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NVIO BATISTA SANTANA

EFICINCIA DA HIDRLISE DE AMIDO DE MANDIOCA POR


DIFERENTES FONTES DE ENZIMAS E RENDIMENTO DA
FERMENTAO ALCOLICA PARA PRODUO DE ETANOL





Dissertao apresentada
Universidade Federal de Viosa,
como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em
Cincia e Tecnologia de Alimentos,
para obteno do ttulo de Magister
Scientiae.









VIOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007

NVIO BATISTA SANTANA



EFICINCIA DA HIDRLISE DE AMIDO DE MANDIOCA POR
DIFERENTES FONTES DE ENZIMAS E RENDIMENTO DA
FERMENTAO ALCOLICA PARA PRODUO DE ETANOL



Dissertao apresentada
Universidade Federal de Viosa,
como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em
Cincia e Tecnologia de
Alimentos, para obteno do ttulo
de Magister Scientiae.


APROVADA: 24 de outubro de 2007.




Prof. Mnica Ribeiro Pirozi
(Co-orientadora)

Pesq. Virgnia Maria Chaves Alves
(Co-orientadora)



Prof. Jos Antonio Marques
Pereira



Prof. Jos Bencio Paes Chaves



Prof. Paulo Henrique Alves da Silva
(Orientador)
ii













A Deus,
minha famlia,
minha namorada,
Aos meus amigos e colegas,
A todos aqueles que fazem parte da minha vida e dessa vitria.
















iii





AGRADECIMENTOS

A Deus, dono de toda a cincia e sabedoria. O temor do Senhor o
principio da sabedoria. Provrbios 9:10.
Universidade Federal de Viosa, pela oportunidade da realizao
deste curso.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro.
Ao Prof. Paulo Henrique Alves da Silva pela orientao, ateno e
apoio em todos os momentos deste curso.
s professoras Mnica Pirozi, Virgnia Alves, Maria Goreti Almeida
pelos oportunos conselhos e sugestes.
Aos meus pais, Hlio Mafra de Santana e Raquel Batista da Silva, pelo
amor, educao e incentivo em todas as reas da minha vida.
A minha irm Valria, pelo amor dedicado.
A minha namorada Qusia pelo amor, compreenso, apoio, pacincia,
incentivo demonstrados durantes estes anos.
Aos meus amigos de repblica, Vagner, Rosana, Andria e Ivan, pelos
momentos vividos juntos durante este perodo.
A Ludmila Beghini pela amizade e ajuda durante o experimento.
Ao amigo e colega Alexandre Fontes pela amizade, companheirismo e
ajuda.
Aos colegas da ps-graduao do Departamento de Tecnologia de
Alimentos.
Aos amigos, mais chegados que irmos, da Primeira Igreja Batista de
Viosa e da Aliana Bblica Universitria - Grupo Ps Graduao, pelo amor,
amizade, fora e pelas oraes.
Aos amigos da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, pela
amizade que perdura at hoje.

iv






BIOGRAFIA




Nvio Batista Santana, filho de Hlio Mafra de Santana e Raquel Batista
da Silva, nasceu em Itapetinga, Bahia, no dia 09 de Junho de 1981.
Em Julho de 2005 graduou-se em Engenharia de Alimentos pela
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Campus Juvino Oliveira, em
Itapetinga, Bahia.
Em Agosto de 2005, ingressou no curso de Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viosa, em Viosa,
Minas Gerais.















v





SUMRIO

RESUMO.......................................................................................................... vii
ABSTRACT........................................................................................................ ix
1. INTRODUO................................................................................................1
2. REVISO DE LITERATURA...........................................................................4
2.1 A histria do lcool no Brasil ............................................................ 4
2.2 Mandioca com matria-prima para a produo de etanol................. 7
2.3 Hidrlise de amido............................................................................ 8
2.4 Custos de produo do lcool .......................................................... 9
2.5 Processos de obteno do etanol................................................... 11
2.6 Matrias-primas para obteno de etanol....................................... 11
2.7 Mandioca............................................................................................ 14
2.7.1 Aspectos gerais da planta............................................................ 14
2.7.2 Utilizao da mandioca no Brasil ................................................. 15
2.3 Amido ................................................................................................. 17
2.4 Enzimas.............................................................................................. 20
2.4.1 Definio...................................................................................... 20
2.4.2 Enzimas Amilolticas.................................................................... 21
2.5 Malte .................................................................................................. 28
2.5.1 Produo do malte....................................................................... 28
2.7 Composio do lcool ........................................................................ 39
3. DETERMINAO DA COMPOSIO QUMICA DO AMIDO DE
MANDIOCA E DOS MALTES DE CEREAIS.....................................................41
3.1 Introduo....................................................................................... 41
3.2 Materiais e Mtodos........................................................................ 42
3.4 Resultados e Discusso ................................................................. 47
3.5 Concluso....................................................................................... 51
4. HIDRLISE DO AMIDO DE MANDIOCA PELAS ENZIMAS DOS MALTES
DE CEVADA, TRIGO, MILHO E CENTEIO EM TRS CONCENTRAES....52
4.1 Introduo....................................................................................... 52
4.2 Materiais e Mtodos........................................................................ 54
4.3 Delineamento experimental ............................................................ 55
4.4 Resultados e Discusso ................................................................. 56
4.5 Concluso....................................................................................... 64
5. FERMENTAO ALCOLICA DOS MOSTOS OBTIDOS DO AMIDO DE
MANDIOCA HIDROLISADO PELAS ENZIMAS DOS MALTES........................66
vi
5.1 Introduo....................................................................................... 66
5.2 Materiais e Mtodos........................................................................ 67
5.2.3 Procedimento experimental das fermentaes............................ 70
5.3 Delineamento experimental ............................................................ 72
5.4 Resultados e Discusso ................................................................. 73
5.4.4 Balano de massa da produo lcool de mandioca................... 83
5.5 Concluso....................................................................................... 88
6 CONCLUSO GERAL...................................................................................90
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..............................................................92
























vii





RESUMO

SANTANA, Nvio Batista. M.Sc., Universidade Federal de Viosa, Outubro
de 2007. Eficincia da hidrlise de amido de mandioca por diferentes
fontes de enzimas e rendimento da fermentao alcolica para
produo de etanol. Orientador: Paulo Henrique Alves da Silva. Co-
orientadores: Mnica Ribeiro Pirozi e Virginia Maria Chaves Alves.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a produo de lcool por dois
tipos de leveduras a partir de amido de mandioca, utilizando maltes de
cereais como fonte de enzimas amilolticas. O trabalho se dividiu em duas
etapas. Na primeira, foram feitos ensaios para se determinar a melhor
concentrao de malte a ser utilizado na hidrlise. As concentraes
testadas foram, 4, 8 e 12,5% de malte em relao massa de amido. Foram
testados os maltes de cevada, trigo, milho e centeio com objetivo de se
determinar se algum destes seria o mais adequado para utilizao neste tipo
de processo. Os hidrolisados foram analisados com relao ao perfil dos
acares formados e foi calculado o rendimento da hidrlise, com o objetivo
de se determinar qual o melhor tipo e concentrao de malte. Estes ensaios
foram feitos em suspenses de 100g contendo 12% de fcula de mandioca
que foi gelatinizado, em seguida resfriado at 50C submetido ao das
enzimas do malte por 24h na temperatura de 50C. Foram feitas anlises de
regresses para se ajustar modelos que descrevessem o perfil da hidrlise.
Os maltes utilizados foram analisados com relao ao teor de amido,
acares, umidade, pH e atividade amiloltica. A fcula de mandioca utilizada
foi caracterizada com relao ao teor de amido, umidade e pH. Na segunda
etapa, de posse dos resultados da primeira, foram feitas fermentaes dos
mostos hidrolisados. A concentrao de malte utilizada foi de 12,5% para
todos os tipos de cereal. O malte de cevada atingiu maiores valores de
rendimento e apresentou maior atividade enzimtica, juntamente com o trigo.
viii
Entretanto, apesar da menor atividade amilolitica, o malte de milho
apresentou rendimentos prximos aos do malte de cevada quando usado na
maior concentrao. Foram preparadas suspenses de 1kg, contendo 12%
de amido de mandioca que foram gelatinizadas, hidrolisadas com o malte e
inoculadas com a levedura. Foram utilizadas neste processo as leveduras
Saccharomyces cerevisiae, que a levedura tradicionalmente utilizada para
a produo de lcool e Saccharomyces diastaticus, que uma variedade
que apresenta a caracterstica de produzir a enzima glicoamilase e crescer
utilizando substrato amilceo. As leveduras foram inoculadas e o processo
fermentativo foi monitorado atravs do consumo de substrato, gerao de
produto, queda do pH e elevao da acidez do mosto. No houve interao
significativa entre os fatores malte e levedura. As maiores concentraes de
etanol foram encontradas nos mostos fermentados por Saccharomyces
cerevisiae e variaram entre 39,1 e 48,9 g de etanol/L. Apesar de apresentar
menores concentraes de etanol, os mostos fermentados por
Saccharomyces diastaticus apresentaram elevada hidrlise do amido,
variando entre 99,2% e 97,9% o que indica elevada capacidade desta
levedura em hidrolisar o amido. A composio do produto formado foi
analisada por meio de cromatografia gasosa. Foi observado que a formao
de acetaldeido foi mais intensa nos mosto de cevada e centeio fermentados
por S. cerevisiae. Acetato de etila esteve mais presente nos mostos
fermentados de centeio e cevada e no houve variao entre as duas
leveduras para este composto. Metanol foi encontrado em maiores
propores nos mostos fermentados por S.cerevisiae, enquanto que os
mostos fermentados por S. diastaticus apresentaram maiores teores de 1
propanol. Os valores para lcool isobutilico e isoamilico no variaram entre
os tratamentos testados. Os dados obtidos servem de base para outras
pesquisas, visando o aperfeioamento deste processo. A busca por fontes
de enzimas mais baratas e processos mais aperfeioados que diminuam os
custos de energia so pontos fundamentais para viabilizar a produo de
etanol a partir de material amilceo.



ix





ABSTRACT

SANTANA, Nvio Batista. M.Sc., Universidade Federal de Viosa, October
2007. Efficiency of cassava starch hydrolysis by different sources
of enzymes and alcoholic-fermentation yield for ethanol
production. Adviser: Paulo Henrique Alves da Silva. Co-Advisers:
Mnica Ribeiro Pirozi and Virginia Maria Chaves Alves.

The objective of this work was to evaluate the alcohol production of
two yeast strains from cassava starch, using cereal malts as source of
amilolytic enzymes. The work was divided in two steps. In the first step,
assays were carried out to determinate the best malt concentrations would
be used on the hydrolysis. Four concentrations of malt in relation to starch
mass, 4,0; 8,0 and 12,5% were tested, Barley, wheat, corn and rye malts
were tested aiming to set if any of them of they would be most suitable for
usage in this kind of process. Hidrolysated suspensions were analyzed
regarding to formed sugars profile by enzymatic kits and the hydrolysis yield
was calculated to determinate the best malt concentration. These tests were
conduced in suspensions of 100g containing 12% of cassava starch, which
was jellied and cooled until 50C and, then, submitted to malts enzymes
action for 24h at 50C. Regressions analyses were done in order to find
models that describe better the hydrolysis profile. The malts used were
analyzed in relation to starch rates, sugars, moisture content, pH and
amilolytic activity. The cassava starch used was characterized in relation to
starch, moisture content and pH. In the second step, with the results of the
first one, fermentations of the wort were done. The malt concentration used
was 12,5% for all cereals. Barley malt has reached greater yield values and
presented greater amilolytic activity as well as wheat. However, despite of
the smaller amilolytic activity, corn malt have shown yields close to barley
malt when used in the highest concentration. 1Kg suspensions containing
x
12% of cassava starch were jellied, hydrolyzed with malt and inoculated with
the yeast. In this process were used Saccharomyces cervisiae yeast strain,
traditionally used for alcohol production and Saccahromyces diastaticus
yeast strain, which presents glycoamilase enzyme production and the growth
using starch as substratum. Yeast were inoculated and the fermentative
process was monitored by substratum consumption, product generation, pH
decreasing and wort acidity increase. The largest alcohol concentrations
were found in the S. cerevisiae- fermented worts and varied from 39,1 to
48,98 g of ethanol L
-1
. In spite of presenting smaller ethanol concentrations,
the S. diastaticus fermented worts presented higher starch consumption,
varying from 99,21 to 97,92%, indicating an high capacity of starch
consumption by this yeast. Formed products compositions were analyzed by
gas chromatography. It was observed that acetaldehyde formation was more
intense in barley and rye wort fermented by S. cerevisiae. Ethyl acetate was
more present in barley and rye fermented wort and there was not difference
between these two yeasts for this compound. Methanol was found in greater
proportions in S. cerevisiae-fermented worts, while S. diastaticus-fermented
worts presented more concentrations of 1 propanol. Isobutyl and isoamyl
alcohols values didnt vary among the tested treatments. The obtained data
serve as basis for other researches, looking for this process improvement.
The search for cheaper enzyme sources and process with higher incomes
that diminish the energy costs are fundamental points to make possible the
ethanol production from starch material.

1





1. INTRODUO

A produo de lcool a partir de mandioca apresenta algumas
dificuldades tcnicas e econmicas. A necessidade de hidrlise do amido
gera elevao dos custos aliada baixa produtividade agrcola no tornam
esse processo vivel economicamente. Diante disso, o estudo de melhorias
no processo tecnolgico de produo e melhorias agronmicas da cultura
so pontos cruciais para utilizao desta cultura como fonte de carboidratos
para produo de etanol.
A busca por fontes limpas e renovveis de energia tem levado ao
desenvolvimento de novas tecnologias alternativas aos processos
convencionais. Os biocombustveis tm demonstrado um grande potencial
para a substituio em escala maior dos derivados do petrleo. Existem
diversas fontes disponveis para a produo destes novos tipos de
combustveis, e como se tratam de fontes vegetais, pode-se garantir a
continuidade da produo e com isto evitar uma eventual crise de
abastecimento energtico. Cana-de-acar, milho, beterraba, oleaginosas
como a soja, mamona, dend, alm de biomassa vegetal como celulose,
hemicelulose, lignina se apresentam como fontes interessantes para a
gerao deste tipo de combustvel.
No Brasil, o etanol, produzido a partir da cana-de-acar, tem sido h
vrios anos utilizado como combustvel, tanto na forma hidratada com uso
direto nos motores a combusto, quanto na forma anidra adicionado
gasolina. Nas dcadas de 30 e 70, a utilizao de etanol como combustvel
teve grande utilidade devido a problemas de abastecimento de petrleo.
Nestas ocasies, porm, quando passadas as crises, este combustvel era
deixado de lado. Com a criao do Prolcool na dcada de 70, grandes
investimentos foram feitos na produo de lcool de cana-de-acar, o que a
transformou na melhor fonte para a obteno deste combustvel no Brasil.
2
A mandioca uma raiz tuberosa da famlia Euphorbiaceae, rica em
amido e muito consumida na dieta brasileira. uma cultura que pode ser
encontrada em toda extenso do territrio nacional, tanto em terras de alta
fertilidade, como o caso do sul do pas, como no semi-rido, em algumas
regies do Nordeste.
Devido a sua grande quantidade de carboidratos, a mandioca se
apresenta como potencial fonte para a gerao de etanol. Chegou-se a
implantar algumas usinas de lcool de mandioca no Brasil em perodos de
grande dificuldade energtica, como na dcada de 30 e na dcada de 70.
Enquanto que a produo de lcool de cana de acar era aperfeioada em
diversos aspectos tecnolgicos e econmicos, a produo de lcool de
mandioca era abandonada, sem maiores investimentos e estudos.
Esta cultura no concorre igualmente com a cana-de-acar devido
sua baixa produtividade agrcola no Brasil, cerca de 13 ton/ha.ano em
mdia, e pelo fato de seus acares no estarem na forma diretamente
fermentescvel, necessitando de um tratamento prvio para obteno do
mosto. Entretanto j existem novas variedades que apresentam
produtividade superior a 20 ton/ha.ano, o que pode aumentar a viabilidade
da produo de lcool a partir desta fonte (VENTURINI FILHO e MENDES,
2003).
Para que possa ser metabolisado pelos agentes de fermentao, o
amido precisa ser hidrolisado a acares fermentescveis, como glicose ou
maltose, entre outros. O processo de transformao do amido da mandioca
em acares fermentescveis pela levedura alcolica envolve o aquecimento
da suspenso de amido para a sua gelatinizao, a fim de facilitar a ao
das amilases.
A hidrlise do amido pode ser feita de forma cida ou enzimtica,
sendo a ltima a que apresenta maiores vantagens. Esta hidrlise
desenvolvida pelas enzimas amilases, que podem ser encontradas em
tecidos animais, vegetais e microrganismos. Os maltes de cereais
apresentam elevada atividade amiloltica, desenvolvidas em seus processos
de germinao. Alguns microrganismos, dentre eles a levedura
Saccharomyces diastaticus, tem tambm a capacidade de sintetizar enzimas
amilolticas. A busca por processos que aperfeioem a hidrlise do amido de
3
mandioca visando a obteno de etanol se torna importante para a incluso
desta cultura genuinamente brasileira na nova matriz energtica nacional.
Isto traria grandes benefcios para a matriz energtica brasileira contribuindo
para a distribuio de renda para os pequenos produtores desta cultura, em
varias regies do pas.
Este trabalho teve como objetivos:
Avaliar a atividade amilolitica dos maltes de cevada, milho, trigo
e centeio e determinar a composio fsico-qumica desses
maltes e da fcula de mandioca utilizados neste trabalho;
Avaliar a ao das amilases de maltes de cereais sobre o amido
de mandioca em diferentes concentraes enzima-substrato;
Avaliar a cintica de fermentao e produo de etanol nos
mostos obtidos a partir de amido de mandioca hidrolisados por
enzimas de maltes de cereais, utilizando as leveduras
Saccharomyces cerevisiae Saflager W-34/70 e Saccharomyces
diastaticus ATCC 13007 e determinar a composio dos
produtos formados a partir das fermentaes anteriores;

















4





2. REVISO DE LITERATURA

2.1 A histria do lcool no Brasil

A difuso da fermentao alcolica no Brasil iniciou-se aparentemente
na capitania de So Vicente, onde foi montado o primeiro engenho do pas,
em 1532, aps a vinda das primeiras mudas de cana-de-acar trazidas da
ilha da Madeira. Por sculos o nico lcool produzido foi empregado como
bebida destilada. A industrializao do lcool propriamente dita desenvolveu-
se na Europa, em meados do sculo 19 e no ltimo quarto do sculo
passado iniciou-se a produo de etanol no Brasil, com as sobras de melao
da indstria de acar, que ampliava a sua capacidade produtiva
(AQUARONE et al, 2001).
O etanol derivado de cana-de-acar foi usado como combustvel
desde 1903, quando o Primeiro Congresso Nacional das Aplicaes
Industriais do lcool props que uma infra-estrutura fosse estabelecida para
promover a produo e uso de lcool. Durante a Primeira Guerra Mundial,
de fato, o uso do lcool foi obrigatrio em muitas reas do pas. Em 1923, a
produo de etanol cresceu para 150 milhes de litros por ano; em 1927,
este foi misturado com ter dietil etlico e leo de castor. Em 1931 um
Decreto Federal 19.717 de 20/02/31 determinou que fosse adicionado lcool
na gasolina na proporo de 5% na mistura e estabeleceu diretrizes para
seu transporte e comercializao. Em 1941, a produo de etanol atingiu
650 milhes de litros. Em 1995, esta atingiu 12.6 bilhes de litros (MOREIRA
e GOLDEMBERG, 1999).
Durante a Segunda Guerra Mundial (1939 a 1945), faltou gasolina e
fez-se necessrio substitu-la por gasognio e lcool. Passada a Segunda
Guerra Mundial, voltou-se importao de gasolina e o combustvel
5
alternativo perdeu sua importncia. Entretanto continuou-se a misturar etanol
gasolina em larga escala (AQUARONE et al, 2001).
A economia Brasileira nos anos 70 passou por grandes dificuldades.
Aps acordar de um perodo de milagre econmico, ocorrido no governo
Mdici (de 1968 a 1973), ocorre um declnio econmico, devido a diversos
problemas e sua poltica econmica baseada principalmente em
emprstimos internacionais, arrocho salarial e favorecimento de empresas
estrangeiras (OLIVEIRA e NETO, 2003).
A crise internacional do petrleo que se deflagrou em 1974, fez com
que se iniciasse no Brasil uma nova fase de produo de etanol. A produo
saltou de 700 milhes de litros por ano para 15 bilhes de litros para
abastecer a nova frota de mais de 4 milhes de automveis projetados para
utilizao de lcool hidratado e tambm para a mistura na gasolina na forma
de lcool anidro. Isto proporcionou a ampliao do parque canavieiro, a
modernizao das destilarias anexas, a instalao de unidades autnomas,
a criao de grande nmero de empregos diretos e indiretos e uma rpida e
importante evoluo na construo de motores para esse combustvel. O
plano de desenvolvimento da produo de lcool no Brasil, denominado de
Prolcool, no foi uma soluo improvisada para a crise de combustveis,
mas simplesmente a continuidade e evoluo de um programa de uso do
lcool como combustvel iniciado em 1931 (AQUARONE et al, 2001).
Apesar de ter sido implantado em 1975, foi a partir de 1979, depois do
segundo choque do petrleo, que o Brasil, de forma mais ousada, lanou a
segunda fase do Proalcool, que tinha como meta a produo de 7,7 bilhes
de litros em cinco anos. A inteno do Estado, anteriormente ao Prolcool,
era a de aumentar a produo de alimentos e produtos exportveis do setor,
buscando a estabilidade interna e tambm nas contas externas. Com a
criao do Prolcool, transfere-se tambm para a agricultura a
responsabilidade de tentar superar a crise do petrleo e estabilizar as contas
externas. Neste contexto, o governo em sua ao direta ou indireta, dado a
ausncia de recursos para atender todo o agronegcio nacional, optou por
privilegiar algumas culturas e desprezar outras, como o caso dos produtos
de mercado interno, relegados a segundo plano. Uma das crticas
apresentadas por muitos estudiosos que o Prolcool tem carter
6
concentrador e elitista, descuidando-se das conseqncias sociais, geradas
pelos problemas nas reas de produo de alimentos e do aumento das
desigualdades regionais e setoriais (OLIVEIRA e NETO, 2003).
Segundo VEIGA FILHO e RAMOS (2006), o Prolcool pode ser
caracterizado em quatro fases. A primeira, de 1975 a 1978, ocorreu pelo
incentivo ao aumento da produo de etanol para utilizao como
combustvel misturado gasolina, atravs da instalao de destilarias
anexas s usinas de acar, motivada pelo primeiro choque de preos do
petrleo no mundo, em outubro de 1973, e a necessidade de aproveitar a
ociosidade do parque industrial sucroalcooleiro. A segunda fase, tambm
motivada por outro choque do petrleo, ocorreu atravs da implantao de
destilarias autnomas, e iniciou-se em 1979, quando os preos do petrleo
dispararam no mercado internacional. Essa fase terminou no episdio da
falta de lcool hidratado nas bombas dos postos de combustvel, em 1989. A
terceira fase, iniciada aps esse episdio, estende-se at a crise de
superproduo de etanol, na safra 1999/2000. Nela predominou um padro
de preos baixos do petrleo no mercado internacional, desestruturao do
sistema de apoio governamental, o que redundou no excesso de produo
de etanol e em queda de preos. O programa se susteve pelo consumo do
anidro, dada a demanda da gasolina, e pela manuteno da frota de
veculos a lcool em uso. A quarta fase, aps 2000, iniciou-se com a
renovao do Prolcool, principalmente atravs de aes corporativas,
articulando cada vez mais segmentos econmicos, sociais e polticos,
marcada pela liberao de preos dos produtos setoriais, introduo dos
veculos flex fuel, possibilidades de aumento nas exportaes de etanol e
patamares de preos elevados, nos curto e mdio prazos, de petrleo no
mercado mundial.
O aumento da produo e uso do etanol como combustvel foi possvel
graas a trs aes governamentais: a deciso que a Petrobras compraria
uma quantidade garantida de etanol; A proviso de incentivos econmicos
para empresas agroindustriais dispostas a produzir etanol, e quase US$ 2.0
bilhes em emprstimos, os quais representaram 29% do total dos
investimentos necessrios a capacidade instalada presente; etapas para
tornar o etanol atrativo para os consumidores pela venda na bomba por 59%
7
do preo da gasolina. Isto somente foi possvel devido ao fato do preo da
gasolina ter sido estabelecido pelo governo a um de valor aproximadamente
o dobro do preo nos Estados Unidos (MOREIRA e GOLDEMBERG, 1999).

