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Quim. Nova, Vol. 28, No.

5, 852-858, 2005 ALENDRONATO DE SDIO: METODOLOGIAS PARA ANLISE QUANTITATIVA

Reviso

Ana Ferreira Ribeiro e Nadia Maria Volpato* Departamento de Medicamentos, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Cincias da Sade, Cidade Universitria, 21941-590 Rio de Janeiro - RJ Recebido em 14/4/04; aceito em 8/3/05; publicado na web em 30/6/05

SODIUM ALENDRONATE: METHODS FOR ANALYTICAL QUANTITATION. This paper presents a review of some published proposals for the analysis of sodium alendronate. The drug is an aminobisphosphonate compound used to inhibit the osteoclastic resorption of bone, and different methods were developed for its quantitative determination. These methodologies employed reversedphase or ion-exchange HPLC analysis, both associated with different detectors: UV and fluorescence detection after derivatization of the drug, conductivity and refractive index detectors, as well as the indirect UV detection. Titrimetry and spectrophotometry (with previous complexation of the drug), which are simpler procedures, were also described, but they showed poor specificity when compared to liquid chromatography. Keywords: sodium alendronate; HPLC analysis; derivatization.

INTRODUO O alendronato de sdio um frmaco pertencente a um grupo de compostos denominados de bisfosfonados. Estas substncias apresentam em comum dois grupos fosfricos em sua estrutura molecular, possuindo grande afinidade pela matriz ssea humana e capacidade de inibir sua reabsoro. Por esta razo, so amplamente utilizados no tratamento de desordens relacionadas ao tecido sseo, como o caso da osteoporose. Apesar da crescente produo industrial do frmaco, apenas recentemente foi lanada monografia analtica do alendronato de sdio em uma farmacopia1 (farmacopias so compndios oficiais para anlise de frmacos e medicamentos). As demais obras internacionais desta categoria, nas suas ltimas edies, ainda no contm metodologia recomendada para anlise quantitativa do alendronato de sdio. Tendo em vista a necessidade de se adotar uma metodologia analtica adequada para controle da qualidade do frmaco em questo, vrios estudos propondo mtodos para sua determinao quantitativa foram publicados. Grande parte das metodologias utiliza, para determinao do alendronato e de outros bisfosfonados semelhantes, a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), seja em fase reversa ou por troca inica, associada a diversos mtodos de deteco e, freqentemente, emprega a derivatizao da substncia. Alm destes esto descritos, em menor nmero, mtodos mais simples para determinao do alendronato, tais como a espectrofotometria e a titulometria. Procedimentos utilizando tcnicas menos empregadas no controle da qualidade de medicamentos, como o plasma de acoplamento indutivo e a voltametria de redissoluo andica, tambm foram publicados. Algumas destas propostas sero apresentadas e discutidas nesta reviso. DESCRIO DO FRMACO Caractersticas farmacolgicas O osso o principal rgo envolvido na sustentao do organismo e constitudo por uma matriz formada de vrios componentes (entre eles clcio, fosfato e fibras colgenas), que conferem rigidez e certa maleabilidade a este tecido. Assim como outros te*e-mail: volpato@pharma.ufrj.br

cidos do corpo, o osso se mantm em constante renovao, possuindo clulas como os osteoblastos, responsveis pela sntese e deposio de material protico na matriz, e os osteoclastos, os quais secretam enzimas e substncias cidas, que digerem a matriz e determinam sua reabsoro. Quando o equilbrio do processo de renovao ssea afetado, a estrutura dos ossos pode ser prejudicada, resultando no aparecimento de doenas como osteoporose e doena de Paget2. Vrios frmacos vm sendo utilizados na preveno e no tratamento das desordens relacionadas ao processo de remodelagem ssea, destacando-se entre estes um grupo de compostos denominados de bisfosfonados. Um dos primeiros bisfosfonados a ser sintetizado foi o cido etano-1-hidroxi-1,1-bisfosfnico (etidronato), cujo principal objetivo era ser utilizado como aditivo em detergentes. Mas logo foram observados seus efeitos fisiolgicos, como a capacidade de inibir a reabsoro ssea. A partir desta observao, iniciaram-se pesquisas para sntese de diversos outros bisfosfonados e avaliao de seus efeitos fisiolgicos3. O alendronato de sdio um potente inibidor especfico da reabsoro ssea mediada por osteoclastos. O mecanismo de ao dos bisfosfonados pode estar relacionado capacidade de se fixarem na matriz ssea, sendo assimilados pelos osteoclastos e, em seguida, inibindo sua ao. Sabe-se que, em solues de fosfato de clcio, so capazes de retardar a formao e a dissoluo dos cristais de hidroxiapatita ([Ca3(PO4)2]3 . Ca(OH)2), os quais, no organismo, se incorporam matriz ssea, conferindo ao osso a dureza necessria para sua resistncia compressional2,4. Desta forma, o frmaco indicado para preveno e tratamento da osteoporose (doena caracterizada por uma taxa de reabsoro ssea maior que a de formao e associada ps-menopausa nas mulheres), no controle da hipercalcemia associada ao neoplasma maligno do osso e no controle da remodelagem ssea desordenada que ocorre na doena de Paget4,5. Em relao ao etidronato, o alendronato possui a vantagem de no inibir acentuadamente a mineralizao ssea, embora possua a capacidade de inibir sua reabsoro. Sendo assim, o alendronato no apresenta o mesmo risco de desenvolvimento de osteomalcia, como no caso de tratamento prolongado com o etidronato4. Por outro lado, pode gerar algumas reaes adversas, tais como

