tm organelos individualizados por membrana (incluindo ncleo) e podem ser uni ou pluricelulares. Nos dois tipos de clula a informao gentica est armazenada nos genes que se agrupam em cromossomas, mas enquanto as clulas eucariotas tm o material gentico no ncleo, as clulas procariotas tm o material gentico disperso pelo citoplasma.
Clula procariota Clula eucariota

Figura 1. Esquema de uma clula procariota (esquerda) e de uma clula eucariota (direita). [modificado de http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/images/cells/allcell.jpg]. A unidade de medida micrmetro (m1) demonstra o tamanho microscpico das clulas e dos microrganismos.

1 m=0.001 mm ou seja, so necessrios 1000 m para perfazer 1 mm. 6

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Microbiologia e microrganismos
A microbiologia a cincia que estuda os microrganismos, isto , todas as formas de vida microscpicas. Os microrganismos incluem seres procariotas (bactrias e rqueas) e seres eucariotas (fungos, leveduras, microalgas e protozorios).

Esterilizao e assepsia Para a cultura de microrganismos em laboratrio deve utilizar-se material e meios de cultura estreis. Para efetuar a esterilizao2 existem vrios mtodos, que devem ser utilizados de acordo com o tipo de material a esterilizar. Para a esterilizao de materiais resistentes a altas temperaturas, como o vidro, utiliza-se o calor seco, recorrendo a estufas que atingem temperaturas de 160-180C. Outro tipo de calor seco consiste na incinerao ou queima direta pelo fogo e utiliza-se por exemplo para esterilizar ansas no bico de Bunsen, assim como para a eliminao de lixos slidos dos hospitais (Alcntara et al., 1996). Os materiais como os meios de cultura, ricos em humidade, no podem ser esterilizados pelo calor seco. Para esterilizar meios de cultura e outros lquidos resistentes ao calor utiliza-se o calor hmido recorrendo a um aparelho denominado autoclave. O calor hmido destri rapidamente os microrganismos por coagulao das suas protenas. O tempo de morte trmica, i.e., o intervalo de tempo necessrio para destruir clulas vegetativas ou esporos at ao nvel pretendido inversamente proporcional temperatura. A conjugao dos fatores tempo-temperatura depende das caractersticas do produto a esterilizar e da sua estabilidade trmica. Nos autoclaves desenvolve-se uma atmosfera de vapor que permite a subida da temperatura a valores superiores a 100C e portanto a rpida esterilizao de materiais. O calor hmido evita a evaporao excessiva quando se trata de meios lquidos e solues, pelo que o mtodo de mais adequado para a esterilizao destes materiais. O tempo de tratamento trmico est relacionado com a temperatura mas tambm com o volume a esterilizar, i.e., com o tempo de penetrao do calor no interior do material. Para a mesma temperatura os tempos de tratamento trmico aumentam com o aumento do volume a esterilizar (Alcntara et al., 1996).

Esterilizao a destruio ou remoo de todos os microrganismos, patognicos ou no, de um dado material. No confundir com desinfeco, que consiste na remoo ou na inactivao de parte ou de todos os microrganismos patognicos presentes num dado material (Ferreira et al., 2010).
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Existem outros mtodos de esterilizao que no utilizam calor e que devem ser utilizados quando o material a esterilizar no resiste ao calor ou alterado por temperaturas elevadas: filtrao, radiaes e compostos qumicos. A filtrao utilizada principalmente para a esterilizao de antibiticos e vitaminas e tambm para a esterilizao do ar. Neste processo, os microrganismos so removidos por passagem do lquido ou do ar atravs de uma membrana filtrante de poro inferior ao tamanho mais vulgar dos microrganismos mais pequenos, i.e., 0.2 m 3. As radiaes, como os raios gama, os raios x e a radiao ultravioleta, so utilizadas para a esterilizao de materiais sensveis ao calor. Os principais compostos qumicos (e.g., sabes, sais biliares, fenis, lcoois, cloro, ) normalmente utilizados na esterilizao eliminam as clulas vegetativas mas no so eficazes sobre as formas esporuladas (formas de resistncia) dos microrganismos. Mesmo utilizando materiais estreis, necessrio manter o local de trabalho isento de contaminaes. A assepsia um conjunto de medidas que permitem manter um ser vivo ou um material inerte isento de contaminaes por microrganismos. As condies mnimas de assepsia incluem a limpeza e desinfeo da bancada, uso de bata limpa (por vezes estril), lavagem e desinfeo das mos, cabelos presos (por vezes cobertos) e mscara quando necessrio. Durante a manipulao de material microbiolgico, as condies de assepsia podem ser mantidas utilizando uma bancada com fluxo e/ou uma chama de um bico de Bunsen. Para as condies de assepsia contribuem tambm a rapidez da execuo sob a zona de influncia da chama, evitar correntes de ar e contaminaes pelo operador (Alcntara et al., 1996). Meios de cultura Para cultivar microrganismos em laboratrio necessrio fornecer-lhes as condies mais adequadas para o seu crescimento. Existem diversos tipos de meios de cultura, que contm diferentes quantidades e tipos de nutrientes e que, slidos ou lquidos, tornam possvel a multiplicao de diferentes tipos de microrganismos em laboratrio.

O micrmetro (m) a milionsima parte do milmetro (mm), i.e., 1 mm=1000 m e 1 m=0.001 mm. 8

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Observao de clulas microbianas Para a observao de microrganismos pode recorrer-se a preparaes a fresco quando h interesse em fazer a observao em condies de vida, por exemplo para observar a mobilidade e tipo de locomoo, para detetar mudanas citolgicas durante a diviso celular, para a diferenciao de esporos, etc. H, porm, objetivos que tornam conveniente a colorao das preparaes, como por exemplo: Aumento do contraste entre as clulas e o meio (o ndice de refraco do protoplasma bacteriano muito semelhante ao do meio circundante, tornando difcil a observao dos microrganismos em preparaes no coradas, a no ser que se usem mtodos especiais de iluminao como por exemplo a microscopia de contraste de fase); Diferenciao de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante (coloraes diferenciais); Observao de estruturas particulares (e.g., parede celular, material nucleico, esporos, cpsula, etc.).

A colorao de Gram uma colorao diferencial especfica para bactrias. Baseia-se no facto de que quando as bactrias so coradas com certos corantes bsicos (Figura 2), Gram-negativas podem ser facilmente descoradas com solventes orgnicos (e.g., etanol, acetona), enquanto as Gram-positivas resistem a esta descolorao. A capacidade das clulas reterem ou perderem o corante reflete diferenas na estrutura fundamental da parede celular, pelo que a resposta colorao de Gram uma caracterstica taxonmica importante, usada numa fase inicial da identificao das bactrias.

Figura 2. A colorao de Gram. Nas bactrias Gram-negativas, o lcool remove os lpidos da membrana externa da parede celular, aumentando a sua permeabilidade; o complexo violeta de cristal-iodo pode assim ser extrado, descorando as bactrias. Nas bactrias Gram-positivas, o tratamento com lcool resulta na sua desidratao, com reduo da permeabilidade da parede e consequente reteno do complexo violeta de cristal-iodo. Fonte: Microbiologia Online (2011).

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Cultura e isolamento de microrganismos Os microrganismos esto presentes na natureza em comunidades mais ou menos complexas. No entanto, o estudo das propriedades e caractersticas dos microrganismos tornou necessrio o desenvolvimento de tcnicas que permitissem a obteno de organismos separados (ou isolados) dessas comunidades, em culturas puras. A cultura e o isolamento de microrganismos so duas operaes bsicas em Microbiologia. O crescimento de populaes microbianas em meios de cultura no laboratrio permite a obteno de culturas puras culturas que contm apenas um tipo de microrganismo ou de culturas mistas culturas com mais que um tipo de microrganismo. O isolamento promove a separao de um microrganismo a partir de populaes mistas. As culturas puras podem ser obtidas atravs de vrios mtodos, nos quais se visa o desenvolvimento de uma populao a partir de uma nica clula inicial e importante fazer subculturas a partir de uma colnia isolada, para certificao da pureza das culturas. Mtodo das estrias ou de riscado em placa um mtodo de isolamento bastante rpido que consiste no espalhamento de uma pequena poro de inculo, colhida com uma ansa, atravs de um riscado na superfcie de um meio de cultura slido. A execuo do riscado pode ser feita por vrios processos. Mtodo das diluies decimais sucessivas Consiste na realizao de diluies decimais sucessivas da amostra e posterior sementeira de quantidades conhecidas em caixas de Petri. A sementeira (operao que consiste em distribuir uniformemente o inculo em meio de cultura apropriado) pode ser feita superfcie (pelo mtodo do espalhamento em placa), em camada dupla e por incorporao. Aps a obteno de uma cultura pura, a sua manuteno em laboratrio deve garantir que os microrganismos permaneam viveis, geneticamente homogneos e protegidos de posteriores contaminaes. As culturas podem ser mantidas por refrigerao (4C), congelao (-20C, -70C ou em azoto lquido: -180C) ou liofilizadas. Para conservao a longo prazo dever usar-se substncias crio protetoras (e.g., glicerol). Avaliao quantitativa de populaes A avaliao quantitativa do crescimento microbiano pode ser feita de diversas formas, dependendo das caractersticas do material e da informao pretendida. Atividade dos microrganismos A avaliao quantitativa de populaes pode ser efetuada atravs da medio da atividade microbiana, como por exemplo, a atividade de reduo de corantes (medida

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pelo grau de reduo em determinado tempo ou pelo tempo necessrio reduo), a libertao de CO2 (pelo volume ou pela massa perdida), o consumo de O2 (por exemplo, atravs da Carncia Bioqumica de Oxignio, CBO). Massa celular A avaliao da massa celular tambm uma forma de avaliao quantitativa de populaes. Para isso necessrio, nas condies de observao, conhecer a funo que relaciona a massa celular com o nmero de microrganismos presentes. Nmero de clulas A avaliao quantitativa de populaes atravs da contagem do nmero de clulas pode ser efetuada por vrios mtodos, de contagem direta ou total (ex. cmaras de contagem e mtodo de Breed) e de contagem indireta ou de clulas viveis (exemplo, contagem em placas e mtodo do Nmero Mais Provvel - NMP). Unidades formadoras de colnia (UFC) O crescimento dos microrganismos em meio slido d origem formao de colnias (crescimento macroscopicamente visvel resultante da multiplicao celular). Se as clulas microbianas estiverem completamente dispersas, cada colnia corresponde a uma bactria inicial em estado vivel e cultivvel. Se os microrganismos estiverem agregados ou aderentes a pequenas partculas no h correspondncia entre o nmero de colnias obtido e o nmero inicial de microrganismos. Desta forma, relativamente origem de uma colnia, ou ao teor de microrganismos determinado por contagem de colnias, fala-se em Unidades Formadoras de Colnias (UFC). O nmero de clulas viveis (clulas com capacidade para se multiplicar) presentes numa populao microbiana pode ser estimado usando tcnicas de contagem em placas. Neste mtodo um volume conhecido de uma suspenso de microrganismos, convenientemente diluda, espalhado na superfcie de um meio de cultura solidificado (sementeira por espalhamento em placa) ou incorporado nesse meio (sementeira por incorporao). As colnias que se desenvolvem, aps incubao adequada, so contadas. Assume-se que cada colnia originada a partir de uma nica clula, o que nem sempre verdade, pelo que os resultados so normalmente expressos em termos de unidades formadoras de colnias (UFC). Para que os resultados sejam significativos as placas contveis devero ter entre 30 a 300 colnias. O nmero total de microrganismos obtm-se multiplicando o nmero de colnias pelo fator de diluio.

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Protocolos bsicos
Protocolo 1.1 - Preparao e distribuio de um meio de cultura Material
Preparados comerciais de meios de cultura; gua destilada; provetas; bales Erlenmeyer com tampas de algodo e papel craft/papel de alumnio ou frascos de vidro com tampa resistentes ao calor; balana; caixas para pesar; colher ou esptula; magnetes; placa magntica de aquecimento; autoclave; caixas de Petri estreis; tubos de ensaio com tampa.

Procedimento 1. Seguindo as instrues da embalagem, pesar a quantidade de p necessria para preparar o volume indicado pelo docente; 2. Medir o volume necessrio de gua destilada numa proveta e transferir para um Erlenmeyer (ou para um frasco prprio com tampa de enroscar) o p pesado e a gua destilada; 3. Colocar um magnete dentro do Erlenmeyer/frasco e agitar numa placa de aquecimento at obter uma soluo lmpida; 4. Ajustar o pH de acordo com as instrues da embalagem, adicionando gota a gota as solues cida ou alcalina; 5. Tapar o Erlenmeyer com a rolha de algodo e papel de alumnio (ou enroscar parcialmente a tampa do frasco); 6. Se for um meio de cultura lquido, em vez de executar o ponto 5, distribuir por tubos de ensaio (10 mL/tubo) e colocar a tampa; 7. Colocar o Erlenmeyer/frasco ou os tubos de ensaio com o meio de cultura a esterilizar no autoclave (121C durante 15- 20 minutos); 8. Esperar que a temperatura e a presso dentro do autoclave diminuam, retirar o Erlenmeyer/frasco ou os tubos de ensaio da autoclave; 9. Se for um meio de cultura lquido, deixar arrefecer e utilizar ou guardar a 4C at sua utilizao; 10. Se for um meio slido, deixar arrefecer at atingir uma temperatura que permita o seu manuseamento, mas superior a 42C (a esta temperatura o agar solidifica); 11. Desembrulhar as caixas de Petri esterilizadas e identificar com o nome do meio de cultura e a data da sua elaborao; 12. Verter o meio de cultura nas caixas de Petri em condies de assepsia, fazendo uma camada de aproximadamente 5 mm; 13. Deixar solidificar e utilizar ou inverter e guardar a 4C at sua utilizao.