2.2 Mandioca com matria-prima para a produo de etanol

Durante a dcada de 70 algumas usinas de lcool de mandioca foram
implantadas, mas em regies que no tinham tradio na produo desta
cultura e devido a isto estas usinas no apresentaram resultados
satisfatrios. H hoje em dia, em algumas regies do Nordeste brasileiro,
como no estado do Maranho, a produo de aguardente a base de
mandioca, conhecida como Tiquira (VENTURINI FILHO e MENDES, 2003).
O lcool de mandioca j foi produzido no Brasil nos perodos de grande
dificuldade energtica. H relatos bibliogrficos de que essa matria-prima
foi usada no perodo de 1932 a 1945, que corresponde ao colapso da
economia mundial da dcada de 30 e segunda guerra mundial e na dcada
de 70, com o advento do Prolcool. Observou-se que, uma vez cessadas as
dificuldades do momento, abandonava-se a mandioca como matria prima
para a produo de lcool, prevalecendo a utilizao da cana-de-acar
(VENTURINI FILHO e MENDES, 2003).
Segundo ARAJO (1982), enquanto o lcool de cana-de-acar
conseguia, em virtude da sua produo continuada, razoveis
aperfeioamentos tecnolgicos, nacionalizao da aparelhagem, melhores
resultados na fermentao, abandono dos processos arcaicos, controle das
infeces, entre outros benefcios, a produo de lcool de mandioca,
interrompida em 1942 com o fechamento da usina de Divinpolis,
permanecera totalmente estagnada em relao metodologia de fabricao.
Criou-se ento uma mstica derrotista em relao ao lcool de mandioca.
A produtividade mdia brasileira baixa: 13 toneladas de mandioca por
hectare, mas a regio de industrializao da mandioca em fcula, no
sudeste, apresenta produtividade mdia superior a 20 t/ha. A mandioca
possui uma srie de vantagens em relao a outros cultivos, tais como a
fcil propagao, elevada tolerncia a estiagens, rendimentos satisfatrios
mesmo em solos de baixa fertilidade, pouco exigente em insumos modernos,
8
potencial resistncia ou tolerncia a pragas e doenas, elevado teor de
amido nas razes, boas perspectivas de mecanizao do plantio colheita,
possibilidade de consrcio com inmeras plantas alimentcias e industriais
(VENTURINI FILHO e MENDES, 2003). Segundo estes mesmos autores a
produtividade de etanol para a mandioca de 4,88 m
3
/ha.ano. Isto daria
uma produo de 376 litros de lcool por tonelada de mandioca, enquanto a
cana-de-acar produz entre 90 e 100 litros por tonelada. Vrios produtos da
mandioca, como a fcula, farinha, raspas, bem como a prpria raiz podem
ser usados na produo de lcool, com rendimentos de 607,47, 515,2,
508,83 e 240,59 litros por tonelada respectivamente.
A supremacia da cana-de-acar em relao mandioca esta ligada a
quantidade de acar e consequentemente de etanol, que possvel de se
produzir a partir de uma unidade de rea (ha) cultivada por unidade de
tempo (ano). Alm disso, a cana, ao contrrio da mandioca, possui acares
fermentveis que so diretamente metabolizados pela levedura alcolica,
no necessitando de hidrlise prvia para a produo do mosto.

2.3 Hidrlise de amido

No processo de hidrlise ou sacarificao de matrias-primas
amilceas, ocorre a transformao do amido em acar, o que pode se dar
atravs de processo contnuo ou descontnuo, com hidrlise cida ou
enzimtica. A hidrlise cida apresenta a vantagem de ser mais rpida,
porm tem como desvantagens evidentes os problemas de corroso de
equipamentos e necessidade de neutralizao (SURMELY et al, 2003). Na
hidrlise enzimtica, enzimas de origem vegetal ou microbiana podem ser
usadas. Destaca-se o malte, o farelo enzimtico (cultivo de microrganismos
amilolticos, como o fungo da espcie Aspergillus oryzae, cujo crescimento
se d em farelo de milho, trigo, arroz ou cevada, previamente gelatinizados)
e enzimas comerciais obtidas de microrganismos (VENTURINI FILHO e
MENDES, 2003).
LEONEL e CEREDA (1998), trabalhando com farelo de mandioca, um
subproduto da extrao da fcula como matria prima para a obteno de
lcool, utilizando pectinase como enzima complementar s enzimas
9
amilolticas, concluram que 86,31% do amido e 70,46% da matria seca
inicial foram hidrolisados neste processo. Uma reduo de 23,04% do
contedo de fibras presentes no farelo inicial foi constatada. Estes mesmos
autores em 2000 obtiveram cerca de 90% de hidrlise do amido inicial
contido no farelo de mandioca, utilizando enzimas comerciais.
A produo de etanol a partir de mandioca segue uma linha industrial
semelhante fabricao de lcool a partir de cereais. As principais
operaes envolvidas na manufatura do lcool de mandioca pelo processo
enzimtico de hidrlise do amido so: pesagem, lavagem e descascameto,
desintegrao, cozimento, pr-sacarificao, sacarificao, fermentao,
peneiragem, centrifugao, destilao, retificao e desidratao.
(VENTURINI FILHO e MENDES, 2003).
LEONEL e CEREDA (1998) chegaram a obter eficincia do processo
fermentativo de 86,89% em relao ao teor de glicose no mosto inicial.
BRINGHENTI e CABELLO (2005) produziram lcool a partir de amido
decantado aditivado com melao. Ao final da fermentao foram
quantificados 97,64 ml de etanol por litro de mosto, ou seja, 9,76% em
volume. Neste lcool observou-se ausncia de lcoois superiores, metanol,
glicerol e cidos orgnicos. Furfuraldedo e formaldedo com concentraes
de 0,01 e 0,004 mg/ml, , respectivamente, foram os aldedos identificados.
FERREIRA et al (2005), produzindo aguardente de mandioca
hidrolisada com malte de milho obtiveram converso do amido a acares
prxima de 17%. Estes autores obtiveram uma concentrao alcolica de
aproximadamente 5,5GL no mosto. Segundo os autores, este baixo
rendimento se deve provavelmente quantidade de material insolvel no
meio (gel de amido), que diminui a disponibilidade de gua.

2.4 Custos de produo do lcool

LEONEL e CEREDA, (1998), utilizando farelo de mandioca, um
subproduto da produo da fcula, como matria-prima e enzimas
comerciais na hidrlise, obtiveram custo de produo de R$ 0,90 por litro de
lcool sendo que as enzimas representaram 53% dos custos. Estes mesmos
autores trabalhando com farelo de mandioca, em 2000, encontraram um
10
custo de produo de R$ 0,55 por litro de lcool fino de mandioca, utilizando
enzimas comerciais.
BOSSO e MACHADO (2006), em estudo sobre os custos de produo
de etanol no Brasil, afirmam que o produto obtido a partir de milho teria um
custo de aproximadamente R$ 0,82 por litro, enquanto que a partir da cana,
este custo de R$ 0,35 por litro.
WOICIECHOWSKI et al (2002) afirmam que a hidrlise cida de 150kg
de bagao de mandioca para produo de acares redutores apresentou
custos de US$ 34.27, enquanto que o processo enzimtico, para a mesma
quantidade custaria U$ 2470.99, sendo que o elevado custo da hidrlise
enzimtica se deu devido ao tempo de hidrlise e ao alto custo das enzimas.
Os EUA so o segundo maior produtor de lcool, obtendo este a partir
de milho. Comparado ao etanol produzido nos Estados Unidos, o
lcool nacional ganha em preo e em produtividade. No Brasil, cada
hectare plantado produz 6,8 mil litros de lcool de cana-de-acar e cada
litro do produto custa US$ 0,20. Nos Estados Unidos, maior produtor mundial
de milho, cada hectare gera 3,2 mil litros do combustvel extrado do milho, e
o litro custa US$ 0,47. Segundo estudos da Organizao para a Cooperao
e o Desenvolvimento Econmico (OCDE), o lcool brasileiro leva vantagem
tambm no que se refere ao meio ambiente. Enquanto o
combustvel extrado da cana-de-acar reduz as emisses de gs
carbnico em 80%, na comparao com a gasolina, o similar norte-
americano s reduz em 20%.
A reduo de custos um objetivo evidente para a produo de lcool
de fontes amilceas. Isto poderia ser atingido, dentre outras maneiras, pela
reduo do consumo de enzimas amilolticas utilizadas no processo
(KOSOWSKI et al, 2006). Muitos estudos tm sido desenvolvidos visando
aperfeioar o processo de produo de lcool de amilceos (KOSOWSKI et
al, 2006, LGEN et al, 2002, VERMA et al, 2000).
A produo de lcool de mandioca poderia ser incentivada em regies
onde as condies do solo so imprprias para o cultivo da cana-de-acar
e apropriadas para esta raiz, que uma cultura pouco exigente em
fertilidade. A utilizao da mandioca poderia suprir as necessidades deste
11
combustvel durante as pocas de entressafra da cana-de-acar, j que
esta matria prima apresenta disponibilidade em todo ano e em todo o pas.

2.5 Processos de obteno do etanol

O etanol pode ser obtido por duas maneiras gerais: por sntese qumica
e por via biolgica ou fermentativa. A via destilatria outra forma de se
obter etanol a partir de fermentaes de resduos semi-slidos vincolas,
porm no tem significado econmico no Brasil, a no ser em algumas
regies vincolas, para o controle de preo de determinadas castas de
vinhos de mesa. Por via sinttica se obtm o etanol a partir de
hidrocarbonetos no saturados, como o eteno e o etino, e de gases de
petrleo e da hulha. Nos pases em que h grandes reservas de petrleo e
indstria petroqumica avanada, a forma econmica de se produzir lcool.
A via fermentativa a maneira mais importante para a produo de lcool
etlico no Brasil. Mesmo que se venha a ter disponibilidade de derivados de
petrleo que permitam a produo de lcool de sntese, a via fermentativa
ainda ser de grande importncia para a produo de lcool potvel, sob a
forma de aguardentes (AQUARONE et al, 2001).
No pas, podem-se considerar dois tipos de destilarias de lcool: as
anexas e as autnomas. As primeiras so parte integrante de uma usina de
acar, podendo utilizar o caldo ou mis e as segundas so independentes,
com matria prima prpria (CAMPOS, 1982).

2.6 Matrias-primas para obteno de etanol

Um dos fatores que torna a produo de etanol por fermentao a
forma mais econmica de sua obteno o grande nmero de matrias
primas naturais existentes em todo o pas. Sua privilegiada distribuio
geogrfica, que encerra diversos climas e tipos de solos, permite a produo
em quase todo o territrio e durante todo o ano. Qualquer matria que
contenha acar ou outro carboidrato constitui-se em matria-prima
potencial para a obteno de etanol (AQUARONE et al, 2001)
12
H vrias maneiras de classificar as matrias primas para a produo
de etanol, mas qualquer dos critrios que se adote deixa algo a desejar.
Pode-se classific-las em matrias aucaradas, agrupando a cana, a
beterraba aucareira, sorgo sacarino, milho sacarino, melaos, mel de
abelhas e frutas; em matrias amilceas e feculentas, agrupando gros
amilceos, razes e tubrculos feculentos como mandioca, batata doce,
babau; e em matrias celulsicas, incluindo palhas, madeiras, resduos
agrcolas e resduos sulfitcos de fbricas de papel (STUPIELLO, 1982).
Segundo STUPIELLO (1982) ainda que todo produto que contenha
carboidratos transformveis em lcool sacarose, glicose, frutose, amido,
celulose, etc. possa ser considerada matria-prima para a fermentao
alcolica, imprescindvel consideraes sobre os seguintes pontos: custo
aquisitivo da matria-prima; facilidade de transformao; rendimento em
lcool; disponibilidade e possibilidade de expanso; fonte de energia
empregada.
Dentre as matrias aucaradas costuma-se distinguir as diretamente
fermentescveis e as no diretamente fermentescveis. As primeiras so as
que contm monossacardeos e se limitam aos sucos de frutas. Sua
importncia reside na produo de lcool em bebidas como o vinho e a
cidra. As no diretamente fermentveis so as que contm dissacardeos,
que fermentam aps uma hidrlise, a qual se da o nome de inverso, e que
se realiza naturalmente por ao da invertase, enzima produzida pelo agente
de fermentao. A sacarose a representante mais importante dos
componentes da cana de acar e dos melaos (AQUARONE et al, 2001).
A disponibilidade e forma dos acares so importantes j no processo
de transporte para o interior da clula fermentativa de Saccharomyces.
Alguns acares j podem ser indisponveis para a fermentao a partir
desta etapa, como o caso da lactose, que no fermentescvel por
Saccharomyces devido restrio no sistema de transporte, hidrlise e
metabolismo da galactose (HOUGH et al 1995)
O sistema de transporte de acares (mono e dissacardeos) atravs
da membrana celular pode ser entendido na Figura 1 a seguir:
13

Figura 1: Transporte de acares atravs da membrana celular da levedura.
Fonte: (ZASTROW e STAMBUK, 2000).

O transporte dos acares atravs da membrana dependente de
transportadores especficos para cada tipo de acar. Estes transportadores
so as permeases, que so protenas transportadoras codificadas por genes
especficos (ZASTROW e STAMBUK, 2000).
Processos alternativos, como a utilizao de madeira e dos resduos
desta para se formar carboidratos solveis, foram praticados na Alemanha,
durante a segunda guerra mundial. Neste processo, havia inicialmente a
produo de acares por hidrlise cida, que eram posteriormente,
fermentados pela levedura. O produto final era empregado como alimento ou
suplemento alimentcio (MENEZES, 1982)
A massa de matrias celulsicas disponvel vultuosa, mas ainda no
oferece ao pas condies econmicas para a produo de etanol. O
processo de hidrlise, necessrio para sacarificar a celulose complexo, e o
teor de acares fermentescveis a ser obtido inferior ao encontrado nas
matrias-primas sacarinas (AQUARONE et al, 2001). Entretanto, esta via
tem sido bastante pesquisada atualmente no Brasil e no exterior.




14
2.7 Mandioca

2.7.1 Aspectos gerais da planta

A mandioca (Manihot esculenta) pertence famlia Euphorbiaceae,
uma das maiores dentro das dicotiledneas. Nesta famlia, so encontrados
290 gneros e aproximadamente 7.500 espcies distribudas em todas as
regies tropicais e subtropicais do globo, principalmente na Amrica e frica
(Barroso citado por DALLAQUA e CORAL 2002). Apresenta-se como um
arbusto de 2 a 3 metros de altura, de raiz tuberosa, com alto valor como
alimento quando cozida dependendo da variedade, mas de alto valor txico
quando crua (Reitz citado por DALLAQUA e CORAL, 2002). As razes so
utilizadas na alimentao humana, na forma de farinha, fcula ou polvilho,
tapioca, ou ainda frita ou cozida (Cereda citado por DALLAQUA e CORAL
2002).
Para completar um ciclo de crescimento, a planta de mandioca passa
por cinco fases fisiolgicas principais, sendo quatro ativas e uma de repouso
vegetativo. Estas fases de desenvolvimento so: brotao da maniva (broto
do caule que d origem uma nova planta), formao do sistema radicular,
desenvolvimento da parte area, engrossamento das razes de reserva e
fase de repouso. Esta planta tem uma fisiologia diferente dos cereais. Neste
ltimo grupo, nas plantas, primeiramente se processa o crescimento
vegetativo para depois iniciar o crescimento reprodutivo que o de interesse
econmico. Ao contrrio, na mandioca ocorre ao mesmo tempo o
crescimento da parte area e das razes fibrosas e a deposio do amido
nas razes de reserva. Este crescimento simultneo da parte area e
engrossamento das razes fibrosas com amido trazem para a cultura da
mandioca uma srie de problemas que no ocorrem nos cereais. Nestes no
existe competio pelos produtos da fotossntese entre os rgos
vegetativos e de armazenamento das reservas, enquanto que na mandioca,
ocorre uma competio entre a parte area e o sistema radicular pela
utilizao e pelo armazenamento de amido (TERNES, 2002).

15
2.7.2 Utilizao da mandioca no Brasil

Tradicionalmente, as variedades de mandioca (Manihot esculenta)
apresentam duas denominaes: de mesa, para o consumo humano e
industrial, para o processamento em farinha, fcula ou mesmo alimentao
animal. A mandioca de uso culinrio recebe diferentes denominaes nas
diversas regies do Brasil, tais como aipim, macaxeira ou mandioca de
mesa. A mandioca de grande utilizao na alimentao humana em todo o
pas. Uma grande variedade de produtos pode ser obtida a partir da
mandioca, como a farinha de mesa, fcula ou polvilho doce, beiju, carim ou
massa puba, tucupi, tacac e tambm a folha de mandioca consumida em
um prato tipicamente da Amaznia chamado manioba (MATTOS et al,
2002). Atualmente, novos produtos tm sido desenvolvidos com o objetivo
de agregar valor a esta cultura como a mandioca minimamente processada,
embalada a vcuo, pr-cozida congelada, fritas, chips e snacks (VILPOUX e
CEREDA, 2003).
Para as famlias nas faixas de renda de menos de um salrio mnimo, o
consumo de mandioca e seus derivados representa em torno de 10% da
despesa anual em alimentao, atrs apenas do feijo, com consumo
equivalente a 13% dessa renda (CARDOSO e SOUZA, 2002).
Um fluxograma da produo de fcula de mandioca esta apresentado
na figura 2 a seguir:
16

Figura 2: Fluxograma da produo de fcula de mandioca

A produo anual de fcula de mandioca no ano de 2006 foi de 574,8
mil toneladas, volume 5,1% maior que o de 2005. Apesar disso, em 2006 o
valor mdio da produo de fcula no Brasil ficou 7% menor que o
observado em 2005 (R$ 401,6 milhes), totalizando R$ 373,5 milhes. Em
2006, o principal setor comprador foi o de papel e papelo, adquirindo mais
de 26% da produo total. O segundo principal setor comprador foi o de
frigorficos (19,5%), seguido por atacadistas (16,8%), massas, biscoitos e
panificao (14,5%), indstrias qumicas (6,6%), setor txtil (4,9%) e
varejista (4,8%). A compra de fcula por outras fecularias (transao dentro
do setor) representou 3,1%. Em 2006, os preos chegaram a ser inferiores
aos custos de produo, diminuindo a rentabilidade do produtor e reduzindo
o interesse pelo plantio de novas reas (CEPEA/ESALQ, 2006).
Para produzir uma tonelada de raiz de mandioca o produtor rural
gastou em 2006 R$ 110,95 (sem considerar juros cobrados por emprstimos
para execuo do plantio, o que elevaria este valor para R$
125,16/tonelada), enquanto que o preo mnimo do Governo Federal era de
R$ 54,00 por tonelada. Considerando-se este valor, a produo de uma saca
de 25 quilos de fcula de mandioca custa R$ 15,61, contra os R$ R$ 11,00
do preo mnimo estabelecido pelo Governo. Tambm com base no mesmo
17
parmetro, a saca de 50 quilos de farinha de mandioca tem custo de R$
24,64, enquanto o Governo tem como preo mnimo o valor de R$ 15,00.
(PORTO, 2006; MELO 2006).

