LABORATORIO BIOQUMICA DE LOS ALIMENTOS No 5 DETERMINACION DE PROTEINA Y ACTIVIDAD DE PROTEASA

RESUMEN

Las enzimas son polmeros de aminocidos que dirigen la actividad cataltica en distintos sistemas biolgicos, gracias a su capacidad de acelerar reacciones qumicas. Durante los ltimos aos, su utilidad en gran cantidad de industrias ha adquirido gran relevancia; siendo las proteasas el grupo de enzimas de mayor importancia industrial y comercial a escala internacional (Haard y col., 2000, Montes y Magaa, 2002). Casi la mitad de las enzimas industriales son proteasas y se utilizan en los detergentes, en procesos de ablandamiento de pieles, en la manufactura de quesos, industria vincola y fabricacin de sedas; a la vez tienen aplicaciones muy importantes en el rea mdica como la produccin de frmacos anti-inflamatorios, disolucin de cogulos sanguneos, inhibicin de la transcripcin (como el Zidovudine que acta como inhibidor de la transcriptasa reversa en el HIV) y activacin de hormonas entre otras (Haard y col., 2000, Copeland, 2000, Klomklao y col., 2005, Saeki y col., 2007).

En el Trabajo Prctico se determinar la concentracin de protenas por el Mtodo de Bradford. Es una tcnica sensible que consiste en la medicin de la extincin provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante (Coomasie Blue G250) cuando ste se une a las protenas (absorbiendo as a 595 nm). Esta unin se realiza a travs de grupos ionizados y se comprueba proporcionalidad con la concentracin de protenas contenidas en las muestras, que en este caso corresponden a salchichas sureas PF y salchichas colonial SAN JORGE por tanto a travs de una curva de calibracin realizada antes de las muestras se determinar el contenido de protena de cada muestra.

ndice

1 Introduccin.

2 Objetivos.

3 Materiales y metodologa.

4 Resultados y discusin.

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5 Conclusiones y recomendaciones.

6 Bibliografa o Webgrafa.

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7 Anexos.

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INTRODUCCIN
EL termino protena fue utilizado por primera vez por el qumico alemn Gerardus Mulder, en 1838, tomo este nombre del vocablo griego PROTERIOS, que significa primordial nivel primario. Las protenas son un grupo de biopolmeros constituidos de aminocidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones. Las protenas como un grupo de biomoleculas , desempean una gran variedad de funciones , algunas participan en la contraccin muscular y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan molculas pequeas. Los anticuerpos (molculas que sirven para como proteccin inmunolgica) son protenas al igual que las enzimas (catalizadores biolgicos) y algunas hormonas. Hay muchos mtodos de determinar la cantidad de protena pero el mtodo de Bradford es una tcnica sensible que consiste en la medicin de la extincin provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante (Coomasie Blue G250) cuando ste se une a las protenas (absorbiendo as a 595 nm). La determinacin del contenido proteico de una muestra requiere la comparacin del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de protenas, con los que se construye una curva de calibracin: a mayor cantidad de protenas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia. Recordar que esta proporcionalidad es slo lineal hasta un cierto lmite de concentracin. Para construir la curva de calibracin se requiere contar con un solucin testigo de protena de concentracin conocida. Se preparan por lo menos 4 tubos testigos con distintas cantidades de protenas (T1, T2, T3 y T4) y otro tubo denominado blanco (en el cual el volumen de la solucin de protenas se reemplaza por agua). En forma simultnea, se procesan las muestras incgnitas. Luego se agrega la misma cantidad del reactivo de Bradford a cada tubo (dado que en definitiva se compara el color desarrollado evidenciado por la absorbancia de la solucin en cada tubo, sus volmenes finales deben ser iguales)

OBJETIVOS
Objetivo General
-Determinacin de protena

Objetivos Especficos
-Determinacin de protena a travs del mtodo Bradford en vienesas PF surea y vienesas San Jorge colonial

MATERIALES Y METODOLOGA
1. Materiales Tubos de ensayos Matraz aforado 25ml Reactivo de Bradford Albumina suero bovino (BSA) Vienesas PF y San Jorge Pao blanco Mortero de porcelana Espectrofotmetro Celdas de vidrio/cuarzo para espectrofotmetro Pipeta 3ml y 1ml 2. Metodologa a) Curva de calibracin Se Prepararon 6 soluciones con BSA (albmina suero bovino) como estndar entre 0.2 1.0 mg/ml, a cada solucin se le agregaron 3 ml de reactivo de Bradford diluido, se dejo reposar por 30 minutos al abrigo de la luz y despus ley a 580 nm. b) Mtodo de Bradford Se Cortaron en trozos pequeos de las vienesas PF y San Jorge, luego se homogenializarn en un mortero y se le agrego 1 ml de agua destilada. Se tom 1 ml del jugo obtenido y deposit en un tubo de ensayo adicionandole 3 ml de reactivo de Bradford diluido, se dej reposar la muestra por 30 minutos al abrigo de la luz. Se ley la absorbancia a 580 nm

