Manual Integrado Normativ MÃ©tods DetecciÃ Ny Med Organms Microbiol

MANUAL INTEGRADO DE LA NORMATIVIDAD Y MTODOS DE DETECCIN Y MEDICIN DE ORGANISMOS
MICROBIOLGICOS EN ALIMENTOS COMO VEGETALES Y FRUTAS FRESCAS, PRODUCTOS DEL MAR Y CRNICOS
DE ANIMALES TERRESTRES

1

MANUAL INTEGRADO DE LA
NORMATIVIDAD Y
MTODOS DE DETECCIN Y
MEDICIN DE ORGANISMOS
MICROBIOLGICOS EN
ALIMENTOS COMO
VEGETALES Y FRUTAS
FRESCAS, PRODUCTOS DEL
MAR Y CRNICOS DE
ANIMALES TERRESTRES


2

NDICE
PREFACIO
3
INTRODUCCIN
5
ESTADO DEL ARTE
6
MARCO LEGAL
7
ACREDITACIN
9
ALCANCE
10
1. 1.NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E
INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS MTODOS PARA EL
ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS
11
2. 2.TRMINOS Y DEFINICIONES DE MTODOS Y PROCEDIMIENTOS
13
3. MTODOS NORMALIZADOS PARA DETECTAR BACTERIAS
ESPECFICAS
18
3.1.1 Deteccin de Escherichia coli, Coliformes, Escherichia coli O157 y productoras
de shiga toxinas.
18
3.1.2 Deteccin de Listeria monocytogenes 27
2.1.3 Deteccin de Staphylococcus aureus 32
3.1.4 Deteccin de Salmonella spp. 38
3.1.5 Deteccin de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus 43
3.2 COLECCIN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS 51
3.3 PREPARACIN DE DILUCIONES USANDO MEDIOS GRAVIMTRICOS 57
3.4 CLCULO DEL NMERO MS PROBABLE 63
4.GLOSARIO DE MEDIOS DE CULTIVO Y OTROS REACTIVOS
106
4.1 Escherichia coli y Coliformes 108
4.2 Listeria spp. y L. monocytogenes 138
4.3 Staphylococcus aureus 160
4.4 Salmonella spp. 172
4.5 Vibrio 203
4.6 Coleccin y transporte de muestras. 224
4.7 Preparacin de diluciones usando medios gravimtricos. 225
5.DESCRIPCIN DE BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO
229
5.1 INSTALACIONES 229
5.2 PERSONAL 231
5.3 MANEJO DE MUESTRAS 233
5.4 EQUIPO 236
5.5 MATERIALES 236
5.6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 237
5.7 MANTENIMIENTO DE REGISTROS 239
BIBLIOGRAFA
240


3

PREFACIO
El presente manual de normatividad y mtodos para la deteccin y medicin de microorganismos
patgenos en alimentos fue integrado y compilado por el Centro Nacional de Metrologa con el
apoyo del Proyecto Sectorial SAGARPA-CONACyT 2011-09-172352, Demanda Especfica 6.
Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos
en alimentos, el cual fue realizado en colaboracin con el Centro de Investigacin en Alimentacin
y Desarrollo, A.C. Unidad Culiacn y tuvo aportaciones honorficas de distinguidos investigadores
y usuarios de Mxico.
Centro Nacional de Metrologa
Responsable Tcnico: Dr. Yoshito Mitani Nakanishi
Responsable Administrativo: C.P. Guillermo Salomn Villalobos Castrejn
Director General del CENAM. Dr. Hctor Nava Jaimes

CENAM
Km 4.5 Carretera a los Cus,
Municipio El Marqus, Quertaro.
C.P. 76246 Mxico Tel. (442) 2110500 al 04
Correo electrnico: meperez@cenam.mx

Compilado y escrito por:
Dra. Melina Prez Urquiza. Coordinador Cientfico. Lder de la Demanda Especfica 6
Dr. Aldo Amaro Reyes, profesor investigador de la UAQ, contratado por CENAM con fondos del
proyecto.
Dra. Nohelia Castro del Campo. CIAD Culiacn

Esta publicacin ha sido revisada por:
Dra. Blanca Garca Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autnoma de Quertaro
Q.A. Judith Sainz Uribe Coordinador Cientfico

2013 por el Centro Nacional de Metrologa
Secretara de Economa

Primera Edicin consta de 1000 ejemplares
Reservado todos los derechos

ISBN: 978-607-96162-6-7

Ninguna parte de esta publicacin puede ser reproducida, almacenada en un sistema o
transmitida, en ninguna forma o en ningn medio, electrnico, mecnico, fotocopia, grabado, sin el
permiso de los copropietarios. Para simplificar la informacin, se han utilizado los nombres de los
productos comerciales. Este manual no pretende recomendar productos nombrados o ilustrados,
como tampoco existe una crtica implcita de productos similares que no se mencionan o ilustran.


4

Agradecimientos por su contribucin en la elaboracin del presente manual

CIAD Culiacn
Dr. Cristbal Chaidez Quiroz
Dra. Josefina Len Flix
Dr. Osvaldo Lpez Cueva
Dra. Hilda Karina Ramrez Medina
QFB Clida Isabel Martnez Rodrguez
QFB Jess Hector Carrillo Yez
Dra. Nohelia Castro del Campo

CIAD Mazatln
Dr. Miguel Betancourt Lozano
M.C. Leobardo Montoya Rodriguez
M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez

IIA Blanca Erika Alvarez Nieves contratada por CENAM con fondos del proyecto.
Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura:
p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez . Instituto Tecnolgico de Celaya
p.IBQ Alma Liliana Villarreal Csares. Instituto Tecnolgico de Durango


5

INTRODUCCIN
El Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) junto con la Secretara de Agricultura,
Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin (SAGARPA) conscientes de la necesidad de
contar con normas que establezcan mtodos adecuados para el anlisis de microorganismos
patgenos en alimentos, han confiado al Centro Nacional de Metrologa (CENAM) la revisin de la
normatividad mexicana actual relacionada con la deteccin y medicin de microorganismos
patgenos en alimentos tales como frutas, vegetales frescos, carne fresca de animales terrestres y
productos marinos, con la finalidad de generar propuestas de actualizacin y mejora, para optimizar
los procesos de evaluacin de la conformidad y de esta manera coadyuvar a mejorar la agro
economa y la inocuidad y calidad agroalimentaria.
Este manual es un compendio de las Normas Oficiales Mexicanas (NOM) actuales relacionadas con
el anlisis de microorganismos patgenos en alimentos y las normas internacionales equivalentes,
elaboradas por diferentes organismos tales como el Comit Europeo de Normalizacin, la Food and
Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos de Amrica y las Normas Britnicas (BS). Su
objetivo es ser un precedente de las Normas Oficiales Mexicanas y presentar mtodos actualizados
para la deteccin y medicin de microorganismos patgenos en alimentos.


6

ESTADO DEL ARTE
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son un problema cada vez ms importante a
nivel internacional debido al intercambio comercial y al constante traslado de las personas entre los
diferentes pases. La mayora de las infecciones transmitidas por los alimentos comnmente
reconocidas son las ocasionadas por los gneros bacterianos Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,
Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes entre algunos otros (INFOSAN, 2009).

La importancia de garantizar la inocuidad de los alimentos estriba en que los alimentos pueden ser
causantes de enfermedades que merman la capacidad de los individuos enfermos y sus actividades
de desarrollo, lo que conlleva a afectar a su comunidad y desequilibrar el funcionamiento de las
organizaciones en donde participa (INFOSAN, 2009). En general, la calidad e inocuidad
alimentaria son factores claves de xito en el comercio internacional agropecuario.

Las infecciones a menudo ocurren como brotes, sin embargo en Amrica es ms frecuente la
deteccin clnica de casos aislados y no siempre confirmados por el laboratorio y comnmente
designados como espordicos. Si dichos casos pudieran relacionarse entre si se lograra un mejor
control y prevencin de las ETA (Pulsenet. Consultado el 15 de mayo de 2012.
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).

Un elemento clave para el reconocimiento y control de brotes es la capacidad de anlisis de los
patgenos aislados de humanos y su identificacin en las probables fuentes de contaminacin, hasta
llegar, en lo posible a su reservorio y las vas de transmisin (Pulsenet. Consultado el 15 de mayo
de 2012.
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).

Los Estatutos de la Comisin del Codex Alimentarius tienen como propsito, entre otras cosas, la
proteccin de la salud de los consumidores, asegurar prcticas equitativas en el comercio de
alimentos y promocionar la coordinacin de todas las normas alimentarias acordadas por las
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales (FAO/OMS. Consultado el 15 de mayo de
2012. http://www.codexalimentarius.net/web/index_es.jsp). Estas recomendaciones del Codex son
utilizadas por los gobiernos para formular y ajustar las polticas y programas en el marco de su
sistema nacional de control de los alimentos (FAO-OMS, 2003).

