Universidad de La Frontera Facultad de Ingeniera Ciencias y Administracin Departamento de Ingeniera Qumica

Informe de Laboratorio n1 Morfologa celular y observacin de Microorganismos

Arismendio Mauricio, Bobadilla Katterin Docente: Hellmuth Leal Carrera: Bioqumica

17 de Octubre 2012

RESUMEN La microbiologa es un rea de la biologa que estudia las caractersticas morfolgicas y funcionales de los microorganismos que habitan nuestro ambiente. Una manera de estudiar por ejemplo, es realizando tinciones para poder observar la estructura bacteriana (falta hablar de los resultados y de las endosporas)

1. INTRODUCCION Todas las bacterias poseen una estructura fundamental que se compone desde la estructura ms interna a la ms externa a la ms interna en: cpsula, resistencia frente a la fagocitosis, adherencia a superficies; pared celular otorgndole la forma rgida y protegindola de la lisis (ver fig. 1). Segn el mtodo de tincin podemos clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas presentando diferencias significativas; membrana plasmtica, entre sus mltiples funciones encontramos: barrera permeable selectiva, medio de transporte de nutrientes y residuos, localizacin de procesos metablicos, entre otras. Las membranas se componen de una fluida bicapa lipdica, estos lpidos tienen la caracterstica de ser molculas anfipatica, es decir, poseen una zona polar hidrofilica y una zona apolar hidrofbica; ribosomas (sntesis proteica); nucloide, localizacin del material gentico.(1)

Fig.1 Membrana citoplasmtica modelo tridimensional de la envoltura o cubierta de una bacteria Gram positiva que consta de una gruesa capa de peptidoglucano y una membrana citoplasmtica subyacente. Obsrvese que en este tipo de bacterias no existe el periplasma.

Podemos agruparlas segn su forma, de esta manera encontramos cocos que poseen una forma casi esfrica; diplococos, formados por la divisin de cocos que finalmente permanecen juntos; Estafilococos, cadenas largas de cocos que se dividen reiteradamente sin separarse; micrococos, son ttradas que se forman al dividirse las clulas en dos planos formando paquetes cuadrados; 3

bacilos, bacterias que poseen forma de bastn, la forma de sus extremos vara entre distintas especies pudiendo ser plana, redondeada o bifurcada; vibrios, poseen forma curvada como una coma; otras bacterias poseen forma de largos bacilos retorcidos llamados espirilos (rgidos) y espiroquetas (flexibles), en la fig. 1 podemos aprecias con mayor claridad la forma que poseen distintas bacterias. (1) Las bacterias forman parte de este conglomerado celular sencillo con dichas caractersticas, y pese a su simplicidad, aun en ellas podemos encontrar diferencias qumicas y estructurales que nos permitan clasificarlas. As, las bacterias suelen poseer cpsulas hacia el exterior que las confieren de capacidad patgena, al ser capaces de adherirse a superficies o partculas, y de soportar la fagocitosis, uno de los mecanismos de eliminacin bacteriana que presenta el sistema inmune ante la presencia bacteriana. Por su parte, la pared celular es una estructura muy rgida en comparacin con la cpsula, y le confiere a la bacteria de soporte mecnico y osmtico, resistiendo de esta manera las variantes osmticas al que puedan estar expuestas. Lgicamente tambin nos encontramos con la membrana plasmtica bacteriana, delimitadora del citoplasma bacteriano, y que por cierto realiza funciones muy variadas, entre las ms conocidas, la de permeabilidad selectiva, de medio de transporte hacia y desde el interior, de regulacin procesos metablicos energticos, ente muchas otras. Por cierto, en el interior celular bacteriano, como ya dijimos, no encontramos organelos, y slo podemos evidenciar un nucleoide o zona donde permanece el material gentico disperso en el citoplasma, adems de ribosomas esparcidos por todo el interior celular sin organizacin alguna. Una descripcin ms detallada del citoplasma bacteriano no viene al caso en este informe, por lo que describiremos derechamente las paredes y membranas celulares bacterianas.(2)

Caractersticas de las paredes bacterianas. Las clulas bacterianas tienen la particularidad de presentar cpsulas y paredes celulares por fuera de la membrana celular propiamente tal.
(3)

Esta caracterstica nos permite clasificar las bacterias

segn las diferencias estructurales que podamos encontrar en este sitio especfico de la clula. Una clasificacin preliminar de las bacterias se basa en la estructura de la pared celular, por lo que debemos hacer una descripcin de ella.