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hipocalcemia e irritao do trato digestivo superior (esofagiana), a qual pode ser minimizada pela administrao concomitante de gua, mantendo-se o paciente em posio ereta5,6. Da mesma maneira que os outros bisfosfonatos, o alendronato pouco absorvido pelo intestino aps administrao oral, possuindo biodisponibilidade de apenas 0,4 a 0,7%. Alm disto, sua absoro prejudicada quando administrado concomitantemente a alimentos, sendo reduzida especialmente por produtos que contenham ctions polivalentes como clcio, magnsio e alumnio, geralmente presentes em complementos alimentares, repositores e anticidos5,7. Por possuir grande afinidade pela matriz ssea, aproximadamente 50% da dose absorvida permanece fixa ao osso, sendo lentamente eliminada e possuindo uma meia vida de eliminao de at 10 anos no homem. O alendronato excretado na urina na sua forma inalterada, no sofrendo qualquer metabolizao aparente5,6. Alm disto, a elevada afinidade dos bisfosfonados pelo tecido sseo possibilita sua utilizao na vetorizao de frmacos. Existem relatos do uso de compostos bisfosfnicos como transportadores de vrias substncias direcionadas ao tecido sseo, tais como radioistopos utilizados no diagnstico de tumor osteoltico, agentes antineoplsicos e antiinflamatrios8. Caractersticas qumicas O alendronato de sdio, frmaco cujo nome qumico 4-amino1-hidroxibutano bisfosfonato de sdio (CAS: 121268-17-5), derivado do cido alendrnico (cido 4-amino-1-hidroxibutano bisfosfnico). Trata-se de um composto aminodifosfonado (Figura 1) que possui estrutura anloga ao pirofosfato, o qual uma substncia endgena com grande afinidade pela matriz ssea, sendo capaz de inibir a mineralizao da mesma5.

Figura 2. Sntese do cido alendrnico (b) a partir do cido 4-aminobutrico (a). Adaptada da ref. 9

Formas farmacuticas disponveis no mercado brasileiro O primeiro medicamento contendo alendronato de sdio foi lanado pela Merck Sharp & Dohme (Fosamax - comprimidos de 10 e 70 mg) e recebeu a aprovao do FDA para comercializao e uso em 199513. No Brasil, o frmaco encontra-se disponvel para administrao oral, em comprimidos de alendronato monossdico, na forma triidratada ou no, apresentando doses de 5, 10 e 70 mg de cido alendrnico por comprimido. Apenas uma formulao comercial encontra-se sob a forma de comprimidos revestidos entre as mais de 10 marcas no mercado6,7. Em fevereiro de 2004 foi registrado, no pas, o primeiro medicamento genrico fabricado pela empresa Biossinttica (comprimidos de alendronato de sdio 10 mg)14. H tambm uma formulao registrada sob forma de soluo oral e outra, sob forma de cpsulas de gelatina mole15. Farmcias magistrais tm manipulado alendronato de sdio em cpsulas de gelatina dura. MTODOS DESCRITOS PARA DETERMINAO DO ALENDRONATO Mtodos cromatogrficos A grande maioria das propostas para determinao quantitativa do alendronato de sdio, descritas na literatura, envolve o uso da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE). So utilizados principalmente dois tipos de anlise cromatogrfica: a cromatografia lquida de troca inica (CLAE-TI) e a cromatografia lquida em fase reversa (CLAE-FR).

Figura 1. Estrutura geral dos bisfosfonatos: cido alendrnico e alendronato monossdico. Adaptada das refs. 4 e 5

Fabricado como sal monossdico do cido alendrnico (C4H13NO7P2), o alendronato de sdio encontra-se freqentemente na forma triidratada (C4H12NNaO7P2 . 3H2O) e possui faixa de fuso de 257 a 262 oC 9. Constitudo por um p fino e branco, o cido alendrnico possui faixa de fuso que vai de 233 a 235 oC, decompondo-se a esta temperatura. Apresenta comportamento anftero, visto que sua estrutura possui caracterstica cida (dois grupos fosfricos) e bsica (grupo amina). Possui quatro constantes de dissociao, cujos valores so pKa1 = 2,72 0,05; pKa2 = 8,73 0,05; pKa3 = 10,5 0,1; pKa4 = 11,6 0,110. O mtodo mais comum para sntese do cido alendrnico envolve a reao do cido 4-aminobutrico (GABA) com cido fosforoso e tricloreto de fsforo (Figura 2). A utilizao do cido metassulfnico durante o processo permite um maior rendimento e maior pureza do produto obtido9. O alendronato de sdio solvel em gua, muito pouco solvel em dimetilsulfxido, metanol e propilenoglicol e praticamente insolvel em diclorometano, acetona, acetonitrila, clorofrmio, lcool isoproplico e cido actico glacial1,11,12.

CLAE em fase reversa Os mtodos propostos para determinao do alendronato de sdio atravs da CLAE em fase reversa empregam, em sua maioria, a deteco por ultravioleta ou fluorescncia. No entanto, com exceo de alguns compostos como o tiludronato (que possui anel aromtico em sua estrutura), a maioria dos bisfosfonados no apresenta propriedades cromforas16. Sendo assim, o alendronato precisa ser submetido previamente a uma reao de derivatizao. Esta tem como objetivo conferir ao composto a capacidade de absorver radiao ultravioleta ou de emitir fluorescncia. Um dos primeiros mtodos desenvolvidos para determinao do alendronato em formulaes farmacuticas faz uso da CLAEFR, utilizando derivatizao pr-coluna com 9-fluorenilmetilcloroformato (FMOC) para deteco do frmaco17. Em 2002, uma proposta de monografia analtica empregando esta metodologia para anlise quantitativa de matria-prima foi encaminhada ao Pharmacopeial Forum18, objetivando publicao oficial no primeiro suplemento da USP 26 (compndio oficial americano de 2003). Entretanto, a mesma no foi lanada e tambm no consta na edio de 2004 (USP 27)19. Provavelmente, no houve consenso entre os organizadores quanto melhor metodologia a ser adotada pela Farmacopia Americana. De Marco e colaboradores17 realizaram a derivatizao acres-

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centando ao frmaco (diludo em soluo de cido ctrico) quantidade apropriada de uma soluo recm-preparada de FMOC em acetonitrila. A concentrao de cido ctrico importante, pois o citrato atua como um quelante de ons metlicos, evitando a complexao do alendronato com metais e permitindo a reao com FMOC. Tambm foi observada a relao entre o tempo de reao e a quantidade de produto obtido, sendo necessrio um tempo mnimo de 20 min para que a reao seja completa. A reao de derivatizao ocorre conforme apresentado na Figura 3, onde o FMOC reage com o nitrognio da amina primria do alendronato.