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Protocolo 1.2 - Elaborao de um esfregao fresco Material necessrio


Bico de Bunsen, ansa; lminas de vidro, lamelas; microscpio.

Procedimento 1. Retirar com a pina uma lmina de vidro do recipiente e inflamar chama; 2. Colocar uma gota de gua destilada esterilizada na lmina; 3. Esterilizar uma ansa chama e deixar arrefecer; 4. Tocar na colnia com a ansa e suspender o material na gota de gua; 5. Espalhar o lquido numa rea de aproximadamente 1 cm2, esfregando bem de forma a separar a massa de clulas; 6. Colocar uma lamela, pressionar ligeiramente e observar ao microscpio Protocolo 1.3 - Colorao de Gram Material
Bico de Bunsen, ansa; lminas de vidro, lamelas; pinas, corante cristal de violeta; corante safranina; soluto de lugol; lcool iodado; gua corrente; microscpio.

Procedimento 1. Depositar a amostra sobre uma lmina de vidro, fazer um esfregao e fixar pelo calor da seguinte forma: 2. Retirar com a pina uma lmina de vidro do recipiente e inflamar chama; 3. Colocar uma gota de gua destilada esterilizada na lmina; 4. Esterilizar uma ansa chama e deixar arrefecer; 5. Tocar na colnia com a ansa e suspender o material na gota de gua; 6. Espalhar o lquido numa rea de aproximadamente 1 cm2, esfregando bem de forma a separar a massa de clulas; 7. Segurar a lmina com uma pina e passar rapidamente sobre a chama at toda a gua evaporar para fixar o material; 8. Realizar uma colorao de Gram das diferentes colnias (Figura 2), da seguinte forma: 9. Inundar o esfregao fixado com cristal de violeta (corante primrio) agitando suavemente durante 60 segundos; 10. Lavar com gua corrente, comeando na extremidade da lmina e deixando escorrer por cima do material fixado; 11. Inundar o esfregao com soluo de Lugol, deixando atuar durante 60 segundos (vai formar um complexo com o cristal de violeta);

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12. Lavar com gua corrente e secar com papel de filtro, pressionando suavemente o papel contra a preparao; 13. Inundar o esfregao com lcool iodado (agente descolorante), agitando suavemente durante 60 segundos; 14. Inundar com corante vermelho safranina durante 30 segundos, lavar e secar com papel de filtro; 15. Observar ao microscpio, verificando se as clulas so Gram-positivas ou Gramnegativas e registando a sua forma e a sua dimenso. Protocolo 1.4 - Diluies decimais sucessivas Material
Bico de Bunsen, 1 suspenso de microrganismos; pipetas estreis de 1 mL; tubos de ensaio com 9 mL de soluto de Ringer estril; vrtex; caixas de Petri estreis e meio se cultura liquefeito (para sementeira por incorporao, ver Protocolo 1.5) ou caixas de Petri com meio de cultura slido e espalhador (para sementeira por espalhamento, ver Protocolo 1.6).

Procedimento 1. Identificar os tubos de ensaio, com as referncias 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, ; 2. Com uma pipeta esterilizada retirar em assepsia 1 ml da amostra da populao fornecida; 3. Introduzir a alquota de 1 ml no primeiro tubo de diluio (tubo com soro fisiolgico); 4. Homogeneizar a suspenso por agitao (vrtex), segurando a rolha para que no salte; 5. Com outra pipeta esterilizada retirar 1 ml da diluio do primeiro tubo (diluio 10-1) e introduzir num segundo tubo de diluio, para obteno da diluio 10-2; 6. Proceder de igual modo at ltima diluio, seguindo o esquema da Figura 3; 7. Semear imediatamente, de acordo com os mtodos indicados nos pontos seguintes, seguindo a ordem decrescente das diluies e utilizando uma s pipeta para todas as sementeiras da mesma amostra.

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Figura 3. O mtodo das diluies decimais sucessivas. Fonte: Madigan et al. (2006).

Protocolo 1.5 - Sementeira por incorporao Material


Meio de cultura slido mantido a 45C; caixas de Petri estreis; suspenso de microrganismos; pipetas estreis de 1 mL; bico de Bunsen.

Procedimento 1. Manter um meio de cultura (slido) liquefeito num banho a 45C (o agar comea a solidificar a 42C); 2. Identificar 5 caixas de Petri esterilizadas com a data, turma e n de aluno e diluio respetiva e marcar uma caixa de Petri extra com a letra C (controlo); 3. Seguindo a ordem decrescente das diluies, retirar 1 ml de cada uma das diluies com uma pipeta esterilizada, depois de a ter enchido e esvaziado pelo menos 6 vezes na suspenso de microrganismos;

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4. Entreabrindo apenas o suficiente a tampa da caixa de Petri, colocar o contedo da pipeta no fundo da caixa; 5. Tirar a rolha do tubo de meio slido liquefeito, passar a boca do tubo pela chama e verter, de uma s vez, o seu contedo na caixa de Petri; 6. Incorporar o inculo no meio de cultura: mantendo a caixa assente sobre o tampo na bancada, agite-a (descrever cinco crculos no sentido dos ponteiros do relgio, cinco outros em sentido contrrio e movimentos retilneos segundo duas direes cruzadas, cinco vezes cada tambm) evitando que o agar toque a tampa da placa e deixe repousar at solidificar; 7. Na caixa controlo no se deposita inculo: verter o contedo de um tubo de meio da mesma maneira que anteriormente; 8. Aps solidificao do meio, identificar as caixas com a data de inoculao, diluio e microrganismo inoculados, inverter e incubar a 25C durante dois dias. Protocolo 1.6 - Sementeira por espalhamento em placa Material
Caixas de Petri estreis com meio de cultura slido; espalhador; copo de vidro; lcool etlico a 96%; suspenso de microrganismos; pipetas estreis de 1 mL; bico de Bunsen.

Procedimento 1. Identificar convenientemente o material a inocular; 2. A partir de cada uma das diluies pipetar 0.1 ml para a superfcie do meio de cultura solidificado; 3. Com um espalhador de vidro estril espalhar o inculo por toda a superfcie da caixa semeada, rodando-a simultaneamente; 4. Identificar as caixas, colocar em posio invertida e incubar a 25C durante dois dias. Protocolo 1.7 - Isolamento por riscado em placa Material
Caixas de Petri estreis com meio de cultura slido; ansa; bico de Bunsen.

Procedimento 1. Com uma ansa esterilizada e arrefecida tocar numa colnia isolada; 2. Riscar com a ansa a superfcie do agar, de acordo com um esquema que vise esgotar completamente o material contido na ansa (Figura 4); 3. Identificar e colocar a caixa de Petri em posio invertida a incubar a 25C durante uma semana.
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Figura 4. Exemplo de um riscado em placa, mostrando as quatro direes do riscado. O objetivo do riscado o esgotamento do inculo e a obteno de colnias isoladas, derivadas de uma nica clula inicial. Para maior eficcia no processo de esgotamento do inculo, pode esterilizar-se a ansa entre os riscados 1, 2, 3 e 4, esperando que arrefea em assepsia antes de iniciar o riscado seguinte. Fonte: Microbiology Virtual Lab (2011).

Protocolo 1.8 - Contagem de clulas viveis (UFC) em placas Material


Caixas de Petri inoculadas pelo mtodo do espalhamento ou da incorporao.

Procedimento 1. Observar as caixas de Petri inoculadas, selecionar apenas as que permitam contar entre 30 a 300 colnias e contar as colnias nas placas selecionadas; 2. Calcular o nmero mdio das diversas repeties; 3. Calcular o nmero de clulas viveis presentes na suspenso original (UFC/ml), i.e., a abundncia de microrganismos cultivveis.

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Parte 2.Qualidade microbiolgica do ar e de superfcies


Ar ambiente
A qualidade do ar o termo que se usa, normalmente, para traduzir o grau de poluio no ar que respiramos. A poluio do ar provocada por uma mistura de substncias qumicas, lanadas no ar ou resultantes de reaes qumicas, que alteram o que seria a constituio natural da atmosfera. Estas substncias poluentes podem ter maior ou menor impacte na qualidade do ar, consoante a sua composio qumica, concentrao na massa de ar em causa e condies meteorolgicas. Assim, por exemplo, a existncia de ventos fortes ou chuvas podero dispersar os poluentes, ao passo que a presena de luz solar poder acentuar os seus efeitos negativos (APA, 2011). Na legislao no est contemplado o uso de parmetros microbiolgicos na avaliao da qualidade do ar ambiente; apenas na avaliao da qualidade do ar interior. Legislao sobre qualidade do ar ambiente

Lei 11/87, de 7 de Abril | Lei de Bases do Ambiente http://dre.pt/pdf1sdip/1987/04/08100/13861397.pdf

Define a orientao de partida da proteo do ar que, como componente ambiental natural, tem necessariamente que conhecer um nvel de proteo coerente e compatvel com as demais componentes ambientais naturais e humanas, previstas neste diploma basilar da definio da poltica ambiental em Portugal.

Decreto-Lei 276/99, de 23 de Julho | http://dre.pt/pdf1sdip/1999/07/170A00/45994604.pdf

Define as linhas de orientao da poltica de gesto da qualidade do ar e transpe para a ordem jurdica interna a Directiva 96/62/CE, do Conselho, de 27 de Setembro, relativa avaliao e gesto da qualidade do ar ambiente.

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Decreto-Lei 279/2007 | http://dre.pt/pdf1sdip/2007/08/15000/0504005042.pdf

Primeira alterao ao Decreto-Lei 276/99, de 23 de Julho, que define as linhas de orientao da poltica de gesto da qualidade do ar e transpe para a ordem jurdica interna a Directiva 96/62/CE, do Conselho, de 27 de Setembro, relativa avaliao e gesto da qualidade do ar ambiente.

Decreto-Lei 111/2002, de 16 de Abril | http://dre.pt/pdf1sdip/2002/04/089A00/37113722.pdf

Estabelece os valores limite das concentraes no ar ambiente do dixido de enxofre, dixido de azoto e xidos de azoto, partculas de suspenso, chumbo, benzeno e monxido de carbono, bem como as regras de gesto da qualidade do ar aplicveis a esses poluentes, em execuo do disposto nos artigos 4 e 5 do Decreto-Lei 276/99 de 23 de Julho, transpondo para a ordem interna as Directivas Comunitrias 1999/30/CE, do Conselho, de 22 de Abril, e 2000/69/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 16 de Novembro.

Decreto-Lei 320/2003, de 20 de Dezembro | http://dre.pt/pdf1sdip/2003/12/293A00/85128521.pdf

Estabelece objetivos a longo prazo, valores alvo, um limiar de alerta e um limiar de informao ao pblico para as concentraes do ozono no ar ambiente, bem como as regras de gesto da qualidade do ar aplicveis a esse poluente, em execuo do disposto nos artigos 4 e 5 do Decreto-Lei 276/99 de 23 de Julho, transpondo para a ordem jurdica nacional a Directiva 2002/3/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 12 de Fevereiro, relativa ao ozono no ar ambiente.

Decreto-Lei 351/2007, de 23 de Outubro | http://dre.pt/pdf1sdip/2007/10/20400/0770607712.pdf

Transpe para a ordem jurdica interna a Directiva 2004/107/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Dezembro, estabelecendo valores alvo para as concentraes de arsnio, cdmio, mercrio, nquel e hidrocarbonetos aromticos policclicos no ar ambiente.

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Ar interior
A qualidade do ar no interior dos edifcios um dos fatores bsicos no conforto dos utilizadores e tambm influencia a sua sade, bem como o rendimento e durao do equipamento e maquinaria existentes na rea de tratamento do ar. A qualidade do ar interior deve, assim, ser avaliada peridica e sistematicamente, com o objetivo de garantir nveis mnimos de qualidade (SGS, 2011). Microrganismos no ar interior Alm das partculas poluentes no biolgicas, o ar contm bio aerossis, que correspondem a material biolgico transmitido pelo ar. Os contaminantes biolgicos incluem microrganismos (bactrias, fungos, vrus), caros, plen, traas, pelo e fezes de animais. As bactrias (e.g., Staphylococcus spp. e Micrococcus spp.) e fungos (e.g., Penicillium spp., Aspergillus spp. e Cladosporium spp.) so os mais frequentemente associados com biocontaminantes e com queixas quanto qualidade de ar de interiores. Entre as principais fontes de contaminao fngica esto os sistemas de ventilao mecnica, em funo do seu funcionamento deficiente e de misturar ar filtrado externo com ar reciclado (Filho et al., 2000). A quantidade e o tipo de microrganismos existentes dentro de um espao fechado esto diretamente relacionados com a existncia de suspenses orgnicas e minerais no ar, a temperatura e a humidade relativa, as condies de manuteno dos sistemas de climatizao existentes, a higiene das instalaes, o nmero e o nvel de higiene dos seus ocupantes. Legislao sobre qualidade do ar interior Em 2006 foi institudo o Sistema Nacional de Certificao Energtica e da Qualidade do Ar Interior nos Edifcios SCE, composto por um extenso pacote legislativo (Decretos-Lei 78, 79 e 80 de 4 de Abril de 2006), que prev a obrigatoriedade de auditorias qualidade do ar interior. Essas auditorias incluem a avaliao microbiolgica da qualidade do ar.