2.3 Amido

O amido o maior polissacardeo de reserva das plantas e o segundo
mais abundante depois da celulose. O material puro pode ser obtido por
processos simples a partir de partes de plantas como sementes, caules e
razes (HIZUKURI, 1996). O amido se armazena em rgos de reserva
durante uma fase do ciclo de vida da planta para ser utilizado mais tarde em
outros ciclos. Amidos de rgos de reserva de vrias plantas tm
importncia comercial (SHANNON e GARWOOD, 1984).
Amido pode ser encontrado em todos os rgos de muitas plantas
superiores. rgos que contm amido incluem plem, folhas, razes, bulbos,
rizomas, frutas, flores e no pericarpo, cotildones, embrio e endosperma
das sementes. Alm das plantas superiores, amido encontrado em
musgos, samambaias e alguns protozorios, algas e bactrias (SHANNON e
GARWOOD, 1984).
A formula geral do amido (C
6
H
10
O
5
)
n
. As unidades de glicose esto
ligadas entre si pelos carbonos C1 - C4 e C1 - C6, atravs de oxignio,
formando ligaes glicosdicas (1-4) e (1-6) (SURMELY et al, 2003).
O amido possui dois tipos de polmeros da glicose, a amilose e a
amilopectina. O primeiro consiste de cadeias longas, que acreditava-se
serem no ramificadas de unidades de D-Glicose unidas por ligaes (1-
4). Tais cadeias variam em peso molecular de uns poucos milhares at
500.000. A amilopectina tambm tem peso molecular alto (at 1 milho),
porm altamente ramificada. As ligaes glicosdicas unindo os resduos
de glicose nas cadeias de amilopectina so (1-4), mas os pontos de
ramificao, que ocorrem entre cada 24 e 30 resduos, so ligaes (1-6)
(LEHNINGER, 1995).
Embora a amilose seja definida como linear, reconhecido agora que
algumas molculas de amilose tenham vrias ramificaes, como na
amilopectina (HIZUKURI, 1996). Os grnulos de amido so estruturas semi-
18
cristalinas compostos de macromolculas lineares e ramificadas arranjadas
na direo radial. Essas molculas formam pontes de hidrognio, pois esto
associadas paralelamente, o que resulta no aparecimento de regies
cristalinas ou micelares (FRANCO et al, 2002).
A cristalinidade do grnulo de amido gira em torno de 15% a 45%.
(FRANCO, et al 2002). Nos grnulos de amido nativo, um grande nmero de
cadeias macromoleculares est organizado em estruturas cristalinas. Trs
padres de cristalinidade foram encontradas por difrao de raio-X, os
padres A, B e C. Somente as estruturas A e B esto bem conhecidas.
Existe uma variao na susceptibilidade dos grnulos de amido a digesto
enzimtica, isto explicado pela variao na morfologia do grnulo e sua
organizao cristalina (GALLANT et al, 1992).
O arranjo da amilose e da amilopectina nos grnulos leva formao
de zonas de deposio mais ou menos densas. As cadeias de amilopectina
esto radialmente arranjadas dentro do grnulo com seus terminais no
redutores em direo superfcie, e estas so organizadas alternando reas
cristalinas (em forma de dupla hlice) e amorfas (regio com pontos de
ramificao) com periodicidade de 9 nm. Esse arranjo dificulta a entrada de
molculas como as de gua e enzimas, apresentando-se portanto mais
resistente ao processo de hidrlise (FRANCO et al, 2002).
A estrutura do grnulo de amido est intimamente ligada ao seu
desenvolvimento na clula viva. O amido armazenado nas clulas das
sementes, razes, dos tubrculos, etc., acha-se depositado como grnulos
mais ou menos brilhantes apresentando formas e dimenses diversas. O
grnulo de amido de mandioca apresenta forma esfrica ou hemisfrica,
com dimetro variando entre 11 e 12 m enquanto que o do milho ceroso
apresenta forma apresenta forma polidrica com 12 m de dimetro
(FRANCO et al, 2002).
Os amidos podem ser classificados em funo de sua susceptibilidade
ao enzimtica. Em ordem decrescente de susceptibilidade so citados
os amidos de milho ceroso, mandioca, sorgo ceroso, sorgo, milho, arroz,
sagu, araruta e batata. Observam-se dois padres de degradao
enzimtica dos grnulos: eroso e fragmentao extensiva dos grnulos nos
19
amidos de milho e sorgo (normais e cerosos) e destruio seletiva nos
grnulos de outros amidos. Os amidos de mandioca, entre os amidos de
outras fontes botnicas que no os cereais, so dos menos resistentes a
degradao enzimtica. No est claro se a amilose ou a amilopectina a
frao mais atacada quando se faz o tratamento enzimtico dos grnulos de
amido (FRANCO et al, 2002).
Segundo FRANCO e CIACCO (1997), a susceptibilidade enzimtica
ao da -amilase e amiloglucosidase foi maior para o amido de milho
ceroso do que para o milho comum. Isto estaria relacionado no s com teor
de amilose, mas tambm com as diferenas de estrutura dos grnulos de
amido.
O contedo de amilose do grnulo parece ser um dos fatores
envolvidos na resistncia do amido (tanto para hidrlise cida como
enzimtica). Isto est evidente em amidos contendo altos nveis de amilose
(por exemplo, ervilha enrugada e grnulos B pequenos do trigo) so mais
resistentes ao ataque enzimtico que os amidos correspondentes com
menor contedo de amilose (milho normal e waxy, ervilha lisa e grnulos de
trigo grandes do tipo A, respectivamente) (GALLANT et al, 1997).
Batatas no mutantes tm, no entanto, contedo normal de amilose
(24%) e altamente reistente enzima, indicando assim que o contedo de
amilose no grnulo no pode completamente descrever a resistncia do
grnulo enzima. As camadas cristalinas e amorfas da amilopectina
organizadas dentro de estruturas mais ou menos esfricas chamadas
bloquetes. A resistncia enzimtica do amido de batata deve estar ligada ao
grande tamanho dos bloquetes, mas pode tambm indicar que a extenso
da interao da amilose com a amilopectina influencia a cristalinidade e a
resistncia. Alm do mais, a localizao da amilose dentro dos grnulos
pode influenciar a cristalinidade e resistncia local. conhecido que existe
um enriquecimento de amilose na superfcie do grnulo em muitos amidos,
includo trigos e batata, o qual pode ser responsvel pelo aumento da
resistncia na superfcie do grnulo (GALLANT et al, 1997).
A resistncia do amido a ao das enzimas da digesto pode se dar de
trs maneiras: o amido fisicamente inacessvel na matriz do alimento, por
causa das paredes celulares e protenas; o amido granular nativo, que
20
resistente s enzimas devido a sua compacidade e estrutura parcialmente
cristalina, podendo ser convertido por gelatinizao; e polmeros de amidos
retrogradados (principalmente amilose), produzidos quando o amido
resfriado aps a gelatinizao (LOBO e LEMOS SILVA, 2003).
A taxa de hidrlise do grnulo de amido depende muito da distribuio
das camadas cristalinas e semicristalinas e do tamanho, identidade e
interao dos seus constituintes. Amidos de batata e amylomaize (ambos
com padro cristalino B e considerados amidos resistente) apresentam a
camada perifrica espessa composta de grandes bloquetes empilhados, o
que explica a baixa taxa de hidrlise nestes amidos (GALLANT et al, 1997).

2.4 Enzimas

2.4.1 Definio

Com exceo de um pequeno grupo de molculas de RNA catalticas,
todas as enzimas so protenas. Sua atividade cataltica depende da
integridade da conformao protica nativa. Se uma enzima desnaturada
ou dissociada em suas subunidades, a atividade cataltica geralmente
perdida. Se uma enzima quebrada em seus aminocidos componentes,
sua atividade cataltica sempre destruda. Assim as estruturas primria,
secundria, terciria e quaternria das enzimas so essenciais para sua
atividade cataltica. Algumas enzimas no requerem nenhum grupo qumico
para atividade alm dos grupos aminocidos. Outras requerem um
componente qumico adicional chamado cofator um ou mais ons
inorgnicos tais como Fe
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
, ou Zn
2+
, ou um complexo orgnico
ou molcula metalorgnico chamada coenzima (LEHNINGER, 2005)
As enzimas so substncias slidas, mas difceis de serem
cristalizadas, devido complexidade de suas estruturas qumicas. Com
algumas excees, so solveis em gua e em lcool diludo, e quando em
solues so precipitados pela adio de sulfato de amnio, lcoois ou acido
tricloroactico. So inativadas pelo calor e esta talvez seja a caracterstica
mais importante destes compostos em relao a tecnologia de alimentos
(BOBBIO, 1995).
21
A ao cataltica das enzimas se faz como a dos catalisadores
inorgnicos, atravs da reduo da energia de ativao da reao ou
alterao do seu equilbrio termodinmico. Alm de reduzirem
significativamente a energia de ativao, as enzimas apresentam alta
especificidade, que pode se expressar quanto ao tipo de reao ou de
substrato. Apenas alguns resduos aminocidos participam diretamente da
ao cataltica, embora cadeias de aminocidos situadas prximas ao stio
cataltico tenham importante funo de fixao e posicionamento da
molcula de substrato (AQUARONE et al, 2001).
As reaes necessrias para digerir alimentos, enviar sinais atravs
dos nervos, ou contrair um msculo simplesmente no ocorrem em
velocidade til sem catlise. Uma enzima contorna estes problemas
fornecendo um ambiente especfico dentro do qual uma reao dada
energeticamente favorvel. A caracterstica distintiva de uma reao
catalisada enzimaticamente que ela ocorre no interior dos limites de uma
cavidade chamada stio ativo (LEHNINGER 1995).
Enzimas podem ser obtidas de fontes animais (pancreatina, pepsina,
renina, catalase), de fontes vegetais (papana, bromelina, ficina, amilases do
malte) ou a partir de microrganismos (AQUARONE, 2001).

2.4.2 Enzimas Amilolticas

As amilases so uma classe de hidrolases vastamente distribudas na
natureza. Estas agem especificamente sobre as ligaes glicosdicas do
amido. Atuam na digesto, como as amilases salivar e pancretica, na
germinao de gros e no crescimento microbiano (HIZUKURI, 1996;
WHITAKER, 1994). Existem diversos tipos de enzimas amilolticas e elas
tm utilizaes em varios tipos de indstrias como a de papel, txtil,
panificao, produo de xaropes, lcool, bebidas, dentre outras.
As -amilases so encontradas em animais, plantas e microrganismos
(HIZUKURI, 1996, WHITAKER, 1994). As -amilases so abundantemente
encontradas em plantas, especialmente em trigo, soja, batata doce e
algumas culturas de microrganismos (Bacillus polymyxa, B. cereus e B.
megaterium) (HIZUKURI, 1996).
22
A -amilase (EC 3.2.1.2, -1,4 glicano-maltohidrolase) uma
exoenzima a qual tem uma ao rigidamente ordenada. Ela ataca a amilose
e a amilopectina somente a partir de extremidades no redutoras e
sequencialmente hidrolisa toda ligao (1-4) posterior. Isso gera maltose
(um dissacardeo fermentescvel) e uma nova molcula de amido com
reduzido peso molecular. A -amilase capaz de repetir essa ao com
grande velocidade, especialmente na presena de grandes molculas pelas
quais ela tenha alta afinidade. Sob essas condies ela provavelmente faz
mltiplos ataques primeiramente em uma cadeia de amilose ou amilopectina
e depois comea a agir em outra. Esta a condio para uma ao mais
rpida. Sua taxa de atuao consideravelmente baixa com pequenas
molculas pelas quais ela tem pouca afinidade. A ao da enzima tambm
diminui e para de agir medida que se aproxima dos pontos de ligao (1-
6) da amilopectina. A -amilase, atuando sozinha (e tendo tempo
suficiente), capaz de converter a amilose quase inteiramente maltose.
Em contraste, esta ataca somente as regies externas da amilopectina
liberando no mais que 10% a 15% dos resduos de glicose como maltose e
deixando -dextrinas limites. A -amilase precisa acessar o interior da
estrutura da amilopectina, a qual compreende 75 a 80% do amido nativo, e
representa a maior parte extrato potencial do amido. (SANTANA, 2003,
LEWIS e YOUNG, 1995, KENT, 1975).
As molculas de amilose linear so completamente degradadas a
maltose se as molculas forem compostas de um mesmo nmero de
resduos glicosil e uma molcula de glicose produzida no final se elas
inclurem um nmero mpar de resduos. Entretanto, maltotriose pode
permanecer por ser difcil de ser hidrolisada (HIZUKURI, 1996).
Na ausncia de amilase, a amilase quebra por volta de um tero da
amilopectina, deixando como resduo, dextrinas de maior massa molar
altamente resistentes, conhecida como dextrinas limites. Entretanto, na
presena de pequenas quantidades de amilase, a amilase hbil a
renovar seu ataque s extremidades no redutoras das pores de
molculas liberadas pela amilase (KENT, 1975).
23
A batata doce tambm apresenta quantidades considerveis de -
amilase (BOYER, 1971). A enzima cristalizada pode ser preparada por
processos bastante simples a partir de batata doce, incluindo recristalizao
a partir de sulfato de amnio (HIZUKURI, 1996). Da cevada malteada
prepara-se a -amilase separando-a da -amilase por extrao fracionada.
A -amilase tem pH timo na faixa de 4,0 e 6,0 e temperatura tima na
faixa de 30C a 50C. O peso molecular destas enzimas esta compreendida
entre 150 KDa e 200 KDa.
A -amilase (EC 3.2.1.1; -1,4 glicano 4-glicanohidrolase) uma
endoenzima. Tal como a -amilase, ela ataca somente as ligaes (1-4),
mas de forma aleatria. Desta maneira, qualquer ligao (1-4) na molcula
de amido (exceto aquelas prximas de uma ligao (1-6) em um ponto de
ramificao) possvel sofrer hidrlise como qualquer outra. Assim, a -
amilase produz quantidades significativas de acares fermentescveis
(glicose, maltose e maltotriose) somente quando ela atua em molculas
relativamente pequenas. Entretanto, a -amilase de Thermoactinomyces
vulgaris fracamente hidrolisa ligaes (1-6) (HIZUKURI, 1996).
A amilase rompe as ligaes (1-4), ao acaso dentro da molcula de
amido, de maneira que se formam pequenas cadeias de dextrose,
denominadas dextrinas. Isto torna a pasta gelatinizada menos consistente e
fornece maior nmero de terminais de cadeias para a ao das enzimas
sacarificantes. Esta enzima no rompe as ligaes (1-6), portanto, todos
os pontos de ramificao ficam intactos aps o tratamento com a amilase
(MENEZES, 1982). Por esta razo, esta enzima e comumente denominada
de enzima liquidificante.
A amilase abre as molculas maiores de amido (especialmente
amilopectina), para que a ao da -amilase seja facilitada. Toda ligao
(1-4) hidrolisada pela amilase cria uma nova extremidade no redutora
onde a -amilase pode agir. Entretanto, como a amilase trabalha melhor
em molculas maiores, o excesso de amilase, que quebra o amido
rapidamente, reduzindo-o a dextrinas, pode ser prejudicial para a
fermentabilidade do mosto. Assim, a quantidade relativa da ao da e -
24
amilases em uma mistura afetam fortemente as propriedades do mosto
(SANTANA, 2003, LEWIS e YOUNG, 1995, KENT, 1975).
O massa molar da -amilase varia de 10 a 210 KDa, dependendo da
sua origem. As -amilases microbianas apresentam peso molecular entre
50 e 60 KDa (Gupta citado por SPIER, 2005), sendo que as -amilases
bacterianas apresentam variao de 28 a 78 KDa e as -amilases fngicas
de 41 a 69 KDa ( Pandey citado por SPIER, 2005).
De acordo com SPIER (2005), o pH timo para a -amilase fngica
est entre 5,0 e 6,0. Possui carter cido e solvel em gua. Sua atividade
diminui rapidamente em temperaturas acima de 50C, mas na presena de
um excesso de ons clcio a desativao pode ser diminuda.
Os ons de clcio atuam como cofatores das -amilases,
estabilizando-as, dentro de certos limites, contra a desnaturao produzida
pelo calor e lcalis. Por outro lado, ons como o de cobre e do mercrio
inibem a -amilase, j que interagem com os grupos sulfidrila do centro da
enzima, bloqueando sua atividade (QUAGLIA, 1991).
Cereais, como cevada, trigo, centeio e arroz apresam pouca ou
nenhuma -amilase, mas esta aumenta rapidamente sua atividade durante
a germinao (HIZUKURI, 1996).
A faixa de atuao das -amilases de cereais esta compreendida entre
55C e 80C. O pH timo para a sua atividade nos cereais esta entre 5,2 e
5,4. As amilases tm escassa ao sobre o amido intacto, tendo maior ao
aps a gelatinizao do amido. (QUAGLIA, 1991).
BIAZUS et al 2006 concluiram que as faixas de pH e temperatura
timas das amilases do malte de milho esto entre 4,3 e 6,0 e 50C e 80C,
respectivamente.
A faixa tima de temperatura para atividade das -amilases de 55 a
70C, que varia dependendo da fonte, sendo que as bacterianas apresentam
maior estabilidade frente s temperaturas superiores a 40C, com atividade
tima em torno de 70C. (Reed citado por SPIER 2005).
As enzimas do malte j foram utilizadas anteriormente na hidrlise de
amido visando a produo de lcool. Tanto na usina de Divinpolis, quanto
em outras poucas usinas existentes na poca, a tcnica de produo
25
baseava-se nos mtodos alemes de fermentao de batata, utilizando
malte de milho para sacarificao do amido, porm esta idia no foi muito
aplicada nem estudada. (ARAJO, 1982)
As pesquisas com as -amilases bacterianas tem recebido grande
ateno nos ltimos anos devido sua maior termoestabilidade. Entretanto,
a sua utilizao para a liquefao do amido tem se constitudo na unidade
operacional mais cara do processo de sacarificao principalmente por
serem produzidas por fermentao submersa (Souza citado por SPIER,
2005).
O quadro 1 apresenta algumas diferenas entre amilases de diferentes
fontes.

Quadro 1: pH, temperatura tima e temperatura de inativao de alguns
tipos de -amilases de diferentes fontes.
Origem pH timo Temperatura tima
(C)
Temperatura de
inativao (C)
Pancretica 6,9 (7,0-8,8) 46 55
Fngica 5,0 (5,5-8,5) 55 82
Malte 5,0 (4,9-9,1) 60 80
Bacteriana 7,0 (4,8-8,5) 70 93
Fonte: QUAGLIA, 1991.

A 75C a atividade da -amilase proveniente dos fungos reduzida
para menos de 10%, enquanto que a dos cereais reduzida para
aproximadamente 30% e das bactrias em torno de 80%. O comportamento
das -amilase tambm diferente em meio cido. A proveniente dos fungos
a que apresenta melhor ao em meio acido (pH = 5,0), enquanto que a
oriunda de bactrias tem seu pH timo ao redor de 7,0 (QUAGLIA, 1991).
Segundo MENEZES (1982), uma outra enzima atua no amido a -
glicosidase, que ataca as ligaes (1-4), das molculas de maltose e, em
menor grau, as dextrinas, formando glicose.
A amiloglicosidase (EC 3.2.1.3 -D-1,4 glicanglicohidrolase), ou
tambm conhecida como glicoamilase ou amilase, uma exoenzima que
26
catalisa a reao de hidrlise das ligaes -1,4 e -1,6 das extremidades
no redutoras do amido e de outros polissacardeos transformando-os em
glicose. Sua vantagem reside no fato de alcanar altos rendimentos,
prximos ao estequiomtrico (BOYER, 1971).
A amiloglicosidase , em sua maior parte, produzida por espcies de
fungos do gnero Aspergillus e Rhizopus, sendo que, dentre essas, a
amiloglucosidase de Aspergillus a mais termoestvel. A amiloglicosidase
catalisa eficientemente a hidrlise do amido dentro de uma faixa estreita de
temperatura (SANTOS, 2006).
Moreira citado por SANTOS (2006), relatam em seu trabalho que as
enzimas -amilase e amiloglucosidase parcialmente purificadas exibiram
mxima atividade na faixa de pH entre 4,5 a 6,0, apresentando grande
estabilidade sob condies cidas (pH 4,0 a 7,0). A mxima atividade
ocorreu em temperaturas entre 50C e 60C, apresentando estabilidade por
mais de 10 horas 55C. O quadro 2 abaixo apresenta algumas
caractersticas das amilases.


















27
Quadro 2: caractersticas dos diferentes tipos de amilases sobre o amido.
Caracterstica -amilase -amilase Glicoamilase
Especificidade Ligao -1,4 Ligao -1,4 Ligao -1,4 e -
1,6
Mecanismo Endoamilase Exoamilase Exoamilase
Principal
produto da
hidrlise

Dextrinas

Maltose

Glicose
Diminuio da
consistncia
Rpida Lenta Lenta
Perda da cor do
iodo
Rpida Lenta Lenta
Aumento do
poder redutor
Lento Rpido Rpido
Produo de
glicose
Lenta No Rpido
Produo de
maltose
Lenta Rpida No
Produo de
dextrinas
Rpida Lenta Lenta
Fonte: QUAGLIA, 1991.

A pululanase ( -dextrina-6 glucanohidrolase, EC 3.2.1.41) um tipo de
enzima amiloltica. uma endo amilase desramificadora que hidrolisa as
ligaes (1-6) do pululano (um polmero linear de com cerca de 250
unidades de maltotriosil unidas por ligaes (1-6) e as e dextrinas
limites da amilopectina e glicognio (WHITAKER, 1994). A pululanase pode
ser produzida por bactrias como Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus e
Aerobacter aerogenes (HIZUKURI, 1996).
Esta enzima parece hidrolisar as ligaes (1-6) prontamente em
polissacardeos, mas no em polmeros menores e nos dmeros isomaltose
e panose. Ela requer que cada duas cadeias de amilopectina ligadas por
28
uma ligao (1-6) contenham no mnimo duas unidades de glicose ligadas
por ligao (1-4) adjacentes (WHITAKER, 1994).
Uma enzima muito similar a pululanase encontrada em uma grande
variedade de plantas superiores fava, batatas, pra, arroz e gros
germinados de cevada, sorgo e milho doce, chamada de R-enzima ou
dextrinase limite. Ela desramifica amilopectina, dextrinas limites da
amilopectina e os mesmos tipos de oligossacardeos que a pululanase de
Aerobacter. Ela tambm hidrolisa pululano e no mostra ao no glicognio
e dextrinas do glicognio (HIZUKURI, 1996; BOYER, 1971).