La pared celular bacteriana Las bacterias poseen una pared celular por fuera de la membrana plasmtica, al igual que en las clulas vegetales y en los hongos. Su naturaleza qumica en las bacterias es particularmente glucocdica- peptdica, presentndose como un conglomerado de la molcula llamada peptidoglicano o murena (palabra que procede del trmino muro) a diferencia de los vegetales, en la que est compuesta primordialmente de celulosa, y de los hongos, con quitina como su componente principal. (4) La pared celular bacteriana se presenta no de igual manera para todas las bacterias (Fig. 2). Por un lado, las llamadas bacterias Gram positivas, estn compuestas por una capa muy gruesa de pared celular, constituidas por muchas capas de peptidoglicano. (5) Adems, nos encontramos con cidos teicoicos que se entrecruzan con las capas de peptidoglicano, y lipoteicoicos que ayudan a adosar la pared a la membrana plasmtica, confiriendo de una mayor estabilidad a la estructura de la pared. Por su parte, las bacterias Gram negativas, estn constituidas por una delgada capa de pared (de tan solo 2 a 3 capas de murena), ubicada entre las membranas externa e interna, y dejando adems espacios de importante funcin entre la membrana interna y la pared, como el espacio denominado periplasma.

Fig. 2. Diferencias entre las paredes bacterianas Gram positivas y Gram negativas. En las primeras (a) se aprecia un grueso entramado de molculas de peptidoglicano que se continua por fuera de la membrana plasmtica. En las segunas (b), Vemos una muy fina capa de esta molcula ubicada entre dos membranas. La membrana externa posee varias estructuras hacia el exterior como los lipopolisacridos (LPS) y protenas de sealizacin.

De esta manera, podemos encontrar importantes diferencias entre ambos tipos de pared celular bacterianas. (Tabla 1)
Bacterias Gram Positivas. Su pared celular de peptidoglicano es ms gruesa por tener muchas capas de esta molcula (alrededor de 40 capas). Posee tan solo una membrana plasmtica, ubicada debajo de la pared celular. La pared celular se contina estrechamente con la membrana plasmtica. Pose dos membranas plasmticas: una externa ubicada por fuera de la pared celular, y una interna por debajo. Existe un espacio entre la pared y la membrana celular interna, llamado espacio periplasmtico o periplasma, con importante funcin de almacenamiento de Bacterias Gram negativas. Su pared celular de peptidoglicano es mucho ms delgada en comparacin (tan solo 1 a 3 capas).

sustancias fuertemente antignicas. No contiene lipopolisacridos (LPS). El antibitico penicilina puede inhibir la formacin de la pared celular en estas bacterias. Contiene LPS por fuera de su membrana externa. Este antibitico no puede actuar por la presencia del LPS en la membrana celular externa, ya que acta como barrera de proteccin. Por su magnitud, contiene adems cidos teicoicos y Encontramos poca presencia de cidos teicoicos y

lipoteicoicos en gran cantidad, los cuales ayudan a mantener la integridad y estabilidad de la pared, al unirse a las hebras de peptidoglicano y a la membrana plasmtica de la clula.

lipoteicoicos, adems de las lipoprotenas de Braunn, que ayuda a adosar la pared celular a la membrana plasmtica interna.

Tabla 1: Tabla comparativa de estructura de bacterias gram positivas y negativas

La descripcin estructural de las paredes celulares bacterianas, nos permitir comprender mejor sobre el cmo actan las tinciones qumicas utilizadas para diferenciar y clasificar las bacterias.