Decreto-Lei 79/2006, de 4 de Abril | http://www.dre.pt/pdf1sdip/2006/04/067A00/24162468.PDF

Aprova o Regulamento dos Sistemas Energticos de Climatizao em Edifcios, publicado em anexo. Transpe parcialmente para a ordem jurdica nacional a Directiva 2002/91/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho de 16 de Dezembro, relativa ao desempenho energtico dos edifcios. Define os parmetros microbiolgicos a avaliar e os valores mximos admissveis para cada parmetro (Tabela 1).

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Tabela 1. Parmetros microbiolgicos e valores mximos admissveis a considerar na determinao da qualidade do ar interior (Decreto-Lei 79/2006).

Bactrias Fungos Legionella4

NUFC/m3 500 500 100

Definio dos parmetros microbiolgicos a considerar na avaliao da qualidade do ar interior Bactrias Grupo muito grande de microrganismos (organismos microscpicos) composto por seres procariotas (i.e., sem ncleo individualizado e sem organelos intracelulares) unicelulares. Podem ter a forma de esferas (i.e., cocos) ou de bastonetes (i.e., bacilos), ou outras formas menos frequentes. O grupo muito diversificado em termos de metabolismo, mas a quantificao do total de bactrias transportadas pelo ar dirigese apenas s bactrias heterotrficas, isto , aquelas cuja fonte de carbono, de energia e de eletres a matria orgnica. Fungos Grupo muito grande de organismos heterotrficos que inclui as leveduras, os bolores, os cogumelos, etc. As suas clulas so eucariotas (i.e., tm ncleo individualizado e organelos intracelulares). Os bolores so fungos pluricelulares filamentosos (Figura 5) e as leveduras so fungos unicelulares. Nos fungos pluricelulares, as clulas formam longos filamentos chamados hifas (Figura 5, direita) que crescem formando um emaranhado chamado miclio (Figura 5, esquerda).

Em edifcios com sistemas de climatizao em que haja produo de aerossis (e.g., torres de arrefecimento ou humidificadores por gua lquida), ou com sistemas de gua quente para chuveiros onde a temperatura de armazenamento seja inferior a 60C. Pesquisa em amostras de gua recolhidas nos locais de maior risco (e.g., tanques das torres de arrefecimento, depsitos de gua quente e tabuleiros de condensao).

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Figura 5. Exemplos de fungos filamentosos ou bolores. Esquerda: miclio do fungo filamentoso Fusarium oxysporum observado a olho nu (Fonte: Scientia, 2011). Direita: hifas do fungo Aspergillus nger o vulgar bolor do po - observadas ao microscpio (Fonte: Instituto Cincia Hoje, 2010).

Legionella uma bactria Gram-negativa, mvel, com forma de bastonete (Figura 6). Pode causar pneumonia (doena dos legionrios) ou uma doena semelhante gripe (doena de Pontiac). Ao contrrio de outras bactrias, pode sobreviver com baixos nveis de oxignio dissolvido e parcialmente resistente desinfeo com cloro. Existem pelo menos 48 espcies de Legionella, das quais 18 podem causar doenas. Pensa-se que a maioria das infees devida espcie Legionella pneumophila.

Figura 6. Fotografia de Legionella pneumophila, mostrando a forma de bastonete e o flagelo que lhe permite mobilidade. Fonte: MicrobLog (2006).

Procedimentos gerais Para a amostragem dos microrganismos do ar pode utilizar-se a monitorizao passiva e a monitorizao ou amostragem ativa. A monitorizao passiva levada a cabo por sedimentao do ar em caixas de Petri standarde com meio de cultura generalista, abertas e expostas ao ar durante um perodo de tempo conhecido. Este mtodo pode ser limitante porque no permite, pelo menos diretamente, a
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contabilizao do nmero de unidades formadoras de colnia por unidade de volume de ar. Para alm disso, as caixas de Petri podem ser contaminadas por microrganismos provenientes de outras fontes de contaminao que no o ar. Por outro lado, um mtodo fcil de usar e com baixos custos. A monitorizao ativa necessita de um amostrador de ar, que filtra volumes conhecidos atravs de um filtro que depois incubado num meio apropriado. Embora ambos os mtodos sejam vlidos e possam ser utilizados, na legislao portuguesa est indicado o mtodo da filtrao para a quantificao das bactrias e dos fungos do ar. Para a distino de fungos e leveduras pode recorrer-se a diferentes meios de cultura, observao macroscpica das colnias e observao microscpica das suas clulas. A determinao de Legionella efetuada nas guas.

Superfcies
A amostragem e a anlise dos microrganismos presentes em superfcies permitem determinar se os mtodos de limpeza e desinfeo utilizados so eficazes. Este tipo de anlise est normalmente relacionado com a produo de alimentos e o controlo microbiolgico um dos passos exigidos no sistema HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point, que se traduz por Anlise de Perigos e Controlo de Pontos Crticos), um sistema de controlo da segurana alimentar. Na legislao no esto previstos valores-limite, mas no controlo da segurana alimentar utilizam-se os valores indicados na Tabela 2 para bactrias aerbias5 mesfilas6 totais (Downes & Ito, 2001).

Classificao quanto s necessidades de oxignio. Os microrganismos podem ser aerbios ou anaerbios. Dentro dos aerbios existem os aerbios obrigatrios ou estritos (s conseguem sobreviver na presena de oxignio na concentrao atmosfrica cerca de 20%) e os microaerfilos (necessitam de oxignio mas no toleram a concentrao atmosfrica; necessitam de 2-10%). Dentro dos anaerbios existem os anaerbios obrigatrios ou estritos (morrem na presena de oxignio), os anaerbios facultativos (no necessitam de oxignio para sobreviver mas crescem melhor na sua presena) e os aerotolerantes (crescem igualmente bem na presena ou na ausncia de oxignio; no usam oxignio, ignoram-no). Classificao quanto s necessidades de temperatura. Os microrganismos mesofilos vivem numa gama de temperaturas amenas (a nossa temperatura ambiente); a temperatura mxima que toleram menor que 50C, a temperatura mnima deve ser maior que 15C e
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Tabela 2. Valores limite para bactrias aerbias mesfilas totais em superfcies na indstria alimentar (Downes & Ito, 2001).

NUFC/cm2 Satisfatrio Aceitvel No satisfatrio <1 2-10 >10

Procedimentos gerais Para a determinao de bactrias aerbias mesfilas totais utiliza-se o mtodo da zaragatoa (objeto semelhante a um cotonete gigante) seguido por inoculao por incorporao.

Avaliao da qualidade do ar interior e de superfcies


Protocolo 2.1 - Amostragem do ar por sedimentao Os microrganismos presentes no ar sedimentam a taxas variadas dependendo do tipo/tamanho das partculas em suspenso e do movimento do ar da sala. A amostragem por sedimentao no determina diretamente o nmero de microrganismos presentes num dado volume de ar, mas possvel transformar os resultados deste mtodo (n de UFC/unidade de rea) em n de UFC/unidade de volume. Para isso, necessrio conhecer a rea da caixa de Petri exposta ao ar e a razo entre o nmero de clulas na superfcie e nmero de clulas no ar (SAR). A SAR para ambientes com sedimentao espontnea, i.e., sem aparelhos que forcem o ar, 23:1 (Morais et al., 2010). O nmero de UFC em cada metro cbico de ar calcula-se de acordo com a

a temperatura ptima 35C. Os microrganismos psicrfilos (que vivem a baixas temperaturas) tm temperatura mxima menor que 20C, a temperatura mnima pode ser menor que 0C e a temperatura ptima 5-10C. Os microrganismos termfilos vivem a temperaturas elevadas; temperatura mnima de 45C, temperatura mxima pode ultrapassar 80C e a temperatura ptima 55-65C.

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Equao 1

Equao 1. Clculo do nmero de UFC/m3 de ar pelo mtodo da amostragem por sedimentao.

(Friberg et al., 1999a; Friberg et al., 1999b):


Equao 1. Clculo do nmero de UFC/m3 de ar pelo mtodo da amostragem por sedimentao.

Para calcular a rea (A) de uma caixa de Petri, mede-se o seu dimetro (cm), divide-se por 2 para obter o raio (r) e aplica-se a Equao 2. Para transformar o resultado obtido (cm2) em m2, divide-se por 10 000 (1 m2 tem 10 000 cm2). Existem caixas de Petri de vrios tamanhos. As mais comuns tm dimetro de 8 cm, pelo que a sua rea aproximadamente 50 cm2 ou seja, 0.0050 m2.

Equao 2. Clculo da rea de um crculo.

Material
Caixas de Petri com meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar); caixas de Petri com meio de cultura PCA (Plate Count Agar).

Procedimento 1. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaborao; 2. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar; 3. Abrir as caixas ao ar no local desejado, tendo o cuidado de utilizar pelo menos duas repeties para cada um dos tipos de microrganismo; 4. Deixar em exposio durante 30 minutos; 5. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30C para as bactrias e 25C para os fungos); 6. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o nmero de UFC em cada caixa; 7. Calcular o nmero de UFC de fungos e de bactrias por m3 do ar da sala (
Equao 1)

Equao 1. Clculo do nmero de UFC/m3 de ar pelo mtodo da amostragem por sedimentao.

; 8. Comparar o resultado obtido com a legislao e concluir.

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Protocolo 2.2 - Amostragem do ar por filtrao A forma correta de aplicao deste mtodo consiste na utilizao de um amostrador que permite determinar com exatido o volume de ar filtrado. O mtodo aqui descrito pretende ultrapassar a limitao imposta pela no existncia de um amostrador, utilizando um aparelho de filtrao normalmente existente nos laboratrios no especializados. Material
Caixas de Petri com meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar); caixas de Petri com meio de cultura PCA (Plate Count Agar); filtros estreis de 0.45 m; aparelho de filtrao; bico de Bunsen; pinas.

Procedimento 1. Ligar a bomba de vcuo ao aparelho de filtrao, colocar uma membrana e cronometrar o tempo que o aparelho demora a filtrar um volume conhecido de gua. Utilizar este resultado para fazer uma estimativa do ar filtrado pelo aparelho durante um dado perodo de tempo; 2. Com uma pina estril, colocar uma membrana estril no aparelho de filtrao, ligar a bomba de vcuo e cronometrar o tempo necessrio para filtrar o volume de ar pretendido; 3. Desligar a bomba de vcuo e, em condies de assepsia, retirar o filtro com uma pina estril, colocar sobre o meio de cultura; 4. Em condies de assepsia e utilizando a pina estril, colocar o filtro sobre o meio de cultura na caixa de Petri; 5. Fazer pelo menos duas repeties para cada um dos tipos de microrganismo; 6. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30C para as bactrias e 25C para os fungos); 7. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o nmero de UFC em cada caixa; 8. Calcular o nmero de UFC de fungos e de bactrias por m3 do ar da sala; 9. Comparar o resultado obtido com a legislao e concluir. Protocolo 2.3 - Amostragem de superfcies pelo mtodo da zaragatoa Material
Caixas de Petri estreis; meio de cultura PCA mantido a 45C; zaragatoas estreis; tubos de ensaio com 10 mL de soluto de Ringer estril; pipetas estreis de 1 mL; bico de Bunsen.

Procedimento 1. Humedecer uma zaragatoa estril com gua destilada;

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2. Percorrer com a zaragatoa uma rea de tamanho conhecido, no mnimo 100 cm2 (por exemplo um quadrado de 10 cm 10 cm); 3. Em condies de assepsia, imergir a zaragatoa num tubo com 10 mL de soluto de Ringer, espremendo vrias vexes contra a parede interior do tubo; 4. Homogeneizar o contedo do tubo de ensaio e, em condies de assepsia, retirar 1 mL para uma caixa de Petri estril; 5. Deitar na caixa de Petri cerca de 15 mL de meio de cultura e homogeneizar (ver ConceitosProtocolo 1.5 - Sementeira por incorporao, pgina 15); 6. Esperar que solidifique, identificar a caixa de Petri, inverter e incubar a 30C durante 24-48 h; 7. Contar o nmero de UFC; 8. Comparar o resultado obtido com a legislao e concluir.