Figura 3. Reao de derivatizao do alendronato (a) com 9fluorenilmetilcloroformato (FMOC) (b), originando produto cromforo (c) passvel de deteco no UV. Adaptada da ref. 17

Aps a reao de derivatizao, faz-se necessrio extrair com diclorometano o excesso de reagente (FMOC), o qual, se no for removido de forma apropriada, pode ocasionar picos assimtricos na anlise cromatogrfica. O diclorometano foi escolhido, frente a outros solventes orgnicos pouco polares, por permitir que a fase aquosa contendo o frmaco derivatizado permanea superior, devido a sua menor densidade, facilitando assim a coleta. No estudo de De Marco foi utilizada uma coluna com fase estacionria polimrica base de estireno divinilbenzeno para a anlise cromatogrfica. Esta apresentou maior estabilidade que as colunas convencionais de fase reversa, C-8 e C-18 base de slica, frente ao elevado pH da fase mvel utilizada (pH=8,0), o qual necessrio para manter a estabilidade do derivado obtido (Figura 3). O comprimento de onda escolhido para a deteco foi de 266 nm, no qual o derivado apresentou mxima absorvncia. Segundo os autores, o mtodo foi validado para doseamento de formulao intravenosa, comprimidos e cpsulas de alendronato e para determinao da taxa de dissoluo, mostrando-se preciso (Desvios Padro Relativos DPRs < 3%), exato e especfico17. Em outro estudo com CLAE em fase reversa20, foi desenvolvido e validado um mtodo para determinao do alendronato na urina, utilizando derivatizao com 2,3-naftaleno dicarboxialdedo cianida (NDA-CN-) e deteco fluorimtrica (DF). O limite de quantificao (LQ) encontrado foi de 5 ng/mL, o qual se apresentou bem abaixo dos valores de LQ encontrados por outros mtodos desenvolvidos at ento. Posteriormente, os autores iniciaram novo estudo21 buscando fornecer uma metodologia com maior sensibili-

dade e que possibilitasse o uso de um reagente menos txico que o NDA-CN-, substituindo o on cianida (CN-) por um outro nuclefilo. Foi ento publicado um trabalho com CLAE-FR, para determinao do alendronato na urina e no plasma, onde se empregou DF aps derivatizao com o reagente 2,3-naftaleno dicarboxialdedoN-acetil-D-penicilamina (NDA-NAP). Foi obtido um LQ de 1 ng/ mL e um de 5 ng/mL para o alendronato de sdio na urina e no plasma, respectivamente, demonstrando assim a sensibilidade superior deste mtodo em relao ao anterior. A reao de derivao que ocorre nos mtodos propostos por Kline e colaboradores pode ser visualizada na Figura 4. Neste mesmo estudo, alm da DF, tambm foi explorada a deteco eletroqumica (DE) do derivado NDA-CN-, observada a eletroatividade do mesmo, empregando eletrodo de trabalho de carbono vtreo. O tampo borato, usado no preparo da amostra para derivatizao, ocasionou uma extensa cauda frontal interferente na anlise e foi substitudo por um tampo carbonato. Para a escolha do potencial a ser aplicado durante a deteco, foi registrado um voltamograma do derivado (c) (Figura 4). Na varredura de potencial, de +0,4 a +0,8 V, observou-se uma mxima intensidade de corrente em +0,65 V, o qual foi considerado o potencial de oxidao timo para anlise. O LQ encontrado foi de 2,5 ng/mL, demonstrando boa sensibilidade do mtodo. A preciso (DPRs < 9%), exatido e linearidade do mtodo foram testadas e mostraram-se adequadas, para concentraes do frmaco entre 2,5 e 50,0 ng/mL21. Recentemente foi descrita uma proposta para determinao de alendronato de sdio na urina (atravs da CLAE-FR) onde tambm foi empregada a derivatizao com FMOC, mas usou-se deteco por fluorescncia, selecionando os comprimentos de onda de 260 nm para a excitao do analito e de 310 nm para medida da fluorescncia emitida. Nesta metodologia no houve remoo do excesso de reagente pela extrao com diclorometano e foi utilizada uma coluna convencional C-18 base de slica em detrimento s colunas polimricas empregadas em outros estudos. Ainda assim foram obtidos picos simtricos e bem resolvidos, segundo o autor. Fez-se uso de um padro interno para realizao das anlises, com intuito de corrigir a variabilidade causada pela preparao das amostras biolgicas. O LQ encontrado neste estudo foi de 3,5 ng/mL, demonstrando que o mtodo, levando-se em conta a baixa biodisponibilidade do alendronato, adequado para determinao do frmaco na urina22. Um recurso muito utilizado na anlise de compostos ionizveis por CLAE-FR a formao do par inico. Como a fase estacion-

Figura 4. Derivatizao do alendronato (a) com 2,3-naftaleno dicarboxialdedo (NDA) (b), originando o produto (c), de acordo com o nuclefilo empregado. Adaptada da ref. 21