La Tincin de Gram (ideada por Christian Gram, en 1884). Bsicamente, las bacterias y otros tipos de microorganismos, son usualmente trasparentes al microscopio cuando se las estudia en estado natural. La observacin en los microorganismos puede llevarse a cabo empleando microorganismos vivos sin teir, u observando clulas muertas, teidas con colorantes. Paul Ehrlich y Robert Koch, concibieron diversos mtodos de fijacin y tincin que permitieron el estudio ulterior de caractersticas y patrones estructurales poco conocidos hasta ese momento por la microbiologa. Las ventajas de utilizar una tincin en los estudios bacterianos, dice relacin con el contraste que se genera entre el microorganismo y el medio circundante a l. Adems, permite la identificacin de las estructuras internas de la clula bacteriana, como las paredes celulares, las vacuolas, los cuerpos nucleares, y muchas otras. (6) En el laboratorio, podemos realizar como dijimos, tinciones que nos permitan identificar el tipo de clulas de inters que deseamos estudiar. Para ello, hacemos uso de las tinciones simples que nos permiten identificar en primera instancia las clulas en estudio, por ejemplo, las tinciones de colorantes cidos y bsicos (azul de metileno, el utilizado en este prctico y que por su carga positiva se une a protenas con cargas negativas de las paredes celulares bacterianas). La Tincin de Gram por su parte, es una tincin de carcter diferencial (como tambin los es la Tincin cido-

alcohol resistente de Zielh-Nielssen), ya que nos permite clasificar las bacterias segn el tipo de capa de peptidoglicano que posea, por lo que nos permite hacer una clasificacin esencialmente estructural de ellas. El mtodo debe tener la capacidad de que los colorantes utilizados en esta tincin no slo deban tener la capacidad de unir a la pared, sino que tambin en ella, se pueda aplicar un mtodo mordiente o de fijacin, y un segundo colorante que funcione como contraste, y que por fin permita diferenciar ambos tipos. El primer colorante, el Violeta de Genciana, permite teir la pared celular de ambos tipos de bacterias, dando un color azulado a la estructura en su totalidad (Fig. 3). Luego, a la muestra se le provee de Lugol o solucin mordiente, que tiene por fu ncin cristalizar el primer colorante, secuestrndolo en la estructura tridimensional de la pared de murena. Posteriormente al sumergir la muestra en alcohol (etanol-acetona), se logra disolver parte de la tincin generada con el primer colorante en las bacterias. En las Gram positivas el Violeta de Genciana queda prcticamente inalterado, por el gran volumen que queda arraigado a la pared, a diferencia de las Gram negativas, en donde se pierde prcticamente la totalidad del primer colorante debido a la poca cantidad de peptidoglicano que mantenga en su lugar al Violeta de Genciana. Por ltimo, al aplicar un segundo colorante, generalmente Fucsina o Safranina, se teirn aquellas bacterias Gram negativas, vale decir, las que perdieron el primer colorante tras el lavado con alcohol, y que por tanto, tiene cabida para un segundo colorante. (7)

Fig. 3. El procedimiento de tincin de Gram para las bacterias positivas y negativas a la tincin, se basa en la utilizacin de dos colorantes: uno primario y otro de contraste. Las Gram positivas teirn azul o prpura, al retener el primer colorante (Violeta de Genciana), mientras que las Gram negativas, un color rosado o rojizo claro, al perder el primer colorante y adherir el segundo colorante de contraste (safranina).

El Violeta de Genciana tie las paredes celulares de un color prpura o azul, mientras que el contraste, de rosado o rojizo claro, por lo que lgicamente las Gram positivas aparecern con un color azulado o prpura, y las Gram negativas con un rojizo claro o rosado. A continuacin, se describir el trabajo prctico llevado a cabo en el laboratorio, en donde se aplic una tincin simple (Tincin de azul de metileno), y una diferencial (Tincin de Gram), para luego observar y registrar las muestras de ambas mediante microscopia. (8) Por otra parte tenemos a las endosporas que son culas diferenciadas extraordinariamente resistentes al calor y difciles de destruir, incluso por agentes qumicos muy agresivos. Las bacterias que forman endosporas se encuentran habitualmente en el suelo y puede decirse que cada muestra de suelo contiene alguna endospora. Las endosporas son muy impermeables a los colorantes, por lo que a veces se ven como regiones sin teir dentro de las clulas que han sido teidas con colorantes bsicos como el azul de metileno. Para teir las esporas se utilizan mtodos especficos de tincin. Entre los mtodos especficos de tincin, encontramosla solucion verde de malaquita que es un colorante dbilmente bsico (tiene una carga positiva dbil) y por tanto, se une dbilmente a la bacteria. Penetra en las clulas vegetativa . Cuando se calienta la preparacin tambin penetra las endosporas. Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las clulas vegetativas, pero no de la endospore ademas se utiliza un colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas (decoloradas por el agua). (9)

2. MATERIALES Y METODOS 2.1 Materiales y Reactivos Cultivos bacterianos de E. coli, Staphylococcus aureus Reactivos para tincin de Gram Asa de siembra Portaobjetos Microscopio ptico Reactivos para tincin endosporas Mechero Gotario Cronometro digital Aceite inmersin Alcohol 70 Jabn Antibacterial Alcohol gel Algodn Papel Absorbente

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2.2.