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Parte 3.Qualidade microbiolgica da gua


A gua um recurso essencial vida, indispensvel para a humanidade mas tambm para os outros organismos e para a manuteno das funes e da integridade dos ecossistemas (Mendes, 2010). A gua um elemento fundamental para o desenvolvimento sustentvel dos pases, pelo que a falta de gua ou a falta de gua com qualidade diminuem a qualidade de vida das populaes. Devido ao aumento da populao humana as necessidades de gua tm vindo a aumentar; no entanto, as atividades humanas direta ou indiretamente podem diminuir a qualidade da gua, tornando-a imprpria para determinados fins, ou seja, podem diminuir a quantidade de gua com qualidade para ser utilizada nalgumas atividades. Na Unio Europeia, a legislao regula a gesto das guas superficiais, designadamente as guas interiores, de transio e costeiras, e das guas subterrneas, de forma a: a) evitar a continuao da degradao e proteger e melhorar o estado dos ecossistemas aquticos e tambm dos ecossistemas terrestres e zonas hmidas diretamente dependentes dos ecossistemas aquticos, no que respeita s suas necessidades de gua; b) promover uma utilizao sustentvel de gua, baseada numa proteo a longo prazo dos recursos hdricos disponveis; c) obter uma proteco reforada e um melhoramento do ambiente aqutico, nomeadamente atravs de medidas especficas para a reduo gradual e a cessao ou eliminao por fases das descargas, das emisses e perdas de substncias prioritrias; d) assegurar a reduo gradual da poluio das guas subterrneas e evitar o agravamento da sua poluio; e) mitigar os efeitos das inundaes e das secas; f) assegurar o fornecimento em quantidade suficiente de gua de origem superficial e subterrnea de boa qualidade, conforme necessrio para uma utilizao sustentvel, equilibrada e equitativa da gua; g) proteger as guas marinhas, incluindo as territoriais; h) assegurar o cumprimento dos objetivos dos acordos internacionais pertinentes, incluindo os que se destinam preveno e eliminao da poluio no ambiente marinho (Lei n58/2005).

O conceito de qualidade da gua


O conceito de qualidade da gua relativo, j que depende do uso a que se destina ou do objetivo do seu utilizador. Assim, a qualidade da gua pode ser definida, para fins especficos, como o conjunto de caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas
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adequadas sua utilizao para determinado uso. Para cada uso da gua pois necessrio estabelecer as exigncias relativas sua qualidade, isto , definir parmetros de qualidade e estabelecer os seus valores-limite (Mendes, 2010). O Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto define quatro tipos principais de utilizao da gua: guas para consumo humano, guas para suporte de vida aqucola, guas balneares e guas de rega. As guas para consumo humano so guas doces que podem ter origem em guas superficiais, em guas subterrneas ou em guas de abastecimento. As guas para suporte de vida aqucola so guas superficiais, doces ou salobras, continentais ou litorais, destinadas produo de peixe (guas pisccolas) ou de bivalves (guas conqucolas). As guas balneares so guas doces lticas e lnticas, comummente designadas de correntes e paradas, assim como a gua do mar e as guas estuarinas, que se encontrem classificadas como guas balneares ou, no estando classificadas, onde o banho no esteja interdito e seja habitualmente praticado por um nmero considervel de banhistas (aproximadamente 100/dia, durante a poca balnear). A gua de rega gua superficial ou subterrnea ou gua residual, que vise satisfazer ou complementar as necessidades hdricas das culturas agrcolas ou florestais (artigo 3 do Decreto-Lei 236/98). Os limites paramtricos estabelecidos na legislao so principalmente desenvolvidos para a preveno da ocorrncia de surtos sanitrios, fornecendo uma informao limitada sobre a proteo do ambiente e da sade. Os limites paramtricos podem definir-se como (i) a concentrao de uma substncia ou organismo que no representa um perigo significativo para a sade de um nmero significativo de utilizadores; (ii) as condies nas quais a exposio a essa substncia ou organismo no so provveis, ou (iii) uma combinao de ambos (Mendes, 2010). Assim, so normalmente impostos na legislao dois limites paramtricos, o valor mximo recomendvel (VMR) e o valor mximo admissvel (VMA). O VMR o valor de norma de qualidade que no dever ser ultrapassado (Decreto-Lei 236/98) e garante a manuteno da sade do consumidor e a cobertura das suas necessidades alimentares. O VMA o valor da norma de qualidade que, de preferncia, deve ser respeitado ou no excedido (Decreto-Lei 236/98); ou seja, como nem sempre os valores obtidos so VMR, toma-se em conta o VMA, na perspetiva de que nesse intervalo de valores (VMR-VMA) no se verificaro riscos significativos para a sade dos consumidores.

Os conceitos de poluio e contaminao da gua


A poluio da gua pode ser definida como: (i) a inadequao da sua aplicabilidade para algum objetivo considerado, (ii) qualquer modificao natural ou artificial que direta ou indiretamente modifique, altere ou destrua o equilbrio dos ecossistemas e

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dos recursos naturais de tal modo que traga perigo para a sade pblica, diminua a sua adequabilidade ou eficincia e o bem-estar do Homem e das suas comunidades, ou (iii) a alterao da composio ou do estado da gua de tal forma que se torne menos adequada para todas ou algumas das funes e fins a que pode ser adequada no seu estado natural. O conceito de contaminao definido como a introduo ou descarga na gua de organismos patognicos ou de substncias txicas que a tornem imprpria para consumo pblico e/ou usos domsticos, ou seja, a contaminao pode ser considerada um aspecto especfico da poluio.

Microrganismos e qualidade da gua


Os microrganismos como poluentes Os poluentes podem ser inorgnicos, organismos e biolgicos, incluindo-se os microrganismos neste ltimo grupo. Os perigos mais significativos da poluio biolgica por microrganismos devem-se contaminao das guas por resduos fecais ou urinrios, provenientes do metabolismo dos animais homeotrmicos7. Embora muitos microrganismos associados a este tipo de resduos sejam inofensivos para pessoas saudveis, alguns so agentes patognicos8. Quando existe contaminao da gua por fezes, as bactrias de origem fecal (associadas s fezes) so uma causa potencial de vrias doenas que podem ocorrer sob a forma epidmica doena que afeta simultaneamente muitos indivduos, por contgio ou sob a forma endmica doena que se verifica permanentemente numa dada regio. Para alm das bactrias fecais, outros microrganismos presentes na gua vrus, helmintas, protozorios, podem representar perigos para as

Animais homeotrmicos (tambm chamados animais de sangue quente) so aqueles que mantm a sua temperatura corporal constante, independentemente da temperatura ambiente (e.g., mamferos e aves). Pelo contrrio, os animais poiquilotrmicos (tambm designados por animais de sangue frio) no conseguem manter a temperatura corporal constante e aquecem ou arrefecem com as alteraes da temperatura ambiente (e.g., rpteis e anfbios). Agentes patognicos so organismos capazes de causar doenas infecciosas nos seus hospedeiros.

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populaes humanas, mas no fazem em geral parte da anlise sistemtica includa nas normas legais da maioria dos pases no tropicais. Microrganismos como indicadores de poluio O nmero de microrganismos presentes nos materiais fecais muito elevado, cerca de 109 (i.e., 10 000 000 000) de cada um dos grupos pesquisados por cada grama de material fecal, dos quais apenas alguns so patognicos (Mendes, 2010). Ou seja, juntamente com os microrganismos patognicos so libertados microrganismos no patognicos ou de patogenia limitada, pelo que a presena ou ausncia desses microrganismos numa amostra indica se a gua em questo foi ou no contaminada por fezes, isto , se apresenta o perigo de conter microrganismos fecais patognicos. Os microrganismos no patognicos ou de patogenia limitada so indicadores de contaminao fecal e so utilizados para monitorizar as guas para a contaminao por fezes (Mendes, 2010). A escolha dos indicadores de qualidade microbiolgica da gua obedece a vrios critrios (Mendes, 2010): 1. A concentrao do microrganismo indicador na gua contaminada deve ter uma relao direta com o grau de contaminao; 2. O microrganismo indicador deve ser suficientemente conhecido, de forma a permitir a atribuio de valores-limite; 3. A anlise do microrganismo indicador deve ter uma metodologia padronizada e especfica para o microrganismo em causa (i.e., a presena de outros microrganismos no deve gerar resultados positivos) e suficientemente sensvel para detetar nveis baixos do indicador; 4. A anlise do microrganismo indicador deve ser rpida, inequvoca e de baixo custo; 5. O microrganismo indicador deve estar presente sempre que microrganismos fecais patognicos estejam tambm presentes, e em quantidade superior aos patognicos; 6. O microrganismo indicador deve ser mais resistente aos agentes desinfetantes que os microrganismos patognicos (i.e., deve sobreviver mais tempo); 7. O microrganismo indicador no deve reproduzir-se na gua (para no causar sobre estimativas da poluio) 8. O microrganismo indicador deve distribuir-se de forma aleatria na massa de gua; 9. O microrganismo indicador deve ser propcio para a anlise de todos os tipos de gua: torneira, rios, subterrnea, barragens, esturios, oceanos, guas residuais (i.e., deve ser capaz de sobreviver nos vrios tipos de gua); 10. O microrganismo indicador deve ser inofensivo para o ser humano.

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Os indicadores clssicos de contaminao fecal so (i) o grupo dos coliformes fecais e no fecais, (ii) o grupo dos enterococos fecais, (iii) Clostridium perfringens; e (iv) o nmero de UFC a 22C e a 37C. O grupo dos coliformes constitudo por bactrias da famlia Enterobacteriaceae, habitantes do aparelho intestinal do homem e de outros animais homeotrmicos. So bactrias Gram-negativas, em forma de bacilo e anaerbias facultativas. Algumas so oxidase-positivas e crescem em condies aerbias em meio de cultura seletivo contendo sais biliares; outras so capazes de fermentar lactose a 37C com libertao de gs e de cido e outras so capazes de fazer a fermentao a 44.5C. A fermentao da lactose a 44.5C permite distinguir os coliformes no fecais (37C) dos coliformes fecais (44.5C). Nos coliformes fecais inclui-se, por exemplo, a bactria Escherichia coli (Mendes, 2010). Os enterococos fecais so caracterizados pela capacidade de crescerem entre 10 e 45C, a pH 9.6, em meio de cultura contendo 6.5% de cloreto de sdio (NaCl), na presena de 40% de sais biliares e em concentraes de azida inibidoras do crescimento dos coliformes. So bactrias Gram-positivas que reduzem azul-demetileno em 0.1% de leite e conseguem sobreviver a 60C durante 30 minutos. Nos enterococos fecais inclui-se, por exemplo, Enterococcus faecalis (Mendes, 2010). Clostridium perfringens uma bactria anaerbia, esporulada, redutora de sulfito, Gram-positiva, em forma de bacilo, habitante do intestino do homem e de outros animais homeotrmicos. Esta bactria tem interesse como indicador de poluio fecal antiga, devido ao seu longo tempo de permanncia na gua e grande capacidade de sobrevivncia dos seus esporos (Mendes, 2010). O nmero de UFC a 22C e a 37C no um indicador especfico de poluio fecal mas sim de enriquecimento por matria orgnica facilmente degradvel. As contagens de colnias so teis para a avaliao do estado da gua e dos processos de tratamento utilizados, por exemplo, nas estaes de tratamento de guas residuais (ETAR). O principal interesse da contagem de colnias reside na possibilidade de detetar as alteraes em relao ao histrico, baseando-se num controlo frequente e a longo prazo. A ocorrncia de um aumento repentino do nmero de UFC pode significar que existe um foco de poluio. Devido ao aprofundamento dos estudos microbiolgicos, atualmente utilizamse, em substituio ou em adio aos indicadores clssicos, outros microrganismos, chamados novos indicadores. A bactria Escherichia coli substituiu, na legislao atual, os coliformes fecais como indicadores de contaminao fecal. Esta bactria apresenta uma grande diversidade de adaptaes ao meio, podendo causar vrias doenas que originam diarreias (Mendes, 2010).

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A bactria Pseudomonas aeruginosa outro dos chamados novos indicadores. No um habitante especfico do intestino mas aparece em 12% da populao. uma bactria oportunista, aerbia, Gram-negativa, patognica e com elevada resistncia a antibiticos (Mendes, 2010). Existem outros microrganismos presentes na gua que podem representar perigo para as populaes humanas, como os vermes helmintas, alguns protozorios (e.g., Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba, Acanthamoeba,) e vrus, mas a legislao atual no prev a sua anlise de rotina (Mendes, 2010). gua destinada ao consumo humano Legislao aplicvel

Decreto-Lei 306/2007, de 27 de Agosto | http://dre.pt/pdf1sdip/2007/08/16400/0574705765.pdf

Estabelece o regime da qualidade da gua destinada ao consumo humano, procedendo reviso do Decreto-Lei 243/2001, de 5 de Setembro, que transps para o ordenamento jurdico interno a Directiva 98/83/CE, do Conselho, de 3 de Novembro, tendo por objetivo proteger a sade humana dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminao dessa gua e assegurar a disponibilizao tendencialmente universal de gua salubre, limpa e desejavelmente equilibrada na sua composio. Define como gua destinada ao consumo humano: (i) Toda a gua no seu estado original, ou aps tratamento, destinada a ser bebida, a cozinhar, preparao de alimentos, higiene pessoal ou a outros fins domsticos, independentemente da sua origem e de ser fornecida a partir de uma rede de distribuio, de um camio ou naviocisterna, em garrafas ou outros recipientes, com ou sem fins comerciais; Toda a gua utilizada numa empresa da indstria alimentar para fabrico, transformao, conservao ou comercializao de produtos ou substncias destinados ao consumo humano, assim como a utilizada na limpeza de superfcies, objetos e materiais que podem estar em contacto com os alimentos, exceto quando a utilizao dessa gua no afeta a salubridade do gnero alimentcio na sua forma acabada.