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ria empregada na CLAE-FR apolar, interage fracamente com o soluto inico e reduz demasiadamente o tempo de reteno, o que pode ocasionar uma seletividade insatisfatria do mtodo. Na tcnica do par inico, um contra-on de carga oposta ao soluto analisado adicionado na fase mvel, permitindo que o analito percorra a coluna como uma molcula neutra, melhorando sua interao com a fase estacionria e aumentando a seletividade do sistema. Dentre os vrios mtodos descritos para anlise de compostos bisfosfonados que empregam o pareamento inico, um dos estudos envolve a determinao do alendronato em fase estacionria polimrica, usando o brometo de cetiltrimetilamnio como contra-on. Para a deteco fluorimtrica foi realizada derivatizao ps-coluna com oftalaldedo e mercaptoetanol (OPA-MERC). O mtodo foi aplicado na determinao do alendronato em formulao intravenosa e comprimidos23. Posteriormente foram descritas outras derivatizaes para anlise de um aminodifosfonado anlogo ao alendronato (o pamidronato, ou 3-amino-1-hidroxipropilideno bisfosfonato)24,25. Os mtodos empregaram a CLAE-FR com utilizao de par inico, mas com distintos reagentes de derivatizao: em um, para determinao do frmaco em formulaes, foi utilizado o fenilisotiocianato, e em outro, para determinao em meios biolgicos, o frmaco foi derivatizado com 1-naftilisotiocianato. Em ambos houve posterior deteco por fluorescncia. Em um outro estudo realizado pelo mesmo grupo de autores26, a determinao do pamidronato e de outros bisfosfonados (incluindo o alendronato) atravs da CLAE-FR com par inico seguiu na mesma linha, empregando-se diferentes isotiocianatos para a derivatizao de cada frmaco e posterior deteco por fluorescncia. Tambm foi analisada a influncia de diferentes contra-ons (utilizados para formao dos pares inicos) na reteno relativa de cada frmaco, como pode ser visualizado na Tabela 1, onde, dependendo do contra-on utilizado, pode-se inclusive observar a reverso da ordem de eluio. CLAE de troca inica A cromatografia lquida de troca inica (CLAE-TI) uma alternativa bastante utilizada na anlise cromatogrfica de compostos inicos, constituindo mtodo perfeitamente aplicvel na determinao dos compostos bisfosfonados. Em um dos mtodos que aplicam a CLAE-TI para determinao do alendronato foi utilizada a condutimetria para deteco do frmaco. Como fase mvel foi usado o cido ntrico (HNO3) na concentrao de 1,6 mmol/L, fornecendo um pH favorvel para manuteno do on monovalente do alendronato na soluo, o qual menos retido pela coluna de troca inica que o on divalente, possibilitando reduo no tempo de anlise. Devido alta condutividade do HNO3 (provocada principalmente pela presena dos ons H+), o alendronato produziu um sinal decrescente (sinal cromatogrfico indireto). Tentativas de se utilizar uma coluna supressora, que reduzisse o sinal provocado pelos ons H+ da fase mvel, no foram bem sucedidas, j que suprimiram paralelamente a resposta do alendronato. O mtodo foi validado para duas formulaes: soluo intravenosa e comprimidos, e foi considerado

preciso (DPRs < 2%), exato (boa recuperao), especfico (alendronato foi bem separado dos outros componentes nas duas formulaes) e reprodutvel (determinaes em equipamentos diferentes no demonstraram diferenas significativas). Foi encontrado um LD de 2 g/mL e um LQ de 5 g/mL, para uma razo sinal/rudo (S/R) igual a 4. Os autores realizaram uma comparao entre a anlise com deteco condutimtrica e a anlise com deteco por UV (derivatizao pr-coluna com 9-fluorenilmetilcloroformato - FMOC) e no foram observadas diferenas estatisticamente significativas entre os resultados dos dois mtodos, os quais puderam ser considerados equivalentes27. Posteriormente, foi realizado outro estudo com CLAETI, onde se utilizou a deteco por ndice de refrao. Assim como na anlise por deteco condutimtrica, empregou-se como fase mvel o HNO3, utilizando-se, no entanto, uma concentrao um pouco mais elevada (6,0 mmol/L) para esta metodologia. O mtodo foi validado para a formulao do alendronato em comprimidos e demonstrou ser seletivo, separando adequadamente o frmaco de impurezas propil-anlogas e dos excipientes. Da mesma forma, demonstrou ser preciso (DPRs < 2%), exato e robusto. O LD encontrado para o mtodo foi de 0,4 g/mL, sendo comparvel ao mtodo com deteco indireta por ultravioleta, com LD de 1 g/mL28. Em edio recente da Farmacopia Portuguesa, h descrio de monografia para o alendronato de sdio, onde a determinao quantitativa do frmaco realizada por cromatografia de troca inica, utilizando coluna trocadora de nions e deteco por ndice de refrao1. Tambm foi proposta a determinao de bisfosfonados em formulaes farmacuticas por CLAETI, utilizando a complexao e deteco por ultravioleta. Como fase mvel foi empregada uma mistura de HNO3 e nitrato de cobre II (Cu(NO3)2). A capacidade de absorver radiao UV foi conferida pela formao de complexo cromforo, obtido pela reao entre os frmacos e ons cpricos (Cu2+) presentes na fase mvel. A leitura da absorvncia foi feita no comprimento de onda de 245 nm. Dentre os bisfosfonados analisados, o LD mais baixo (0,4 g/mL) foi obtido para o pamidronato29. Ainda, explorando a deteco espectrofotomtrica, foi proposta uma outra metodologia utilizando CLAETI para os bisfosfonados, onde se empregou uma reao fotoqumica ps-coluna para os frmacos. O mtodo pode ser explicado, resumidamente, da seguinte maneira: o bisfosfonado passa por um reator fotoqumico (acoplado ao sistema) aps eluir da coluna. No reator ele submetido radiao ultravioleta ( = 254 nm) transformando-se em ortofosfato, o qual ir reagir com o molibdato (reagente introduzido ps-coluna) para formar o fosfomolibdato. Sob radiao UV o fosfomolibdato reduzido a fosfomolibdnio, um complexo de cor azul que , ento, detectado a um comprimento de onda de 750 nm. O mtodo foi otimizado para determinao do cido 2-tioetano-1,1-bisfosfnico em formulaes farmacuticas utilizando a eluio por gradiente. Esta metodologia apresenta vantagem frente eluio isocrtica por permitir a separao de produtos de degradao, obtidos nos ensaios de estabilidade do frmaco em condies de estresse30.