En el presente documento se condensan y se abordan diferentes normas para asegurar la inocuidad
de los alimentos, descritas por diversas instituciones nacionales como internacionales, tales como
las Normas Oficiales Mexicanas descritas por la Secretaria de Salud de Mxico, Normas ISO de la
Organizacin Internacional de estandarizacin (ISO), el Manual Analtico de Bacteriologa de la
Administracin de Drogas y Alimentos de Estados Unidos, la Gua de Laboratorio del
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, por mencionar algunos, de manera que le
sirvan al productor como un manual o gua rpida, en donde encontrar aspectos tcnicos para
asegurar y mantener la calidad microbiolgica de sus alimentos.

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MARCO LEGAL
Las Normas Oficiales Mexicanas que rigen los procedimientos para la preparacin, dilucin, toma,
manejo y transporte de muestras y los mtodos analticos para determinar los organismos
microbiolgicos en alimentos tales como Listeria monocytogenes, Salmonella, Staphylococcus
aureus, Vibrio y Coliformes totales fueron publicadas por la Secretara de Salud, en colaboracin
con otros organismos entre los aos de 1994 y 1997.
El objetivo general de las Normas es establecer mtodos estndar para determinar los
microorganismos en alimentos.
En la actualidad existen en nuestro pas ocho Normas Oficiales Mexicanas directamente
relacionadas con este fin.
NOM-109-SSA1-1994 Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de
muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Establece los procedimientos que deben
seguirse para la toma de muestras, los cuales varan dependiendo del tipo de producto y la finalidad
del anlisis (productos envasados con presentacin comercial, envasados en recipientes grandes,
alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones). Asimismo propone prcticas que deben
adoptarse durante la toma de muestras (uso de bata, cofia, cubrebocas y guantes estriles; rapidez en
la toma de muestras; etiquetado e identificacin de las muestras, etc.). Adems propone condiciones
en las que las muestras deben ser transportadas e informacin que debe contener la muestra antes de
su entrada en el laboratorio.
NOM-110-SSA1-1994 Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su
anlisis microbiolgico. Presenta el procedimiento para la dilucin primaria y diluciones decimales
adicionales de muestras de alimentos: lquidas, slidas y muestras congeladas. La dilucin primaria
consiste en pesar una cantidad de la muestra y mezclarla con una cantidad de diluyente nueve veces
mayor en proporcin. Mientras que la dilucin decimal adicional es una solucin obtenida al
mezclar un determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un
diluyente y por repeticin de este procedimiento se obtiene una serie de diluciones decimales
adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo.
NOM-114-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en
alimentos. Establece el mtodo para detectar la presencia de Salmonella en alimentos, el cual vara
dependiendo del alimento (huevo, frmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo, productos no
pasteurizados congelados de huevo, productos que contienen huevo en su formulacin, ensaladas,
frutas frescas, crustceos, pescado, leche en polvo, etc.). La norma divide el procedimiento de
deteccin del microorganismo en 5 pasos bsicos: el preenriquecimiento, el enriquecimiento
selectivo, la seleccin en medios slidos, la identificacin bioqumica y la serotipificacin.
NOM-115-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus
en alimentos. Aporta el mtodo para la deteccin de Staphylococcus aureus en alimentos basado en
la cuenta directa de este microorganismo en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con
la confirmacin mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa.
NOM-143-SSA1-1995 Bienes y servicios. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos.
Determinacin de Listeria monocytogenes. El objetivo principal de esta norma es establecer el
mtodo microbiolgico para determinar la presencia de Listeria monocytogenes en alimentos. El
aislamiento y diferenciacin de especies de Listeria spp. se basa en la fermentacin de

8

carbohidratos y la actividad hemoltica caracterstica del gnero. El mtodo sugiere un
procedimiento en cuatro etapas: enriquecimiento, aislamiento, identificacin y serologa.
NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes
totales en placa. Esta norma establece el mtodo microbiolgico para determinar el nmero de
microorganismos coliformes totales presentes en los productos alimenticios, el cual es un indicador
de prcticas higinicas inadecuadas. El mtodo se basa en la tcnica de cuenta en placa en medio
selectivo.
NOM-112-SSA1-1994 Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del
nmero ms probable. En esta norma se describe el procedimiento para determinar las bacterias
coliformes mediante la tcnica del nmero ms propable (NMP). Esta tcnica se fundamenta en la
capacidad que poseen estos microorganismos de fermentar la lactosa con la produccin de cidos y
gas que puede observarse en las campanas de fermentacin. La tcnica se divide en una prueba
presuntiva y una prueba confirmativa. La prueba presuntiva incluye la inoculacin en un medio
diferencial que permite determinar si hay produccin de gas. La prueba confirmativa requiere del
crecimiento de las cepas presuntivas en un medio selectivo.
NOM-242-SSA1-2009 Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba. Esta NOM tiene por
objeto establecer los requisitos sanitarios para: las reas de captura de moluscos bivalvos; los
establecimientos que procesan productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados,
incluyendo las embarcaciones de pesca y recoleccin; as como las especificaciones sanitarias que
deben cumplir dichos productos. En ella se incluye el mtodo para la deteccin de Vibrio que se
basa en el crecimiento en medio selectivo salino y la diferenciacin e identificacin de cepas tanto
por pruebas bioqumicas, como pruebas serolgicas de aglutinacin.
Cabe mencionar que existen adicionalmente otras 9 normas sobre productos de la pesca y crnicos,
en las cuales se menciona la deteccin de los microorganismos patgenos de inters en este manual.


9

ACREDITACIN
En Mxico, la evaluacin de la conformidad se realiza por las dependencias competentes o por los
organismos de certificacin (OC), los laboratorios de pruebas (LP) o de calibracin (LC) y por las
unidades de verificacin (UV) acreditados y, en su caso, aprobados.
La acreditacin de esos organismos, laboratorios y unidades es realizada por las entidades de
acreditacin (EA) autorizadas, conforme lo establecen los artculos 68 y 69 de la Ley Federal de
Metrologa y Normalizacin (LFMN). En Mxico hasta ahora, la Entidad Mexicana de Acreditacin
(EMA) es la nica entidad que proporciona este servicio y de acuerdo a los lineamientos
internacionales se realiza tomando como base lo establecido en la norma NMX-EC-17025-IMNC-
2006 (ISO/IEC 17025:2005) Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo
y calibracin, tras cumplir una auditoria.
En la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin (LFMN) Artculo 81 se instituye al Sistema
Nacional de Acreditamiento de Laboratorios de Pruebas con el objeto de contar con una red de
laboratorios acreditados que cuenten con equipo suficiente, personal tcnico calificado y dems
requisitos que establezca el reglamento, para que presten servicios relacionados con la
normalizacin a que se refiere esta Ley (Mxico, 1992). Actualmente se cuenta con laboratorios
acreditados en la deteccin de microorganismos patgenos en alimentos, mismos que participan en
ensayos de aptitud con proveedores extranjeros debido a que actualmente en Mxico no contamos
con este servicio.


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ALCANCE
El alcance del presente manual es proveer de una gua tcnica comprensiva sobre las metodologas
microbiolgicas a travs de una recopilacin de informacin relacionada con la normatividad
mexicana, normas internacionales de aplicacin actual y metodologa de deteccin rpida empleada
por las instituciones del pas en materia de inocuidad de los alimentos y laboratorios de ensayo en
beneficio del sector productivo de crnicos, frutas y vegetales y alimentos de origen acutico que
involucra la deteccin de microorganismos patgenos como Salmonella spp, Escherichia coli,
Listeria monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus aureus y E. coli O157:H7 y productoras de
shiga toxinas.


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1. NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E
INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS MTODOS PARA EL
ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS

Para la realizacin de este manual se consultaron las siguientes normas oficiales y regulaciones
nacionales e internacionales relacionadas con los mtodos para el anlisis microbiolgico de
alimentos en productos para consumo humano incluidos productos frescos de vegetales, frutas,
carne de animales terrestres y productos del mar (Ver Tabla 1 y Tabla 2).
Tabla 1. Normatividad nacional e internacional que rige los procedimientos para la toma, manejo y
preparacin de las muestras de alimentos revisada para la realizacin del manual.
Objeto y campo de
aplicacin Normas aplicables
Procedimientos para la toma,
manejo y transporte de
muestras
NOM 109-SSA1-1994
BAM Captulo 1: Muestreo de alimentos y preparacin de la
muestra homogeneizada
BS 5763: Part 0: 1986
Preparacin y dilucin de
muestras
NOM-110-SSA1-1994
UNE/ISO 6887-1
UNE/ISO 6887-2
UNE/ISO 6887-3
UNE/ISO 6887-4
BAM Captulo 1: Muestreo de alimentos y preparacin de la
muestra homogeneizada
BS 5763: Part 0: 1986
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comit Europeo de Normalizacin-Asociacin Espaola de
Normalizacin y Certificacin, BAM: Manual Analtico Bacteriolgico, BS: Normas Britnicas.