Resultados y discusin
Una vez teniendo ya el reactivo de Bradford, se procedi a la obtencin de una curva de calibracin para la determinacin de protena de una muestra problema. Mediante el clculo por medio de un procedimiento matemtico. se obtuvieron las gramajes de suero bovino a pesar.
concentracion se extraen (mg) 0.2 5 0.4 10 0.6 15 0.8 20 1 25
Tabla 1 Peso del material para la curva de calibracin

Luego de esperar 30 minutos para la homogenizacin en oscuridad de las soluciones preparadas, se llev a una lectura espectrofotomtrica que se detalla en la Tabla 2, con el detalle de que en la muestra de concentracin 0,4[mg] no pudo tener una correcta lectura.

Absorbancia concentracion desprecio 0.139 0.2 0.097 0.4 * 0.168 0.6 0.118 0.8 0.118 1
Tabla 2 Curva de calibracin para muestra problema obtenida a travs del Mtodo de Bradford.

Con los datos de la tabla 2, ya podemos hacer nuestro grafico de la curva de calibracin.

curva de calibracion
0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 y = -0.0341x + 0.1579 R = 0.2428 curva de calibracion Linear (curva de calibracion)

Grafico 1 Curva de calibracin

De el Grafico 1 podemos saber la ecuacin de la recta, que se representa de la siguiente manera:

Y = -0.0341x + 0.1579

Con un coeficiente de correlacin de,

R = 0.2428

Al seguir con el procedimiento y someter a lectura espectrofotomtrica a las disoluciones de vienesas PF sureas y San Jorge Colonial se obtuvieron los siguientes resultados.
Muestra Absorbancia 1 0.705 2 0.809

Tabla 3 Vienesa PF surea (1) y San Jorge (2)

Con los datos de la ecuacin de la recta podemos despejar la incgnita y reemplazando la absorbancia de las muestras podemos determinar la cantidad de protenas de las muestras.
Muestra Protena 1 16.044 2 19.094

Tabla 4 proteinas en las muestras de Vienesas PF sureas (1) y San Jorge (2)

Conclusiones y Recomendaciones.
Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo de Bradford La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y aromticos. El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas. La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el ensayo. Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la automatizacin. Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la utilizacin de buffers). Los nicos componentes encontrados que dan una excesiva interferencia en el color del ensayo, son altas concentraciones de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc. La curva de calibracin en este caso no es la ms ptima porque la solucin de albumina se aglutino esta debera dar en forma recta y el R debera estar en el rango cercano a 1 pero est lejos de este podemos concluir que la vienesa San Jorge contiene ms protena que la vienesa PF

BIBLIOGRAFA WEBGRAFA
http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS %20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3% 8DNAS.pdf visitado 13/10/2013 a las 15:30 https://www.google.cl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=5&cad=rj a&ved=0CFAQFjAE&url=http%3A%2F%2Fwww.biol.unlp.edu.ar%2Fqcabiol farmacia%2Fguia1.doc&ei=cgheUsjlIsyPkAet24DABw&usg=AFQjCNEE8Uli Yu602KZz9eSHS_4u7SeF9Q&sig2=fG3_9jpc4AG6h7r3DafraQ&bvm=bv.54 176721,d.eW0 Visitado 13/10/2013 a las 15:40 https://www.google.cl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=6&cad=rj a&ved=0CFYQFjAF&url=http%3A%2F%2Fdocencia.izt.uam.mx%2Fhgm%2 Fbq_fisiol_microbiana%2Fdocumentos%2Fpdf%2Fproyecto_amilasa%2FM %25E9todo%2520de%2520Bradford.ppt&ei=cgheUsjlIsyPkAet24DABw&us g=AFQjCNEqJHv0YyEiFpkWcKipJFFriqUg&sig2=vmXs4DnIMEhDwPiWYy Auag&bvm=bv.54176721,d.eW0 Visitado 13/10/2013 a las 15:40

http://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf Visitado 13/10/2013 a las 15:35

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Anexos

Obtencin de la concentracin de protena Mediante el uso de la ecuacin de la recta X= y 0,1579 / - 0,0341

Calculo de mg de la muestra estandar Para una concentracin de 0,2 se obtiene. 0,2mg -> en 1mL xmg -> 25mL

x=5mg

Para una concentracin de 0,4 se obtiene. 0,4mg -> 1mL xmg -> 25mL

x=10mg

Para una concentracin de 0,6 se obtiene. 0,6mg -> 1mL xmg -> 25mL

x=15mg

Para una concentracin de 0,8 se obtiene. 0,8mg -> 1mL xmg -> 25mL

x=20mg

Para una concentracin de 1 se obtiene. 1mg -> 1mL xmg -> 25mL

x=25mg

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