Tabela 1. Influncia do contra-on na reteno dos derivados aminobisfosfonados-FTC Componente (derivado do fenilisotiocianato) Pamidronato FTC Neridronato FTC Alendronato FTC Fator de separao () em relao ao derivado pamidronato-FTC contra-on TEA contra-on THA Contra-on TOA 1 4,9 1,7 1 0,88 0,94 1 0,88 0,93

FTC = feniltiocianato; Contra-ons: TEA = tetraetilamnio, THA = tetraexilamnio, TOA = tetraoctilamnio. Adaptada da ref. 26.

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Como esperado, a ausncia de grupo cromforo na estrutura qumica do alendronato dificulta sua anlise por CLAE com deteco espectrofotomtrica apresentando, assim, a desvantagem de necessitar de extensivas preparaes (no caso da derivatizao pr-coluna) ou de equipamento especfico e de custo mais elevado (no caso da derivatizao ps-coluna). Na tentativa de elaborar procedimentos mais simples, alguns autores desenvolveram mtodos para determinao de alendronato e outros bisfosfonados utilizando deteco indireta por ultravioleta. Estas metodologias baseiam-se na medida da diminuio da absorvncia da fase mvel (contendo HNO3) que ocorre pela presena do soluto (bisfosfonado)31,32. Em um dos estudos, foi empregado HNO3 1,6 mmol/L como fase mvel, o comprimento de onda de 235 nm para leitura da absorvncia e um detector com polaridade invertida. medida que os ons nitrato da fase mvel so substitudos pelos nions do bisfosfonado (alendronato, entre outros), as medidas de absorvncia decrescem. Este mtodo foi validado para uma formulao de alendronato em comprimidos e formulao injetvel de dois outros bisfosfonados. Entretanto, devido ao elevado LD encontrado (1 g/mL), o mtodo no se mostrou adequado para deteco de produtos de degradao do alendronato em estudos de estabilidade32. Uma outra proposta empregou derivatizao ps-coluna e deteco indireta por fluorescncia para determinao do alendronato e outros bisfosfonados em matrizes biolgicas. Neste estudo foi usada uma coluna aninica fortemente bsica para anlise por CLAE-TI e a fase mvel foi composta por hidrxido de sdio (NaOH) e nitrato de sdio (NaNO 3). O reagente utilizado na derivatizao foi o Al3+-morin. O morin, ou 2',3,4',5,7-pentaidroxiflavona, um composto fluorescente que na presena do on Al3+ forma um complexo de fluorescncia ainda mais intensa. O princpio da anlise baseado na adio ps-coluna do reagente Al3+ morin fase mvel, conferindo mesma a capacidade de emitir fluorescncia. medida que os ons do alendronato eluem da coluna, eles competem com o morin pela complexao com o Al3+, estabelecendo-se um equilbrio da reao: Al3+-morin + alendronato Al3+-alendronato + morin

O complexo formado pelo alendronato e o alumnio no fluorescente e o morin sem a complexao com o Al3+ torna-se menos fluorescente, o que ocasiona decrscimo na fluorescncia emitida pela fase mvel. Esta diminuio na leitura da fluorescncia emitida proporcional concentrao de alendronato que elui da coluna. O LD encontrado foi de 10 ng na coluna3. Encontra-se tambm, na literatura, estudo para caracterizao do alendronato onde se emprega a CLAE-TI e deteco por espectrometria de massas com electrospray33. Mtodos espectrofotomtricos A utilizao do mtodo espectrofotomtrico na determinao quantitativa de um frmaco pode ser muito conveniente em algumas situaes, considerando-se a simplicidade, rapidez e baixo custo proporcionados por este tipo de anlise. No entanto o alendronato de sdio, assim como alguns outros compostos bisfosfnicos, no possui grupamentos cromofricos em sua estrutura, o que impede sua anlise por tcnicas espectrofotomtricas convencionais. Os compostos bisfosfonados so capazes de atuar como quelantes de ons metlicos, devido propriedade ligante conferida pelo grupamento hidroxila34. Observando esta capacidade, Ostovic e colaboradores35 realizaram um estudo onde foi analisada a formao de um complexo cromforo entre o alendronato e ons cpricos (Cu2+). Foi avaliada a cintica da reao de formao do

complexo e, tambm, a capacidade deste de absorver radiao ultravioleta. Os autores apontaram a possibilidade da utilizao deste mtodo para determinao quantitativa do alendronato de sdio, mas destacaram algumas limitaes, tais como a presena de outros ons que competem pela complexao com o bisfosfonado, a presena de agentes quelantes do Cu2+ (como o citrato, por ex.) e a baixa solubilidade do complexo bisfosfonado Cu2+ na presena de valores elevados de pH35. Explorando ainda a propriedade quelante dos bisfosfonados, foi desenvolvida e validada uma metodologia para determinao do alendronato de sdio em comprimidos, onde o frmaco foi inicialmente complexado com ons frricos (Fe3+) para que, ento, pudesse ser analisado por espectrofotometria no ultravioleta (UV)36. A complexao do alendronato ocorreu por adio de soluo de cloreto frrico (em cido perclrico) a uma soluo contendo o alendronato de sdio (tambm em cido perclrico). Foram realizados experimentos para determinar qual proporo entre cloreto frrico (FeCl 3) e alendronato origina melhores valores de absorvncia e constatou-se que a proporo ideal para formao do complexo de 1:1. Kuljanin e colaboradores36 observaram mxima absorvncia do complexo alendronatoFe3+ em um comprimento de onda de 260 nm, no qual o alendronato livre no apresentou leitura, mas onde se nota razovel interferncia do cloreto frrico, embora seu comprimento de onda de mxima absorvncia esteja em torno de 238 nm. Assim, para minimizar o efeito interferente dos ons frricos na anlise, as leituras do complexo foram realizadas em torno de 300 nm. Para avaliar a robustez do mtodo foram feitas medidas da absorbncia, imediatamente aps a formao do complexo, nos comprimentos de onda de 290, 300 e 310 nm. O LD encontrado para este mtodo foi de 2 g/mL (para um S/R = 3) e o LQ foi de 7 g/mL. A especificidade foi testada avaliando-se a interferncia dos excipientes da formulao na formao do complexo e nas medidas de absorvncia. A amostra de placebo no apresentou sinal nas condies experimentais descritas36. Embora este mtodo possua especificidade satisfatria quanto interferncia dos excipientes, ele no pode ser considerado seletivo para determinao de produtos de degradao e impurezas do alendronato. Portanto, no pode ser aplicado como mtodo indicador de estabilidade. Mtodos titulomtricos Da mesma maneira que a espectrofotometria, a titulometria consiste em um mtodo simples e de baixo custo que pode ser aplicado para anlise quantitativa de uma grande variedade de compostos. Por outro lado, durante o procedimento, pode-se quantificar substncias de estruturas qumicas diferentes que apresentam propriedades fsico-qumicas semelhantes ou mesmos grupos reacionais. Portanto, na maioria dos casos, este mtodo no pode ser considerado seletivo. Na literatura cientfica, h poucos trabalhos propondo metodologia titulomtrica para determinao quantitativa de derivados de cidos bisfosfnicos, sendo que em dois relatos empregada a complexometria. As anlises so baseadas na capacidade dos compostos bisfosfonados em formar complexos. Nestes mtodos, o alendronato (assim como alguns outros bisfosfonados estudados) titulado por agentes complexantes como o dinitrilocicloexilenotetracetato de trio (Th[DCTA]) ou o etilenodiaminotetracetato de trio (Th[EDTA]), sendo que o ponto final da titulao pode ser determinado utilizando-se indicadores visuais (laranja de xilenol ou azul de metil timol)37,38. A Farmacopia Americana adota metodologia semelhante para determinao do etidronato, onde o frmaco titulado pelo Th(DCTA)