Tabla 2. Normatividad nacional e internacional revisada para la realizacin del manual para
determinar microorganismos patgenos en alimentos de consumo humano y animal.
Objeto y campo de
aplicacin
Normas aplicables
Bacterias coliformes y
Escherichia coli
NOM-112-SSA1-1994
NOM-113-SSA1-1994
UNE/ISO 16654:2002
BS 5763: Part 10: 1993
BS 5763: Part13: 1989
BAM Captulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias
coliformes
ISO 7251: 2005 (E)
Escherichia coli O157 BAM Capitulo 4A. Escherichia coli diarreognica
Listeria spp. y L. NOM 143-SSA1-1995

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monocytogenes
UNE/ISO 11290-1:1997
UNE/ISO 11290-2:2000
BAM Captulo 10. Deteccin y recuento de Listeria
monocytogenes en los alimentos; Protocolo: Confirmacin
simultnea de especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por
PCR en tiempo real.
Staphylococcus aureus
NOM-115-SSA1-1994
UNE/ISO 6888-1: 2000
UNE/ISO 6888-2:2000
UNE/ISO 6888-3:2003
BS 5763: Part 7: 1983
BAM Captulo 12. Staphylococcus aureus
BAM Captulo 12: Staphylococcus aureus (NMP)
Salmonella spp.
NOM-114-SSA1-1994
UNE/ISO 6579:2003
BAM Captulo 5. Salmonella
Vibrio
NOM-242-SSA1-2009
ISO/TS 21872-1:2007
BS 5763:Part14:1991
BAM Captulo 9. Vibrio
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comit Europeo de Normalizacin-Asociacin Espaola de
Normalizacin y Certificacin, BAM: Manual Analtico Bacteriolgico, BS: Normas Britnicas.


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2. TRMINOS Y DEFINICIONES DE MTODOS Y PROCEDIMIENTOS
Aspticamente: forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio.
-hemlisis: zona transparente alrededor de la colonia debida a la lisis total del eritrocito.
Bloque; pieza: muestra cuya composicin y dimensiones (superficie y espesor, pero
particularmente espesor) permite tomar una muestra en profundidad bajo condiciones estriles
satisfactorias.
Canales; despieces: unidades (productos avcolas, carne de conejo) similares a las que se preparan
para su venta.
Coliformes: bacilos Gram negativos, no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, que a 35
C fermentan la lactosa con la produccin de gas bajo las condiciones especificadas en la NOM-
112-SSA1-1994 o bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a
35 C fermentan la lactosa con formacin de cido, ocasionando en las colonias desarrolladas el
vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitacin de las sales biliares segn lo
especificado en la NOM-113-SSA1-1994.
Deteccin de Salmonella: determinacin de la presencia o ausencia de estos microorganismos en
una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con la NOM -
114-SSA1-1994 o determinacin de la presencia o ausencia de Salmonella, en una masa o volumen
determinada de producto, cuando los anlisis se realizan segn la UNE-EN ISO 6579:2003.
Determinacin del nmero de estafilococos coagulasa-positivos: determinacin del nmero de
estafilococos coagulasa-positivos presentes por mililitro o por gramo de muestra cuando se realiza
el ensayo de acuerdo con el mtodo especificado en esta parte de la norma ISO 6888.
Deteccin de Listeria monocytogenes: determinacin de la presencia o ausencia de estos
microorganismos en una cantidad, peso o volumen dado de producto, cuando se realizan los
ensayos de esta parte de la norma ISO 11290.
Dilucin primaria: es la disolucin, suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de
diluyente.
Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un
determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que
por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones
decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo.
Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen
determinado de la suspensin inicial, con un volumen nueve veces superior de disolvente y
repitiendo esta operacin con diluciones decimales sucesivas, hasta llegar a un nivel de dilucin
adecuado para la inoculacin del medio de cultivo.
Enterobacteriaceae: microorganismo que fermenta la glucosa y muestra reaccin negativa a la
oxidasa cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al mtodo especificado.

14

Escherichia coli: bacteria que a 44 C forma colonias indol positivas (color rosa), sobre membranas
de acetato de celulosa superpuestas en agar triptona bilis, bajo las condiciones descritas en BS 5763:
Part 13: 1989.
Escherichia coli O157; E.coli O157: microorganismos que forman colonias caractersticas en la
superficie del medio en placa, empleado en esta norma internacional y que producen indol y que
aglutinan especficamente con antisuero, frente al antgeno O157.
Estafilococos coagulasa-positivos: bacterias que forman colonias caractersticas y/o no
caractersticas sobre la superficie de un medio de cultivo selectivo y que dan resultados positivos a
la reaccin de la coagulasa, cuando se realiza el ensayo siguiendo el mtodo especificado en esta
parte de la norma ISO 6888.
Fecha de caducidad: fecha lmite en que se considera que un producto, almacenado en las
condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las caractersticas sanitarias que debe de reunir
para su consumo. Despus de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.
Fragmento; viruta: muestra de carne congelada resultante de un corte profundo de una muestra de
superficie o una muestra tomada en profundidad del interior de la pieza para anlisis mediante un
taladro elctrico o manual, equipado con una broca para madera.
Loncha: corte de carne con las dos caras ms o menos paralelas de algunos centmetros de espesor.
Listeria monocytogenes: bacilo corto, Gram positivo, no esporulado, mvil, aerobio, capaz de
crecer en condiciones de microaereofilia, catalasa positivo y oxidasa negativo. En agar sangre da
origen a colonias puntiformes, circulares, lisas y translcidas de color azul grisceo con una zona
discreta de -hemlisis o microorganismos que forman colonias tpicas en medios slidos selectivos
y que presentan las caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas descritas cuando se
llevan a cabo los ensayos de esta parte de la norma ISO 11290.
Mtodo: es un proceso o camino sistemtico establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin
de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento cientfico seguido en la ciencia para hallar
la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea especfica en la clase o mdulo.
Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser
utilizada para inspeccin o para anlisis.
Muestra representativa: es un nmero de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas
en forma aleatoria y cuyas caractersticas son lo ms similar posible a las del lote del que procede.
Muestra testigo: muestra que queda en poder del interesado y a disposicin de la autoridad
competente.
Norma especfica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el anlisis de un
producto determinado (o de un grupo de productos) para la deteccin o la determinacin del nmero
de un microorganismo especfico (o de un grupo de microorganismos).
Porcin para anlisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la
muestra para el laboratorio, para emplearse en la preparacin de la suspensin inicial.
Presuntas Escherichia coli: bacteria que fermenta la lactosa con la produccin de gas a 44 C, y
que adems produce indol a partir de triptofano, cuando el ensayo se realiza de acuerdo al mtodo
especificado en la ISO 7251: 2005 (E).

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Procedimiento: es un trmino que hace referencia a la accin que consiste en proceder de alguna
forma. El concepto, por otra parte, est vinculado a un mtodo una manera de ejecutar algo. Un
procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una
labor de manera eficaz.
Productos perecederos: grupo de alimentos que por su naturaleza biolgica y fsico-qumica, su
vida til es de hasta 30 das, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe
ostentarse en su etiqueta o envase.
Recuento de enterobacteriaceae: el nmero de Enterobacteriaceae encontrado por mililitro o por
gramo de la muestra examinada cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al mtodo
especificado.
Recuento de Listeria monocytogenes: determinacin del nmero de unidades formadoras de
colonias (UFC) de Listeria monocytogenes en una cantidad determinada de producto, cuando el
anlisis se realiza de acuerdo con esta parte de la norma ISO 11290.
Recuento de presuntas Escherichia coli: nmero ms probable de E. coli por mililitro o por
gramo de la muestra cuando el ensayo se realiza de acuerdo al mtodo especificado en esta norma
internacional.
Salmonella: microorganismo patgeno perteneciente al grupo de las Enterobacterias. Bacilo gram
negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias tpicas en medios selectivos slidos y que
presentan adems las caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando los procedimientos
se efectan de acuerdo con la NOM -114-SSA1-1994 o microorganismos que forman colonias
tpicas o menos tpicas en medios selectivos slidos y que manifiestan las caractersticas
bioqumicas y serolgicas descritas cuando los anlisis se realizan segn la UNE-EN ISO
6579:2003.
Staphylococcus aureus: microorganismo que forma colonias tpicas y/o atpicas en la superficie de
un medio de cultivo selectivo y que muestra reaccin de coagulasa fuertemente positiva o
microorganismo que se desarrolla en medios de cultivo selectivo y diferencial, que es capaz de dar
positiva la prueba de coagulasa y termonucleasa.
Suspensin inicial (dilucin base): suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando un peso o
volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del
producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las
partculas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Suspensin inicial (dilucin primaria): suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando un
peso o volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a
partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando
que las partculas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de
la totalidad del lote o partida.
Vibrio parahaemolyticus: microorganismo halfilo que forma colonias caractersticas en medio
slido selectivo y que muestra las caractersticas bioqumicas descritas cuando las pruebas son
llevadas a cabo de acuerdo con la BS 5763: Part 14: 1991.

16

Vida til o vida de anaquel: es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel
de calidad sanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones especficas de procesamiento,
envasado y almacenamiento.