(ii)

Define os mtodos de controlo da qualidade da gua, estabelecendo a localizao dos pontos de amostragem, as frequncias mnimas de amostragem (variveis consoante o volume de gua fornecida; Anexo II do Decreto-Lei 306/2007), estabelecendo um controlo de rotina e um controlo de inspeo da qualidade da gua.

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Localizao dos pontos de amostragem

A localizao dos pontos de amostragem depende da provenincia da gua (artigo 10, nmero 2): No caso da gua fornecida a partir de uma rede de distribuio, no ponto em que, no interior de uma instalao ou estabelecimento, sai das torneiras normalmente utilizadas para consumo humano; No caso da gua fornecida a partir de fontanrios no ligados rede de distribuio, no ponto de utilizao; No caso da gua fornecida por entidades gestoras em alta, nos pontos de amostragem dos pontos de entrega aos respetivos utilizadores; No caso da gua fornecida a partir de camies, navios--cisterna e reservatrios no ligados rede de distribuio, no ponto de utilizao; No caso da gua destinada venda em garrafas e outros recipientes, com ou sem fins comerciais, no fim da linha de enchimento; No caso da gua utilizada numa empresa da indstria alimentar, no ponto de utilizao.

Qualidade microbiolgica: valores paramtricos

Os valores paramtricos e os parmetros microbiolgicos que a gua destinada ao consumo humano deve respeitar so divididos em duas partes, uma relativa gua fornecida por redes de distribuio, fontanrios, camies ou navios-cisterna, reservatrios e utilizada na indstria alimentar (Tabela 3) e outra relativa gua colocada venda em garrafas ou noutros recipientes (Tabela 4).
Tabela 3. Parmetros microbiolgicos e valores paramtricos para a gua fornecida por redes de distribuio, fontanrios, camies ou navios-cisterna, reservatrios e gua utilizada na indstria alimentar (Decreto-Lei 306/2007, anexo I, parte I).

Parmetro Escherichia coli (E. coli) Enterococos

Valor paramtrico 0 0

Unidade Nmero/100 mL Nmero/100 mL

Tabela 4. Parmetros microbiolgicos e valores paramtricos para a gua colocada venda em garrafas ou outros recipientes (Decreto-Lei 306/2007, anexo I, parte I).

Parmetro Escherichia coli (E. coli) Enterococos Pseudomonas aeruginosa N UFC a 22C N UFC a 37C

Valor paramtrico 0 0 0 100 20

Unidade Nmero/250 mL Nmero/250 mL Nmero/250 mL Nmero/mL Nmero/mL

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Controlo da qualidade

Os parmetros microbiolgicos a analisar nos controlos de rotina so os constantes da Tabela 5. No controlo de inspeco devem ser analisados os parmetros constantes da Tabela 3 ou Tabela 4, consoante a provenincia da gua.
Tabela 5. Parmetros microbiolgicos a analisar nos controlos de rotina (Decreto-Lei 306/2007, anexo II).

Controlo de rotina 1 Bactrias coliformes Escherichia coli (E. coli)

Controlo de rotina 2 Clostridium perfringens, incluindo esporos Nmero de colnias a 22C Nmero de colnias a 37C Pseudomonas aeruginosa

Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 306/2007)


Bactrias coliformes e Escherichia coli (E. coli): norma ISO 9308-1

Filtrao por membrana, em duplicado, seguida de incubao em meio TTC Chapman agar durante 213 horas a 362C (coliformes) e 444C (E. coli). As colnias que crescem a 36C so consideradas coliformes fecais e as colnias que crescem a 44C so consideradas E. coli. Aps a incubao, as colnias de vrias espcies diferentes apresentam diferentes caractersticas: E. coli e Citrobacter spp. apresentam colnias amarelas com centro laranja; Enterobacter spp. forma colnias vermelhas ou amarelo-escuro com o centro laranja e o meio de cultura amarelo; Klebsiella spp. forma colnias vermelhas ou amarelas, sem colorao diferenciada no centro e o meio de cultura amarelo; As bactrias que no fermentam lactose formam colnias prpuras e alteram a cor do meio de cultura para azul.

Enterococos: norma ISO 7899-2

Filtrao por membrana, em duplicado, seguida de incubao em meio de blis azida agar durante 213 horas a 352C. As colnias de enterococos aparecem rodeadas de uma cor castanha. Transferncia dos filtros com as colnias, sem inverter, para uma caixa de Petri com meio agar de blis azida pr-aquecido a 44C e incubao a 440.5C durante 2 horas para confirmao imediata. As colnias que apresentem meio com colorao castanha-negra em seu redor so confirmadas como enterococos.
Pseudomonas aeruginosa: norma EN ISO 12780

Filtrao por membrana, em duplicado, seguida de incubao em meio CN agar durante 24-48 horas. Contagem de todas as colnias que apresentem cor azulesverdeada como sendo Pseudomonas aeruginosa. Exame das membranas sob radiao ultravioleta e contagem de todas as colnias que no sejam azul-esverdeadas

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mas que emitam fluorescncia como possveis P. aeruginosa. Contagem de todas as colnias avermelhadas que no emitam fluorescncia como possveis P. aeruginosa. Para confirmao, repicagem das colnias que necessitam de confirmao para meio agar nutritivo durante 222 horas a 362C. Teste da oxidase a todas as colnias que eram inicialmente avermelhadas. Repicagem das colnias com reao oxidasepositiva para meio B King agar durante 213 horas (mas o perodo de incubao pode prolongar-se por um mximo de 5 dias) a 362C. O crescimento das colnias observado diariamente sob radiao ultravioleta (UV). A presena de colnias de Pseudomonas aeruginosa revela-se, sob a radiao UV, pela emisso de fluorescncia.
Enumerao de microrganismos viveis nmero de UFC a 22C e a 37C: norma EN ISO 6222

Diluies decimais seguidas de inoculao por incorporao, de caixas de Petri, em quadruplicado, com meio de extrato de levedura agar. Incubao de duas caixas a 2022C durante 3 dias e das outras duas a 37C durante 44 horas. Contagem de UFC.
Clostridium perfringens (incluindo esporos)

Filtrao em membrana, em duplicado, seguida de incubao anaerbia da membrana em m-CP agar a 44C 1C durante 21 3 horas. Contagem das colnias amarelas opacas que passam a rosa ou vermelho aps exposio, durante vinte a trinta segundos, a vapores de hidrxido de amnio. guas para produo de gua para consumo humano, para suporte de vida aqucola e guas de rega Legislao aplicvel

Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto | http://dre.pt/pdf1sdip/1998/08/176A00/36763722.pdf

Estabelece normas, critrios e objetivos de qualidade com a finalidade de proteger o meio aqutico e melhorar a qualidade das guas em funo dos seus principais usos: utilizao da gua para consumo humano, para suporte de vida aqucola, para efeitos balneares (que passou a ser regulamentada pelo Decreto-Lei 135/2009, de 3 de Junho) e para rega. No que respeita utilizao da gua para consumo humano, consideram-se trs tipos: (i) guas doces superficiais destinadas produo de gua para consumo humano; (ii) guas subterrneas destinadas produo de gua para consumo

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humano e (iii) guas de abastecimento para consumo humano (que passaram a ser regulamentadas pelo Decreto-Lei 306/2007). guas doces superficiais e subterrneas destinadas produo de gua para consumo humano As guas superficiais destinadas produo de gua para consumo humano so classificadas nas categorias A1, A2 e A3, de acordo com as normas de qualidade fixadas no anexo I do Decreto-Lei 236/98 (Tabela 6), a que correspondem esquemas de tratamento tipo distintos, definidos no anexo II do mesmo Decreto-Lei, para as tornar aptas para consumo humano: classe A1 - tratamento fsico e desinfeo, classe A2 - tratamento fsico e qumico e desinfeo, classe A3 - tratamento fsico, qumico de afinao e desinfeo.
Tabela 6. Parmetros microbiolgicos e valores mximos recomendveis para as guas doces superficiais destinadas produo de gua para consumo humano (Decreto-Lei 236/98, anexo I).

Parmetro9 Coliformes totais Coliformes fecais Estreptococos fecais Salmonelas

Unidade Nmero/100 mL Nmero/100 mL Nmero/100 mL

Valor mximo recomendvel A1* A2 50 5000 20 2000 20 1000 0 / 5000 mL 0 / 1000 mL

A3 50000 20000 10000 -

* Categoria tambm aplicvel qualidade das guas subterrneas utilizveis para produo de gua para consumo humano.

Consideram-se aptas para poderem ser utilizadas como origem de gua para a produo de gua para consumo humano as guas subterrneas que apresentem qualidade superior ou igual da categoria A1 (Tabela 6) das guas doces superficiais destinadas produo de gua para consumo humano, correspondendo-lhes o esquema de tratamento indicado no anexo II do Decreto-Lei 236/98 para aquela categoria de guas, com as devidas adaptaes.

Na legislao mais recente relativa qualidade microbiolgica de outros tipos de guas, os estreptococos fecais foram substitudos pelos enterococos um subgrupo mais resistente s condies do meio, nomeadamente a salinidade, os coliformes fecais foram substitudos por Escherichia coli e os coliformes totais deixaram de ser considerados indicadores especficos de poluio fecal e apenas so considerados indicadores de poluio. No entanto, a avaliao da qualidade microbiolgica deste tipo de guas continua a ser ainda regulada pelo Decreto-Lei 236/98.

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guas para suporte de vida aqucola Do conjunto de guas para suporte de vida aqucola (guas doces superficiais lticas e lnticas - pisccolas; guas do litoral e salobras - conqucolas e pisccolas), apenas esto definidas normas de qualidade microbiolgica para as guas do litoral e salobras com fins conqucolas (Tabela 7), controlo a exercer de no mnimo de trs em trs meses, no na gua mas no corpo do molusco. As normas de qualidade das guas do litoral e salobras para fins aqucolas guas conqucolas tm por finalidade proteger e melhorar a qualidade dessas guas a fim de permitir a vida e o crescimento de moluscos (bivalves e gastrpodes), equinodermes, tunicados e crustceos, contribuindo para a boa qualidade dos produtos conqucolas passveis de consumo pelo homem.
Tabela 7. Parmetros microbiolgicos e valores mximos recomendveis para o corpo dos moluscos e para o lquido intervalar (Decreto-Lei 236/98, anexo II).

Parmetro Coliformes fecais

Unidade Nmero/100 mL

VMR 300

guas de rega Os critrios e normas de qualidade das guas de rega visam proteger a sade pblica, a qualidade das guas superficiais e subterrneas, as culturas que podem ser afetadas pela m qualidade das guas de rega e os solos cuja aptido para a agricultura pode ser degradada pelo uso sistemtico de guas de rega de m qualidade. Nas guas de rega, os parmetros microbiolgicos a considerar so os indicados na Tabela 8.
Tabela 8. Parmetros microbiolgicos e valores mximos recomendveis para a gua de rega (Decreto-Lei 236/98, anexo XVI).

Parmetro Coliformes fecais Ovos de parasitas intestinais

Unidade Nmero/100 mL Nmero/L

VMR 100 -

VMA 1

Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 236/98)


Coliformes totais, coliformes fecais e estreptococos fecais

Podem usar-se dois mtodos analticos: filtrao por membrana ou inoculao de tubos mltiplos. A temperatura de incubao 37C 1C para os coliformes totais e para os estreptococos fecais e 44.5C 0.5C para os coliformes fecais. Na filtrao por membrana, a inoculao feita em meio slido especfico adequado para o efeito e contagem das colnias (UFC). As amostras devem ser diludas ou, quando apropriado, concentradas a fim de que o nmero de colnias fique compreendido entre 10 e 100.