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Alendronato de Sdio: Metodologias para Anlise Quantitativa

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na presena do laranja de xilenol e o ponto final da titulao caracterizado pela viragem do indicador a uma cor vermelho-violcea39. A volumetria de neutralizao tambm foi proposta para determinao do alendronato de sdio em formulaes farmacuticas, aproveitando as propriedades cidas da molcula40. Foi utilizado como titulante NaOH 0,1 e 0,05 mol/L para anlise de matriaprima e produto acabado, respectivamente. Segundo os autores, o mtodo mostrou-se preciso e exato, porm, na anlise de uma formulao sob forma de comprimidos foi observada interferncia dos excipientes. H tambm registros no publicados em meios cientficos, provenientes principalmente de empresas produtoras do frmaco, onde vem sendo utilizada a titulao cido-base para determinao quantitativa do alendronato de sdio11,12. O mtodo, entretanto, precisa ser melhor avaliado no que se refere seletividade, quando da presena de impurezas de carter cido na matria-prima. Outros mtodos Metodologias menos comuns na rotina laboratorial farmacutica tambm foram empregadas para determinao do alendronato de sdio, tais como a Eletroforese Capilar (EC), Plasma de Acoplamento Indutivo ou ICP (Inductively Coupled Plasma) e a Voltametria de Redissoluo Andica ou ASV (Anodic Stripping Voltammetry). Eletroforese capilar (EC) A eletroforese capilar um mtodo de separao bastante eficiente e que vem sendo utilizado cada vez mais na anlise de produtos farmacuticos. Sua aplicao voltada, principalmente, para anlise de molculas carregadas eletricamente, o que torna este mtodo bastante atraente para determinao dos compostos bisfosfonados, j que estes possuem carga negativa. O uso da EC apresenta algumas vantagens em relao CLAE, tais como elevada eficincia, alta resoluo, rapidez no desenvolvimento dos mtodos, reduzido consumo de solvente e menor volume de amostra utilizada (este ltimo, s vezes, tornando-se uma desvantagem face exigncia de deteco sensvel). Tsai e colaboradores34 desenvolveram uma metodologia para determinao do alendronato de sdio utilizando a EC como mtodo de separao. Foi utilizado tubo capilar de slica, no revestido, com soluo composta por uma mistura de HNO3 1,6 mmol/L e sulfato cprico (CuSO4 2 mmol/L) e empregou-se a deteco direta do complexo formado entre alendronato e cobre (presente na soluo eletroltica), por ultravioleta. Este mtodo apresentou algumas vantagens em comparao a dois outros mtodos utilizando CLAE (um com CLAE-FR e deteco por UV e outro com CLAE-TI e deteco por condutividade), tais como maior eficincia de separao, maior simplicidade e rapidez no preparo da amostra e consumo extremamente reduzido de fase mvel. Contudo, a dificuldade dos autores em selecionar um padro interno adequado resultou, como conseqncia, em menor preciso do mtodo (DPR 2 5%)34. Outros mtodos onde a EC utilizada para determinao de compostos bisfosfonados foram descritos e empregam tanto a deteco direta por UV como a deteco por espectrometria de massas com electrospray41-43. Plasma de acoplamento indutivo (ICP) O ICP um mtodo que utiliza o plasma como fonte de excitao para emisso atmica e pode estar associado a mtodos de deteco como a Espectroscopia de Emisso tica ou a Espectrometria de Massas. Apesar de no ser um mtodo de uso comum na rotina laboratorial, seu emprego na anlise de substn-