17

Smbolos y abreviaturas
ms menos
/ signo de divisin
C Celsius
% por ciento
1/d inversa de la dilucin
ATCC American Type Culture Collection
beta
cbp cuanto basta para
CIP Culture International Production
cm centmetro
cm
2
centmetro cuadrado
g gramo
h hora
kg kilogramo
l, L litro
lb libras
m micrmetro
M molar
ml, mL mililitro
mm milmetro
min minuto
N normal
NCTC National Culture Type Collection
NMP nmero ms probable
p peso
p. ejem. por ejemplo
pH potencial de hidrgeno
PM peso molecular
RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa
s segundo
UFC unidades formadoras de colonias
spp especies plurales
v volumen
x signo de multiplicacin


18

3. MTODOS NORMALIZADOS PARA DETECTAR BACTERIAS
ESPECFICAS
Datos Generales y requerimientos de mtodos cualitativos
Los mtodos de ensayo microbiolgicos cualitativos, son aquellos en los que el resultado se expresa
en trminos de detectado/no detectado y los procedimientos de confirmacin e identificacin, deben
ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa, desviacin
positiva, desviacin negativa, lmite de deteccin, efecto matricial, repetibilidad y reproducibilidad.
Datos generales y requerimientos de mtodos cuantitativos
En el caso de ensayos microbiolgicos cuantitativos, debe considerarse la especificidad,
sensibilidad, exactitud relativa, desviacin positiva, desviacin negativa, repetibilidad,
reproducibilidad y el lmite de cuantificacin dentro de una variabilidad establecida y en caso
necesario, determinar cuantitativamente estos parmetros. Las diferencias debidas a las matrices
deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse
utilizando mtodos estadsticos apropiados.
3.1.1. Deteccin de Escherichia coli, Coliformes, Escherichia coli O157 y productoras de shiga
toxinas.
El denominado grupo de coliformes es utilizado como indicador de condiciones de higiene y
calidad general en los anlisis de alimentos, se compone principalmenete de cepas de los gneros
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, entre otros, tales como Citrobacter, Salmonella y Shigella.
Los coliformes fermentan la lactosa a cido y gas a 35 C37 C dentro de 24 h -48 h (Anand y
Griffiths, 2011). Los coliformes tambin incluyen bacterias de origen no fecal por lo que no deben
ser exclusivos de indicadores de contaminacin fecal u otros patgenos entricos, generalmente se
diferencian los coliformes fecales de los no fecales con una incubacin a (45 0.2) C (Anand,
2011).
El gnero Escherichia coli se compone de bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos,
comnmente habita el tracto gastrointestinal de mamferos y pertenece a la familia
Enterobacteriaceae (Viazis y Diez-Gonzalez, 2011). Existen cepas patognicas de E. coli
productoras de shiga toxinas las cuales son miembros de una familia de toxinas que se clasifican en
dos subgrupos: Stx1 y Stx2 (O'Brien y Holmes, 1987). Las toxinas son producidas por el patgeno
en el colon y pueden causar dao local, poseen la capacidad de viajar al rin a travs del torrente
sanguneo, donde se cree que desempean un papel en la causa de colitis hemorrgica y sndrome
urmico hemoltico (Kaper, 2005).
A continuacin se muestran de manera resumida algunos aspectos de las normas tales como el
objetivo y campo de aplicacin, fundamento, procedimiento, reactivos y medios de cultivo,
materiales, aparatos e instrumentos, preparacin de la muestra, expresin de los resultados, informe
de la prueba y concordancia con otras normas, con el fin de comparar de manera rpida estos
aspectos entre diferentes normas.


19

NOM-112-SSA1-1994
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Estimar el nmero de coliformes presentes en productos alimenticios (agua
potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados trmicamente)por medio
del clculo del nmero ms probable (NMP).
Fundamento:
Fermentacin de la lactosa por bacterias coliformes, incubadas a (35 1) C
durante (24 a 48) h, resultando una produccin de cidos y gas el cual se
manifiesta en las campanas de fermentacin.
Procedimiento:
Para agua potable y hielo: Inoculacin (caldo lactosado), incubacin a 35 C por
(24 a 48) h 2 h, prueba confirmativa (caldo lactosa lauril bilis verde brillante)
incubacin a 35 C por (24 a 48) h 2 h. Para alimentos: Prueba presuntiva
(inoculacin en medio de enriquecimiento, dilucin, incubacin a 35 C por (24 a
48) 2 h, prueba confirmativa (de cada tubo que muestre formacin de gas,
tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de
confirmacin. Incubar a (35 0.5) C por (24 a 48) h.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Soluciones diluyentes (Disolucin reguladora de fosfatos, agua peptonada).
Medios de cultivo (Caldo lactosado, caldo lauril sulfato triptosa, caldo lactosa
bilis verde brillante).
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio,
pHmetro.
Preparacin de
la muestra:
Las muestras deben prepararse y diluirse de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994.
Expresin de
resultados:
Nmero ms probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra.
Informe de la
prueba:
Informar "Nmero ms probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de
muestra". En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml.
Concordancia
con normas
internacionales:
Esta norma no tiene concordancia con normas internacionales.
Cepas de
referencia :
No especifica.

NOM-113-SSA1-1994
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo microbiolgico para determinar el nmero de microorganismos
coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la tcnica de
cuenta en placa.
Fundamento:
Determinacin del nmero de microorganismos coliformes presentes en una
muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se
desarrollan bacterias a 35 C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la
produccin de gas y cidos orgnicos, los cuales viran el indicador de pH y
precipitan las sales biliares.

20

Procedimiento:
Dilucin, inoculacin en medio RVBA, incubacin a 35 C, durante (24 2) h,
contar colonias, seleccionar las placas que contengan entre 15 colonias y 150
colonias.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Soluciones diluyentes (Disolucin reguladora de fosfatos, agua peptonada).
Medio de cultivo agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA).
Aparatos e
instrumentos:
contador de colonias, licuadora, vasos para licuadora, microscopio, pHmetro.
Preparacin de
la muestra:
La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-
110-SSA1-1994.
Expresin de
resultados:
UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 C durante 24 h
2 h.
Informe de la
prueba:
UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 C durante 24 h
2 h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar
utilizando como referencia la dilucin ms baja utilizada, por ejemplo dilucin
10
-1
. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no
desarrollo de coliformes por ml".
Concordancia
con normas
internacionales:
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 16654:2002
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo horizontal para la deteccin de Escherichia coli serogrupo O157.
Aplicable a productos para consumo humano o animal.
Fundamento:
Deteccin de Escherichia coli serogrupo O157 por enriquecimiento en caldo
triptona soya, separacin y concentracin mediante partculas inmunomagnticas,
aislamiento y confirmacin mediante la produccin de indol y aglutinacin con el
suero anti E. coli O157.
Procedimiento:
Dilucin, enriquecimiento, incubacin (41.5 C durante 6 h, 12 h y 18 h),
separacin inmunomagntica (IMS) (inmunocaptura, separacin), siembra en
agares selectivos e identificacin de colonias E. coli O157, confirmacin
(confirmacin de colonias, confirmacin bioqumica por formacin de indol,
identificacin serolgica).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio de enriquecimiento (caldo triptona soya modificado con novobiocina,
mTSB+N), primer medio selectivo (agar cefixima telurito sorbitol Mc Conkey
agar, CT-SMAC), disolucin de telurito potsico, disolucin de cefixima, agar
nutritivo, medio triptona/triptfano, reactivo de indol de Kovac, partculas
inmunomagnticas anti E. coli O157, tampn fosfato modificado (0.01 mol/l, pH
7.2), disolucin salina normal, suero anti E.coli O157.

21

Aparatos e
instrumentos:
mezclador rotatorio, vortex, separador magntico con gradilla magntica, bao de
agua, microscopio, pHmetro.
Preparacin de
la muestra:
Realizar de acuerdo con la norma internacional especfica adecuada para el
producto. Si no existe una norma internacional especfica, se recomienda que las
partes interesadas adopten un acuerdo sobre este asunto.
Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia de E. coli x gramo o por mililitro.
Informe de la
prueba:
Deber especificar: informacin necesaria para la completa identificacin de la
muestra, mtodo de muestreo empleado, mtodo de ensayo empleado, haciendo
referencia a la norma ISO 6888, temperatura de incubacin utilizada, detalles
operativos, resultados obtenidos.
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 16654:2001.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BS 5763: Part 10: 1993
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Productos para consumo humano y animal.
Fundamento:
Clculo del nmero ms probable (NMP) despus de incubacin a (35 o 37 ) C
en medio lquido; conteo de colonias en medio selectivo en placa incubando a (35
o 37) C.
Procedimiento:
Dilucin, NMP (inoculacin e incubacin, aislamiento en placa, seleccin de
colonias y confirmacin), conteo en placa (inoculacin e incubacin, conteo y
seleccin de colonias), confirmacin (subcultivo, confirmacin bioqumica).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Caldo verde brillante bilis glucosa (Caldo E.E), agar rojo violeta bilis glucosa,
agar glucosa, agar nutritivo, reactivo de oxidasa.
Aparatos e
instrumentos:
asas, pHmetro.
Preparacin de
la muestra:
Diluciones decimales.
Expresin de
resultados:
Tabla de nmero ms probable (NMP), nmero de Enterobacteriaceae x gramo o
por mililitro.
Informe de la
prueba:
Reportar mtodo, temperatura de incubacin, resultados, condiciones de
operacin no especificadas en la norma, incidentes, identificacin de la muestra.