2.5 Malte

A utilizao do malte para a produo de bebidas alcolicas data de
pocas remotas, sendo a cevada uma das suas formas mais conhecidas. A
diastase (amilase) do malte foi uma das primeiras enzimas a serem
identificadas no incio do sculo XIX. Desde ento as enzimas do malte tm
sido intensamente estudadas. A partir do malte de cevada e de outros
cereais, possvel extrair uma variedade muito grande de enzimas, tais
como: proteases, lipases, oxirredutases e hemicelulases, sendo as amilases
as principais enzimas contidas no malte (AQUARONE, et al 2001)

2.5.1 Produo do malte

A malteao inicia com a macerao, onde o cereal absorve gua, a
respirao aumenta lentamente no inicio do processo e rapidamente depois,
causando acmulo de CO
2
. Para evitar este inconveniente, a gua deve ser
trocada vrias vezes e a massa de gros deve ser aerada constantemente.
A gua deve ser potvel, e gelada. Entre as trocas de gua, ar bombeado
atravs da massa de gros. A umidade se eleva de aproximadamente 12% a
13% para 42% a 46%. A macerao dura geralmente de 40 a 50 horas ou
mais em poucos casos, e a temperatura da gua deve ser de 10 a 15C
(LEWIS e YOUNG, 1995).
29
Nesta fase formam-se as enzimas que compem o malte. O cereal
formado por embrio, endosperma, camada de aleurona, e recobrindo todo o
gro, o epicarpo. Aproximadamente 90% do gro so constitudos de amido.
A camada da aleurona responsvel pelo fornecimento de enzimas que
atuam na hidrlise do endosperma. Muitas destas enzimas so liberadas
em resposta s mensagens enviadas pelo embrio, na forma de um
hormnio chamado cido giberlico. Outras enzimas esto presentes nos
gros antes de sua germinao, como o caso das amilases (QUAGLIA,
1991, AQUARONE et al, 2001, KENT, 1975).
Acompanhando o aumento da atividade enzimtica, a qual mobiliza
substncias de alto peso molecular no gro e permite sua translocao do
embrio para fazer novos tecidos durante o crescimento, h um considervel
aumento da taxa de respirao do gro - processo no qual o material
amilceo convertido em dixido de carbono e gua. As perdas de matria
seca durante a malteao, devido a respirao, so de 5% a 9% geralmente,
dependendo do tempo em que o gro permanece na malteao. A perda
minimizada quando a germinao rpida e uniforme (KENT, 1975).
A durao do processo de germinao depende da velocidade com que
as enzimas hidrolticas alteram o endosperma. A faixa de temperatura
empregada na germinao varia de 5C a 25C, com um timo em torno de
15C. Entre as vrias enzimas produzidas durante este processo, as mais
importantes so as amilases e amilases (LEWIS e YOUNG, 1995).
Vrias enzimas so liberadas durante a germinao: entre as primeiras
est a citase, uma enzima que dissolve o material de ligao das paredes
celulares do endosperma e ajuda a liberar o amido contido no gro nas
clulas do endosperma. Outras enzimas que se tornam ativas nos primeiros
estgios incluem fosfatase, fitase, hemicelulase e protease. As amilases se
tornam ativas em estgios posteriores (KENT, 1975).
As proteases so responsveis pela hidrlise de protenas insolveis
em gua, degradando-as em aminocidos que sero utilizados na sntese de
novas protenas durante a germinao. Alm disso, as matrizes proticas
que envolvem os gros de amido devem ser degradadas antes da amilase
atuar sobre elas. O tempo de germinao varia de acordo com a qualidade
30
do malte que se quer obter. Normalmente, a germinao interrompida no
momento em que a quantidade de enzima produzida e as modificaes do
endosperma atingem os nveis ideais, muitas vezes determinado de acordo
como o tamanho do broto germinado (AQUARONE et al, 2001).
A secagem com ar aquecido reduz o contedo de umidade do malte de
45% a 50% para cerca de 3 a 5%. A secagem deve atingir baixa umidade no
malte e o sabor desejado. Isto requer calor, porm deve conservar as
enzimas, as quais o calor pode inativar. Entretanto as enzimas so muito
mais estveis ao calor no malte seco do que no malte mido. O processo de
secagem do malte se divide em trs estgios. No primeiro, o produto
encontra-se bastante mido e a gua superficial do gro e aquela das
camadas inferiores, prximas superfcie, podem ser facilmente removidas
pelo uso de correntes de ar elevados, temperaturas de 50C a 60C. Nesta
fase, a evaporao da gua dos gros esfria-os fazendo com que as
enzimas do malte no sejam to sensveis temperatura inicial do ar de
entrada. Durante esta fase o teor de umidade do malte reduzido para 23%
a 25% em base mida. No segundo estgio, a umidade deve difundir das
camadas mais profundas do gro para a superfcie e, ento, ser removida. A
umidade reduzida para 12%. O gro encolhe medida que seco, e isto
reduz a distncia que a gua deve percorrer no gro, como tambm a rea
superficial na qual ela pode ser vaporizada. Se a temperatura e o volume de
ar de secagem permanecerem os mesmos, o ar de sada carrega menos
gua que a sua carga mxima, sendo necessrio um aumento de
temperatura para prximo a 70C, para aumentar a eficincia de secagem.
Quando a cevada encontra-se abaixo de 12%, h praticamente, apenas a
gua de constituio e, para remov-la, a temperatura do ar deve ser
novamente elevada. Geralmente, neste estgio so usadas temperaturas de
80C a 85C. Neste terceiro estgio, a umidade reduzida de 12 para 5%, e
quando o gro se aproxima de 5% o malte est curado e, ento, deixado
em repouso de 4 a 8 horas, at alcanar umidade final de 3% a 5% (LEWIS
e YOUNG, 1995).
BIAZUS et al (2005), estudando a produo de malte de milho, afirmam
que a mxima atividade enzimtica nas sementes germinadas foi obtida no
31
quarto dia e a melhor condio de secagem foi a temperatura de 54 C e em
tempo menor ou igual 6 horas.
Segundo BIAZUS et al (2006), as amilases do malte de milho
apresentam faixa tima de pH entre 4,3 e 6,0 com temperaturas timas a
50C e 80C.
O malte de sorgo muito utilizado em diversas partes do mundo. Uma
das suas principais aplicaes na cerveja de Kaffir, uma bebida tradicional
dos habitantes do sul da frica. Para um maior desenvolvimento do poder
diasttico, necessria uma temperatura de 25 C a 35 C e a manuteno
de umidade elevada. O malte de sorgo rico em amilase, sendo apenas
18 a 39% de sua atividade amiloltica devida a amilase (WALL e ROSS,
2004).
DEWAR et al (1997) estudaram o efeito do tempo, temperatura e
aerao na qualidade do malte de sorgo e relatam que o tempo e a
temperatura de macerao tiveram um efeito altamente significante na
qualidade do malte de sorgo. De maneira geral, a qualidade do malte
aumentou como o tempo de macerao de 16h a 40 h. O poder diasttico
teve elevao com o aumento da temperatura de macerao acima de 30C.
GEORG-KRAEMER et al (2001) estudaram dez cultivares de cevada
brasileira. Estes autores concluram que para os cultivares analisados,
existiu alta atividade das amilases por volta do quarto dia de germinao,
indicando que a germinao poderia para neste momento. Alguns cultivares
manteram alta atividade amiloltica at o ltimo dia, enquanto que outras
apresentaram decrscimo no quinto e sexto.
CAPANZANA e BUCKLE (1997) estudaram a otimizao do processo
de malteao de gros de arroz. As condies timas de germinao foram:
tempo de macerao de 24 h a 25 C ou 16 h a 35 C, tempo de germinao
de 3 dias a uma temperatura de 30C.

2.6 Fermentao alcolica

A classe de microrganismos responsveis pela fermentao alcolica
a das leveduras, embora algumas bactrias como no caso de Zymomonas
32
mobilis tambm tenham esta capacidade (AMUTHA e GUNASEKARAN,
2001, DAVIS et al, 2006).
As leveduras so fungos unicelulares geralmente pertencentes s
classes dos Ascomicetos. Apresentam forma oval, elptica ou arredondada.
Possuem parede celular rgida, membrana citoplasmtica e as mesmas
organelas que so geralmente encontradas em eucariotos, tais como ncleo,
mitocndria, retculo endoplasmtico (VENTURINI FILHO e MENDES,
2003).
Para o seu desenvolvimento e sobrevivncia, as leveduras necessitam
de carbono, principalmente na forma de carboidratos e estes nas formas de
monossacardeos ou dissacardeos. Quanto ao ambiente, as leveduras se
desenvolvem numa faixa ampla de temperatura, sendo que o intervalo timo
situa-se entre 20 e 30C. Em relao ao pH, os limites esto entre 2,2 e 8,0.
Estes microrganismos tambm apresentam elevada resistncia osmtica
(VENTURINI FILHO e MENDES, 2003).
Cerca de 500 espcies de leveduras so conhecidas pelo homem.
Dentre elas destacam-se como produtoras de etanol, espcies do gnero
Saccharomyces, Schizosaccharamyces, Pichia entre outras. As leveduras
utilizadas para a fermentao alcolica devem apresentar alto rendimento e
elevada produtividade de etanol, ou seja, rpida converso de acar em
lcool, com baixa produo de componentes secundrios. A espcie mais
importante de levedura alcolica a Saccharomyces cereviseae, que possui
um largo espectro de utilizao. empregada na produo de pes,
bebidas, etanol, etc. Sua biomassa pode ser recuperada como subproduto
de fermentao e transformada em levedura seca, que se constitui em
matria prima para a fabricao de rao animal ou suplemento vitamnico
para o homem (VENTURINI FILHO e MENDES, 2003).
As leveduras e outros microrganismos fermentam a glicose em etanol e
CO
2
e no em lactato. A glicose convertida a piruvato pela gliclise e o
piruvato convertido em etanol e CO
2
em um processo de dois passos. No
primeiro o piruvato sofre a descarboxilao em uma reao irreversvel
catalisada pela enzima piruvato descarboxliase. Esta reao uma
descarboxilao simples e no envolve oxidao do piruvato. No segundo
passo, atravs da ao da lcool desidrogenase, o acetaldeido reduzido a
33
etanol, com o NADH, fornecendo poder redutor. A equao geral da
fermentao alcolica (LEHNINGER, 1995):

Glicose + 2 ADP + 2 Pi 2 Etanol + 2 CO
2
+ 2 ATP + 2 H
2
O

A espcie Saccharomyces uvarum se distingue essencialmente da
espcie Saccharomyces cerevisiae pela capacidade de fermentao da
melibiose e rafinose (SILVA, 1989). Saccharomyces uvarum tem a
capacidade de hidrolisar a melibiose porque sintetiza a enzima melibiase
( -galactosidase) capaz de hidrolisar a ligao (1-6) entre as unidades
dos monossacardeos, liberando a glicose e galactose. Possui tambm
capacidade de hidrolisar a molcula de rafinose porque possui, alm da
melibiase, a invertase. A melibiase est ausente em Saccharomyces
cerevisiae, por isto essa espcie no metabolisa a melibiose e usa um tero
da molcula de rafinose. Durante a utilizao da rafinose e melibiose a
Saccharomyces uvarum pode fermentar glicose, galactose, sacarose e
maltose, se presentes no meio. Esta cultura pode ou no fermentar trealose
ou -metil-D-glucosideo, e no fermentam a celobiose, a lactose e o amido
solvel (SILVA, 1989).
Algumas diferenas existentes entre Saccharomyces cerevisiae e
Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), alm do uso da melibiose e da
rafinose, so o poder respiratrio, o grau de esporulao, a capacidade de
fermentar gliceraldedo e a intensidade de produo de H
2
S (SILVA, 1989).
Os acares fermentveis por Saccharomyces cerevisiae na
cervejaria consistem em glicose, frutose, maltose, maltotriose e sacarose
(SILVA, 1989).
As leveduras de baixa fermentao so espcies de Saccharomyces
uvarum (S. carlsbergensis), que produzem a cerveja americana e a alem
Pilsener do tipo lager. Essas cervejas so processadas pela fermentao
profunda (baixa), na qual as leveduras se depositam, aps a fermentao
tumultuosa, no fundo do tanque. Os agentes biolgicos de baixa
fermentao so considerados como de alta atividade fermentativa e de
menor capacidade respiratria que as leveduras de alta fermentao (S.
34
cerevisiae). A levedura de baixa fermentao desenvolve-se em
temperaturas de 5 a 15 C (REINOLD, 1997).
S. cerevisiae considerada levedura de alta fermentao, pois emerge
para superfcie aps a fermentao tumultuosa (ou principal). Essas
espcies de leveduras produzem as cervejas inglesas Porter ou Stout do tipo
ale, que geralmente so produzidas por fermentao superficial (alta). Esse
microrganismo se desenvolve em temperaturas entre 12 C e 21 C
(EHRHARDT & SASSEN, 1995; REINOLD, 1997).
De acordo com HORNSEY (2003), a superfcie celular das leveduras
de alta fermentao (ale) est coberta por pequenas protuberncias
microfibilares, que lhes conferem uma aspereza que permite que as clulas
fiquem em suspenso durante a fermentao. A parte da superfcie spera
da parede celular possui carga negativa e hidrofobicidade, caractersticas de
importncia para o processo cervejeiro. A carga negativa atribuda s
cadeias de fosfato localizadas na parede externa de manoprotenas; essa
carga importante durante a finalizao da cerveja para o engarrafamento,
quando os pontos positivamente carregados das molculas de colgeno
(material usado para a clarificao) atraem clulas de leveduras em
suspenso e provocam sedimentao.
Em 1952 Andrews e Gilliland isolaram uma variedade de
Saccharomyces responsvel por superatenuao de cerveja. Eles a
denominaram de S. diastaticus. Esta fermenta glicose, frutose, galactose,
maltose, sacarose e rafinose e tambm fermenta parcialmente dextrinas de
amido. Quando inoculada em cerveja jovem de densidade 1,0146, o limite de
atenuao final com S. cerevisiae foi 1,0106; com S. carlsbergensis esta foi
de 1,010 e com S. diastaticus esta foi de 1,0042. S. diastaticus requer
biotina, inositol e pantetonato de clcio para crescer (REED e PEPPLER
1973).
O quadro 3 apresenta o perfil de acares utilizados por algumas
leveduras.




35
Quadro 3: Acares comuns metabolizados por leveduras.
Acares fermentados e assimilados
G Ga Ma Su Me Ra La Xi

Saccharomyces cerevisiae

++

++

++

++

--

1/3+

--

--

Saccharomyces uvarum

++

++

++

++

++

++

--

--

Saccharomyces diastaticus

++

++

++

++

--

1/3+

--

--
G=glicose, Ga=galactose, Ma= maltose, Su=sacarose, Me=melibiose, Ra=rafinose,
La=lactose, Xi=xilose; ++=fermentvel e assimilvel; -- = no fermentvel e no
assimilvel; 1/3+ = 1/3 da molcula fermentada, a molcula inteira utilizada
aerobicamente. Fonte: REED e PEPPLER 1973.

Muitas modificaes genticas tm sido estudadas em leveduras com a
finalidade de obter mutantes com caractersticas especiais, tais como
tolerncia a altas concentraes de etanol e produo de enzimas
amilolticas. Esta ltima possibilita a utilizao de amido como substrato para
a produo de etanol. Estas modificaes so obtidas pela insero na
levedura de um gene de algum microrganismo que possua a caracterstica
desejada.
As leveduras do gnero Saccharomyces, que tradicionalmente so
utilizadas na produo de etanol, no possuem a habilidade de hidrolisar
amido. Devido este fato, alteraes genticas tm sido feitas nestes
microrganismos, com o objetivo de capacit-los a utilizar este tipo de
substrato (LIU et al, 2004). Geralmente inserido nestas leveduras, material
gentico de outro tipo de microrganismos, como fungos do gnero
Aspergillus, ou bactrias do gnero Bacillus (LIN et al, 1998, LATORRE-
GARCA et al 2004). Saccharomyces diastaticus uma variedade de
Saccharomyces que tem a capacidade de utilizar amido como substrato, por
possuir a capacidade de produzir e secretar glicoamilase. Entretanto, este
microrganismo no capaz de se desenvolver em amido nativo ou insolvel;
isto se deve ao fato de que a enzima produzida por este microrganismo no
possuir um domnio de ligao ao amido, como o que est presente na
36
glicoamilase produzida por Aspergillus niger, por exemplo (VERMA et al,
2000, LATORRE-GARCA et al 2004).
VERMA et al (2000), em trabalho com uma co-cultura de
Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces diastaticus, utilizando amido
solvel como substrato, concluiu que a fermentao direta do amido pode
ser efetivamente conduzida pela co-cultura, com eficincia de 93%,
comparada a 78% e 85% de eficincias obtidas com estas mesmas
leveduras em processos de bioconverso de duas etapas usando amido pr-
hidrolisado.
LGEN et al (2002), utilizando uma cepa de S. cereviseae YPG/AB a
qual expressa -amilase de Bacillus subtilis e glucoamilase de Aspergillus
awamori obtiveram rendimento de etanol de 47,5 g/L em sistema
descontnuo alimentado representando aumento de 200% em relao ao
sistema em batelada.
DELGENES et al (1996), estudaram a produo de etanol a partir de
madeira em condies contnuas e utilizando co-cultura de S. diastaticus e
Pichia stipilis para a hidrlise e fermentao. Comparando com a
fermentao do material pr-hidrolisado, concluram que na taxa de diluio
de 0,125 h
-1
, produziu-se etanol na concentrao de 13,5 g/L com
rendimento de 0.25 g/g, produtividade volumtrica de 1,6 g/L.h e taxa de
converso de substrato de 100%. No esquema de fermentao separada por
Zymomonas mobilis, obteve-se uma concentrao de etanol de 39 g/L foi a
partir de hidrolisados de celulose com rendimento de 0,35 g/g e
produtividade de 7,8 g/L.h, enquanto que Pichia stipitis cultivada em
hidrolisados de hemicelulose produziu etanol (14 g/L) com rendimento de
0,37 g/g e produtividade de 0.56 g/L.h.
SHIGECHI et al (2002) avaliaram duas variedades de Saccharomyces
cerevisiae, uma que co-expressava glicoamilase e amilase na superfcie
da clula e outra que apresentava glicoamilase e secretava amilase no
meio. Em sistema de fermentao descontinuo alimentado, essas leveduras
recombinantes mostraram maior decomposio do amido e habilidade de
produo de etanol, do que clulas que expressavam apenas glicoamilase,
produzindo uma concentrao de etanol de 60g/L, aps 100 horas de
fermentao, aproximadamente, em condies anaerbicas. A variedade
37
que expressava apenas glicoamilase apresentou uma produo de etanol de
aproximadamente 50g/L em 120 horas. Estes pesquisadores utilizaram
amido solvel de batata como fonte de carbono no meio de fermentao, na
concentrao inicial de 6%. Aps uma decomposio do amido presente o
meio foi alimentado com novo meio contendo amido a 105g/L e
posteriormente com meio contendo 140g/L de amido.
BRINGHENTI et al (2007) obtiveram rendimentos de fermentao de
23% em mostos provenientes da hidrlise de amido residual do
processamento de farinha de mandioca aditivado com melao, nas
concentraes de 0, 5, 10,15 e 20%.
KNOX et al (2004) avaliaram a produo de etanol a partir de amido
com trs variedades de S. cerevisiae transformadas com diferentes
combinaes de genes de leveduras amilolticas. A variedade recombinante
de Saccharomyces cerevisiae stell7, que expressava o gene LK2 da
amilase de Lipomyces kononenkoae e SFG1, que expressa a glicoamilase
de Saccharomycopsis fibuligera produziu 21 g de etanol por litro com
coeficiente de rendimento 0.4 (g de etanol/g de amido) aps 120 h em cultivo
anaerbio. Cem por cento de hidrlise do amido foi obtida em 100 horas. O
meio inicial continha 55g de amido por litro.
Com o objetivo de reduzir a quantidade de enzima utilizada na
produo de lcool e avaliar a composio desse lcool formado,
KOSOWSKI et al (2006) utilizaram um mutante nomeado I-7-43 (mutante
entre S.cerevisiae e S. diastaticus resultante da eletrofuso de protoplasto
entre mutantes auxotrficos das variedades originais) em meio contendo
amido de milho liquefeito com amilase e sacarificado com amiloglicosidase
numa dose reduzida em 25% em relao ao controle que utilizou a dose
integral de amiloglicosidade e S. cerevisiae. Estes autores concluram que a
dose de amiloglicosidase pode ser reduzida em 25% do valor recomendado,
com a utilizao da variedade I-7-43, sem trazer diferenas no rendimento e
produtividade da fermentao. Em ambos os casos o rendimento da
fermentao foi em torno de 65 dm
3
de lcool anidro/100kg de amido com 72
foras de fermentao. A produtividade mxima foi obtida com 24h de
fermentao, sendo nos dois casos prximos a 58cm
3
de lcool anidro/dm
3

de meio h
-1
. O resduo de acares redutores tambm foi igual para ambos
38
os tratamentos, a saber, 0,07% para o controle e 0,08% para a mutante I-7-
43. A concentrao de compostos carbonila foi 10% maior nos destilados
obtidos a partir do mosto fermentado por I-7-43, entretanto a concentrao
de lcoois superiores foi menor por volta de 15%, em relao ao controle.
Isto foi devido a menor porcentagem de isobutanol e lcoois amlicos.
BIROL et al (1998) obtiveram rendimento de 43,8g/L de etanol em
meio com 10% de amido, utilizando uma variedade geneticamente
modificada de S. cerevisiae YPG/AB, que expressa separadamente
amiloglicosidade de Aspergillus awamori e amilase de Bacillus subtilis. A
produo de etanol foi observada aps aproximadamente 43h de
fermentao. A produtividade de etanol desta variedade foi maior quando
comparada com a variedade YPB-G, que secreta essa enzimas de forma
fundida. A variedade YPG/MM, que expressa amilase de ratos, no
produziu etanol devido a sua deficincia em produzir amiloglicosidase.
BANDARU et al (2006), estudando a produo de etanol a partir de
amido de sagu liquefeito com amilase e sacarificado continuamente por
sistema de imobilizao de amiloglicosidase e fermentado por Zymomonas
mobilis. Estes pesquisadores utilizaram a tcnica de superfcie de resposta
para determinar as melhores condies do processo. A produo mxima de
etanol de 55,3 g/L foi obtida usando a concentrao de amido de 150 g/l. As
condies timas foram a temperatura de 32.4C, pH de 4.93 e tempo de
fermentao de 17,24h.
Em estudo realizado com clulas co-imobilizadas de S. diastaticus e
Zymomonas mobilis visando a produo de etanol a partir de amido
liquefeito de mandioca, AMUTHA e GUANASEKARAM (2001), encontraram
produo de 46,7g/L de etanol a partir de meio com 150g/L de amido. Este
resultado foi superior ao encontrado no tratamento que utilizou apenas
clulas de S. diastaticus imobilizadas, 37,5g/L, e ao que utilizou uma cultura
de clulas livres, que produziu 34,5g/L. Os rendimentos desses processos
foram de 0,38g/g para as clulas co-imobilizadas, 0,31g/g para S. diastaticus
imobilizadas e 0,33g/g para as clulas livres. Esses valores representam,
respectivamente, 61%, 49% e 45,1% do rendimento terico. Avaliando um
sistema de bateladas repetidas com o intuito de se aumentar a produtividade
de etanol e reduzir o tempo de fermentao e de preparo de inculo, estes
39
pesquisadores conseguiram um aumento da concentrao final de etanol de
46,7g/L para 53,5g/L, em sete sucessivas bateladas, onde o tempo de
fermentao foi reduzido de 42 horas a primeira batelada, para 17 horas na
quinta batelada. Quando estudando o sistema contnuo a uma taxa de fluxo
de 15mL/h, foi obtida produo de 53,5g/L e rendimento de 0,5g/g de lcool.