cias farmacuticas vem aumentando, j havendo descrio de sua utilizao na quantificao do etidronato (como mtodo de deteco acoplado CLAE-TI)44,45. O mtodo baseia-se na aplicao de um campo de rdio freqncia a um compartimento por onde passa um fluxo de argnio. Desta forma o gs energizado e, com a ajuda de uma descarga auxiliar, forma um plasma estvel que atinge uma temperatura de 9727 oC. A amostra com a substncia a ser analisada nebulizada e carreada pelo fluxo de argnio at a chama de plasma, onde atinge uma temperatura extremamente alta, levando atomizao do analito e posterior emisso de ftons. A intensidade do feixe de ftons emitido proporcional concentrao da substncia na amostra45. Reed e colaboradores44 desenvolveram metodologia para determinao do alendronato de sdio em comprimidos utilizando a anlise por ICP para contedo de fsforo. O alendronato (tanto o padro como a amostra em comprimidos) foi dissolvido em gua e diretamente analisado (sem o uso de mtodo de separao previamente anlise). No espectrmetro acoplado ao ICP foi selecionado um comprimento de onda de 178 nm (utilizado para a deteco de fsforo). O mtodo foi considerado linear, preciso (DPRs < 2%) e exato (comparativamente ao mtodo por CLAE-FR, com uso do FMOC e deteco por UV). Alm disto, mostrou ser extremamente rpido e simples, proporcionando fcil preparo da amostra e menor tempo total de anlise. No entanto no pode ser utilizado como indicador de estabilidade, pois especfico apenas para o fsforo, podendo quantificar ao mesmo tempo qualquer composto que contenha este elemento (tais como impurezas de sntese ou produtos de degradao do alendronato)44. Voltametria de redissoluo andica A voltametria de redissoluo um mtodo extremamente sensvel, utilizado para determinao de baixas concentraes de substncias eletroativas em soluo. empregado na anlise de compostos que possam ser facilmente reduzidos e oxidados, tais como os metais. Esta tcnica baseada na aplicao de um potencial extremamente negativo (chamado de potencial de deposio) a um eletrodo em contato com uma soluo contendo o analito (geralmente um on metlico), o qual sofre reduo e se deposita na superfcie do eletrodo. Em seguida, o potencial aplicado modificado, realizando-se uma varredura na direo de valores positivos. Desta forma o analito acumulado reoxidado e se dissolve, retornando soluo e resultando na gerao de uma corrente. A intensidade da corrente produzida proporcional concentrao da substncia analisada que se depositou no eletrodo46. Recentemente, Razac e colaboradores 47 desenvolveram metodologia para determinao do alendronato de sdio (alm de outros dois compostos) atravs da voltametria de redissoluo andica. Neste mtodo foi realizada a complexao do frmaco pelo cobre (Cu2+) e o complexo formado depositou-se na superfcie do eletrodo, sob ao de um potencial de deposio de 1100 mV. Para a redissoluo foi utilizada a tcnica de pulso diferencial (DPASV), a qual um tipo de voltametria de redissoluo que apresenta elevada sensibilidade. Durante o estudo foram analisadas a influncia do pH e do tempo de agitao sobre a formao do complexo, assim como o efeito do potencial de acumulao sobre a etapa de deposio. Tambm foi observado que o excesso do fosfato de cobre II (Cu3(PO4)2), utilizado na complexao, no interfere na anlise, pois este reagente fracamente solvel e mesmo pequenos nveis de Cu2+ residuais no prejudicam a deteco do complexo. O mtodo foi considerado linear na faixa de 0,1 a 0,3 g/mL, preciso (DPRs < 2%), exato e apresentou alta sensibilidade, com um LD igual a 8,6 ng/mL e um LQ igual a 29 ng/mL47.

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Ribeiro e Volpato

Quim. Nova

CONSIDERAES FINAIS Ao longo dos anos 90 foram publicadas diversas metodologias analticas para determinao quantitativa do alendronato de sdio, a maioria delas empregando a cromatografia lquida de alta eficincia. A CLAE-FR, associada a diferentes formas de deteco (principalmente ultravioleta e fluorescncia), apresentou os melhores resultados quanto sensibilidade, com limites de quantificao de at 1 ng/mL, mostrando-se, portanto, bastante adequada para determinao do alendronato em matrizes biolgicas, considerandose a biodisponibilidade extremamente reduzida deste frmaco. No entanto, como a molcula no apresenta absoro na regio do UV ou capacidade de emitir fluorescncia, deve sofrer derivatizao previamente deteco, com procedimentos extensivos, tornando a execuo complexa e demorada. As metodologias empregando a CLAE-TI parecem ser de execuo mais simples e mostraram-se alternativas adequadas para determinao de um composto inico, como o alendronato, em formulaes. No entanto, alguns detectores utilizados nas anlises com CLAE-TI so menos comuns nos laboratrios e podem ser de difcil manuseio. Alm disto, apresentaram sensibilidade reduzida em relao aos mtodos com CLAE-FR, sendo o menor limite de quantificao alcanado de 0,4 g/mL. A deteco indireta por ultravioleta utiliza detector de uso mais comum e requer procedimentos mais simples, mas fornece elevado limite de deteco, prejudicando a sensibilidade do mtodo. Tcnicas menos empregadas na rotina laboratorial farmacutica tambm mostraram-se adequadas para determinao do alendronato em formulaes. O plasma de acoplamento indutivo de execuo simples, a voltametria de redissoluo andica apresentou elevada sensibilidade e a EC, boa resoluo dos picos. A principal desvantagem destes procedimentos a utilizao de equipamentos menos comuns quando comparados CLAE. A espectrofotometria e a titulometria constituem mtodos mais simples para determinao do alendronato, mas poucos estudos envolvendo estas metodologias foram encontrados na literatura. Normalmente, apresentam limitaes quanto especificidade, podendo apresentar erros resultantes da presena de impurezas e produtos de degradao, alm de serem mtodos pouco sensveis. Ainda assim, alguns laboratrios utilizam a volumetria de neutralizao para as anlises do controle de qualidade do frmaco. Assim, a anlise quantitativa de compostos bisfosfnicos, como o alendronato, necessita maiores estudos, no apenas visando o desenvolvimento de novos mtodos, mas tambm documentando cientificamente metodologias no oficiais, rotineiramente empregadas nos laboratrios farmacuticos que, mostrando-se adequadas e validadas, poderiam ser adotadas pela Farmacopia Brasileira ou compndios oficiais estrangeiros. AGRADECIMENTOS CAPES pela bolsa de mestrado recebida por A. F. Ribeiro. REFERNCIAS
1. Farmacopia Portuguesa VII; 7 ed., Instituto Nacional da Farmcia e do Medicamento: Lisboa, 2002 (CD-ROM). 2. Guyton, A. C.; Fisiologia Humana, 6 ed., Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 1988, cap. 36. 3. Lovdahl, M. J.; Pietrzyk, D. J.; J. Chromatogr., A 1999, 850, 143. 4. Marcus, R. Em As Bases Farmacolgicas da Teraputica; Hardman, J. G.; Limbird, L. E.; Molinoff, P. B.; Ruddon, R. W.; Gilman, A. G., eds.; 9 ed., McGraw-Hill: Rio de Janeiro, 1996, cap. 61.