22

Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 7402-1985, ISO 7402-1993 (E).
Cepas de
referencia :
No especifica.

BS 5763: Part 13: 1989
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Resucitacin en membranas de acetato de celulosa cubiertas con agar modificado
glutamato mineral incubadas a 37 C por 4 h, aislamiento: transferir las
membranas de la etapa de resucitacin a agar bilis triptona, incubar 44 C por (18
a 20) h, deteccin: demostracin de la presencia de E. coli por la produccin de
indol.
Procedimiento:
Dilucin. Resucitacin: colocar la membrana de acetato de celulosa sobre la
superficie de cajas Petri con agar mineral glutamato modificado, humedecer la
membrana con la muestra, incubar a (35 o 37) C por 4 h. Transferir a medio
selectivo: Transferir las membranas de las placas Petri con agar mineral
glutamato modificado a cajas Petri con agar bilis triptona, incubar a 44 C
durante (18 a 24) h. Deteccin produccin de indol por colonias en membranas:
Retirar las membranas de la superficie del agar y embeber las membranas en el
reactivo de deteccin de indol en la tapa de la caja Petri propia del ensayo,
colocar la membrana bajo una lmpara de luz ultravioleta durante 30 min, las
colonias indol-positivas desarrollarn color rosado. Conteo: contar las colonias
indol-positivas (color rosa) de la membrana.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio de resucitacin: Agar mineral glutamato modificado, medio selectivo:
Agar triptona bilis, reactivo de deteccin de indol (p-dimetilaminobenzaldehido,
HCl).
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, mezcladoras (mecnica, peristltica), tubos,
cajas Petri, membranas de acetato de celulosa, pipetas, varillas de vidrio, lmpara
ultravioleta, pHmetro.
Preparacin de
la muestra:
Dependiente de la muestra.
Expresin de
resultados:
Nmero de E. coli x gramo o por mililitro.
Informe de la
prueba:
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 6391.

23

Cepas de
referencia :
No especifica.

BAM Captulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias coliformes
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Productos de consumo humano.
Fundamento: Fermentacin de lactosa y clculo del nmero ms probable.
Procedimiento:
General: Dilucin, NMP (inoculacin e incubacin, aislamiento en placa,
seleccin de colonias y confirmacin), conteo en placa (inoculacin e incubacin,
conteo y seleccin de colonias), confirmacin (subcultivo, confirmacin
bioqumica). Confirmacin en medio slido y filtracin por membrana.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) (M25), caldo lauril triptosa
(LST)(M76), caldo EC (M49), azul Levin de metileno-eosina (L-EMB), agar
(M80), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo MR-VP (M104), caldo citrato
de Koser (M72), agar para cuenta en placa mtodo estndar (PCA) (M124), agua
Butterfield de tampon de fosfatos (R11) o diluyente equivalente (excepto para
crustceos), reactivo de Kovacs (R38), reactivo Voges-Proskauer (VP) (R89),
reactivos para tincin de Gram (R32), indicador rojo de metilo (R44), agar bilis
rojo violeta (VRBA) (M174), agar VRBA-MUG (M175), medio EC-MUG
(M50), caldo lauril triptosa MUG (LST-MUG) (M77), diluyente de peptona, 0.1
% (R56).
Aparatos e
instrumentos:
asas, pHmetro, contador de colonia, licuadora, frascos de dilucin, lmpara UV.
Preparacin de
la muestra:
Diluciones decimales.
Expresin de
resultados:
Tabla del nmero ms probable (NMP), nmero de Enterobacteriaceae x gramo
o por mililitro.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
No especifica.


24

BAM: Captulo 4A. Escherichia coli diarreognica.
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Identificar y aislar cepas patgenas de E. coli en base a sus propiedades nicas de
virulencia en los alimentos para consumo humano.
Fundamento:
Enriquecimiento en medio lquido, seleccin de cepas fermentadoras de lactosa,
caracterizacin primaria y secundaria por pruebas bioqumicas, pruebas mediante
cultivo de tejidos, sondas de ADN, PCR en tiempo real de enterotoxignicidad,
enteroinvasividad, enteropatgenicidad, deteccin sistemtica de E. coli serotipo
O157:H7.
Procedimiento:
A. Enriquecimiento de cepas patgenas de E. coli. Caldo BHI, caldo de doble
fuerza TP incubar 20 h a 44.0 C 0.2 C. Plaquear en medio selectivo, incubar
20 h a 35 C. B. Seleccin. Caractersticas fenotpicas en medio selectivo. C.
Anlisis e identificacin bioqumica. Primera y segunda inspeccin con pruebas
bioqumicas tradicionales o como alternativa, API20E o el ensayo de pruebas
bioqumicas automatizado VITEK. D. Pruebas de E. coli enterotoxignica
(ETEC), por anlisis de hibridacin de colonias con sondas de ADN, cultivo de
tejidos, prueba del ratn lactante, pruebas comerciales de RPLA y ELISA para
detectar toxinas, ensayos de PCR. E. Pruebas de E. coli enteroinvasiva (EIEC),
por la prueba de Sereny o el ensayo queratoconjuntivitis con cobayos, ensayo de
tejido de clulas HeLa, tcnica de tincin en vitro usando naranja de acridina,
sondas de ADN y PCR. F. Pruebas de Escherichia coli enteropatgena (EPEC),
por cultivo de tejidos, PCR y sondas. G. Deteccin de E. coli serotipo O157: H7.
Medio de enriquecimiento, medio slido selectivo, identificacin fenotpica,
serologa y la prueba de genes de la Shiga toxina por PCR y PCR en tiempo real.
H. Preparacin de la muestra, enriquecimeinto. I. Anlisis de PCR en tiempo real.
Preparacin del ADN molde, controles de PCR positivo y negativo, protocolo de
la reaccin del Smart Cycler II y anlisis de datos. J. Anlisis y deteccin de los
cultivos aislados. De positivos por el ensayo de PCR en tiempo real. Proceso de
aislamiento. Diluir y crecer en medio slido selectivo y agar cromgeno,
identificar fenotpicamente, pruebas de antgenos, ensayar en medio selectivo y
pruebas bioqumicas, pruebas confirmatorias (bioqumicas, con antgenos,
antisueros comerciales, PCR tiempo real). K. Mtodos de anlisis para cepas
STECno-O157. Enriquecimiento, aislamiento en medio selectivo, pruebas
confirmatorias de los aislados por API20E o VITEK, PCR, electroforesis en gel
en campos pulsados.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Caldo triptona fosfato (TP) (M162), caldo infusin cerebro corazn (BHI) (M24),
agar azul Levine azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80), agar MacConkey
(M91), agar triple azcar hierro (TSI) (M149), agar base sangre (BAB) (M21),
caldo triptona (triptofano) (M164), caldo prpura de bromocresol (M26)
suplementado individualmente con 0.5 % (w/v) de cada uno de los azcares:
glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa, caldo urea
(M171), caldo Falkow lisina decarboxilasa (M87), caldo cianida de potasio
(KCN) (M126), caldo MR-VP (M104), medio indol nitrito (nitrato triptico)
(M66), agar acetato (M3), caldo mucato (M105), caldo mucato control (M106),
caldo malonato (M92), caldo citrato de Koser (M72), disolucin acuosa de
bicarbonato de sodio 10 % (R70), discos de ONPG (o-nitrofenil--D-
galactopiranosido) (R53), disolucin salina amortiguador de fosfatos (PBS)
(R60), agua diluyente de Butterfield amortiguador de fosfatos (BPBW) (R11),
reactivo de Kovac (R38), reactivo VP (R89), reactivo de prueba de oxidasa