2.7 Composio do lcool

Durante a fermentao, outros compostos alem do etanol so
formados. Alguns so originados do metabolismo secundrio da levedura e
outros so devidos a contaminaes dos mostos.
BRINGHENTI e CABELLO (2005) estudando a produo de lcool de
resduo amilceo observaram a ausncia de lcoois superiores, metanol,
glicerol e cidos orgnicos. Dentre os aldedos identificados esto o
furfuraldeido e o formaldeido com concentraes de 0,01 e 0,004mg/mL
respectivamente.
KOSOWSKI et al (2006) obtiveram concentraes de aldedos totais
de 98 a 110 mg/dm
3
de lcool anidro (AA), metanol 8mg/100cm
3
AA, acetato
de etila variando de 126 a 258 mg/dm
3
de AA, n propanol de 223 a 251
mg/dm
3
de AA, isobutilico entre 829mg a 1,311 g/dm
3
de AA, n butanol entre
4 e 3 mg/dm
3
de AA,

lcool amlico de 859mg a 1,071 g/dm
3
de AA. Estes
pesquisadores avaliaram a reduo da dose de enzimas utilizadas na
hidrlise do amido atravs da utilizao de uma levedura amiloltica.
A Agncia Nacional do Petrleo (ANP), na Resoluo 36 de
06/12/2005 publicada no Dirio Oficial da Unio de 06/12/2005, estabelece
as especificaes para lcoois combustveis, anidro e hidratado. Porm esta
no estabelece valores para lcoois superiores, steres e outros compostos
(BRASIL, 2005). Segundo a resoluo ANP n 5, de 24/2/2005, os aldedos,
steres e lcoois superiores devem estar ausentes no lcool anidro
combustvel, enquanto que no lcool hidratado, devem estar dentro do limite
mximo de 60 mg/L, 100mg/L e 500mg/L, respectivamente (BRASIL, 2005).
A Coopersucar admite em seu padro de qualidade para lcool
hidratado, limites para metanol de 30mg/L, acetaldedo de 50mg/L, acetato
40
de etila de 120 mg/L, N-propanol, 20mg/L, N-butanol, 10mg/L e lcool
isoamlico, 200mg/L (COOPERSUCAR, 2007).
A instruo normativa n. 13, de 29 de junho de 2005, estabelece o
Regulamento Tcnico para Fixao dos Padres de Identidade e Qualidade
para Aguardente de Cana e para Cachaa. Esta estabelece que os limites
de steres, acetaldeido e lcoois superiores devem estar baixo dos limites
mximos de 200, 30 e 360 mg/100mL de lcool anidro. Para metanol, o
limite mximo deve ficar abaixo de 20mg/100mL AA.
























41





3. DETERMINAO DA COMPOSIO QUMICA DO AMIDO DE
MANDIOCA E DOS MALTES DE CEREAIS

3.1 Introduo
O malte tradicionalmente utilizado na fabricao de bebidas
alcolicas como no caso da cerveja e whisky (LEWIS e YOUNG, 1995). O
extrato de malte tambm utilizado como fonte de acares para
alimentao, principalmente maltose (GOERING et al, 1980). O malte
produzido a partir da germinao do cereal em condies definidas de
tempo, temperatura, aerao e umidade, de maneira a proporcionar uma
maior atividade das amilases e obter as caractersticas sensoriais desejadas
do malte. (LEWIS e YOUNG, 1994) O Brasil um dos maiores produtores
mundiais de mandioca, devido boa adaptao dessa cultura aos diversos
tipos de solos presentes no territrio brasileiro, sendo um alimento
consumido em todo o pas, em diversas formas, principalmente nas regies
norte e nordeste (MATTOS et al, 2002, VILPOUX e CEREDA, 2003). O
amido ou fcula de mandioca apresenta diversas utilizaes entre elas na
alimentao, nas indstrias de papel, txtil, petrleo, entre outras
(CEPEA/ESALQ, 2006). As matrias-primas utilizadas neste trabalho foram
caracterizadas com relao sua composio fsico-qumica. Os maltes
foram caracterizados quanto ao teor de acares redutores, amido, umidade
e pH. A fcula de mandioca foi caracterizada em relao umidade, pH e
teor de amido.






42
3.2 Materiais e Mtodos

3.2.1 Matrias-primas

a) Amido de mandioca

Utilizou-se fcula de mandioca comercial da marca Amafil adquirido
no comrcio local.

b) Maltes de cereais
Foram utilizados maltes de quatros tipos de cereais. Os maltes de
cevada, trigo e centeio foram adquiridos da empresa Agrria, localizada na
cidade de Guarapuava no estado do Paran, em uma embalagem de 50 kg
para o malte de cevada de uma de 25kg para o de centeio e uma de 25kg
para o malte de trigo. Como no foi identificado um fornecedor de malte de
milho e por ser este um dos maltes mais convenientes para a produo de
acares no Brasil devido os custos e disponibilidade deste cereal, optou-se
por produzi-lo em laboratrio de forma que este fosse tambm testado nos
experimentos.
Os diferentes tipos de malte foram triturados a seco em moinho de
discos eltrico de bancada marca Arbel modelo MCF-55, com a finalidade de
se obter uma farinha fina. Estes foram acondicionados em potes plsticos
devidamente higienizados e armazenados em geladeira na temperatura de
10C at o momento de uso.

c) Preparo do malte de milho

O malte de milho foi produzido no Laboratrio de Secagem de Gros
do Departamento de Engenharia Agrcola da Universidade Federal de
Viosa. A metodologia de malteao utilizada na produo foi a descrita por
LEWIS e YOUNG (1994). Os gros de milho do cultivar UFV M100
cultivados no Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de
Viosa, foram selecionados e lavados com gua para retirada de sujidades.
Em seguida foram umedecidos, sob temperatura de 15C por 3 dias, at
43
atingirem 40% 45% de umidade. A gua de macerao foi periodicamente
trocada para evitar acmulo de substncias solveis do cereal. Aps
atingirem a umidade desejada, as sementes foram dispostas em bandejas
na cmara de germinao a temperatura controlada de 20C. O tempo de
germinao foi de 4 dias, de acordo com as recomendaes de BIAZUS et al
(2005), para proporcionar uma maior atividade das amilases do milho. Aps
a germinao as radculas e epiclitos foram retirados com o auxlio de uma
faca de mesa. A secagem foi feita em estufa na temperatura de 54C por 4
horas at atingirem 60% do peso dos gros midos.

3.2.2 Metodologias

a) Determinao do teor de acares redutores gerados pelo prprio
malte sem adio de fcula.

Durante a hidrlise da fcula pelas enzimas dos maltes utilizados, o
amido do prprio malte tambm sobre a ao destas enzimas. Por esta
razo, foi necessrio quantificar estes acares formados.
Foi preparada uma suspenso de 100g contendo aproximadamente
cinco gramas do malte modo e gua destilada. Em seguida mantidas as
mesmas condies que seriam utilizadas nas hidrlises, 50C durante 24h
sob constante agitao. Ao final deste perodo a gua removida por
evaporao foi reposta e foi determinada a porcentagem de acares
redutores destas suspenses em funo da massa de malte utilizada.

b) Determinao de acares redutores

Este mtodo foi utilizado com o objetivo de determinar os acares
redutores presentes ou formados em trs situaes: nas matrias-primas
utilizadas, os formados durantes etapas de hidrlise e presentes nos meios
de fermentao.
Os acares redutores foram determinados pelo de mtodo Lane-
Eynon, de acordo com as normas do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2005). O
mtodo tem como base a reduo de ons de cobre da soluo de Fehling
44
pela ao da extremidade redutora de alguns acares, com o uso de altas
temperaturas e meio alcalino. As amostras slidas foram submetidas a trs
extraes com gua a 10C e centrifugadas e o sobrenadante foi utilizado na
anlise.
Em um Erlenmeyer juntou-se 10mL de cada uma das solues de
Fehling, devidamente fatoradas com soluo de glicose 1%, adicionou-se
40mL de gua destilada e levou-se ebulio. Em seguida titulou-se com as
solues das amostras at a formao de um precipitado de cor
avermelhada no fundo do recipiente. O teor de acares redutores foi
calculado de acordo com a equao abaixo:

mv
Vf 100
= redutores Acares %
Em que:
V=volume da soluo da amostra, em mL;
f= fator das solues de Fehling;
m= massa da amostra, em gramas;
v=volume de soluo de amostra gasto na titulao, em mL;

c) Determinao do teor de amido

O mtodo utilizado foi o descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (BRASIL,
2005), e tem como base a hidrlise do amido presente na amostra pela ao
de base e cido para formao de acares redutores. Posteriormente
hidrlise, os acares formados so determinados pelo mtodo de Lane-
Eynon. O teor de amido calculado pela equao abaixo.

9 , 0
mv
Vf 100
= Amido %
Onde: V=volume da soluo da amostra;
f= fator das solues de Fehling;
m= massa da amostra;
v=volume da soluo da amostra gasto na titulao;
0,9= fator de transformao de acares redutores em amido;
45
d) Determinao de umidade

Pesou-se as placas de Petri devidamente limpas e secas, em seguida
adicionou-se aproximadamente 5 gramas da amostra. Esta foi levada
estufa a 105C por 24h. Aps este perodo, as amostras foram retiradas e
colocadas em dessecador e pesadas at atingir peso constante (Instituto
Adolfo Lutz, BRASIL, 2005). A determinao da umidade foi feita por
diferena de peso entre a amostra mida e a amostra seca.

e) Determinao do pH

Foi feita utilizando de pHmetro digital da marca WTW, modelo pH330i
de acordo com as normas do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2005). Para
medio em amostras slidas, estas foram diludas em gua recentemente
fervida e resfriada, para retirada de gases dissolvidos.

f) Preparo do extrato enzimtico dos maltes

Utilizou-se metodologia descrita por SANTOS (1999) para extrair as
amilases da matria slida, viabilizando a anlise. Cinco gramas de malte,
finamente triturados, foram dissolvidos em 100 ml de cloreto de sdio 0,5%,
permanecendo por 1 hora a 30
o
C, sob constante agitao. Em seguida,
foram centrifugados (3400 x g por 10 minutos) em centrifuga da marca
Fanem modelo Excelsa II 206BL e filtrados em papel-filtro Whatman 125
mm. Dez mililitros do filtrado, diludos em 100 mL de cloreto de sdio 0,5%.
Logo aps a extrao foi feita a determinao da atividade amiloltica. Este
extrato foi tambm usado para determinao da protena total pelo mtodo
de LOWRY (1951).

g) Atividade amiloltica dos extratos enzimticos dos maltes

A avaliao da atividade das amilases dos maltes foi feita utilizando
do kit comercial Bioclin K003 Amilase colorimtrica. Seguindo a metodologia
descrita por CARAWAY (1959) modificada. A determinao da atividade de
46
amilase tem como base a hidrlise do amido pela amilase, com liberao de
molculas de glicose e dextrina. O amido no hidrolisado adquire colorao
azul, depois de reagir com a soluo de iodo adicionada. Essa colorao
inversamente proporcional atividade da amilase, e esta calculada pela
comparao com um controle de substrato sem adio da enzima. A
medio da cor feita em espectrofotmetro a 660 nm, comprimento de
onda este em que apresentada a maior estabilidade (CARAWAY, 1959).
Nos tubos previamente identificados (controle e amostras), foram
adicionados 0,5 mL do reagente n 1 (amido solvel). Em seguida, os tubos
foram colocados em banho-maria a 37C, por dois minutos. Uma alquota de
10 L do extrato enzimtico de cada malte foi adicionada a cada um dos
tubos, sendo que no tubo controle apenas os reagentes foram adicionados.
Os tubos foram agitados e levados a banho-maria a 37C, durante sete
minutos e trinta segundos. Ao fim deste tempo foram adicionados a cada
tubo 0,5 mL reagente de trabalho (soluo de Iodo) e 4 mL de gua
destilada. Aps agitao, as absorbncias das amostras e do controle foram
determinadas a 660 nm, em espectrofotmetro Thermospectronic,
previamente zerado com gua destilada. A atividade das amilases dos
maltes foi calculada de acordo com a seguinte equao:

800
C
A C
= ) dL / UA ( amilase de Unidades
-

Em que:
C: Absorbncia do controle
A: Absorbncia da amostra

Uma unidade da amilase representa a quantidade da enzima que
hidrolisa totalmente 10 mg de amido, em 30 minutos a 37C.

h) Determinao do teor de protena nos extratos de malte

O mesmo extrato enzimtico utilizado na determinao da atividade
amiloltica foi utilizado na determinao de protena pelo mtodo de Lowry,
(1951). O princpio do mtodo baseia-se numa reao de oxireduo de
47
molibdato, tungstato e cido fosfrico (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre
uma reduo quando reage com protenas, na presena do catalisador cobre
(II), e produz um composto com absoro mxima em 750 nm.
Foram preparados os reagentes A e B. O reagente A foi preparado a
partir de 0,5g de CuSO
4
.5H
2
O e 1g de citrato de sdio adicionando-se
100mL de gua destilada. Para preparo do reagente B, juntou-se 20g de
Na
2
CO
3
, 4g de NaOH em 1 litro de gua destilada.
No momento da anlise, foi preparado o reagente C, pela adio de
50mL do reagente B e 1mL do reagente A.
Em um tubo de ensaio contendo 0,5 mL do extrato enzimtico
adicionou-se 2,5 mL do reagente C, lentamente e a temperatura ambiente.
Misturou-se e deixou-se em repouso por 10 minutos. Em seguida foram
adicionados 0,25 mL do reagente de Folin-Ciocalteau, misturando, e
deixando reagir por 30 minutos. Aps este tempo, foi feita a leitura em
735nm. Albumina srica bovina (BSA), adquirida de Sigma Chemical, foi
usada na construo da curva padro. O resultado das anlises de atividade
amiloltica dos extratos foi dividido pelo teor de protenas das respectivas
amostras, obtendo-se assim a atividade especfica aparente das enzimas.

3.3 Delineamento experimental

Os experimentos para determinao da atividade enzimtica em
funo do tipo de malte foram realizados em delineamento inteiramente
casualisado com trs repeties.

3.4 Resultados e Discusso

3.4.1 Anlise fsico-qumicas dos maltes de cereais e da fcula de
mandioca

Os resultados das anlises dos parmetros fsico-qumicos estudados
nos maltes esto apresentados na tabela 3.1.


48
Tabela 3.1: Resultados das anlises fsico-qumicas dos maltes utilizados.
Malte
Acares
Redutores
(%)
Amido
(%)
pH Umidade
(% base
mida)
Acares
redutores
gerados (%)
Trigo 8,95 49,39 5,99 9,39 31,61
Milho 9,89 49,59 5,68 13,22 24,29
Cevada 14,09 42,90 5,64 10,92 35,74
Centeio 8,44 42,80 6,01 9,60 29,95

A alta umidade das amostras pode ser devida a absoro de gua
durante o armazenamento. A umidade ideal para maltes deve estar em torno
de 4% (LEWIS e YOUNG, 1995).
Os teores de acares redutores relativamente altos e os de amido
relativamente baixos se devem converso do amido em acares durante
o processo de malteao e alguma ao hidroltica aps esta etapa.
SUHASINI et al (1997) estudando duas variedades de trigo, uma
adequada e outra no adequada para malteao, os teores de acares
totais, sacarose e maltose aumentaram em sete, quatro e seis vezes,
respectivamente, aps 120h de germinao para duas variedades. Os teores
de acares totais foram de 1,32% e 0,92% antes da germinao e 8,7% e
6,32% aps as 120h para a adequada e a no adequada, respectivamente.
NIRMALA et al (2000), estudando a malteao de ragi, uma espcie
de milheto usada na ndia, relataram que contedo de acares redutores
totais aumentou de 1.44 para 8.36%, aps 96 h de germinao e que houve
um decrscimo linear no contedo de amido de 65% para 43%.
O malte de cevada apresentou maior formao de acares
redutores, seguido por trigo, centeio e milho. Estes valores de acares
redutores sero levados em conta no momento da determinao da
eficincia de hidrlise do amido de mandioca, de maneira que no venham a
superestimar os resultados.
Os resultados das anlises da fcula esto expostos na tabela 3.2
abaixo. Os resultados abaixo so medias de trs repeties.


49
Tabela 3.2: Resultados das anlises da fcula de mandioca.
Parmetro Valores
Umidade 11,8 (%)
pH 5,2
Teor de amido 89,0 (%)

Na Tabela Brasileira de Composio de Alimentos, a umidade da
fcula de mandioca de 17,8 % e o teor de carboidratos totais de 81,1% em
base mida (NEPA-UNICAMP, 2006). A menor umidade da fcula utilizada
neste trabalho pode explicar o maior valor percentual para o teor de amido.
O teor de umidade est dentro do limite mximo estabelecido na legislao
vigente no Brasil, que de 13,0 % , e o teor de amido esta acima do limite
mnimo que de 80,0 % e o pH esta dentro da faixa estabelecida pelo
Concex, de 4,5 a 6,5 (FRANCO et al, 2002).

3.4.2 Atividade amiloltica dos maltes

Com o objetivo de se estimar a influncia do tipo de cereal e suas
respectivas enzimas amilolticas na hidrlise da fcula de mandioca, foi feita
a anlise da atividade amiloltica dos maltes. Os resultados esto
apresentados na tabela 3.3 abaixo.

Tabela 3.3: Atividade das amilases dos maltes de cereais. Os valores so
relativos amostra de 10 L do extrato enzimtico.

Protena
(mg)
Unidade de
amilase(UA)
Atividade especfica
aparente (UA/mg de
protena)
Cevada 2,14 117,7 54,9 (11,69) a
Trigo 2,10 95,5 45,4 (4,26) a
Milho 1,58 20,9 13,3 (8,19) b
Centeio 2,61 33,3 12,7 (5,31) b
Mdias seguidas por uma mesma letra no diferem estatisticamente pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
50
Como pode ser observado na tabela 3.3, os maltes de cevada e trigo
apresentaram maior atividade amiloltica especfica, sendo estatisticamente
iguais pelo teste de Tukey ao nvel de probabilidade 5% e maiores que
centeio e milho.
Diferenas na atividade amiloltica dos maltes esto relacionadas com
fatores como qualidade dos gros e processo de malteao. Segundo
BIAZUS et al (2005), estudando a otimizao das etapas de produo de
malte de milho, o quarto dia seria ideal para interrupo da germinao, pois
neste estagio, os gros milho germinados apresentaram um pico de
atividade enzimtica. Segundo os mesmos autores, a secagem das
sementes deve ser feita a uma temperatura de 54C por um tempo de 5
horas e 10 minutos a 6 horas para preservao maior das enzimas. BIAZUS
et al (2006), afirmam que o pH ideal para a ao das amilases do milho est
na faixa de 4,3 a 6. Os autores afirmam tambm que, a temperatura de
90C, as amilases do milho apresentaram pico de atividade, provavelmente
por ser esta a faixa ideal para ao da amilase do milho. A 50C ocorreu
tambm a elevao da atividade enzimtica, indicando que esta seria a
temperatura de ao ideal da amilase do milho.
GEORG-KRAEMER et al (2001), estudando a germinao de 10
cultivares de cevada, notaram que todos as amostras revelaram aumento na
atividade da amilase at o terceiro ou quarto dia de germinao. A alta
atividade da -amilase foi obserada j no segundo dia de germinao,
enquanto que a atividade da amilase comeou a aumentar somente a
partir do terceiro dia.
DEWAR et al (1997) afirma que a qualidade do malte de sorgo
aumentou com o tempo de umedecimento entre 16 a 40 h. O poder
diasttico do mate aumentou com a temperatura de malteao a cima de
30C.
ENEJE et al (2004) afirmam que os maiores nveis de atividade
amiloltica estiveram associados com menores contedos de nitrognio das
amostras de milho germinado. Os autores concluram que a durao do
umedecimento e da germinao dos gros de milho foi importante no
desenvolvimento das enzimas.
51
3.5 Concluso

O reduzido teor de amido e o relativamente alto teor de acares nos
maltes so devidos ao das amilases sobre o endosperma dos gros
durante o processo de germinao. O teor de amido e umidade da fcula
esto de acordo com os limites da legislao brasileira. O pH da fcula se
encontra no valor ideal para a ao das amilases. Aps a hidrlise do amido
de mandioca pelas enzimas dos maltes, os acares resultantes da hidrlise
do amido dos maltes bem como o amido residual dos maltes estaro
presentes nos hidrolisados, portanto quantificao destes compostos se faz
necessria para se fazer as devidas correes nas avaliaes de rendimento
de hidrlise.
Os maltes de cevada e trigo apresentaram maior atividade amiloltica
especifica aparente. Este resultado justificado pela maior atividade das
suas enzimas, resultado do aprimoramento das tcnicas de malteao e
secagem, que garantem uma maior qualidade das enzimas. O malte de
milho e o de centeio foram os que apresentaram menor atividade amiloltica.
Com relao ao malte de milho, isto pode ser devido ao fato de este ter sido
produzido em laboratrio e possivelmente sem os mesmos controles dos
processos industriais. Mais pesquisas so necessrias para o
estabelecimento de tcnicas de malteao que proporcionem uma maior
atividade das enzimas do milho. Algumas vantagens da utilizao do malte
de milho sero avaliadas no prximo captulo.