5. Parfitt, K.; Martindale . The complete drug reference , 32 ed., Pharmaceutical Press: London, 1999. 6. DEF 2000/01. Dicionrio de Especialidades Farmacuticas; 29 ed., Publicaes Cientficas: Rio de Janeiro, 2000. 7. P.R Vade-mcum, Edio: 2002/2003, Ed. Metha: So Paulo, 2002 (CDROOM). 8. Castro, L. F.; Silva, A. T. A.; Chung, M.; Ferreira, A. G.; Ferreira, E. I.; Quim. Nova 2004, 27, 456. 9. Kieczykowski, G. R.; Jobson, R. B.; Melillo, D. G.; Reinhold, D. F.; Grenda, V. J.; Shinkai, I.; J. Org. Chem. 1995, 60, 8310. 10. The Merck Index. An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals; 13 ed., Merck e Co. Inc.: Whitehouse Station, New Jersey, 2001. 11. CIPLA kurkumbh; Finished Product Specification. Test and methods. Alendronate sodium trihydrate, 1999. 12. PROSINT srl; Informacion de Producto. Alendronato monosodico trihidrato. Mtodo de Anlisis, Buenos Aires, 1997. 13. McCarthy, M.; The Lancet 1995, 346, 1028. 14. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA); Resoluo RE n 37, de 05/02/2004. 15. http://www.consultaremedios.com.br, acessada em Dezembro 2004. 16. Sparidans, R. W.; Hartigh, J.; Cremers, S.; Vermeij, P.; J. Chromatogr., A 2000, 868, 141. 17. De Marco, J. D.; Biffar, S. E.; Reed, D. G.; Brooks, M. A.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1989, 7, 1719. 18. Medjedovic, A.; Pharmacopeial Forum 2002, 28, 737. 19. United States Pharmacopeia ; 27 ed., Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2004. 20. Kline, W. F.; Matuszewski, B. K.; Bayne, W. F.; J. Chromatogr. 1990, 534, 139. 21. Kline, W. F.; Matuszewski, B. K.; J. Chromatogr. 1992, 583, 183. 22. Ptcek, P.; Klma, J.; Macek, J.; J. Chromatogr., B: Biomed. Sci. Appl. 2002, 767, 111. 23. Kwong, E.; Chiu, A. M.; McClintock, S. A.; Cotton, M. L.; J. Chromatogr. Sci. 1990, 28, 563. 24. Sparidans, R. W.; Hartigh, J.; Ramp-Koopmanschap, W. M.; Langebroek, R. H.; Vermeij, P.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1997, 16, 491. 25. Sparidans, R. W.; Hartigh, J.; Beijnen, J. H.; Vermeij, P.; J. Chromatogr., B: Biomed. Sci. Appl. 1998, 705, 331. 26. Sparidans, R. W.; Hartigh, J.; Beijnen, J. H.; Vermeij, P.; J. Chromatogr., A 1997, 782, 211. 27. Tsai, E. W.; Ip, D. P.; Brooks, M. A.; J. Chromatogr. 1992, 596, 217. 28. Han, Y. R.; Qin, X.; J. Chromatogr., A 1996, 719, 345. 29. Sparidans, R. W.; Hartigh, J.; Vermeij, P.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1995, 13, 1545. 30. Peng, S. X.; Dansereau, S. M.; J. Chromatogr., A 2001, 914, 105. 31. Quattrocchi, O.; Frisardi, L.; Iglesias, M.; Noya, M.; Caputto, M.; Damin, F.; Siliprandi, D.; Piccinni, E.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 24, 1011. 32. Tsai, E. W.; Chamberlin, S. D.; Forsyth, R. J.; Bell, C.; Ip, D. P.; Brooks, M. A.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1994, 12, 983. 33. Qin, X.; Tsai, E.W.; Sakuma, T.; Ip, D. P.; J. Chromatogr., A 1994, 686, 205. 34. Tsai, E. W.; Singh, M. M.; Lu, H. H.; Ip, D. P.; Brooks, M. A.; J. Chromatogr. 1992, 626, 245. 35. Ostovic, D.; Stelmach, C.; Becky, H.; Pharm. Res. 1993, 10, 470. 36. Kuljanin, J.; Jankovic, I.; Nedeljkovic, J.; Prstojevic, D.; Marinkovic, V.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 28, 1215. 37. Podolska, M.; Bialecka, W.; Kwiatkowska-Puchniarz, B.; Tuszynska, E.; Acta Poloniae Pharmaceutica 1997, 54, 267. 38. Podolska, M.; Bialecka, W.; Kwiatkowska-Puchniarz, B.; Acta Poloniae Pharmaceutica 2000, 57, 159. 39. United States Pharmacopeia ; 24 ed., Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2000. 40. Bueno, F.; Bergold, A. M.; Acta Farm. Bonaerense 2000, 19, 129. 41. Peng, S. X.; Takigiku, R.; Burton, D. E.; Powell, L. L.; J. Chromatogr., B: Biomed. Sci. Appl. 1998, 709, 157. 42. Huikko, K.; Kostiainen, R.; J. Chromatogr., A 2000, 872, 289. 43. Huikko, K.; Kostiainen, R.; J. Chromatogr., A 2000, 893, 411. 44. Reed, D. G.; Martin, G. P.; Konieczny, J. M.; Brooks, M. A.; J. Pharm. Biomed. Anal. 1995, 13, 1055. 45. http://www.myway.com.br/usuarios/rafagui/exp.htm, acessada em Agosto 2003. 46. http://www.epsilon-web.net/Ec/manual/Techniques/Stripping/ stripping.html, acessada em Julho 2003. 47. Razak, O. A.; Belal, S. F.; Bedair, M. M.; Haggag, R. S.; Talanta 2003, 59, 1061.