Mtodos Tincin diferencial de Gram 1) Se recibe un cultivo microbiano con el cual se debern preparar un frotis. 2) Se procedi segn las normas de higiene del laboratorio de microbiologa, se lavaron las manos con jabn antibacterial, luego stas se secaron con papel absorbente y se utiliz alcohol gel para continuar la asepsia. 3) Se desinfect la superficie de trabajo con alcohol de 70 con la ayuda de un pedazo de toalla nova. 4) Con el asa de siembra, la que se esteriliz llevndola al rojo vivo con el mechero se extrajo una pequea muestra. 5) Esta alcuota de muestra se coloc en el portaobjeto el cual tena en el centro una gota de agua, con la cual la muestra se dispers en el portaobjeto de manera uniforme generando as un frotis muy delgado. (Esto se realiz en duplicado para realizar tincin Gram y de Endosporas) 6) La muestra se fij por calor con ayuda del portaobjeto, siempre cuidando que el fijado se realizara de manera uniforme para as evitar que la muestra no se estropee. 7) Se procede a aplicar colorante violeta de genciana por 1 min, posteriormente se lava con agua destilada, posteriormente se cubre el frotis con lugol por 30 segundos. 8) Se decolorar con una solucin alcohol-acetona hasta que no se elimine ms colorante y se lava con agua destilada 9) Se cubrir el frotis con safranina por 30 segundos. 10) Se secan las muestras y se procede a observarlas en el miscroscopio.

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 Tincin Endosporas 1. Se recibe un cultivo microbiano con el cual se debern preparar un frotis. 2. Se procedi segn las normas de higiene del laboratorio de microbiologa, se lavaron las manos con jabn antibacterial, luego stas se secaron con papel absorbente y se utiliz alcohol gel para continuar la asepsia. 3. Se desinfect la superficie de trabajo con alcohol de 70 con la ayuda de un pedazo de toalla nova. 4. Con el asa de siembra, la que se esteriliz llevndola al rojo vivo con el mechero se extrajo una pequea muestra. 5. Esta alcuota de muestra se coloc en el portaobjeto el cual tena en el centro una gota de agua, con la cual la muestra se dispers en el portaobjeto de manera uniforme generando as un frotis muy delgado. (Esto se realiz en duplicado para realizar tincin Gram y de Endosporas) 6. La muestra se fij por calor con ayuda del portaobjeto, siempre cuidando que el fijado se realizara de manera uniforme para as evitar que la muestra no se estropee. 7. Se cubre el frotis con verde malaquita y se calienta durante 5 minutos, mantener siempre la muestra cubierta con el colorante 8. Lavar con agua destilada 9. Cubrir el frotis con safranina por 30 segundos 10. Lavar con agua destilada 11. Secar el portaobjetos con calor suave o por simple presin entre dos papeles absorbentes. No frote el portaobjetos con el papel, 12. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin

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3.

RESULTADOS

Esta actividad experimental se bas en el fundamento de la tincin de violeta de genciana y de safranina (Tincin Gram); colorantes de carcter bsico que tien por afinidad estructuras cargadas negativamente como la pared celular bacteriana. Adems se observan la tincin con verde malaquita que nos permite observar endosporas.

Figura

Tincin

Lente objetivo del microscopio 1000 x

Morfologa presente Estreptococos Estafilococos Diplococos Bacilos

Violeta de genciana

Safranina

1000 x

Verde Malaquita

1000 x

Endosporas

Tabla 1. Resultados experimentales, que indica morfologa presente, aumento y tincin utilizada.

C B A

Fig. 4. Se apreci distintitas morfologas: (A) Estreptococos, (B) Estafilococos y (C) Diplococos con tincin de violeta de genciana, aumento 1000X

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Fig. 5. Se apreci morfologa de bacilos (A) con tincin de safranina, con aumento de 1000X

Fig. 6. Se apreci morfologa endosporas con verde malaquita, con un aumento de 1000X

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4.