25

(R54), reactivo de deteccin de nitritos (R48), acite mineral pesado (R46),
reactivos de tincin de Gram (R32). Para pruebas en PCR tiempo real: Agua
peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-
Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a), oligonucletidos iniciadores y sondas
para STEC/O157 especficos para la plataforma de PCR en tiempo real,
OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR (Cepheid o Fisher),
LightCycler FastStart ADN Master Hybridization Probes M-Grade (Roche
Applied Science, Catalog #3 383 393), agar MacConkey telurito cefixima-
sorbitol (TC-SMAC) (M194), agar cromognico selectivo: Agar E. coli O157:H7
R&F agar (R&F Laboratories), agar Rainbow O157 (BIOLOG), agar Levin
azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) (solo seccin R), agar tripticasa de soya
con extracto de levadura (TSAYE) (M153), amortiguador de fosfato Butterfield
(R11) (pH 7.2 0.2), agua destilada, agua grado molecular, disolucin
fisiolgica salina (0.85 % NaCl), ColiComplete Discs - conteniendo sustrato
fluorognico MUG para GUD y X-gal cromognico para GAL (BioControl),
reactivo anti-O157 y anti-H7 latex (Remel), API20E o VITEK GNI
(BioMerieux).
Aparatos e
instrumentos:
licuadora, estomaquer, mezclador rotatorio, vortex, separador magntico con
gradilla magntica, bao de agua, microscopio, pHmetro, microcentrfuga,
termociclador Smart Cycler II, tubos para PCR, instrumento LightCycler 2.0
PCR tiempo real, capilares LightCycler para PCR tiempo real.
Preparacin de
la muestra:
Refrigere las muestras inmediatamente despus de su recepcin. No congelar,
excepto para mantener los productos congelados hasta justo antes del anlisis.
Analizar las muestras tan pronto como sea posible. Si el recuento lo requiere,
preparar un homogeneizado de 25 g en 225 ml de PBS o BPBW. Realizar
diluciones decimales (en PBS o BPBW) de la placa de homogeneizado e inocular
en cajas directo en agar MacConkey para obtener colonias aisladas. Despus de
incubar las placas durante 20 horas a 35 C, realizar levantamiento de las
colonias y pruebas de hibridacin con sondas genticas especficas para los genes
de virulencia. Pruebas con sondas y PCR: Productos con hojas - aade un peso
igual de amortiguador fosfato de Butterfield a por lo menos 200 g de producto en
un recipiente estril o bolsa resellable de plstico y agitar suavemente durante 5
minutos. Pesar 125 g del producto enjuagado en 125 ml de (2X) mBPWp doble
fuerza. Jugo, leche u otras muestras de bebidas turbias - aspticamente
centrifugar 200 ml de muestra a 10.000 x g durante 10 min. Despus de decantar
el sobrenadante, resuspender el material precipitado en 225 ml de mBPWp. Agua
embotellada u otros lquidos no turbios - pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X.
Tambin seguir este procedimiento con lquidos en el que no sea visible un
precipitado despus de la centrifugacin. Todos los dems alimentos - pesar 25 g
de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o mezclar con un stomaquer segn sea
necesario. Preparacin del ADN molde: Enriquecer la cepa durante una noche,
centrifugar, resuspender el precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar,
resuspender el precipitado en agua estril, mantener a 100 C durante 10 min,
centrifugar, retirar y guardar el sobrenadante como ADN molde (Esto puede ser
congelado, mnimo a -20 C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una
dilucin 1:10 de este molde.
Expresin de
resultados:
Nmero de E. coli por gramo o por mililitro.

26

Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
E. coli 465-97 USDA (stx1-, stx2- uidA+), ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+),
ATCC 43888 (stx1-, stx2- uidA+) o equivalente, ATCC 43895 (EDL 933) o
ATCC 43894 (stx1+, stx2+ y uidA+).

ISO 7251: 2005 (E)
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Detectar y cuantificar presuntas colonias de Escherichia coli en productos para
consumo humano, animal y muestras ambientales del rea de manejo y
produccin de alimentos.
Fundamento:
Clculo del nmero ms probable (NMP) despus del crecimiento en cultivo
lquido en medio selectivo.
Procedimiento:
Mtodo de deteccin: Porcin de la muestra y dilucin inicial (ver ISO 6887 o
ISO 8261 dependiendo del producto). Incubar en medio selectivo de
enriquecimiento (37 C 24 h- 48 h). Inoculacin e incubacin en medio selectivo
(44 C 24 h -48 h). Inoculacin e incubacin en agua peptonada. Prueba
confirmatoria (indol). Mtodo de recuento: Porcin de la muestra y dilucin
inicial (ISO 6887 o 8261). Inoculacin e incubacin en medio de enriquecimiento
selectivo (37 C 24 h-48 h). Subcultivo e incubacin en medio selectivo (44 C
24 h-48 h). Inoculacin e incubacin en agua peptonada (44 C 48 h). Prueba
confirmatoria (produccin de indol). Interpretacin.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio diluyente: En general ver norma ISO 6887-1, para productos lcteos ver
ISO 8261. Medio de enriquecimiento selectivo: Caldo lauril sulfato, caldo EC,
agua peptonada libre de indol, reactivo de indol (reactivo de Kovac).
Aparatos e
instrumentos:
Horno, autoclave, incubadoras, baos de agua, tubos de ensayo, asas, campanas
Durham, potencimetro.
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Mtodo de deteccin: Presencia o ausencia de presuntas E. coli en la porcin de
la muestra en gramos o mililitros. Mtodo de recuento: NMP de E. coli por
gramo.
Informe de la
prueba:
Identificacin de la muestra, el mtodo de muestreo utilizado, el mtodo del
ensayo, todos los detalles operacionales no especificados u opcionales en el
estndar internacional junto con aquellos incidentes que pudieron haber infludo
en el resultado de la prueba, los resultados obtenidos.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.

27

Cepas de
referencia :
No especifica.

3.1.2 Deteccin de Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes es una bacteria que vive de manera natural en el suelo como saprfito, pero
es capaz de hacer su transicin como patgeno en el hombre y los animales despus de su ingestin
a travs de los alimentos (Freitag et al., 2009). L. monocytogenes es una bacteria Gram positiva,
intracelular, que se caracteriza por tolerar temperaturas de refrigeracin, pH cido, alta
concentracin de sal y formar biopelculas, lo cual favorece su presencia y proliferacin en los
alimentos y el ambiente (Gandhi y Chikindas, 2007). L. monocytogenes se clasifica con base a sus
antgenos somticos y flagelares, en 13 serotipos; 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4ab, 4b, 4d, 4e
y 7, los cuales son considerados potencialmente patgenos (Seeliger y Hhne, 1979). L.
monocytogenes es el agente causal de la listeriosis, la cual se manifiesta en graves enfermedades
(meningitis, septicemia, aborto y gastroenteritis), con una alta tasa de mortalidad entre 20 % a 30 %,
y afecta principalmente a la poblacin en riesgo, como nios, mujeres embarazadas, ancianos y
personas inmunocomprometidas (Mead et al., 1999).
L. monocytogenes es un contaminante frecuente en alimentos, estando presente en 2 % a 4 % de los
suministros de leche cruda y tambin comnmente aislada de carne cruda, pollo y mariscos, as
como tambin de numerosos productos procesados como, carne, pescado y mariscos.
A continuacin se muestra de manera resumida algunos aspectos de las normas tales como el
de la prueba y concordancia con otras normas con el fin de comparar de manera rpida estos
NOM-143-SSA1-1995
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo microbiolgico para determinar la presencia de Listeria monocytogenes
en alimentos.
Fundamento:
Se basa en el aislamiento y la diferenciacin de especies de Listeria spp.,
principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica de
los miembros de este gnero.
Procedimiento:
Enriquecimiento (inoculacin en medio EB e incubacin por 48 h a 35 C).
Aislamiento (resembrar en medios LMP y OXA, incubar a 30 C por 24 h a 48 h
y 35 C respectivamente). Identificacin (seleccionar colonias tpicas y sembrar
en medio ASTEL. Incubar a 35 C por 24 h). Prueba de movilidad en fresco.
Prueba de catalasa. Tincin de Gram. Prueba de hemlisis. Prueba de reduccin
de nitratos. Prueba de movilidad en agar. Prueba de utilizacin de carbohidratos.
Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP). Serologa (la determinacin
de los tipos serolgicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones
epidemiolgicas sean cruciales.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Reactivos (Reactivos para Tincin de Gram, reactivos para la determinacin de
nitritos), medios de cultivo (Caldo soya tripticasena con 0.6 % de extracto de
levadura (CSTEL), caldo de enriquecimiento (EB) pH 7.3, medio de cloruro de
litio feniletanol-moxolactam (LMP), medio Oxford, agar soya tripticasena con

28

0.6 % de extracto de levadura (ASTEL), agar sangre de carnero, caldo nitratos),
medios para la prueba de movilidad (medio de SIM, medio MTM), caldo prpura
para fermentacin de carbohidratos.
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, lmpara de luz blanca, microscopio, tubos,
cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio.
Preparacin de
la muestra:
Para la preparacin de la muestra seguir la NOM-110-SSA1-1994.
Expresin de
resultados:
Para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 ml de muestra.
Informe de la
prueba:
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la
presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Si los resultados son negativos informar
ausencia en 25 g o 25 ml de muestra.
Concordancia
con normas
internacionales:
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 11290-1:1997
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo horizontal para la deteccin de Listeria monocytogenes, aplicable a
productos destinados al consumo humano o a la alimentacin animal.
Fundamento:
Deteccin de L. monocytogenes en cuatro etapas consecutivas: enriquecimiento
primario en un medio lquido de enriquecimiento selectivo, enriquecimiento
secundario en medio lquido, aislamiento e identificacin, confirmacin.
Procedimiento:
Dilucin. Enriquecimiento primario. Incubacin a 30 C por 24 h.
Enriquecimiento secundario. Incubacin a 35 C o 37 C por 48 h. Aislamiento e
identificacin (sembrar en medio OXFORD y PALCAM). Confirmacin de
Listeria spp.(seleccin de colonias, reaccin de la catalasa, tincin de Gram,
prueba de motilidad). Confirmacin de L. monocytogenes (ensayo de hemlisis,
utilizacin de carbohidratos, ensayo de CAMP). Interpretacin de las propiedades
morfolgicas y fisiolgicas y de las reacciones bioqumicas. Confirmacin
definitiva. Cultivos control.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio de enriquecimiento selectivo primario (Caldo Fraser de media
concentracin), medio de enriquecimiento selectivo secundario con agentes
selectivos (caldo Fraser), medios de cultivo slidos selectivos (agar OXFORD,
agar PALCAM), medio de cultivo agar triptona soya - extracto de levadura
(TSYEA), medio de cultivo caldo triptona soya - extracto de levadura (TSYEB),
agar sangre de cordero, caldo de utilizacin de carbohidratos (ramnosa y xilosa),
caldo motilidad, medio CAMP y cepas para ensayo, disolucin de perxido de
hidrgeno, disolucin de tampn de fosfato salino (PBS).
Aparatos e
instrumentos:

29

Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Para L. monocytogenes registrar la presencia o ausencia en g o ml de muestra.
Informe de la
prueba:
muestra, mtodo de muestreo empleado, mtodo de ensayo empleado haciendo
referencia a la Norma ISO 11290, temperatura de incubacin utilizada, detalles
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 11290-1:1997.
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 11290-2:2000
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo horizontal para la deteccin de Listeria monocytogenes, aplicable a
productos destinados al consumo humano o preparados alimenticios para
animales.
Fundamento:
Recuento de L. monocytogenes en seis etapas consecutivas: preparacin de la
suspensin inicial, re-verificacin, aplicacin en placa, incubacin, confirmacin,
clculo del nmero de L. monocytogenes por gramo o mililitro.
Procedimiento:
Suspensin inicial. Dilucin. Inoculacin (placas de agar PALCAM). Incubacin
a 35 C o 37 C durante 24 h a 48 h. Recuento de colonias caractersticas.
Confirmacin de las especies de Listeria (seleccin de colonias para la
confirmacin, reaccin de catalasa, tincin de Gram, ensayo de movilidad).
Confirmacin de L. monocytogenes (ensayo de hemlisis, utilizacin de
carbohidratos, ensayo de CAMP). Interpretacin de las propiedades
morfolgicas y fisiolgicas y de las reacciones bioqimicas. Confirmacin
definitiva.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Vase Norma ISO 7218.
Aparatos e
instrumentos:
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Nmero de L. monocytogenes por g o ml de muestra.
Informe de la
prueba:

30

Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 11290-2:2000.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BAM Captulo 10: Listeria monocytogenes
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Productos para consumo humano.
Fundamento:
Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento, procedimiento de aislamiento,
procedimiento de identificacin (PCR tiempo real, Kits), subtipificacin de
aislados de L. monocytogenes, prueba de patogenicidad del ratn
inmunodeficiente, interpretacin de los datos de las pruebas, recuento.
Procedimiento:
1. Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento: Tratamiento de la muestra,
pre-enriquecimiento y enriquecimiento, enriquecimiento con conteo, mtodos
alternativos prescritos para el cribado de las muestras enriquecidas. 2.
Procedimiento de aislamiento: medios selectivos. 3. Procedimiento de
identificacin: Morfologa, tincin de Gram, prueba de catalasa, fermentacin de
carbohidratos, medio selectivo, prueba de reduccin de nitrato, pruebas de
movilidad, pruebas con kits, PCR en tiempo real, mtodos rpidos alternativos,
prueba de CAMP. 4. Subtipificacin de aislados de L. monocytogenes
(obligatorio): serolgica y genticamente. 5. Prueba de patogenicidad del ratn
inmunodeficiente (opcional). 6. Interpretacin de los datos de las pruebas. 7.
Recuento (requerido).
Reactivos y
medios de
cultivo:
cido actico 5 N, monohidroclorido de acriflavina, agar, N-(1-naftil) etilen
diamina (R48), reactivo -Naftol (R48), agar base sangre No. 2, cicloheximida,
natamicina, sangre de cordero defibrinado, etanol absoluto, tampn de anticuerpo
fluorescente, glicina anhidra, kit de tincin de Gram, disolucin de perxido de
hidrgeno 3 % para prueba de catalasa (R12), disolucin de KOH 40 % (R65),
juego ser Listeria-typing, agar cloruro de litio feniletanol moxalactam (LPM)
(M81) con esculina y hierro (M82), cido nalidxico (sal de sodio), medio de
reduccin de nitrato (M108) y reactivo de deteccin de nitrato (R48), caldo
nutritivo (M114), disolucin salina fisiolgica 0.85 % (R63), caldo base
fermentacin carbohidrato prpura (M130) conteniendo soluciones 0.5 % de
dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol, y xilosa, medio SIM (M137) o
medio de prueba de movilidad (M103), reactivo de cido sulfanlico (R48), agar
tripticasa de soya con 0.6 % de extracto de levadura (TSAye) (M153), caldo
tripticasa de soya con 0.6 % extracto de levadura (TSBye) (M157), medio Oxford
(OXA) (M118), caldo de enriquecimiento amortiguado para Listeria (BLEB)
(M52), agar PALCAM (M118a), carragenina, agar BCM (M17a), agar MOX
(M103a), agar ALOA (M10a), agar Listeria cromognico (M40b), rapid L'mono
(M131a), CHROMagar Listeria (M40a), agar y caldo triptosa (M167).

31

Aparatos e
instrumentos:
microscopio de contraste de fases, licuadora o mezcladora peristltica.
Preparacin de
la muestra:
Tratamiento de la muestra. Refrigerar la muestra a 4 C. Muestras compuesta.
Una muestra de un lote de alimento debe constar de 10 sub-muestras, porciones
de 50 g o ml de cada sub-muestra se utilizan para hacer dos muestras compuestas
(250 g cada una) con mezcladoras peristlticas y medio de enriquecimiento sin
agentes selectivos. Muestras no compuestas. Si no se requieren muestras
compuestas porciones analticas simples de 25 g se mezclan con 225 ml de medio
basal de pre-enriquecimiento/enriquecimiento BLEB en una licuadora o
mezcladora peristltica.
Expresin de
resultados:
UFC por gramo o por mL.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
AOAC 992.18. 2000, AOAC 992.19. 2000, AOAC 993.09. 2000, AOAC 993.12.
2000, AOAC 994.03. 2000, AOAC 995.22. 2000, AOAC 996.14. 2000, AOAC
997.03. 2000, AOAC 999.06. 2000, AOAC 2003.12. 2005.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BAM Captulo 10: Listeria monocytogenes. BAM Protocolo: Confirmacin simultnea de
especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por PCR en tiempo real

Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Identificacin de especies de Listeria monocytogenes y Listeria especficamente
por PCR en tiempo real. Un ensayo de PCR en tiempo real 5'-nucleasa de
diferentes regiones del gen iap para detectar L. monocytogenes, as como las
especies de Listeria, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri y L. welshimeri.
Procedimiento:
1. Preparacin del templado: crecimiento de la bacteria aislada por 20 h-24 h a 35
C, aislamiento de ADN por el mtodo de agua hirviendo. 2. Preparacin de
controles: positivo (cepa de referencia) y negativo (agua sin templado). 3. Ensayo
de PCR en tiempo real (ensamble de la reaccin, corrida en SmartCycler II,
nalisis de datos cuantitativos, interpretacin de los resultados del PCR en tiempo
real).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Agua estril de grado molecular, OmniMix-HS PCR reactivo en soporte slido,
Iniciadores y sondas del gen iap para las especies de Listeria y L.
monocytogenes.

32

Aparatos e
instrumentos:
Equipo PCR en tiempo real (SmartCycler II) y material propio de ensayos de
PCR en tiempo real.
Preparacin de
la muestra:
Crecer aislados bacterianos en caldo de infusin cerebro corazn (BHI) de 20 h -
24 h 35 C o suspender una colonia cultivada en placa de agar en disolucin
salina al 0.85 %, centrifugar, resuspender pastilla, someter a ebullicin,
centrifugar y conservar sobrenadante (templado).
Expresin de
resultados:
UFC por gramo o por mL.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
Listeria monocytogenes ATCC 19115, Listeria innocua ATCC 33090, Listeria
seeligeri ATCC 35967, Listeria ivanovii ATCC 19119.