52





4. HIDRLISE DO AMIDO DE MANDIOCA PELAS ENZIMAS DOS
MALTES DE CEVADA, TRIGO, MILHO E CENTEIO EM TRS
CONCENTRAES

4.1 Introduo

A cana-de-acar , sem dvida nenhuma, a melhor matria-prima
para obteno de etanol no Brasil, tanto tcnica como economicamente.
Entretanto, outras regies onde o clima e solo no so favorveis cana, o
preo e disponibilidade deste combustvel so afetados. Uma alternativa
para solucionar este problema seria a produo de lcool a parte de
matrias amilceas, como a mandioca.
O amido composto principalmente por uma poro linear, a amilose,
um polmero linear de glicose, conectadas por ligaes (1-4) e uma
ramificada, a amilopectina, que tem uma estrutura altamente ramificada,
constituda por cadeias de amilose conectadas entre si por ligaes (1-6)
(SURMELY et al, 2003). Quando hidrolisado, o amido da origem a acares
fermentescveis que podem servir como substrato para produo de lcool.
O arranjo da amilose e da amilopectina nos grnulos leva formao
de zonas de deposio mais ou menos densas. A regio onde se concentra
a amilopectina mais densa e cristalina. Sendo mais compacta, dificulta a
entrada de molculas como as de gua e enzimas, apresentando-se
portanto mais resistente ao processo de hidrlise (FRANCO et al, 2002).
Geralmente as enzimas utilizadas na hidrlise do amido so produzidas
por vegetais, como no caso do malte, ou microrganismos amilolticos, como
algumas espcies de fungos e bactrias e em processos de fermentao
submersa. Normalmente estas ltimas so importadas e caras (SPIER,
2005).
53
WOICIECHOWSKI et al (2002), afirma que a hidrlise cida de 150kg
de bagao de mandioca para produo de acares redutores apresentou
custos de US$ 34.27, enquanto que o processo enzimtico, para a mesma
quantidade custaria US$ 2470.99, sendo que o elevado custo da hidrlise
enzimtica se deu devido ao elevado tempo de hidrlise e ao alto custo das
enzimas.
LEONEL e CEREDA, (1998), utilizando farelo de mandioca, um
subproduto da produo da fcula, como matria-prima e enzimas
comerciais na hidrlise, obtiveram um custo de produo de R$ 0,90 por litro
de lcool. Porm as enzimas representaram 53% dos custos.
Este fato, aliado baixa produtividade da mandioca no Brasil torna o
processo de obteno de lcool de mandioca mais caro quando comparado
ao lcool de cana (VENTURINI FILHO e MENDES, 2003).
A busca por novas fontes de enzimas e de processos que reduzam os
custos da produo de lcool de amilceos tem recebido considervel
ateno entre os pesquisadores (SPIER 2005, SANTANA, 2003).
A amilase (EC 3.2.1.1; -1,4 glicano 4-glicanohidrolase) e a
amilase (EC 3.2.1.1, -1,4 glicano-maltohidrolase) so enzimas presentes
nos maltes de cereais obtidos a partir de cereais germinados. Estas enzimas
degradam as ligaes (1-4) da amilose e amilopectina, no agindo sobre
as ligaes (1-6) das ramificaes da amilopectina (WHITAKER, 1994,
BOYER, 1971).
As enzimas do malte j foram utilizadas anteriormente na hidrlise de
amido visando a produo de lcool (ARAJO, 1982), mas esta idia no foi
muito aplicada e estudada.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a ao das enzimas dos maltes de
quatro tipos de cereais na hidrlise de amido de mandioca, por estas
possurem menores custos quando comparadas s enzimas purificadas de
origem microbiana, e assim determinar qual cereal seria mais adequado
para a utilizao como fonte de enzimas para a produo de lcool de
mandioca.


54
4.2 Materiais e Mtodos

4.2.1 Materiais

a) Amido de mandioca

Neste trabalho foi utilizada fcula de mandioca comercial da marca
Amafil adquirida no comrcio local. A fcula apresentou teor de amido de
89%, umidade de 11,8% e pH de 5,2.

b) Maltes de cereais

Foram utilizados maltes de cevada, trigo, milho e centeio, como
descrito no item 3.2.1.

4.2.2 Metodologia

a) Hidrlise das suspenses de fcula de mandioca

Testou-se a capacidade hidroltica dos maltes de cereais sobre o
amido de mandioca conforme se segue:
A massa de fcula foi pesada e suspensa em gua destilada
formando uma suspenso de massa 100g contendo 12% de fcula em peso.
No foi necessrio ajustar o pH da suspenso pois este j se encontrava
dentro do intervalo ideal para a ao das amilases. A massa do bquer e a
massa total da suspenso composta de amido, gua e malte foram tomadas
com a finalidade de repor a gua perdida durante a gelatinizao e hidrlise.
Em um bquer de 200 mL, as suspenses de 100g contendo 12% de
fcula foram aquecidas em temperatura superior a 60C em manta
aquecedora sob agitao constante para gelatinizao do amido com o
objetivo de facilitar a ao das enzimas. A pasta de amido foi resfriada at
50 C a 55 C e adicionado o malte na concentrao testada,
homogeneizando para uma boa interao do substrato com a enzima. As
amostras foram incubadas a temperatura de 50C durante 24h com agitao
55
peridica para melhor ao das enzimas. Aps este perodo a suspenso foi
filtrada em malha sinttica para separar-se o hidrolisado da parte fibrosa
(cascas de malte e amido no hidrolisado). Foram testadas 3 concentraes
de malte (0,5 g/100g, 1,0 g/100g e 1,5g/100g de suspenso,
correspondentes a 4,0%, 8,0% e 12,5% em relao massa de amido e a
hidrlise usando enzimas comerciais com o objetivo de avaliar qual das
concentraes fornece uma maior eficincia de hidrlise.

b) Anlise do hidrolisado

Os hidrolisados obtidos foram analisados com relao ao perfil dos
acares formados, glicose e maltose, e da quantidade de amido residual
por meio de kits enzimticos da Boehringer.
As amostras de hidrolisados foram diludos nas propores de 1:500
para anlise de maltose, 1:100 para anlise de glicose e 1:1000 para amido,
de maneira que as leituras de absorbncias estivessem dentro do limite de
linearidade do aparelho, de acordo com as recomendaes descritas no
manual de utilizao dos kits Boehringer,

4.3 Delineamento experimental

O experimento foi realizado num delineamento inteiramente
casualisado disposto em arranjo tipo fatorial 4 x 3, com os fatores tipo de
malte em quatro nveis (milho, cevada, centeio e trigo) e concentrao do
malte, com trs nveis (4,0%, 8,0% e 12,5% em relao a massa de amido).
O experimento foi feito em trs repeties. Foi calculada a eficincia das
hidrlises e os dados foram analisados por meio de anlise de varincia e
em seguida foram feitas as anlises de regresso testando o ajuste do
modelo do tipo linear, com o objetivo de descrever a variao da eficincia
da hidrlise em funo dos tipos de malte e da concentrao utilizadas. Os
dados foram analisados com o auxlio do programa SAS (Statistical Analysis
Sistem), licenciado para Universidade Federal de Viosa.

56
4.4 Resultados e Discusso

4.4.1 Acares formados durante a hidrlise

A tabela 4.1 mostra o perfil dos acares formados na hidrlise do
amido de mandioca pelas enzimas dos maltes de cereais.

Tabela 4.1: Acares formados pela hidrlise do amido pelas enzimas dos
maltes.

Concentrao
(%)
Maltose
(g/L)
Glicose
(g/L)
Acar Total
(g/L)
Acares
redutores
do malte
(g/L)
Acares
redutores
da Fcula
(g/L)
4,0 87,38 2,87 90,25 1,79 88,47
Cevada 8,0 100,64 4,34 104,99 3,58 101,42
12,5 110,21 5,18 115,39 5,36 110,04
4,0 90,80 2,01 92,81 1,58 91,23
Trigo 8,0 96,13 4,23 100,36 3,16 97,20
12,5 98,59 4,77 103,37 4,74 98,63
4,0 86,83 2,47 89,30 1,50 87,81
Centeio 8,0 89,29 5,72 95,02 3,00 92,03
12,5 95,44 5,49 100,94 4,49 96,45
4,0 67,55 6,21 73,77 1,22 72,56
Milho 8,0 84,37 10,79 95,16 2,43 92,74
12,5 98,04 12,52 110,56 3,64 106,93

Conforme mostra a tabela 4.1, as concentraes de maltose e acares
totais no tiveram variaes expressivas nos hidrolisados obtidos atravs
dos maltes de trigo e centeio. Os teores de glicose foram, em todos os
casos, muito menores que os teores observados para maltose. Isto devido
provavelmente a uma maior atividade das -amilases em relao -
amilases.
Os teores -amilases de presentes nos cereais in natura so nulos ou
muito menores que os das -amilases, mas estes rapidamente aumentam
com a germinao dos gros.
57
GEORG-KRAEMER et al (2001), afirmam que a atividade da amilase
durante a germinao de 10 cultivares de cevada brasileira foi sempre
superior que a da -amilase. Relatam tambm que a atividade da amilase
foi altamente correlacionada com o poder diasttico do malte, indicando que
a atividade da amilase pode ser um melhor parmetro de avaliao da
qualidade do malte. EVANS et al (1997) tambm afirmam quem o poder
diasttico est altamente correlacionado atividade da -amilase.
As -amilases hidrolisam as ligaes gilcosdicas da molcula de amido
a cada duas molculas de glicose, formando maltose. Nas extremidades das
cadeias, caso haja trs unidades de glicose, elas deixam estes resduos de
trs unidades, formando maltotriose. A glicose formada se deve quase
inteiramente a ao das -amilases, que atacam aleatoriamente a molcula
de amido gerando dextrinas e pequena quantidade de glicose (SANTANA,
2003, LEWIS e YOUNG, 1995, KENT, 1975).
A -amilase de B. subtilis e B. amyloliquefacience hidrolizaram amilose
a uma mistura de resduos contendo G1 a G6 (molculas de uma a seis
umidades de glicose), gerando preferencialmente G2, G3 e G6, e liberou G1
a partir de G7, atacando pela extremidade redutora, e tendo uma fraca ao
sobre G6 e quase nenhuma ao sobre G5. O limite de hidrlise do amido
foi de aproximadamente 35% (HIZUKURI, 1996). A maior afinidade por
molculas maiores explicaria a diminuio da atividade das -amilases e a
menor produo de glicose.
Os produtos da hidrlise das -amilases so oligossacardeos de
comprimento de cadeia variveis, os quais possuem -configurao no
carbono C1 da unidade redutora de glicose, da vem o nome -amilase (Hill
& Macgregor citados por MURALIKRISHNA e NIRMALA, 2005). Por esta
razo a -amilase pode gerar resduos de glicose.
A tabela 4.2 a seguir mostra a composio percentual dos acares do
hidrolisado para cada tipo de malte na concentrao 12,5%.



58
Tabela 4.2. Composio percentual dos acares dos hidrolisados
obtidos pela ao das enzimas dos maltes na concentrao de 12,5%.
Malte Maltose (%) Glicose (%)
Cevada 95,48 (a) 4,51 (a)
Trigo 95,37 (a) 4,62 (a)
Centeio 94,64 (a) 5,35 (a)
Milho 88,7 (b) 11,30 (b)

As mdias seguidas pela mesma letra no diferem entre si pelo teste
de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.
NEVES (2004), estudando a produo de lcool a partir de crueira de
mandioca, um resduo da produo de farinha, promoveu a hidrlise
utilizando amilase Termamyl 120L e amiloglucosidase AMG 300 L ambas
da Novozymes. O hidrolisado obtido apresentou 97,49% de glicose, 1,35%
de maltose e 1,16% de dextrinas. A maior quantidade de glicose devida ao
uso da amiloglucosidase, que capaz de quebrar as ligaes (1-6) e
(1-4), gerando grandes quantidades de glicose.
EJIOFOR et al (1995) obtiveram por aproximadamente de 80.7% de
glicose no hidrolisado do amido proveniente de guas residuais do
processamento de mandioca, utilizando enzimas microbianas amilase e
glucoamilase. O restante dos acares compreendia malto-oligossacardeos,
principalmente maltose e isomaltose.

4.4.2 Rendimentos e eficincias das hidrlises

O rendimento terico da hidrlise do amido foi obtido pela seguinte
equao de acordo com FERREIRA et al (2006):

Suspenso da Volume
Amido de Massa
162
180
= ) L / g ( Y
TERICO

Em que: 180 a massa molecular da glicose e 162 massa
molecular do monmero de glicose na molcula de amido;
59
A partir dos valores de rendimento foi calculada a eficincia da
hidrlise pela seguinte equao:

100
Y
Y
= (%) Hidrlise da Eficincia
TERICO
REAL


Em que: Y
Real
o rendimento de acares obtido na suspenso (g/L) e
Y
Teorico
o rendimento que seria obtido da hidrlise total da massa de amido
(g/L).
Considerando que a fcula usada como matria prima apresentava
90% de amido, uma suspenso de 120g/L de fcula, contendo
aproximadamente 108g de amido, produzir 120 gramas por litro de
acares redutores. Este valor o rendimento terico de hidrlise.
A tabela 4.3 apresenta os resultados do rendimento obtido e da
eficincia de hidrlise dos tratamentos.

Tabela 4.3: Rendimento e eficincia de hidrlise dos maltes utilizados.
Malte
Concentrao
(%)
Yreal
(g/L)
Eficincia
(%)
4,0 88,47 74,29
Cevada 8,0 101,42 85,17
12,5 110,04 93,18
4,0 91,23 76,61
Trigo 8,0 97,20 82,31
12,5 98,63 82,83
4,0 87,81 73,67
Centeio 8,0 92,03 77,24
12,5 96,45 81,01
4,0 72,55 60,88
Milho 8,0 92,74 78,53
12,5 106,92 89,76

60
Como mostra a tabela 4.3, as maiores concentraes (12,5%) foram
as que forneceram maiores rendimentos de hidrlise para todos os maltes,
sendo que a cevada obteve uma maior eficincia (93,18% em mdia)
seguida pelo milho, trigo e centeio, com 89,76%, 82,83% e 81,01%
respectivamente. Pode-se notar tambm que o aumento da porcentagem de
malte adicionado no representou aumentos relevantes no rendimento de
hidrlise nos maltes de trigo e centeio. J para os maltes de cevada e milho,
este aumento foi bastante considervel.
Apesar de apresentar menor atividade amiloltica, o malte de milho
apresentou resultados prximos aos da cevada quando usado na maior
concentrao. Isso talvez seja devido a uma maior afinidade das enzimas do
milho pelo amido de mandioca, em relao s demais enzimas. Segundo
BOYER (1971), diferenas na composio dos aminocidos que compem
as amilases refletem em suas propriedades fsicas, qumicas e
enzimolgicas. Amido de batata digerido mais rapidamente por amilases
de soro, urina e saliva do que amido de milho, enquanto que este mais
susceptvel a ao de amilase pancretica e duodenal. Diferenas na
especificidade de uma amilase, isto , na maneira detalhada como ela
hidrolisa um polissacardeo, pode ser explicada em termos de seus substios
no stio ativo da molcula (MURALIKRISHNA e NIRMALA, 2005).
Este resultado muito interessante porque o milho um cereal de
custo de produo muito baixo se comparado com a cevada, por exemplo.
Com melhorias no processo de malteao, de maneira que se obtivesse um
malte de maior atividade enzimtica, este poderia ser utilizado para
produo de enzimas destinadas a hidrlise de amido de mandioca.
Esses resultados so prximos aos relatados por HOSEIN e
MELLOWES (1989), que obtiveram converso de amido em acares de 88
a 92% utilizando enzimas do malte em batata doce e eddoes, uma raiz
usada na culinria indiana, chinesa e caribenha. A porcentagem de malte
ideal para a converso encontrada pelos autores foi de 8% a 10% para
batata doce e de 8% para eddoes.
Os resultados acima tambm so superiores aos obtidos por
FERREIRA et al (2005) na produo de aguardente de mandioca, onde
61
foram obtidos 17% de converso do amido em acares redutores utilizando
malte de milho, na proporo de 5g/L, a 65C e pH 6,0.
De acordo com a anlise de varincia, a interao tipo de
Malte*Concentrao foi significativa, ou seja, o rendimento de hidrlise no
depende de um fator independente, mas sim da combinao entre eles. Isso
quer dizer que o efeito da concentrao depende do tipo de malte. Para se
decompor a interao foi feita uma regresso, testando o modelo linear para
as concentraes usadas dentro de cada tipo de malte.
A figura 4.1 mostra o resultado da hidrlise do amido de mandioca
pelas diferentes concentraes das enzimas dos maltes testados.


Rendimento da Hidrlise do amido de mandioca
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
0 4 8 12
Concentrao de malte (g/100g)
E
f
i
c
i

n
c
i
a

d
e

h
i
d
r

l
i
s
e

(
%
)
cevada
centeio
milho
trigo

Figura 4.1: Efeito da concentrao e do tipo de malte na eficincia de
hidrlise do amido de mandioca.

A figura 4.1 mostra que para os maltes de milho e cevada, o aumento
na concentrao de malte resultou em aumento linear mais pronunciado no
rendimento de hidrlise, enquanto que para trigo e centeio, esta relao no
foi to evidente.
Utilizando o Procedimento GLM, foi aplicado o teste F para cada tipo
de malte, avaliando o efeito da concentrao no rendimento de hidrlise. De
acordo com o teste F a falta de ajuste dos modelos foi no significativa para
62
centeio (p = 0,9797), cevada (p = 0,6993), milho (p = 0,3046) e trigo (p =
0,5032) a um nvel de significncia =10%. Isto indica que os modelos do
tipo linear podem ser adequados para se explicar a influncia da
concentrao no rendimento de hidrlise. De acordo com as anlises
estatsticas, as regresses dos modelos lineares testados foram
significativos para milho (p < 0,0001), cevada (p = 0,0017) e centeio (p =
0,0971) para um nvel de significncia =10%. Porm, o modelo testado no
foi significativo para o trigo (p = 0,1685), para o mesmo nvel de
significncia. Isto quer dizer que, para o trigo, um aumento na concentrao
de malte no resulta em um aumento significativo no rendimento de
hidrlise. A tabela 4.4 apresenta os modelos que melhor se ajustaram para
cada tipo de malte.

Tabela 4.4: Modelos lineares ajustados para a eficincia de hidrlise
da fcula de mandioca em funo da concentrao de malte.
Malte Modelo linear R
2
Milho y = 3,3788x + 48,797 (*) 0,9042
Cevada y = 21, 076x + 72,436 (*) 0,7711
Centeio y = 0,8633x + 70,258 (*) 0,3437
Trigo y = 0,7192x + 74,714 (n.s) 0,2435
(*) = significativo para = 5% pelo teste t;
(n.s) = No significativo para = 5% pelo teste t.

Pode-se afirmar que os maiores rendimentos de hidrlise foram
obtidos nas maiores concentraes de malte, ou seja, na concentrao de
12,5% de malte em relao massa de amido. Para cevada, rendimento
mdio foi de 93,18%, enquanto que para milho, trigo e centeio foram de
82,83%, 89,75% e 81,01%, respectivamente.
Estes resultados esto prximos ao encontrados por LEONEL e
CEREDA (1999), que obtiveram rendimento de at 97% na hidrlise de uma
suspenso de farelo de mandioca com 6% de amido, utilizando celulase e
pectinase como enzimas complementares a ao das amilases. Em outro
tratamento onde foi utilizado o dobro da concentrao de amido, obteve-se
rendimento de 87%. So tambm superiores ao encontrados por LEONEL e
63
CEREDA (1998) que afirmam que no processo de hidrlise de farelo de
mandioca ocorreu converso de 86,31% do amido inicial e rendimento de
80% de acares totais (% do terico) utilizando pectinase como enzima
complementar as amilases.
EDUARDO (2002) estudando a produo de xarope de maltose a
partir de mandioca e puba, atravs da hidrlise com dois diferentes tipos de
amilase, obteve 59,1% de eficincia de hidrlise da mandioca utilizando
uma concentrao de slidos de 10%. Quando utilizando puba de mandioca,
o maior rendimento foi de 52,1%, em uma concentrao de 20% de slidos.
J EJIOFOR et al (1995), em trabalho visando o cultivo de fermento
de panificao em mosto obtido da hidrlise de amido proveniente de guas
residuais do processamento de mandioca, afirmam que mais de 98% do
amido foi hidrolisado pela ao da amilase de Bacillus licheniformes e de
uma glucoamilase de Aspergillus niger.
Entretanto estes resultados esto abaixo daqueles apresentados por
SRINORAKUTARA et al (2004) que encontraram rendimento de 122,4 g/L
de acares redutores, obtidos atravs da hidrlise de resduo de amido de
mandioca, com teor de carboidratos no solveis de 110 g/L. A hidrlise foi
conduzida utilizando as enzimas celulase e pectinase num tratamento
preliminar do resduo, seguindo-se a utilizao de uma amilase e
amiloglicosidase. O mesmo autor afirma que a produo de lcool a partir do
resduo de mandioca foi 1.5 vezes maior do que a partir da raiz, devido ao
custo alto das enzimas.