DISCUSIN

Los microorganismos son muy sensibles a la tincin con diversos colorantes, ya que un pequeo error en la manipulacin de ellos y estas clulas no podrn ser observadas y/o diferenciadas. Este inconveniente puede darse por ejemplo, por exceso en la aplicacin de colorante (que en nuestro caso fue violeta de genciana y /o safranina) en la muestra a analizar bajo microscopio. Para observar bacilos, se tuvo que utilizar tincin de safranina ya que sta puede colorear bacterias gram (-). Para observar estreptococos, se utiliz violeta de genciana. El calor que se aplique en una muestra para fijarla, tambin influir en obtener un pequeo error en los resultados, ya que muchos microorganismos mueren y su estructura celular se destruye completamente al romperse la pared celular. Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una estructura muy pequea, por medio de la tincin con verde de malaquita, el cual requiri del calor para la penetracin; se pudo observar la estructura interna de la clula bacteriana, particularmente las endosporas. En este experimento se utiliz una tincin simple debido a que la misma permite que se coloree toda la clula excepto la espora que se observa de un tamao bien aceptable, El uso adecuado de colorantes o tinciones en un ensayo de laboratorio, ms un procedimiento pertinente, nos facilit el trabajo en laboratorio para llegar al resultado que desebamos, que en esta oportunidad era diferenciacin de morfologa en una muestra. La correcta manipulacin del microscopio nos permiti fotografiar las muestras de anlisis y as poder respaldar nuestro resultados experimentales. FALTA MAS DISCUSIN Y APOYARLA CON LA BIBLIOGRAFIA COMO EN LA INTRO el interlineado es doble

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5. CONCLUSION Los laboratorios hacen uso habitual de muestras bacterianas procedentes de fluidos corporales, o de cultivos obtenidos previamente. Los estudios que sufren estas muestras son variados, pasando por los qumicos, los metablicos, los genticos y otros ms complejos. Sin embargo, el paso inicial lo da una tincin celular que revele su estructura y morfologa. La tincin de Gram es necesaria para diferenciar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, una clasificacin preliminar que dice relacin con la estructura de la pared celular de estas clulas. Sin embargo, la tincin es un procedimiento de laboratorio que se realiza segn indicaciones que pueden variar en sus colorantes empleados, tiempos de espera entre cada paso, mtodos de fijacin, etc. Esto tiene por objetivo lograr la mxima fidelidad posible en las muestras, sin embargo no est exento de variaciones en los resultados, debido a discrepancias en los materiales y tiempos de espera que utilicen los laboratoristas. Por tanto, es importante tener en claro que las tinciones simples y diferenciales pueden diferir entre las preparaciones, por lo que es menester afinar el procedimiento personal y la instrumentacin local a emplear. Nuestra experiencia en esta actividad, nos permiti no solo aprender los fundamentos fsicoqumicos, procedimentales, instrumentales y biolgicos que constituyen una tincin simple y una diferencial, sino tambin, percatarnos de considerar las mltiples variables y presentaciones que pueden aflorar en la labor experimental. Esto ltimo, nos lleva a cumplir de mejor manera las expectativas que emergen en cada actividad prctica, por lo cual, destacamos el mejoramiento razonablemente fundado y constante de nuestra actitud desempeo como estudiantes de la labor bioqumica.

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6. BIBLIOGRAFIA

1. Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory Manual in General Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers. Dubuque, lowa 2. Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales (segunda edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. 3. Company. Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en accin. Manual de Laboratorio para Microbiologa. Editorial Blume. Madrid-Espaa. 4. Fineglod y Barn. Diagnostico Microbiolgico de Bailey y Scot. Sptima edicin. 1989. MOSBY. Montoya H. Microbiologa bsica para el rea de la salud y a fines. Segunda edicin. 2008. Editorial Universidad de Antioqua. Colombia Mdica Panamericana. 5. Murray, P.R. Microbiologa mdica. 2006. MOSBY. 6. Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth edition. Mc GrawHill Book 7. Prescott, Harley, Klein. Microbiologa. Segunda edicin. 2004. Editorial Mc Graw Hill. Espaa. 8. Shirlyn B. Mc Kenzie. Hematologa clnica. Segunda edicin. 2000. Editorial El manual Moderno. 9. Tortora, Funke and Case. Introduccin a la Microbiologa. 9na Edicin 2007. Editorial

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