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Na inoculao de tubos mltiplos, para os coliformes totais e fecais utiliza-se o mtodo de diluio com fermentao em substratos lquidos em pelo menos trs tubos em 3 diluies, com subcultura dos tubos positivos em meios de confirmao e contagem em nmero mais provvel (NMP). Para os estreptococos fecais, utiliza-se o mtodo de diluio em caldo de azoteto de sdio em pelo menos trs tubos para cada uma das trs diluies e contagem em NMP.
Salmonelas

O mtodo geral consiste na concentrao por filtrao (atravs de membrana ou filtro apropriado) seguida de sementeira em meio de pr-enriquecimento, enriquecimento, subcultura em meio de isolamento e identificao.
Ovos de parasitas intestinais

Observao e contagem ao microscpio. guas balneares Legislao aplicvel

Decreto-Lei 135/2009, de 3 de Junho | http://dre.pt/pdf1sdip/2009/06/10700/0346003468.pdf

Estabelece o regime jurdico de identificao, gesto, monitorizao e classificao da qualidade das guas balneares e de prestao de informao ao pblico sobre as mesmas, transpondo para a ordem jurdica interna a Directiva n. 2006/7/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Fevereiro, relativa gesto da qualidade das guas balneares, e complementando a Lei da gua, aprovada pela Lei 58/2005, de 29 de Dezembro. Define como guas balneares as guas superficiais, quer sejam interiores, costeiras ou de transio, tal como definidas na Lei da gua, aprovada pela Lei n. 58/2005, de 29 de Dezembro, em que se preveja que um grande nmero de pessoas se banhe e onde a prtica balnear no tenha sido interdita ou desaconselhada de modo permanente. A monitorizao das guas balneares deve ser efetuada no prazo mximo de quatro dias a contar da data indicada no calendrio de amostragem, o qual estabelecido pelo INAG para cada poca balnear, antes do seu incio. O ponto de amostragem estabelecido no local onde: (i) se preveja maior afluncia de banhistas; ou (ii) de acordo com o perfil das guas balneares, onde exista maior risco de poluio, entendida como a presena de contaminao microbiolgica ou outros organismos ou resduos que afetem a qualidade das guas balneares e constituam um

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risco para a sade dos banhistas. A monitorizao deve ser efetuada com a frequncia especificada no anexo II do Decreto-Lei 135/2009, sendo os resultados dessa monitorizao utilizados na constituio dos conjuntos de dados sobre a qualidade das guas balneares. Os parmetros microbiolgicos a avaliar na avaliao da qualidade das guas balneares so os mesmos para as guas interiores (Tabela 9.) e para as guas costeiras e de transio (Tabela 10), mas os valores diferem entre os dois tipos de gua.
Tabela 9. Valores paramtricos microbiolgicos a observar na avaliao da qualidade das guas balneares interiores (Decreto-Lei 135/2009, anexo I).

Parmetro Enterococos intestinais Escherichia coli

Unidade Nmero/100 mL Nmero/100 mL

Qualidade Excelente Boa Aceitvel 200 330 400 500 900 1000

NOTA: No Decreto-Lei 135/2009, os valores da coluna Qualidade Boa e Qualidade aceitvel esto trocados Tabela 10. Valores paramtricos microbiolgicos a observar na avaliao da qualidade das guas balneares costeiras e de transio (Decreto-Lei 135/2009, anexo I).

Parmetro Enterococos intestinais Escherichia coli

Unidade Nmero/100 mL Nmero/100 mL

Qualidade Excelente Boa Aceitvel 100 185 200 250 500 500

NOTA: No Decreto-Lei 135/2009, os valores da coluna Qualidade Boa e Qualidade aceitvel esto trocados

Ponto de amostragem, recolha e conservao das amostras As amostras devero ser recolhidas 30 cm abaixo da superfcie das guas e onde a sua profundidade seja no mnimo de 1 m. Os frascos a utilizar devem ser de material transparente e incolor (vidro, polietileno ou polipropileno), com capacidade mnima de 250 mL e devem encontrar-se estreis. As amostras devem ser claramente identificadas com tinta indelvel na amostra e no formulrio relativo amostra. As amostras de gua devem, em todas as fases do transporte, ser protegidas da exposio luz, em especial luz directa do sol e conservadas a uma temperatura de cerca de 4C at sua anlise. Se for provvel que o transporte para o laboratrio demore mais de quatro horas, obrigatrio o transporte em frigorfico. O perodo de tempo decorrido entre a recolha da amostra e a realizao da anlise deve ser o mais curto possvel, sempre que possvel no mesmo dia e no prazo mximo de vinte e quatro horas.

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Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 135/2009)


Enterococos intestinais: normas ISO 7899-1 ou ISO 7899-2

Consultar a seco relativa anlise das guas destinadas ao consumo humano, para as quais referido o mesmo mtodo.
Escherichia coli: normas ISO 9308-3 ou ISO 9308-1

Consultar a seco relativa anlise das guas destinadas ao consumo humano, para as quais referido o mesmo mtodo.

Avaliao da qualidade das guas


Protocolo 3.1 - Recolha de amostras de gua Norma: EN 25667-2 | ISO 5667-2:1991 As mos e a roupa dos intervenientes na colheita devem estar limpas. Os recipientes para colheita das amostras de gua devem ser de material transparente e incolor (vidro, polietileno ou polipropileno) e estar esterilizados mediante: esterilizao em autoclave (mnimo de quinze minutos a 121C), esterilizao a seco (mnimo uma hora a 160C - 170C) ou ser constitudos por recipientes irradiados recebidos diretamente do fabricante. As amostras devem ser claramente identificadas com tinta indelvel no recipiente e no formulrio relativo amostra. A amostra de gua deve ser colhida obedecendo aos cuidados de assepsia, deve ser representativa das caractersticas microbiolgicas do material a analisar e deve ter volume suficiente para permitir, se necessrio, a repetio dos testes. O recipiente para a colheita da amostra deve permanecer fechado at ao momento da colheita; nessa altura enche-se sem enxaguar com a gua a analisar e fecha-se imediatamente, tendo cuidado para no contaminar durante estas operaes as superfcies interiores da rolha ou tampa. O frasco no deve ficar completamente cheio, pois algum espao vazio no seu interior facilitar a agitao e mistura da amostra antes de se efectuarem as anlises. Aps a colheita, as amostras de gua devem, em todas as fases do transporte, ser protegidas da exposio luz, em especial luz direta do sol e devem ser mantidas a uma temperatura de cerca de 4C at ao seu processamento. Material para uma amostra
Frasco estril com tampa, com capacidade suficiente para recolher a gua necessria anlise de todos os parmetros a analisar.

Recolha de amostras de gua de uma torneira 1. Lavar e desinfetar as mos (ou usar luvas estreis);

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2. Retirar qualquer filtro e deixar correr o tempo necessrio (1-2 minutos) para esgotar a gua que tenha estado parada na canalizao; 3. Fechar a torneira e desinfetar o interior e o exterior com lcool; 4. Abrir a torneira com cuidado e deixar a gua correr um pouco; 5. Abrir o frasco esterilizado s neste momento e colher a gua mantendo-o inclinado para evitar a sua contaminao pelo ar. Manter a rolha na mo esquerda virada para baixo e nunca tocar no interior da rolha ou no gargalo do frasco; 6. Recolher a amostra de gua mantendo o frasco inclinado para evitar a sua contaminao pelo ar e sem encher completamente o frasco; 7. Fechar imediatamente o frasco; 8. Identificar a amostra; 9. Transportar as amostras em caixa isotrmica com placas acumuladoras trmicas congeladas (4C) e realizar a anlise nas 4 horas seguintes colheita. Recolha de amostras de gua de um curso de gua, de um reservatrio ou de uma praia 1. Lavar e desinfetar as mos (ou usar luvas estreis); 2. Segurar o frasco numa zona perto da sua base e mergulh-lo na massa de gua com a boca virada para baixo. Deve mergulhar-se at cerca de metade da altura da coluna lquida ou pelo menos at cerca de 20 cm abaixo da superfcie da gua; 3. Virar o frasco at que o gargalo aponte ligeiramente para a superfcie e a boca esteja voltada contra a corrente. Se no existir qualquer corrente (por exemplo, no caso de um reservatrio) empurrar o frasco horizontalmente; 4. Recolher a amostra e fechar imediatamente o frasco; 5. Seguir os passos 8-9 indicados para a gua recolhida de uma torneira.

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Protocolo 3.2 Enumerao de microrganismos cultivveis: contagem de colnias por sementeira em meio extrato de levedura agar Norma: EN ISO 6222 | ISO 6222:1999 Consiste na enumerao de microrganismos cultivveis10, por contagem de UFC em meio extrato de levedura agar aps incubao aerbia a 22 e a 36C, em guas destinadas ao consumo humano. Faz-se a inoculao de um volume conhecido de amostra ou suas diluies, por homogeneizao com um meio de cultura especfico em caixas de Petri, com incubao de um conjunto a 36C durante 44 horas e de outro conjunto a 22C durante 68 horas. No final contam-se as colnias das caixas contveis e faz-se o clculo do nmero de UFC por mililitro da amostra. Material para uma amostra
Meio agar extrato de levedura material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) 4 caixas de Petri estreis pipetas estreis de 1 mL estufa a 22C estufa a 37C.

Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura agar extracto de levedura


Composio do meio agar extracto de levedura: Triptona 6.0 g/L Extracto de levedura 3.0 g/L Agar 15.0 g/L gua destilada pH 7.20.2 a 25C

1.

Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12);

2. Esterilizar em autoclave em tubos de 15-20 mL (volume para uma caixa de Petri); 3. Conservar no frigorfico at utilizao. Segundo tempo: recolha, diluio, sementeira e incubao das amostras 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 2. Fundir o meio de cultura no autoclave ou no micro-ondas, deixar arrefecer e manter a 451C num banho de gua;

10

Todas as bactrias aerbias, leveduras e bolores capazes de formar colnias no meio especificado e nas condies de ensaio.

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3. Se necessrio (isto , se o tipo de gua fizer prever um grande contedo microbiano que provoque a coalescncia das colnias), fazer diluies decimais sucessivas da amostra (Protocolo 1.4, pgina 14); 4. Incorporar um inculo de 1 mL (da amostra ou das suas diluies) em 15-20 mL do meio de cultura fundido (Protocolo 1.5, pgina 15); 5. Inocular no mnimo duas caixas de Petri por cada temperatura de incubao; 6. Deixar solidificar, inverter e incubar um conjunto a 372C durante 444 h e o outro conjunto a 222C durante 684 h. Terceiro tempo: contagem das colnias 1. Observar as caixas assim que terminar o tempo de incubao ou armazen-las a 53C e fazer a observao num perodo de 48h; 2. Contar as colnias observadas em cada caixa (com um nmero contvel de colnias) e calcular o nmero de UFC presentes num mililitro da amostra para cada temperatura de incubao (Protocolo 1.8, pgina 17); 3. Se no existirem colnias nas caixas inoculadas com a amostra no diluda, exprimir os resultados como no detetados num mL; 4. Se existirem mais de 300 colnias nas caixas inoculadas com a diluio maia alta utilizada, exprimir os resultados como> 300. 5. O relatrio deve incluir a referncia norma de referncia, todos os detalhes necessrios para a completa identificao da amostra, a tcnica e o meio de cultura utilizados, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados do ensaio e qualquer ocorrncia observado no decurso da anlise e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao. Protocolo 3.3 - Deteo e enumerao de Escherichia coli e de bactrias coliformes pelo mtodo da filtrao por membrana Norma: EN ISO 9308-1 | ISO 9308-1:2000 Consiste na deteo e na enumerao de Escherichia coli, que normalmente habita o intestino do homem e de outros animais homeotrmicos, indicando a contaminao fecal da gua, e de outros coliformes. A presena de coliformes, embora no prove de forma conclusiva a contaminao fecal da gua visto que algumas destas bactrias no de origem intestinal, vivendo no solo e em guas superficiais pode indicar falhas no tratamento e na distribuio da gua destinada ao consumo humano. O mtodo est dividido em duas partes, um ensaio standard de referncia (que permite enumerar separadamente E. coli e outras bactrias coliformes) e um ensaio rpido opcional (que permite enumerar E. coli), que podem ser efetuados em paralelo. Neste protocolo apenas abordaremos o ensaio standard de referncia.

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Material para uma amostra


Material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) aparelho de filtrao e bomba de vcuo 2 filtros de 45 m meio agar de lactose TTT com heptadecilsulfato de sdio (2 caixas de Petri) meio caldo de triptofano (10 tubos de ensaio) meio agar triptonado de soja (10 caixas de Petri) ansa soluo de tetrametil-p-fenilendiamina papel de filtro reagente de Kovacs estufa a 37C estufa a 44C.

Primeiro tempo: elaborao dos meios de cultura agar de lactose TTT com heptadecilsulfato de sdio, caldo de triptofano e agar triptonado de soja (TSA)
Composio do meio de base agar de lactose : Lactose: 20 g/L Peptona: 10 g/L Extracto de levedura: 6 g/L Extracto de carne: 5 g/L , Azul de bromotimol: 0.05 g/L Agar: 15-25 g/L gua destilada pH 7.20.2 a 25C

1.

Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH a pH 7.20.2 a 25C ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12);
Composio da soluo TTT: cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTT) 0.05 g/100 mL gua destilada

2. Dissolver 0.05 g de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTT) num pequeno volume de gua, perfazer at 100 mL, esterilizar por filtrao (0.2 m);
Composio da soluo heptadecilsulfato de sdio: heptadecilsulfato de sdio (Tergitol 7) 0.2 g/100 mL gua destilada

3. Dissolver 0.2 g de heptadecilsulfato de sdio (Tergitol 7) num pequeno volume de gua, perfazer at 100 mL, esterilizar em autoclave; 4. Fundir o meio de base e esperar que arrefea at 50C; 5. Adicionar a 100 mL de meio de base, 5 mL da soluo TTT e 5 mL da soluo de heptadecilsulfato de sdio; 6. Misturar completamente evitando que se formem bolhas; 7. Repartir por caixas de Petri (camada de cerca de 5 mm, cerca de 15 mL/caixa); 8. Guardar no frio e no escuro e utilizar no prazo mximo de 10 dias.
Composio do caldo de triptofano: Digestato trptico de casena 10 g/L L-triptofano 1 g/L Cloreto de sdio 5 g/L gua destilada pH 7.50.1 a 25C

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9. Repartir em tubos de vidro (cerca de 10 mL em cada tubo) e esterilizar em autoclave; 10. Guardar no frio e no escuro e utilizar no prazo mximo de 10 dias.
Composio do meio agar triptonado de soja: Digestato trptico de casena 15 g/L Peptona de soja 5 g/L Cloreto de sdio 5 g/L Agar 15-25 g/L gua destilada pH 7.20.1 a 25C;

11. Dissolver, ajustar o pH e esterilizar; 12. Repartir por caixas de Petri (camada de cerca de 5 mm=cerca de 15 mL/caixa); 13. Guardar no frio e no escuro e utilizar no prazo mximo de 10 dias. Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 2. Filtrar 100 mL de gua (ou 250 mL no caso de guas engarrafadas) atravs do filtro de membrana (pelo menos dois filtros/amostra); 3. Colocar o filtro sobre a caixa de Petri com meio agar de lactose TTT com heptadecilsulfato de sdio; 4. Incubar a 362C durante 213 h. Terceiro tempo: exame e repicagem 1. Examinar a membrana e contar as colnias que apresentem uma cor amarela no meio por baixo da colnia (colnias lactose-positivas11); 2. Repicar todas essas colnias (ou no mnimo 10) para caixas com meio TSA e para tubos com caldo de triptofano; 3. Incubar o meio TSA a 362C durante 21 h2 h; 4. Incubar os tubos com caldo de triptofano a 440.5C durante 21 h3 h

11

Bactrias capazes de formar colnias em aerobiose a 362C num meio selectivo e diferencial com lactose, com produo de cido.
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Quarto tempo: diferenciao e contagem 1. Preparar o reagente do teste da oxidase, adicionando 0.1 mg de tetrametil-pfenilendiamina a 10 mL de gua destilada; 2. Efetuar o teste da oxidase nas colnias incubadas mo meio TSA: Colocar sobre um papel de filtro duas ou trs gotas do reagente da oxidase; Utilizando uma vareta de vidro ou de plstico, retirar uma parte da colnia e deposit-la sobre o papel de filtro molhado; Considerar que ocorreu uma reao positiva quando se desenvolve uma cor azul/violeta escuro em 30 segundos.

3. Efetuar o teste da produo da formao de indol nos tubos com caldo de triptofano: 3.1 Adicionar ao tubo 0.2 a 0.3 mL do reagente de Kovacs; 3.2 Considerar que ocorreu a formao do indol quando se desenvolve uma cor roxa-avermelhada na superfcie do meio. 4. Considerar todas as colnias com reao negativa ao teste da oxidase como bactrias coliformes; 5. Considerar todas as colnias com reaco negativa ao teste da oxidase e com produo de indol como E. coli. 6. O relatrio deve incluir a referncia norma, todos os detalhes necessrios para a completa identificao da amostra, a tcnica e o meio de cultura utilizados, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados do ensaio e qualquer ocorrncia observado no decurso da anlise e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao. Protocolo 3.4 - Deteo e enumerao de coliformes totais, coliformes fecais e Escherichia coli pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) O teste completo permite enumerar os coliformes totais e os coliformes fecais (mas no especificamente E. coli) para o que so necessrias trs fases: teste presuntivo, teste confirmativo e teste final. s No teste presuntivo (verificao da produo de gs) inoculam-se volumes apropriados da amostra em sries de tubos contendo meio de cultura apropriado, e a incubam-se a 370,5 C, durante 242 horas. Se findo esse perodo no tiver havido formao de gs em nenhum tubo, prolonga-se a incubao at s 483 horas. O meio de cultura inibe o crescimento dos microrganismos Gram-positivos e encoraja o crescimento dos microrganismos coliformes. Os coliformes usam o oxignio presente no meio e atravs da fermentao produzem cido e gs sob condies anaerbias. Se no existir produo de gs o resultado do teste negativo, estabelecendo-se que no existem coliformes na amostra. A formao de gs (resultado positivo) determina a
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presena de coliformes na amostra. O nmero de tubos positivos em cada diluio utilizado para calcular o NMP de microrganismos coliformes na amostra de gua. No teste confirmativo (confirmao dos resultados) todos os tubos positivos s 24 horas so repicados para um apropriado, incubados a 37C e lidos nas condies anteriormente descritas. A formao de gs confirma a presena de coliformes na amostra. Este teste confirma os resultados uma vez que a formao de gs no teste presuntivo pode ter sido devida atividade de microrganismos no coliformes, como por exemplo Clostridium perfringens, uma bactria Gram-positiva. No teste final (verificao da presena de coliformes fecais), repete-se o procedimento utilizado no teste confirmativo mas a incubao feita a 44.5C durante 24 a 48 horas. A formao de gs determina a presena de coliformes fecais na amostra. Se no existir formao de gs a 44.5C mas existir a 37C determina-se que existem coliformes mas que no so fecais. O NMP de coliformes fecais determinado com base no nmero de tubos positivos em cada diluio. Um teste adicional permite determinar se a presena ou ausncia de E. coli na amostra. Adiciona-se aos tubos inoculados para o teste final reagente de Kovacs (teste do indol). Uma reao positiva (formao de um anel cor-de-rosa) mostra a presena de E. coli. Uma reao negativa (formao de um anel da cor do meio) mostra que E. coli no faz parte da populao de coliformes fecais presentes na amostra. Material para uma amostra
Material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) meio caldo blis verde brilhante de concentrao dupla (5 tubos de ensaio) meio caldo blis verde brilhante de concentrao simples (25 tubos de ensaio, apenas para teste presuntivo e final) ; meio caldo peptonado (15 tubos de ensaio) 30 tubos Durham pipetas de 0.1 mL pipetas de 1 mL pipetas de 10 mL ansa estufa a 37C estufa a 44C reagente de Kovacs.

Primeiro tempo: elaborao dos meios de cultura caldo blis verde brilhante e caldo peptonado
Composio do caldo blis verde brilhante: Triptona 10 g/L Lactose 10 g/L Blis desidratada 20 g/L Verde brilhante 0.0133 g/L gua destilada pH 7.00.1 a 25C

1.

Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12) para preparar o meio de concentrao simples; 2. Preparar meio com dose dupla (isto , duas vezes a quantidade indicada na embalagem para a mesma quantidade de gua);

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3. Colocar tubos Durham invertidos12 dentro dos tubos de ensaio pequenos (meio de concentrao simples) e grandes (meio de concentrao dupla); 4. Distribuir 10 mL de meio em cada tubo de ensaio; 5. Esterilizar em autoclave e guardar no frio at sua utilizao.
Composio do caldo peptonado: Peptona 18 g/L Cloreto de sdio 5 g/L Extrato de carne 6 g/L gua destilada pH 7.20.1 a 25C

6. Para calcular a quantidade necessria de caldo peptonado, considerar que todos os tubos tero resultado positivo para coliformes, contando assim com 15 tubos por amostra e um volume de 10 mL de meio por tubo; 7. Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12); 8. Distribuir 10 mL de meio em cada tubo de ensaio; 9. Esterilizar em autoclave guardar no frio at sua utilizao. Segundo tempo: recolha das amostras e teste presuntivo 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 2. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante duplo com 10 mL da amostra; 3. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante simples com 1 mL da amostra; 4. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante simples com 0.1 mL da amostra; 5. Incubar a 370.5 C durante 242 horas ou 483 horas.

12

Os tubos Durham so semelhantes a pequenos tubos de ensaio; acumulam o gs produzido pelos coliformes permitindo assim a deteco da sua presena numa dada amostra de gua; a presena de gs nos tubos Durham um resultado positivo para coliformes.

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Terceiro tempo: verificao da existncia de coliformes e teste final 1. Verificar a produo de gs nos tubos, anotando o nmero de tubos positivos em cada conjunto de 5 tubos de cada diluio; 2. Usar esses algarismos para determinar o NMP de microrganismos coliformes na amostra (para evitar falsos positivos, porque a formao de gs no teste presuntivo pode ter sido devida atividade de microrganismos no coliformes, deveria ser feito o teste confirmativo, mas neste protocolo vamos saltar esse passo); 3. Repicar com uma ansa os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante (cor verde) e para novos tubos contendo meio peptonado (cor amarela); 4. Levar a incubar a 44.5C durante 24+24 horas Quarto tempo: verificao da existncia de coliformes fecais e de E. coli 1. Verificar a produo de gs nos tubos com meio verde brilhante, anotando o nmero de tubos positivos em cada diluio; 2. Usar esses algarismos para determinar o NMP de coliformes fecais na amostra; 3. Adicionar uma gota de reagente de Kovacs a cada um dos tubos com meio peptonado (cor amarela); 4. A formao de um anel cor-de-rosa um resultado positivo que indica a presena de E. coli na amostra; 5. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de microrganismos coliformes, coliformes fecais e E. coli na amostra e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise.

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Protocolo 3.5 Deteo e enumerao de enterococos intestinais pelo mtodo da filtrao por membrana Norma: EN ISO 7899-2 | ISO 7899-2:2000 Consiste na deteo e na enumerao de enterococos13 intestinais, nomeadamente Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans e E. hirae. Eventualmente tambm se podero enumerar outras espcies de enterococos e algumas espcies de estreptococos, em particular Streptococcus bovis e S. equinus. Os enterococos podem considerar-se como indicadores de contaminao fecal, embora alguns possam ter outras provenincias. A enumerao dos enterococos intestinais baseia-se na filtrao de um volume conhecido de amostra, colocando-se o filtro sobre um meio slido seletivo que contm azida de sdio (a azida de sdio inibe o crescimento das bactrias Gram-negativas) e cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio, um composto incolor que se reduz a formazo, de cor vermelha, pela ao dos enterococos intestinais. No meio crescem colnias tpicas, de cor vermelha, castanha ou rosa, total ou no centro da colnia. Se se formarem colnias tpicas, a confirmao feita por transferncia da membrana para agar de blis de esculina e azida, previamente aquecido a 44C. Neste meio os enterococos intestinais hidrolisam a esculina em 2 horas produzindo 6,7dihidroxicumarina que se combina com os ies ferro para formar um composto de cor castanha ou negra que se difunde pelo meio. Material para uma amostra
Material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) aparelho de filtrao e bomba de vcuo 2 filtros de 45 m meio Slanetz e Batley com soluo TTT (2 caixas de Petri) meio agar blis-esculina-azida (2 caixas de Petri) estufa a 37C estufa a 44C.

13

Microrganismos capazes de reduzir o cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTT) a formazo e de hidrolisar a esculina a 44C sobre os meios especificados nesta norma.
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Primeiro tempo: elaborao dos meios de cultura Slanetz e Bartley, soluo TTT e agar blis-esculina-azida
Composio do meio Slanetz e Bartley: Triptose 20 g/L Extracto de levedura 5 g/L Glucose 2 g/L Hidrogenosulfato de di-potssio (K2HPO4) 4 g/L Azida de sdio (NaN3) 0.4 g/L Agar 8-18 g/L gua destilada pH 7.20.1 a 25C

1.

Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12);

2. Esterilizar em autoclave e deixar arrefecer at 50-60C;


Composio da soluo TTT: 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTT) 1 g/100 mL gua destilada

3. Dissolver 1 g de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTT) num pequeno volume de gua, perfazer at 100 mL, esterilizar por filtrao (0.2 m); 4. Juntar 10 mL da soluo TTT a 1000 mL do meio base arrefecido a 50-60C; 5. Repartir por caixas de Petri (cerca de 20 mL/caixa); 6. Guardar no frio e no escuro e utilizar no prazo mximo de 15 dias.
Composio do meio agar blis-esculina-azida: Triptona 17 g/L Peptona 3 g/L Extracto de levedura 5 g/L Blis desidratada 10 g/L Cloreto de sdio 5 g/L Esculina 1 g/L Citrato de ferro (III) e amnia 0.5 g/l Azida de sdio 0.15 g/L gua destilada pH 7.10.1 a 25C

7.

Esterilizar em autoclave e repartir por caixas de Petri (cerca de 15 mL/caixa)

8. Guardar no frio e no escuro e utilizar no prazo mximo de 15 dias. Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 2. Filtrar 100 mL (ou 250 mL no caso de guas engarrafadas) atravs do filtro de membrana (pelo menos dois filtros por amostra); 3. Colocar o filtro sobre a caixa de Petri com meio Slanetz e Bartley; 4. Incubar a 362C durante 444 h.

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Terceiro tempo: confirmao e contagem 1. Examinar as membranas e contar todas as colnias que apresentem uma colorao vermelha, castanha ou rosa, no centro ou em toda a colnia; 2. Colocar a membrana numa caixa de Petri com meio agar blis-esculina-azida, previamente aquecida a 44C; 3. Incubar a 440.5C durante 2 h; 4. Considerar um resultado positivo todas as colnias que apresentem, no meio circundante, uma colorao castanha ou negra e cont-las como enterococos intestinais 5. O relatrio deve incluir a referncia norma, todos os detalhes necessrios para a completa identificao da amostra, a tcnica e o meio de cultura utilizados, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados do ensaio e qualquer ocorrncia observado no decurso da anlise e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao. Protocolo 3.6 - Deteco e enumerao de estreptococos fecais pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) Material para uma amostra
Material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) meio bagg de concentrao dupla (5 tubos de ensaio) meio bagg de concentrao simples (10 tubos de ensaio) pipetas de 0.1 mL pipetas de 1 mL pipetas de 10 mL estufa a 37C.

Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura caldo bagg


Composio do caldo bagg: Triptose 20 g/l Dextrose 5 g/L Fosfato dipotssico 4 g/L Fosfato monopotssico 1.5 g/L Cloreto de sdio 5 g/L Azida sdica 0.5 g/L Prpura bromo cresol 0.015 g/L gua destilada pH 6.90.2 a 25C

1.

Para calcular a quantidade necessria de caldo bagg simples e duplo, considerar, por amostra, 5 tubos de meio duplo e 10 tubos de meio simples, com um volume de 10 mL de meio por tubo; 2. Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12) para preparar o meio de concentrao simples; 3. Preparar meio com dose dupla (isto , duas vezes a quantidade indicada na embalagem para a mesma quantidade de gua); 4. Distribuir 10 mL dos meios em tubos de ensaio pequenos (meio de concentrao simples) e grandes (meio de concentrao dupla); 5. Esterilizar em autoclave e conservar no frio at sua utilizao.
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Segundo tempo: recolha das amostras e incubao 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 2. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio bagg duplo com 10 mL da amostra; 3. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio bagg simples com 1 mL da amostra; 4. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio bagg simples com 0.1 mL da amostra; 5. Incubar a 370.5 C durante 242 horas ou 483 horas. Terceiro tempo: verificao da existncia de estreptococos fecais 1. Verificar a alterao da cor do meio de cultura de roxo-violeta para amarelo (resultado positivo para a presena de estreptococos); 2. Usar esses algarismos para determinar o NMP de estreptococos fecais na amostra; 3. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de enterococos na amostra e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise. Protocolo 3.7 - Deteo e enumerao de Clostridium perfringens (incluindo esporos) pelo mtodo da filtrao por membrana Material para uma amostra
Material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) aparelho de filtrao e bomba de vcuo 2 filtros de 45 m meio agar m-CP completo (2 caixas de Petri estufa a 37C estufa a 44C.

Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura agar m-CP


Composio do meio agar m-CP: Sulfato de magnsio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0.1 g/L Cloreto frrico hexahidratado 0.09 g/L Hidrocloreto de L-cistena 1.0 g/L Extracto de levedura 20 g/L Prpura bromo cresol 0.04 g/L Indoxil-D-glucosdeol 0.06 g/L Triptose 30 g/L Sacarose 5 g/L Agar 15 g/L gua destilada pH 7.60.2 a 25C

1.

Adicionar todos os ingredientes e ajustar o pH ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12);
D-ciclocernina 0.4 g/L;

2. Deixar arrefecer e adicionar:

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Sulfato de B-poliximin:a 60 g dissolvidos em 8 mL de gua destilada e esterilizada; Soluo de 0.5% de difosfato de fenolftalena: 20 mL filtrados e esterilizados; Soluo 4.5% de FeCl3.6H2O: 2 mL/L;

3. Distribuir por caixas de Petri (cerca de 15 mL/caixa) e guardar no frio at sua utilizao. Segundo tempo: recolha das amostras e incubao 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 5. Filtrar 250 mL atravs do filtro de membrana (pelo menos dois filtros por amostra); 6. Colocar o filtro sobre a caixa de Petri com meio m-CP; 7. Incubar a 441C durante 213 h.

Terceiro tempo: diferenciao 1. Examinar as colnias, identificando aquelas que se apresentam com cor amarela opaca; 2. Expor as colnias a vapores de hidrxido de amnio durante 20-30 segundos (com cuidados por exemplo, numa hotte - para no inalar os vapores); 3. Contar todas as colnias anteriormente identificadas que passaram a rosa ou vermelho aps a exposio aos vapores de hidrxido de amnio; 4. O relatrio deve incluir a referncia legislao e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise.

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Protocolo 3.8 - Deteo e enumerao de Clostridium perfringens14 (incluindo esporos) pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) Norma: EN 26461-1:1993 | ISO 6461-1:1986 Especifica um mtodo para a deteo e contagem de esporos de microrganismos anaerbio sulfito-redutores (clostrdios) por enriquecimento em meio lquido. Os esporos de microrganismos anaerbios sulfito-redutores encontram-se amplamente dispersos no meio ambiente. Esto presentes na matria fecal humana e animal, nas guas residuais e no solo. Ao contrrio de Escherichia coli e de outros microrganismos coliformes, os esporos sobrevivem na gua durante grandes perodos de tempo e so mais resistentes que as clulas vegetativas ao de fatores qumicos e fsicos, podendo assim representar um sinal de contaminao antiga ou intermitente. Os esporos podem tambm resistir aos nveis de cloro utilizados normalmente no tratamento da gua, sendo portanto teis para as aes de controlo. Mtodo da inoculao de tubos mltiplos e contagem segundo o NMP O Decreto-Lei n306/2007 define o mtodo apresentado no Protocolo 3.7 (pgina 54) como mtodo analtico de referncia para a pesquisa de Clostridium perfringens (incluindo esporos). O Decreto-Lei n 236/98 considerava como mtodos analticos de referncia para a quantificao de clostrdios sulfito - redutores em guas de consumo humano, o aquecimento da amostra a 80C e contagem dos esporos por (i) sementeira em meio com glucose, sulfito de ferro e contagem das colnias com halo negro; (ii) filtrao atravs de membrana, colocao do filtro invertido sobre meio com glucose, sulfito de ferro, recoberto de gelose e contagem das colnias negras; e (iii) repartio em tubos de meio DRCM (diferencial reinforced clostridium medium), subcultura dos tubos negros para meio de leite tornesolado e contagem segundo o Nmero Mais Provvel (NMP). Neste protocolo iremos utilizar uma modificao do terceiro mtodo e da norma ISO 6461-1:1986; em vez de meio lquido e incubao em anaerobiose, para garantir a incubao na ausncia de oxignio utilizar-se- meio slido em tubos de ensaio. Material para uma amostra
Material indicado no Protocolo 1.1 (pgina 12) e no Protocolo 3.1 (pgina 41) meio agar reinforced clostridial de concentrao dupla (5 tubos de ensaio) meio agar reinforced clostridial de

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Microrganismos anaerbios sulfito-redutores que formam esporos, pertencentes famlia Bacillaceae.


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concentrao simples (10 tubos de ensaio) pipetas de 0.1 mL pipetas de 1 mL pipetas de 10 mL banho-maria a 45C banho-maria a 80C estufa a 37C.

Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura agar reinforced clostridial e das solues sulfito de sdio e ferro amoniacal
Composio do meio agar reinforced clostridial: Extracto de carne 4 g/L Extrato de levedura 5 g/L Triptona 10 g/L Glucose 2g/L Amido solvel 1 g/L Cloridrato de L-cistena 0.3 g/L Cloreto de sdio 5 g/L Agar 8 g/L gua destilada pH 7.10.1 a 25C

1.

Adicionar todos os ingredientes ou seguir as instrues do preparado em p (Protocolo 1.1, pgina 12);

2. Preparar meio de concentrao dupla (isto , duas vezes a quantidade indicada na embalagem para a mesma quantidade de gua); 3. Distribuir 10 mL dos meios de cultura em tubos de 10 mL; 4. Esterilizar em autoclave; 5. Guardar no frio at sua utilizao.
Composio da soluo sulfito de sdio: Sulfito de sdio (NaSO3) 1 g/100 mL gua destilada

6. Dissolver o sulfito de sdio na gua destilada e esterilizar por filtrao; 7. Guardar no frio (2-5C) e utilizar no prazo de 14 dias.
Composio da soluo ferro amoniacal: Sulfato de ferro III amoniacal (almen de ferro) ou citrato de ferro III amoniacal 5 g /100 mL gua destilada

8. Dissolver o sulfato ou o citrato de ferro na gua destilada e esterilizar por filtrao; 9. Guardar no frio (2-5C) e utilizar no prazo de 14 dias. Segundo tempo: recolha das amostras, inoculao e incubao 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 3.1 (pgina 41); 2. Distribuir a amostra de gua em tubos de ensaio: 10 mL em 5 tubos de ensaio grandes (20 mL); 1 mL em 5 tubos de ensaio pequenos (10 mL) e 0.1 mL em tubos de ensaio pequenos (10 mL);

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3. Aquecer, num banho de gua, os tubos com as amostras a 80C durante 10 minutos, de forma a inativar as clulas vegetativas que l possam existir; 4. Deixar arrefecer e manter a 45C at sua utilizao; 5. Ferver em banho de gua durante 15 minutos os tubos com o meio base, de forma a regenerar as condies de anaerobiose (i.e., para eliminar o oxignio do meio de cultura); 6. Esperar que arrefea e manter a 45C at sua utilizao; 7. Imediatamente antes da inoculao, adicionar em cada tubo com meio base de concentrao dupla, 1 mL da soluo de sulfito de sdio e 0.5 mL da soluo de ferro amoniacal;

8. Adicionar em cada tubo com meio base de concentrao simples, 0.5 mL da soluo de sulfito de sdio e 0.25 mL da soluo de ferro amoniacal; 9. Verter o meio de cultura para os tubos que contm a amostra; meio de cultura de concentrao dupla nos tubos que contm 10 mL de amostra e meio de cultura de concentrao simples nos tubos que contm 1 mL e 0.1 mL de amostra; 10. Agitar suavemente, de forma a evitar a introduo de ar no meio de cultura e arrefecer imediatamente em gua fria; 11. Incubar a 37C durante 1 a 5 dias. Terceiro tempo: leitura de resultados 1. Verificar se no meio de cultura aparecem colnias negras, isoladas ou no, que so indicadoras da existncia de clostrdeos sulfito-redutores na amostra; 2. Contar os tubos que apresentam resultados positivos em cada diluio e usar esses algarismos para determinar o NMP de clostrdeos na amostra; 3. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de enterococos na amostra e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise.

Bibliografia citada
Alcntara, F., Cunha, M.A. & Almeida, M.A. (2006). Microbiologia prticas laboratoriais. Universidade de Aveiro, Aveiro. APA (2011). Qualidade do ar. Agncia Portuguesa do Ambiente. Disponvel em http://www.qualar.org/?page=5&subpage=1, consultado em 30-Junho-2011. Ferreira, W.F.C., Sousa, J.C.F. & Lima, N. (2010). Microbiologia. Lidel-Edies tcnicas, Lda. Lisboa. 622 pginas. ISBN 978-972-757-515-2.

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Filho, P.P.G., Silva, C.R.M. & Kritski, A.L. (2000). Ambientes climatizados, portaria 3.523 de 28/8/98 do Ministrio da Sade e padres de qualidade do ar de interiores do Brasil. Jornal de Pneumologia, 26 (5). doi: 10.1590/S0102-35862000000500006. Disponvel em http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010235862000000500006&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt. Friberg, B., Friberg, S. & Burman, L.G. (1999a). Correlation between surface and air count of particles carrying aerobic bacteria in operating rooms with turbulent ventilation. Journal of Hospital Infection, 42: 61-68. Friberg, B., Friberg, S. & Burman, L.G. (1999b). Inconsistent correlation between aerobic bacterial surface and air counts in operating rooms with ultra clean laminar air flows: proposal of a new bacteriological standard for surface contamination. Journal of Hospital Infection, 42: 287-293. Instituto Cincia Hoje (2010). Caa-corantes. Sociedade Brasileira para o Progresso da Cincia. Disponvel em http://cienciahoje.uol.com.br/noticias/2010/01/imagens/Fungodescontaminantefig2 .jpg/view, consultado em 05-Julho-2011. Madigan, M.T., Martinki, J.M. & Brock, T.D. (2006). Biology of microorganisms. 11 edio. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ. Mendes, B. (2010). Microbiologia da gua. Pginas 506-522 in Ferreira, W.F.C, Sousa, J.C.F. & Lima, N. (coords.). Microbiologia. Lidel-Edies tcnicas, Lda. Lisboa. 622 pginas. ISBN 978-972-757-515-2. Microbiologia Online (2011). Colorao de Gram. Disponvel em http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com/2010/12/microbiologia-online-comfoco-em.html, consultado em 30-Junho-2011. Microbiology Virtual Lab (2011). Streak Plate Method. Biotechnology Engineering, Amrita Vishawa VidyapeethamVirtual Labs. Disponvel em http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=213&cnt=1, consultado em 5-Julho2011. MicrobLog (2006). Legionella pneumophila. MicrobLog: Microbiology Training Medical Microbiology, Virology and Infectious Diseases. Disponvel em http://microblog.me.uk/90, consultado em 30-Junho-2011. Morais, G.R., Silva, M.A., Carvalho, M.V. Santos, J.G.S., von Dolinger, E.J.O. & Brito, D.D. (2010). Qualidade do ar interno em uma instituio de ensino superior brasileira. Bioscience Journal, 26 (2): 305-310 Scientia (2011). Fungos. Disponvel em http://www.scientia.blog.br/wordpress/?tag=fungos, consultado em 5-Julho-2011.

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Manuela Abelho

SGS (2011). Qualidade do ar interior. SGS. Disponvel em http://www.pt.sgs.com/pt/quality_of_the_indoor_environment?serviceId=8565&lo bId=30893, consultado em 30-Junho-2011.

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