4.4.3 Teor de amido residual nos hidrolisados

A tabela 4.5 apresenta o resultado das anlises de amido residual nos
hidrolisados.






64
Tabela 4.5: Amido residual presente nas suspenses aps a hidrlise.

Malte

Concentrao
(%)
Amido Residual
(g/L)
4,0 21,97 (12,0)
Cevada 8,0 9,03 ( 2,1)
12,5 5,39 (4,4)
4,0 18,82 (5,6)
Trigo 8,0 15,45 (7,7)
12,5 12,44 (2,3)
4,0 18,54 (2,8)
Centeio 8,0 17,66 (4,1)
12,5 19,24 (4,3)
4,0 28,91 (18,4)
Milho 8,0 10,29 (2,8)
12,5 11,19 (12,4)


Para os maltes de cevada, trigo e milho, pode ser observada uma
diminuio acentuada no teor de amido residual com o aumento da
concentrao de malte adicionada. J para os hidrolisados feitos a partir de
centeio, no houve uma reduo na quantidade de amido presente no
hidrolisado final. Os menores teores de amido residual foram encontrados
quando se utilizou o malte de cevada na concentrao de 12,5%.
importante salientar que esta quantidade de amido presente se
deve ao amido no hidrolisado tanto da fcula de mandioca, quanto do
prprio malte o que acarreta aumento na quantidade de amido residual.

4.5 Concluso

O resultado da anlise de varincia mostrou que a interao entre tipo
e concentrao de malte significativa, no se podendo analisar os fatores
separadamente. Isto quer dizer que a melhor concentrao depende do tipo
65
de malte sendo necessrio proceder decomposio da interao para
melhor interpretao.
Os modelos ajustados foram significativos para cevada, milho e
centeio. Entretanto, para centeio a variao do rendimento com a
concentrao foi muito pequena. Para trigo no houve ajuste do modelo
linear, indicando que no houve o aumento do rendimento em funo da
concentrao de malte.
O malte de cevada mostrou ter maior eficincia na hidrlise do amido
de mandioca, apresentando resultados de rendimento prximos ao terico
(93% de eficincia) quando usada na concentrao de 12,5% em relao
massa de amido. Este resultado pode ser explicado pela maior atividade das
enzimas, resultado do aprimoramento das tcnicas de malteao e
secagem, que garantem maior qualidade das enzimas. Apesar da baixa
atividade amiloltica, o milho apresentou resultados de rendimento prximos
ao da cevada quando na concentrao de 12,5%, com eficincia de 89,75%.
O milho tambm apresentou maior formao de glicose que os outros maltes
testados. Estes fatos talvez possam ser explicados por uma maior afinidade
das amilases do milho pelo amido de mandioca. O conhecimento das
caractersticas da enzima e o aprimoramento das tcnicas de malteao e
secagem podem vir a tornar este cereal uma fonte interessante de enzimas
amilolticas, j que se trata de matria-prima de custo muito menor
comparado a outros cereais como a cevada por exemplo.
O malte de centeio apresentou os valores de rendimento e eficincia
mais baixos, no apresentando acrscimos significativos nestes parmetros
com o aumento da concentrao. De maneira semelhante, o trigo no
demonstrou um aumento linear do rendimento com o aumento da
concentrao, porm seu rendimento foi superior ao do milho e centeio e
prximo ao da cevada na concentrao 8%.






66





5. FERMENTAO ALCOLICA DOS MOSTOS OBTIDOS DO AMIDO DE
MANDIOCA HIDROLISADO PELAS ENZIMAS DOS MALTES

5.1 Introduo

Amido uma fonte barata, limpa e renovvel fonte de carbono para a
produo de biocombustveis.
Geralmente a converso de amido a etanol passa por etapas de
cozimento, liquefao, sacarificao e fermentao. Este grande nmero de
etapas causa uma elevao do custo do processo, devido a gastos com
energia e insumos (WOICIECHOWSKI et al 2002).
A reduo de custos um objetivo evidente para a produo de lcool
de fontes amilceas. Isto poderia ser atingido, dentre outras maneiras, pela
reduo do consumo de enzimas amilolticas utilizadas no processo
(KOSOWSKI et al, 2006). Muitos estudos tm sido desenvolvidos visando
aperfeioar o processo de produo de lcool de amilceos (KOSOWSKI
et al, 2006, LGEN et al, 2002, VERMA et al, 2000).
A utilizao de microrganismos capazes de hidrolisar amido e
posteriormente convert-lo a etanol tem recebido grande ateno pelos
pesquisadores. As leveduras do gnero Saccharomyces, que
tradicionalmente so utilizadas na produo de etanol, no possuem a
habilidade de hidrolisar amido. Devido este fato, alteraes genticas tm
sido feitas nestes microrganismos, com o objetivo capacit-los a utilizar este
tipo de substrato (LIU et al, 2004). Geralmente inserido nestas leveduras,
material gentico de outro tipo de microrganismos, como fungos do gnero
Aspergillus, ou bactrias do gnero Bacillus. (LIN et al, 1998, LATORRE-
GARCA et al 2004). Saccharomyces diastaticus uma variedade de S.
cerevisiae, que tem a capacidade de utilizar amido como substrato, por
67
possuir a capacidade de produzir glicoamilase. Entretanto, este
microrganismo no capaz de se desenvolver em amido nativo ou insolvel.
Isto se deve ao fato de a enzima produzida por este microrganismo no
possuir um domnio de ligao ao amido, que est presente na glicoamilase
produzida por Aspergillus niger, por exemplo (VERMA et al, 2000,
LATORRE-GARCA et al 2004).
As enzimas e amilases tm a capacidade de hidrolisar apenas as
ligaes (1-4) da molcula de amido, produzindo glicose, maltose e
deixando resduos de dextrinas, devido a no capacidade de quebrar as
ligaes (1-6) da amilopectina (LEWIS e YOUNG, 1995, MENEZES,
1982), enquanto que a enzima glicoamilase capaz de hidrolisar tanto as
ligaes (1-4) quanto as (1-6) (WHITAKER, 1994, BOYER, 1971).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilizao de duas culturas,
Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces diastaticus, na produo de
etanol a partir de um mosto de amido de mandioca hidrolisado com enzimas
de maltes de cereais, visando um aproveitamento do amido residual no
hidrolisado pelas amilases dos maltes e consequentemente, um aumento na
produo de lcool e conhecer a composio dos produtos formados
durante a fermentao.

5.2 Materiais e Mtodos

5.2.1 Materiais

a) Enzima Comercial

Foi utilizada a enzima Spirizymel Fuel cedida pela NOVOZYMES
(Araucria, Paran). A enzima utilizada uma amiloglicosidase produzida
por Aspergillus niger. Foi utilizada na concentrao de 0,06% de enzima em
relao massa seca de amido em pH 4,5 e a 70C, que so as condies
idias de ao da mesma, segundo recomendaes do fabricante.


68
b) Leveduras

Foram utilizados dois tipos de culturas fermentativas, uma de
Saccharomyces cerevisiae de baixa fermentao de utilizao cervejeira e
Saccharomyces diastaticus ATCC 13007, uma levedura que apresenta a
capacidade de secretar glicoamilase e crescer em amido solvel (VERMA,
2000). S. cerevisiae Saflager W-34/70 foi fornecida pela empresa Agrria
(Guarapuava, Paran, Brasil) na forma liofilizada enquanto que S. diastaticus
foi adquirida do banco de culturas na forma de slants refrigerados da
fundao Andr Tosello (Campinas, So Paulo, Brasil).

5.2.2 Metodologias

a) Determinao de slidos solveis no mosto de fermentao

Foi feita por meio de refratometria, utilizando refratmetro porttil.
Uma gota da amostra era disposta sobre o prisma do equipamento e este
era colocado contra a luz para se ter a leitura do teor de slidos solveis,
expresso em Graus brix. Foi utilizado um refratmetro de Brix Instrutherm RT
30 ATC com escala de 0 a 32Brix.

b) Determinao do teor alcolico dos mostos

Foi feito de acordo com as normas do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL,
2005). Coletou-se 100mL do mosto fermentado, em seguida destilou-se em
destilador Gibertini, obtendo-se o destilado na mesma concentrao
alcolica do mosto original. O destilado foi analisado por picnometria para
determinao da densidade relativa da amostra a 20C. Atravs do uso de
uma tabela obteve-se o teor alcolico de acordo com a densidade relativa da
amostra.




69
c) Determinao do pH

Foi feita atravs de pHmetro digital da marca WTW, modelo pH330i
de acordo com as normas do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2005).

d) Determinao da acidez total dos mostos

Foi feita por titulometria, com utilizao de soluo de NaOH 0,1N.
Dez mL da amostra foram diludos at 100mL com gua destilada e foram
usadas 3 gotas de fenolfetaleina como indicador. A acidez foi calculada em
funo da quantidade de base utilizada para neutralizar os cidos presentes.
Os resultados foram expressos em miliequivalente de NaOH (Instituto Adolfo
Lutz, BRASIL, 2005).

e) Determinao do teor de amido

Foi feita com objetivo de determinar o teor de amido residual
presente nos mostos aps a fermentao.
Tem como base a hidrlise do amido presente na amostra pela ao
de base e cido para formao de acares redutores. Os acares
redutores formados so determinados como descrito no Instituto Adolfo Lutz
(BRASIL, 2005). O teor de amido calculado pela equao abaixo.

9 , 0
mv
Vf 100
= Amido %
Onde: V=volume da soluo da amostra;
f = fator das solues de Fehling
m = massa da amostra
v = volume da soluo da amostra gasto na titulao
0,9 = fator de transformao de acares redutores em amido.




70
5.2.3 Procedimento experimental das fermentaes

a) Preparo dos mostos

Na preparao dos mostos para fermentao para S. cerevisiae,
foram feitas suspenses de massa 1 kg contendo 12% de fcula de
mandioca. A concentrao de malte utilizada para esta etapa foi de 12,5%
em relao massa de amido, devido esta apresentar maior eficincia de
hidrlise na etapa anterior do experimento. A suspenso de fcula foi
aquecida at 100C por 5 minutos sob agitao at a total gelatinizao do
amido. O malte foi adicionado quando a pasta de amido atingiu a
temperatura de 50C a 55C, sob agitao para promover a interao da
enzima com o substrato. As suspenses foram mantidas a temperatura de
50C sob agitao por 24C para completa ao das amilases. Os mostos
de S. diastaticus foram preparados de forma semelhante aos de S.
cerevisiae, alterando-se apenas o tempo de hidrlise de 24h para 10
minutos, de forma a obter-se apenas uma reduo da consistncia do amido
gelatinizado. Aps este tempo a suspenso foi resfriada at 28C. A enzima
Spirizyme Fuel foi utilizada na concentrao de 0,1% em relao massa
seca de amido, pH 4,5 e na temperatura de 70C, como recomendado pelo
fabricante.

b) Filtrao do mosto

Aps a o trmino da hidrlise, o mosto foi filtrado com a finalidade de se
retirar a parte no hidrolisada tanto do malte quanto da prpria mandioca.
Para isto foi utilizada uma malha sinttica usada no dessoramento de queijos
(dessorador). O mosto foi caracterizado em relao a slidos solveis totais,
acidez e pH.

c) Fermentao dos mostos

Os mostos foram enriquecidos com sulfato de amnio (NH
4
SO
4
) (1g/L),
fosfato dibsico de potssio (K
2
HPO
4
) (0,1g/L) e sulfato de magnsio hepta
71
hidratado (MgSO
4
. 7H
2
O) (0,2g/L). O pH do mosto foi ajustado para 5,3
como o uso de H
2
SO
4
quando necessrio.
A fermentao foi conduzida em escala de laboratrio em bales de
vidro de 3 litros, providos de tampas possuindo dispositivo para liberao de
CO
2
e para coleta de amostra atravs de seringas de 20mL. Ao volume de
mosto de 1 L foram inoculados 0,4% da levedura liofilizada (Saccharomyces
cerevisiae) previamente reativadas por 30 minutos a 30C no uma alquota
50mL do prprio meio de fermentao.
A levedura Saccharomyces diastaticus adquirida em Slants
refrigerados, foi propagada em meio YEPS (extrato de levedura 1%, peptona
1%, e amido solvel 2%) por 48 horas, 28C e 150 RPM, de acordo com
VERMA et al, 2000. Este procedimento foi feito no Laboratrio de Fisiologia
de Microrganismos, do Departamento de Microbiologia da Universidade
Federal de Viosa. O volume de inculo utilizado na fermentao foi de 10%
em relao ao volume do mosto. O nmero de clulas do inculo foi de 1,79
x 10
7
clulas por mililitro. O nmero de clulas foi determinado pelo uso de
lmina de Thoma (MATHER e ROBERTS, 1998).
Foi feito o acompanhamento do processo fermentativo pela medio do
consumo de substrato, gerao de produto, pH e acidez conforme descrito
nos itens 5.2.2 (a), (b), (c) e (d) em intervalos de 12 horas at 120 horas
para S. cerevisiae e 96 horas para S. diastaticus. O final das fermentaes
foi definido pela medio do teor de acares redutores no meio. A
fermentao foi conduzida em incubadora BOD da marca Novatica, na
temperatura de 28C durante 120h.

5.2.4 Anlises cromatogrficas

a) Cromatgrafo a gs e coluna cromatogrfica

Utilizou-se nesta etapa um cromatgrafo a gs GC 17A Shimadzu com
detector de ionizao de chama (GC-FID), equipado com coluna capilar de
slica fundida PAG, de carter muito polar, com as seguintes dimenses: (30
m de comprimento x 0.25 mm de espessura do filme x 0.25 m de dimetro
72
interno). Foi usado o hlio como gs de arraste e tambm o ar sinttico e o
gs hidrognio, todos com alto grau de pureza (99, 999%).

b) Preparo das amostras

Um volume de 100mL das amostras finais do fermentado foram
destiladas em aparelho destilador eletrnico Gibertini recolhendo-se 2/3 do
volume inicial e completando-se com gua destilada at o volume original de
100mL. Desta maneira no houve concentrao de volteis e as
concentraes dos analitos determinados correspondem quelas presentes
nos mostos no momento da amostragem.

c) Preparo das curvas padro

Foram preparadas solues-padro para cada um dos lcoois
superiores nas concentraes: (60, 150, 300, 450, 600, 1200) mg/L, em
soluo de etanol/gua (40:60 v/v). A quantificao foi realizada pela
interpolao em curva padro. Os padres de acetaldedo, acetato de etila,
metanol, 1 propanol, lcool isobutlico e lcool isoamlico foram obtidos da
empresa VETEC (Rio de Janeiro).

d) Condies cromatogrficas

As condies cromatogrficas utilizadas foram as seguintes:
temperatura inicial de 35C por 5 minutos, elevando a uma taxa de 10C por
minuto at 100C, permanecendo nesta temperatura por 10 minutos.
A temperatura do injetor a 180C; Temperatura do detector a 200C;
Vazo do gs de arraste (He) a 1 mL/min; Vazo da chama (H
2
): 20 mL/min;
Vazo do ar sinttico: 175 mL/min; Razo de diviso (split) de 10.

5.3 Delineamento experimental

O delineamento experimental utilizado na etapa de fermentao foi
inteiramente casualisado disposto em arranjo fatorial 5x2, onde se tem cinco
73
fontes de enzimas (maltes de trigo, milho, cevada e centeio e uma enzima
comercial) e dois tipos de cultura de leveduras. Os dados foram analisados
por meio de anlise de varincia verificando a influncia do tipo de malte, da
levedura e da interao entre os dois fatores na eficincia de fermentao,
hidrlise do amido e na composio dos produtos formados na fermentao.
Os dados foram analisados por meio do programa SAS (Statistical Analisys
System) licenciado para Universidade Federal e Viosa. O experimento foi
feito em duas repeties.

5.4 Resultados e Discusso

5.4.1 Acompanhamento da fermentao

A seguir so apresentados os resultados das medies dos
parmetros cinticos obtidos no decorrer das fermentaes.
Na figura 5.1 a seguir est apresentada a evoluo do consumo do
substrato no decorrer das fermentaes conduzidas por Saccharomyces
cerevisiae e Saccharomyces diastaticus.











74
S. diastaticus
0
2
4
6
8
10
12
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tempo (h)
S

l
i
d
o
s

S
o
l

v
e
i
s

(

B
r
i
x
)

S. cerevisiae
0
2
4
6
8
10
12
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Tempo (h)
S

l
i
d
o
s

S
o
l

v
e
i
s

(

B
r
i
x
)

Trigo Milho X Centeio Cevada Spirizyme Fuel (controle)
Figura 5.1: Evoluo do consumo do substrato durante o processo fermentativo
para S. diastaticus e S. cerevisiae. Os resultados so mdias de duas repeties.

Nas fermentaes onde S. diastaticus foi utilizada como agente
fermentativo, pode-se observar queda mais intensa no teor de slidos
solveis nas primeiras 24 horas de fermentao. Para S. cerevisiae, o
consumo de slidos solveis foi mais intenso at as primeiras 36 horas do
processo, sendo o consumo mais lento a partir deste ponto. O brix final dos
mostos foi, em mdia de 4,77 para S. diastaticus e de 4,61 para S.
cerevisiae. A medio de slidos solveis no mosto serviu apenas como um
parmetro de acompanhamento da evoluo da fermentao, porque vrios
compostos, como cidos e lcoois, podem estar interferindo no ndice de
refrao da amostra e, portanto no resultados da leitura.
75
Em todas as fermentaes pode-se notar queda rpida do pH nas
primeiras 24 horas do processo fermentativo e aps este perodo, o valor do
pH mantm-se praticamente constante at o fim, como mostrado na figura
5.2 a seguir. Entretanto o valor final do pH para S. diastaticus foi menor que
para S. cerevisiae. O valor final mdio do pH dos mostos de S.cerevisiae foi
de 3,24 e para S. diastaticus foi de 2,43.

S. diastaticus
0
1
2
3
4
5
6
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tempo (h)
p
H

S. cerevisiae
0
1
2
3
4
5
6
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Tempo (h)
p
H

Trigo Milho X Centeio Cevada Spirizyme Fuel (controle)
Figura 5.2: Potencial hidrogeninico (pH) dos mostos durante o processo
fermentativo para S. diastaticus e S. cerevisiae. Os resultados so mdias de duas
repeties.

Como pode ser visto na figura 5.3, para S. diastaticus, os valores para
acidez total tiveram elevao nas primeiras 12 horas de fermentao,
76
apresentando pequenas oscilaes at 72h e estabilizando-se at fim do
processo. J para S. cerevisiae, ocorreu aumento da acidez total dos mostos
principalmente nas primeiras 36 horas de fermentao e a partir deste ponto,
os valores ou se mantiveram constantes ou variaram muito pouco entre as
fontes de enzimas testadas. O valor da acidez final dos mostos ficou em
23,77 mEq de NaOH para S. diastaticus e 31,77 mEq de NaOH para S.
cerevisiae.

S.diastaticus
0
10
20
30
40
50
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tempo (h)
A
c
i
d
e
z

(
m
E
q

d
e

N
a
O
H
)

S. cerevisiae
0
10
20
30
40
50
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Tempo (h)
A
c
i
d
e
z

(
m
E
q

d
e

N
a
O
H
)

Trigo Milho X Centeio Cevada Spirizyme Fuel (controle)
Figura 5.3: Acidez dos mostos durante o processo fermentativo para S. diastaticus
e S. cerevisiae. Os resultados so mdias de duas repeties.


77
Os teores alcolicos mais elevados foram obtidos aps 120 horas de
fermentao para S. cerevisiae e 96 horas para S. diastaticus. Apesar de
maior consumo do substrato nas fermentaes feitas com S. diastaticus, isto
no se reverteu em maior rendimento alcolico. Talvez esta levedura
consuma energia para a produo da enzima amiloltica, o que causaria uma
diminuio do acar destinado para as vias metablicas produtoras de
lcool. Na figura 5.4 a seguir pode se observar a evoluo da formao de
produto durante o processo fermentativo.
S. diastaticus
0
10
20
30
40
50
60
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tempo (h)
T
e
o
r

A
l
c
o
o
l
i
c
o

(
g
/
L
)

S.cerevisiae
0
10
20
30
40
50
60
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Tempo (h)
T
e
o
r

A
l
c
o

l
i
c
o

(
g
/
L
)

Trigo Milho X Centeio Cevada Spirizyme Fuel (controle)
Figura 5.4: Evoluo gerao de produto (etanol) durante o processo
fermentativo para S. diastaticus e S. cerevisiae. Os resultados so mdias
de duas repeties.

78
A tabela 5.1 apresenta os valores mdios dos teores alcolicos
obtidos ao final da fermentao.
Tabela 5.1: Teores alcolicos dos tratamentos testados aps o fim das
fermentaes.
Teor alcolico (g/L)*
Fonte de enzima S. cerevisiae S. diastaticus
Centeio 39,10 (6,14) 39,89 (0,55)
Cevada 48,98 (7,82) 39,89 (0,55)
Milho 41,87 (5,58) 32,78 (1,67)
Trigo 44,63 (1,67) 41,08 (1,11)
Spirizyme Fuel 44,24 (6,70) **********
Mdia 43,76 38,41


De acordo com os resultados das anlises estatsticas, a interao
entre fonte de enzima e o tipo de levedura no foi significativa em relao
produo de lcool. A concentrao de lcool presente nos mostos tambm
no variou de forma significativa entre os maltes e a enzima comercial. Ou
seja, o tipo de enzima no foi significativo, ao nvel 5% de probabilidade, na
produo do lcool a partir de amido de mandioca, portanto qualquer um dos
maltes ou a enzima purificada podem ser utilizados como fonte de enzima
para a hidrlise do amido. Houve diferena significativa entre os dois tipos
de leveduras testados, sendo que a levedura Saccharomyces cerevisiae foi
a que apresentou maior potencial em relao produo de lcool pelo teste
t a 5% de probabilidade.
Os resultados deste trabalho esto prximos aos apresentados por
BIROL et al (1998) em um trabalho no qual obtiveram rendimento de 43,8g/L
de etanol em um meio com 10% de amido. Tambm esto prximos aos
apresentados por JAMAI et al (2007), onde se obteve 43.1 g de etanol/L em
65 h a partir de amido solvel 9% (p/v).



79
5.4.2 Rendimentos das fermentaes

Com o objetivo de se avaliar a eficincia das fermentaes, foram
calculados os rendimentos tericos (Yp/s
terico
) e comparados com os
rendimentos obtidos (Yp/s
real
). O clculo do rendimento terico mostrado
na equao abaixo:

51 , 0 =
180
92
= ) g / g ( s / Yp
Terico


Em que: 92 a massa molecular de duas molculas de etanol
produzidas a partir da fermentao alcolica de uma molcula de glicose e
180 a massa molecular da glicose.
Os valores de rendimentos tericos so muito difceis de encontrar na
prtica, devido utilizao de substrato para outras funes da clula ou
contaminaes por exemplo.
A eficincia considerada como o valor percentual em relao ao
rendimento terico que se conseguiu obter em uma fermentao. O clculo
est mostrado na equao abaixo:



Os valores de rendimentos tericos, rendimentos reais e de eficincia
das fermentaes esto apresentados na tabela 5.2 a seguir.








100
s / Yp
s / Yp
=
TERICO
REAL
80
Tabela 5.2: Rendimentos tericos e reais e eficincias das
fermentaes.
S.cerevisiae S.diastaticus
Enzima
Yp/s
Terico
(g/L)
Yp/s
Real
(g/L)

(%)
Yp/s
Terico
(g/L)
Yp/s
Real

(g/L)
(%)
Trigo 0,51 0,45 89 0,51 0,35 68
Cevada 0,51 0,44 87 0,51 0,34 67
Centeio 0,51 0,41 79 0,51 0,34 67
Milho 0,51 0,39 77 0,51 0,28 55
Spirizyme 0,51 0,37 72 ***** ***** *****

As anlises de varincia indicaram que a influncia da fonte de
enzima, bem como a interao entre enzima e levedura foi no significativa
ao nvel de 5% de probabilidade. S. cerevisiae apresentou valores de
rendimento estatisticamente maiores pelo teste t. Isto talvez demonstre
menor tolerncia de S. diastaticus elevadas concentraes de etanol ou
utilizao de parte do substrato para outras funes metablicas da clula.
Os melhores resultados obtidos esto prximos aos encontrados por
SRINORAKUTARA et al (2004), que encontraram uma maior concentrao
de etanol de 36,2 g/L, correspondente a 91% do rendimento terico depois
de 24 horas de fermentao, a uma concentrao inicial de acares
redutores de 89.2 g/l, oriundo de resduo de amido de mandioca, hidrolisado
com as enzimas celulase e pectinase num tratamento preliminar do resduo,
seguindo a utilizao de uma amilase e amiloglicosidase.
Alguns dos resultados obtidos para S. cerevisiae so superiores aos
encontrados por MOJOVI et al (2006), que obtiveram um rendimento de
etanol de mais de 80% em relao ao terico trabalhando com farinha de
milho hidrolisada com amilase e amiloglicosidase.
Em comparao com JAMAI et al (2007), que encontraram
rendimentos de 96% estudando a produo de etanol utilizando amido como
substrato e a levedura Candida tropicalis como agente de fermentao, nas
formas livre e imobilizada, os resultados deste trabalho so bem inferiores.
Tambm so inferiores aos apresentados por VERMA et al (2000),
que encontraram eficincias de fermentao de 93%, trabalhando com uma
81
co-cultura de S. cerevisiae e S. diastaticus cultivadas em amido solvel
60g/L.

5.4.3 Amido residual nos mostos

O amido residual dos mostos se deve ao fato de que as amilases de
cereais so incapazes de hidrolisar as ligaes (1-6) da molcula de
amilopectina. Estas molculas de amido de menor tamanho no podem ser
metabolisadas diretamente pela levedura.
Saccharomyces diastaticus produz um tipo de glicoamilase que
hidrolisa tanto as ligaes (1-4) quanto as (1-6), agindo a partir de
cadeias pequenas de dextrinas, gerando glicose, que metabolisada pela
clula (VERMA et al, 2000, LATORRE-GARCA et al 2004).
A tabela 5.3 mostra o resultado das anlises de amido residual nos
mostos fermentados.

Tabela 5.3: Quantidade de amido residual dos mostos aps a
fermentao.

Amido residual (% em
relao ao teor inicial)
Malte S. cerevisiae S.diastaticus
Milho 9,33 (3,36) 4,16 (1,41)
Cevada 4,5 (3,67) 2,45 (1,23)
Trigo 10,37 (1,95) 1,58 (0,01)
Centeio 16,04 (3,62) 2,12 (0,29)

A interao entre levedura e tipo de malte foi significativa ao nvel de
probabilidade = 5%. Os resultados das anlises estatsticas mostraram
que a utilizao da levedura Saccharomyces diastaticus foi mais eficiente em
relao a degradao do amido residual dos mostos, pelo teste t ao nvel de
significncia de =5% para os mostos onde se utilizou os maltes de milho,
trigo e centeio como fontes de enzimas. Para o malte de cevada no houve
82
diferena significativa entre as leveduras. Os resultados da degradao do
amido por S. diastaticus variaram entre 97,92% a 99,21%.
interessante tambm ressaltar que a temperatura ideal de ao das
glicoamilases se encontra em torno de 60C (SANTOS, 2006, SURMELY et
al, 2003), valor muito acima da temperatura de 28C, na qual as
fermentaes foram conduzidas. Mesmo assim pode-se observar uma ao
marcante da enzima na degradao do amido.
Estes valores so superiores aos encontrados por VERMA et al
(2000), em seus melhores resultados, onde obtiveram 78% de degradao
do amido inicial do mosto com 100g/L de amido solvel, a partir de uma co-
cultura de S. cerevisiae e S. diastaticus.
Os resultados so superiores tambm aos encontrados por LIN et al
(1998) obtiveram um consumo de amido de 82% em 6 dias de cultivo com
clulas de Saccharomyces cerevisiae que expressavam glicoamilase de
Aspergillus awamori, cultivadas em meio contendo 1% de amido solvel.
Os valores acima relatados esto prximos ao encontrados por KNOX
et al (2004) que obtiveram 100% de degradao de amido aps 100h com
uma levedura recombinante codificada como stell7, transformada com o
gene de glicoamilase de S. fibuligera, produzindo 21 g etanol por litro com
coeficiente de rendimento de 0.4 aps de 120 h de cultivo anaerbico.
FERREIRA et al (2005), produzindo aguardente de mandioca,
utilizando malte de milho como fonte de enzimas amilolticas, obteve uma
converso do amido a acares prxima dos 17%.
Entretanto, apesar da maior degradao do amido nas fermentaes
conduzidas com S. diastaticus, a quantidade de lcool presente nestas no
foi superior s encontradas para S. cerevisiae. Isto pode indicar que a
glicose gerada pela degradao do amido pela ao da enzima produzida
pela levedura estaria sendo direcionada para gerao de algum outro
produto ou para outra funo metablica da clula, ou ento indicaria uma
baixa tolerncia e S. diastaticus ao etanol.



83
5.4.4 Balano de massa da produo lcool de mandioca

Foi feito o balano de massa da produo de lcool de mandioca
obtido atravs da metodologia utilizada neste estudo. Para isto, utilizou-se os
dados da produo mdia de brasileira, que de 13 t/ha (VENTURINI
FILHO e MENDES, 2003). Partindo-se deste dado juntamente com dados da
composio da mandioca e dos rendimentos alcolicos mdios obtidos neste
trabalho para S. cerevisiae (40,4%) e S. diastaticus (38,4%), estabeleceu-se
o balano de massa, como mostrado na figura 5.2 abaixo.






Figura 5.2: Balano de massa da produo de lcool a partir de amido de
mandioca.
* Converso microbiolgica de massa de amido em massa de etanol desse
trabalho.

De acordo com o Ministrio do Desenvolvimento Indstria e Comrcio
(MDIC), a produtividade mdia da cana-de-acar no Brasil em 2004 ficou
em 74 t/ha e a produtividade de lcool em 80 litros por tonelada o que gera
uma produo de 5920 litros por hectare (FREITAS, 2005). Portanto os
valores obtidos ainda so muito inferiores em relao ao obtidos com a
cana-de-acar. Estudos na melhoria da produtividade agrcola da
mandioca, melhorias dos processos de hidrlise e fermentao, alm
daqueles voltados para os custos do processo so de extrema importncia
para a viabilizao da produo de etanol a partir da mandioca.
Apesar da baixa produtividade por hectare plantado, a mandioca
apresenta uma maior produtividade de etanol por tonelada de matria prima
que a cana. Com os dados apresentados acima, seriam obtidos 113,12 litros
por tonelada de mandioca e 404 litros por tonelada de amido. As figuras 5.3
e 5.4 apresentam comparaes entre fontes de obteno de etanol.
1 hectare de
mandioca = 13 t
65% umidade
80% amido na
matria seca
3.64
toneladas
de amido
S.cerevisiae
40,4%
rendimento *
S.diastaticus
38,4%
rendimento *
1470 kg ou
1860 litros de
etanol/ha
1397 kg ou
1769 litros
de etanol/ha
84
Produo de etanol por tonelada de
matria-prima
0
100
200
300
400
500
cana* mandioca** bagao de
cana*
milho*
L
i
t
r
o
s

p
o
r

t
o
n
e
l
a
d
a

Figura 5.3: Produo de etanol de cana, mandioca, bagao de cana e milho
por tonelada de matria-prima. *Dados Fermentec (AMORIM, 2006);
**Dados experimentais deste trabalho.
Produo de etanol por hectare
plantado
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
cana* bagao de
cana*
milho* mandioca**
L
i
t
r
o
s

p
o
r

h
e
c
t
a
r
e

Figura 5.4: Produo de etanol de cana, mandioca, bagao de cana e milho
por hectare de matria-prima plantada. *Dados Fermentec (AMORIM, 2006);
**Extrapolao dos dados experimentais obtidos neste trabalho para
produtividade agrcola de 13 ton/ha.
O menor rendimento da mandioca por tonelada de matria prima
quando comparada com o bagao de cana e milho e provavelmente devido a
seu maior teor de umidade. A mandioca apresenta um teor mdio de
umidade de 60%, o bagao de cana-de-acar de 5% e o milho de 13%. Se
estes valores fossem expressos em base seca, os rendimentos seriam bem
mais prximos, caracterizando uma maior competitividade tecnolgica da
mandioca em relao as demais fontes citadas.
85
A baixa produtividade agrcola justifica menor produtividade por
hectare plantado, que poderia tambm ser melhorada com os incrementos
agrcolas de produtividade que tm sido observados.

5.4.5 Anlises Cromatogrficas

Os principais compostos encontrados nos destilados foram
acetaldeido, acetato de etila, metanol, etanol, os lcoois superiores
1propanol, isobutlico e isoamlico. Os resultados foram analisados por meio
de anlise de varincia pelo programa SAS (Statistical Analysis System)
licenciado para Universidade Federal de Viosa. Os dados foram analisados
testando a influncia do tipo de enzima (malte de trigo, milho, cevada,
centeio e a enzima comercial Spirizyme Fuel, da Novozymes), da variedade
de levedura, S.cerevisiae e S. diastaticus e da interao entre os dois
fatores.
Os resultados das anlises cromatogrficas dos mostos fermentados
por Saccharomyces cerevisiae durante a fermentao esto expresso na
tabela 5.4 a seguir.

Tabela 5.4: Teores dos compostos formados durante a fermentao por
S.cerevisiae.
Enzima
Acetaldeido
(mg/100mL
amostra)
Acet. Etila
(mg/100mL
amostra)
Metanol
(mg/100mL
amostra)
1 Propanol
(mg/100mL
amostra)
Isobutlico
(mg/100mL
amostra)
Isoamilico
(mg/100mL
amostra)
Centeio 1337,69 19,51 1,55 15,74 176,58 36,18
Cevada 1455,70 16,10 1,92 16,78 165,75 35,97
Milho 957,30 13,01 1,15 16,38 157,76 35,58
Trigo 220,57 8,07 1,46 15,52 148,50 26,82
Spirizyme 192,01 9,03 0,46 12,04 196,84 46,34

A tabela 5.5 apresenta os resultados das anlises cromatogrficas do
produto da fermentao de Saccharomyces diastaticus.

86
Tabela 5.5: Teores dos compostos formados durante a fermentao por
S.diastaticus.
Enzima
Acetaldeido
(mg/100mL
amostra)
Acet. Etila
(mg/100mL
amostra)
Metanol
(mg/100mL
amostra)
1 Propanol
(mg/100mL
amostra)
Isobutlico
(mg/100mL
amostra)
Isoamilico
(mg/100mL
amostra)
Centeio 116,85 11,65 0,49 23,11 158,77 32,68
Cevada 239,07 13,59 0,68 21,93 176,45 37,66
Milho 142,84 8,59 0,63 20,00 165,52 33,00
Trigo 284,20 13,94 0,35 18,85 170,89 37,70

De acordo com os resultados da anlise de varincia, a interao
entre enzima e levedura foi significativa nos resultados de acetaldedo e
acetato de etila ao nvel de significncia = 10% pelo teste F.
Ao analisar a influncia do tipo de levedura dentro de cada tipo de
enzima na formao de acetaldedo, pode-se observar que para os maltes
de centeio, cevada e milho houve diferena entre as leveduras com relao
aos teores de acetaldeido, sendo que a S. cerevisiae foi a levedura que mais
produziu este composto para esses maltes. Para trigo, no houve diferena
entre as leveduras. Quando se comparou a fermentao onde se utilizou
enzima comercial com as fermentaes conduzidas com S. diastaticus, a
concentrao de acetaldeido foi igual entre estas. Entretanto, as
fermentaes conduzidas com S. cerevisiae e hidrolisados de malte, foram
todas superiores em relao ao acetaldeido quando comparadas s
fermentaes feitas com a enzima comercial. Entre as leveduras, existiu
diferena significativa (p<0,001) entre os as fontes de enzima utilizadas para
a levedura S.cerevisiae a um nvel de significncia de =10% pelo teste F.
J para S. diastaticus, a diferena entre as fontes de enzimas foi no
significativa a um nvel de probabilidade de =10%.
As fermentaes feitas com os maltes de cevada e centeio foram
iguais estatisticamente e apresentaram maior formao de acetaldeido pelo
teste de Duncan ao nvel de probabilidade de 5%, enquanto que as
conduzidas com malte de trigo e enzima comercial foram as que
apresentaram menores teores deste composto. Existiu diferena significativa
entre as leveduras com relao a formao de acetato de etila pelo teste t a
87
5% de probabilidade, sendo que os mostos fermentados por S. cerevisiae
apresentaram maiores concentraes.
Para acetato de etila, ao analisar a influncia do tipo de levedura
dentro de cada fonte de enzima, notou-se que as leveduras no variaram
para o malte de cevada, variando, porm para as outras fontes de enzimas,
a um nvel de significncia de =10% pelo teste F. Houve diferena
significativa entre as fontes de enzimas para as duas leveduras a um nvel
de significncia de =10% pelo teste F.
Os mostos hidrolisados por maltes de centeio e cevada foram os que
apresentaram maiores teores de acetato de etila, sendo iguais
estatisticamente pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. Os mostos
hidrolisados por maltes de trigo, milho e a enzima comercial apresentaram
menores teores e foram estatisticamente iguais pelo teste de Duncan a 5%
de probabilidade. No houve diferena significativa entre as leveduras com
relao formao de acetato de etila pelo teste t a 5% de probabilidade.
Para metanol e 1-propanol, a interao enzima*levedura foi no
significativa ao nvel de significncia = 10% pelo teste F e os fatores
agindo separadamente foram significativos ao mesmo nvel de significncia
de acordo com a anlise de varincia, por tanto a influncia de cada fator
pde ser analisada separadamente. As leveduras apresentaram diferena
significativa entre si com relao formao de metanol, sendo que
S.cerevisiae foi a que obteve maiores valores pelo teste t a um nvel de
significncia de 5% de probabilidade. As fontes de enzima apresentaram
diferena significativa entre si pelo teste de Duncan ao nvel de 5% de
significncia, sendo que todos os maltes testados foram estatisticamente
iguais entre si. Os maltes de cevada e trigo foram superiores a enzima
comercial, enquanto que os de milho e centeio foram iguais estatisticamente.
Com relao ao 1-propanol, S. diastaticus apresentou maior formao deste
composto pelo teste t ao nvel de significncia de 5% de probabilidade. Com
relao fonte de enzima, todos os mostos hidrolisados com maltes foram
iguais entre si, porm, todos apresentaram teores de 1-propanol maiores do
que os observados nos mostos hidrolisados com Spirizyme Fuel, pelo teste
de Duncan ao nvel de significncia de 5% de probabilidade.
88
Para os lcoois isobutlico e isoamlico no houve influncia de
nenhum dos fatores testados, sendo os valores de concentrao
encontrados para estes compostos considerados iguais entre as fontes de
enzimas e entre as leveduras.

5.5 Concluso

A fonte de enzima no foi significativa em relao a produo de
lcool, ou seja, no houve diferena entre os maltes e a enzima comercial na
produo de etanol. Os maiores teores alcolicos foram encontrados nas
fermentaes onde Saccharomyces cerevisiae foi utilizada como agente
fermentativo. Apesar dos teores alcolicos encontrados nos mostos onde se
utilizou Saccharomyces diastaticus como agente fermentativo terem sido
menores, pode-se observar que a degradao do amido foi mais eficiente
nestes, devido as capacidade desta levedura de secretar glicoamilase.
interessante relatar que esta degradao do amido ocorreu a uma
temperatura de 28C, usada na fermentao, que relativamente baixa em
comparao com a temperatura ideal das glicoamilases, que fica em torno
de 60C, o que mostra uma caracterstica interessante do ponto de vista
tecnolgico. Estudos devem ser feitos para avaliar a utilizao desta
levedura como ferramenta para a produo de lcool a partir de materiais
amilceos. Melhorias quanto capacidade desta levedura em produzir lcool
poderiam torn-la agente fermentativo de maior interesse. O balano de
massa deste processo revela que a produo de lcool de mandioca por
este processo ainda no compete com a cana-de-acar, principalmente
devido baixa produtividade agrcola da mandioca, sendo esta questo um
importante ponto a ser pesquisado.
Com relao produo de acetaldeido, os maiores teores foram
encontrados nos mostos obtidos a partir de centeio e cevada, tendo
S.cerevisiae como agente fermentativo. Acetato de etila apresentou maiores
teores nos mostos de cevada e centeio, porm, entre as leveduras no
houve diferena significativa.
S. cerevisiae apresentou uma maior formao de metanol e
S.diastaticus foi quem mais produziu 1 propanol. Para os lcoois isoamilico e
89
isobutilico, nenhuma das fontes de variao foi significativa, ou seja, no
houve variao entre os tratamentos.
































90
6 CONCLUSO GERAL

As anlises fsico-qumicas das matrias revelaram a conformidade
da fcula utilizada com os padres da legislao brasileira, com teor de
amido de 89% e umidade de 11,8%. As concentraes de acares (8,44
14,09%) e de amido (42,8 49,59%) nos maltes utilizados refletem as
alteraes sofridas pelo gro durante o processo de malteao, onde h
converso de amido em acares. As elevadas umidades dos maltes, ente
9,39 e 13,22%, revelam absoro de gua durante o armazenamento. Os
maltes de cevada e trigo apresentaram maior poder amiloltico dentre
aqueles utilizados neste experimento, seguidos milho e centeio, sendo estes
iguais entre si. Isto provavelmente se deve ao aprimoramento das tcnicas
de malteao que potencializam a formao e manuteno da atividade
enzimtica.
A anlise de varincia revelou que a interao malte*concentrao foi
significativa para todos os tratamentos da etapa de hidrlise, no se
podendo analisar os fatores separadamente. As anlises de regresso
mostraram que os modelos lineares se ajustaram bem para cevada, milho e
centeio, indicando aumento linear da eficincia de hidrlise como o aumento
da adio de malte. Entretanto, para trigo o ajuste dos modelo foram no
significativos. O malte de cevada forneceu os maiores valores de hidrlise do
amido de mandioca. Apesar da baixa atividade amiloltica, o milho forneceu
valores de rendimento prximos aos da cevada na concentrao de 12,5%.
As suspenses hidrolisadas com malte de milho forneceram teores de
glicose maiores que as suspenses dos outros maltes.
Na etapa de fermentao, no houve interao significativa entre o
tipo de malte e levedura para a produo de lcool. O tipo de malte no
apresentou variao significativa a formao de lcool, sendo que qualquer
malte ou a enzima comercial podem ser usados para a obteno de etanol.
Entretanto, houve diferena significativa entre as leveduras, sendo que
Saccharomyces cerevisiae apresentou maiores teores de etanol, com
resultados entre 39,10 e 44,63g de etanol/L. O consumo de amido nos
mostos fermentados por Saccharomyces diastaticus foi superior ao obtido
por S. cerevisiae para trigo, centeio e milho, ficando entre 97,92 e 99,21%,
91
enquanto que para cevada, no houve diferena entre as leveduras. S.
cerevisiae obteve maiores valores de eficincia de fermentao, atingindo
resultados de 89% de eficincia. O balano de massa do processo revela
que, com a atual produtividade mdia da mandioca brasileira, a produo de
lcool a partir desta matria prima ainda no ideal, gerando um volume de
1860 litros de etanol/ha, apesar de uma tonelada de mandioca gerar mais
lcool que uma tonelada de cana, com produo de 113,12 litros por
tonelada de mandioca e 404 litros por tonelada de fcula de mandioca.
As anlises estatsticas revelaram que os teores de acetaldedo foram
maiores nos mostos produzidos a partir de cevada e centeio, fermentados
por S. cerevisiae. Acetato de etila teve maior formao nos mostos de
cevada e centeio, porm no houve diferena significativa entre as
leveduras. Os teores de metanol foram maiores nos mosto fermentados por
S. cerevisiae enquanto que aqueles fermentados por S. diastaticus
produziram maiores teores de 1 propanol. Os teores dos lcoois isoamlico e
isobutlico no apresentaram variaes devido a nenhuma das fontes
testadas.

















92





7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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