3.1.3 Deteccin de Staphylococcus aureus
Staphyloccocus aureus es un coco Gram-positivo, catalasa positivo, oxidasa negativo, anaerobio
facultativo, mesfilo que crece en un rango de temperatura de 7 C a 48C con una temperatura
ptima de crecimiento de 37 C (Valero et al., 2009). El intervalo de pH ptimo al que se desarrolla
es de 6 a 7. Se desarrolla adecuadamente en medios que contienen de un 5 % a un 7 % de NaCl y
actividades de agua de 0.86 (Ewald y Notermans, 1988). Su resistencia a inhibidores que se
encuentran en los alimentos le permite desarrollarse bajo condiciones en las que otros patgenos no
se desarrollan. Por lo tanto, alimentos con altas concentraciones de sal y baja actividad de agua se
ven implicados en brotes. El Staphyloccocus aureus produce enterotoxinas termoestables (serotipos
A-E) causantes de intoxicaciones en humanos (Anand, 2011).
A continuacin se muestran de manera resumida algunos aspectos de las normas tales como el
de la prueba y concordancia con otras normas, con el fin de comparar de manera rpida estos


33

NOM-115-SSA1-1994
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Cuenta de Staphylococcus aureus presente en alimentos nacionales o de
importacin.
Fundamento:
Estimacin del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efecta
directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la
confirmacin mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa.
Este mtodo es adecuado para el anlisis de alimentos en los cuales se esperen
ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus por g.
Procedimiento:
Dilucin, inoculacin, incubacin por 45 h -48 h a 35 C, conteo y colecta de
colonias presuntivas, prueba de coagulasa, prueba termonucleasa
Reactivos y
medios de
cultivo:
Soluciones diluyentes (disolucin reguladora de fosfatos, agua peptonada), medio
de Baird-Parker (medio base de Baird-Parker, disolucin de telurito, emulsin de
yema de huevo, disolucin salina isotnica), caldo de infusin cerebro-corazn
(BHI), cido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera (Disolucin de
cloruro de calcio anhidro 0.01 M, disolucin de azul de toluidina 0.1 M,
disolucin amortiguadora 0.05 M Tris-(hidroximetilaminometano) (Tris pH 9)
reactivo biolgico: plasma de conejo.
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio.
Preparacin de
la muestra:
Realizar de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994 "Preparacin y
dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico".
Expresin de
resultados:
UFC/gramo.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 6888-1: 2000
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en productos destinados al
consumo humano o a la alimentacin de los animales.
Fundamento:
Mtodo horizontal para el recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en
productos destinados al consumo humano o a la alimentacin de animales,
mediante el recuento de las colonias obtenidas en un medio slido (medio Baird-
Parker) tras la incubacin en condiciones aerbicas a 35 C o a 37 C.

34

Procedimiento:
Dilucin, inoculacin, incubacin por 24 h 2 h a 35 C a 37 C, conteo y
seleccin de colonias, prueba de coagulasa.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Diluyentes (vase la Norma ISO 6887-1), medio de agar Baird- Parker (medio
base, disolucin de telurito potsico, emulsin de yema de huevo, disolucin de
sulfametacina), infucin de cerebro y corazn, plasma de conejo.
Aparatos e
instrumentos:
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Nmero de colonias x gramo o por mL.
Informe de la
prueba:
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO-6888-1:1999.
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 6888-2:2000
Objetivo y
campo de
aplicacin:
consumo humano o a la alimentacin de los animales.
Fundamento:
Mtodo horizontal para el recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en
productos destinados al consumo humano o a la alimentacin de animales,
mediante el recuento de las colonias obtenidas en un medio slido (medio de
plasma de conejo y fibringeno) tras la incubacin en condiciones aerbicas a 35
C o a 37 C..
Procedimiento:
Dilucin, inoculacin, incubacin por 18 h a 24 h a 35 C a 37 C, conteo y
seleccin de colonias, prueba de coagulasa.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Diluyentes (vase la Norma ISO 6887-1), medio de agar de plasma de conejo y
de fibringeno, soluciones (medio base, disolucin de telurito potsico,
disolucin de fibringeno bovino, disolucin de plasma de conejo y del inhibidor
de tripsina).
Aparatos e
instrumentos:
Preparacin de
la muestra:

35

Expresin de
resultados:
Informe de la
prueba:
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO-6888-2:1999.
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 6888-3:2003
Objetivo y
campo de
aplicacin:
consumo humano o animal y muestras ambientales en el rea de produccin y
manipulacin de alimentos.
Fundamento:
Mtodo horizontal para el recuento de Staphylococcus coagulasa positivos,
empleando la tcnica del nmero ms probable (NMP) en productos destinados al
consumo humano o animal y muestras ambientales en el rea de produccin y
manipulacin de alimentos. Se recomienda este mtodo para alimentos en los que
los estafilococos estn sometidos a tensin y en nmero bajo, como en productos
deshidratados.
Procedimiento:
Preparacin de suspensin inicial (caldo Giolitti y Cantoni), enriquecimiento
(incubacin por 24 h 2 h a 37 C), subcultivo de tubos (agar de Baird - Parker o
agar de plasma de conejo y fibringeno), incubacin por 24 h y 48 h a 37 C,
dilucin, inoculacin, incubacin por 24 h a 37 C, seleccin de colonias,
interpretacin.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Diluyentes (vase la Norma ISO 6887 o la Norma ISO 8621), caldo Giolitti y
Cantoni modificado (medio base, disolucin de telurito potsico), medio de agar
Baird-Parker, medio de agar de plasma de conejo y fibringeno, caldo infusin
de cerebro y corazn, plasma de conejo.
Aparatos e
instrumentos:
frasco anaerbico.
Preparacin de
la muestra:
Se preparan de acuerdo con la parte apropiada de la norma ISO 6887, o de la
norma ISO 8621, o con la norma internacional especfica adecuada para el
Expresin de
resultados:
Mtodo de deteccin (se informa la presencia o ausencia de estafilococos
coagulasa positivos por gramo o mL), mtodo de recuento (clculos de acuerdo a
la norma ISO 7218:1996 apartado 9.4).
Informe de la
prueba:

36

Concordancia
con normas
internacionales:
ISO-6888-3:2003.
Cepas de
referencia :
Staphylococcus auerus ATCC 6538P o Staphylococcus auerus ATCC 25923, E.
coli ATCC 8732 o 25922.

BS 5763: Part 7: 1983
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Inoculacin en medio selectivo en placa (por duplicado), inoculacin usando
diluciones seriadas, incubacin de las placas a 35 C o 37 C durante 24 h a 48 h,
prueba de coagulasa confirmatoria, clculo de nmero de colonias por ml o por
mg de producto.
Procedimiento: Dilucin, inoculacin, incubacin, platos selectivos, prueba confirmatoria.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio base Baird-Parker adicionado con telurito, sulfamazatina, piruvato de
sodio y emulsin de yema de huevo; caldo infusin cerebro corazn, plasma de
conejo.
Aparatos e
instrumentos:
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Informe de la
prueba:
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 6888-1983.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BAM Captulo 12: Staphylococcus aureus
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Alimentos donde se espera un elevado nmero de Staphylococcus. Aislamiento y
recuento de S. aureus, prueba de coagulasa, pruebas complementarias,
identificacin de alguna caracterstica tpica de 2 cepas de S. aureus, S.

37

epidermidis, y Micrococci.
Procedimiento:
Dilucin, inoculacin, incubacin por 45 h -48 h a 35 C, conteo y colecta de
colonias presuntivas, prueba de coagulasa, prueba de catalasa, utilizacin
anaerbica de glucosa, utilizacin anaerbica de manitol, sensibilidad a
lisostafina, produccin de nucleasa termoestable, identificacin de alguna
caracterstica tpica de 2 cepas de S. aureus, S. epidermidis, y Micrococci.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya (TSA) (M152), caldo infusin
cerebro corazn (M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA toluidina
azul-ADN (M148), agar lisostafina triptona extracto de levadura (M165), aceite
de parafina, tampn salino de fosfato 0.02 M (R61) conteniendo 1 % NaCl,
prueba de catalasa (R12).
Aparatos e
instrumentos:
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
AOAC 975.55.
Cepas de
referencia :
No especifica.

Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Deteccin de Satphylococcus spp. Por el mtodo del nmero ms probable
(NMP) en muestras con un nmero bajo esperado de Staphylococcus y contenido
de especies competitivas.
Procedimiento:
Determinacin del NMP. dilucin, inoculacin en medio selectivo lquido, medio
selectivo slido, aislar en medio selectivo slido, transferir a medio selectivo
lquido para recuento, identificacin y confirmacin de S. aureus por prueba de
coagulasa, prueba de catalasa, utilizacin anaerbica de glucosa, utilizacin
anaerbica de manitol, sensibilidad a lisostafina, produccin de nucleasa
termoestable, identificacin de alguna caracterstica tpica de 2 cepas de S.
aureus, S. epidermidis, y Micrococci. Reportar de acuerdo a tablas de NMP.

38

Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya (TSA) (M152), caldo infusin
cerebro corazn (M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA toluidina
azul-ADN (M148), agar lisostafina triptona extracto de levadura (M165), aceite
de parafina, tampn salino de fosfato 0.02 M (R61) conteniendo 1 % NaCl,
prueba de catalasa (R12), caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 % NaCl
y 1 % piruvato de sodio (M154a).
Aparatos e
instrumentos:
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
NMP x gramo o por mL.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
AOAC 987.09.
Cepas de
referencia :
No especifica.

3.1.4Deteccin de Salmonella spp.
Todos los miembros del genero Salmonella son bacilos Gram (-), de 0.7 m a 1.5 m de dimetro y
de 2 m a 5 m de longitud, su temperatura de crecimiento oscila entre 7 C y 48 C. La mayora
son bacterias mviles por la presencia de abundantes flagelos pertricos, a excepcin de S. pullorum
y S. gallinarum. Son bacterias anaerobias facultativas, no encapsuladas y no esporuladas que se
caracterizan por ser el grupo ms complejo, por su gran diversidad bioqumica y serolgica (Doyle
et al., 1997). El gnero Salmonella se divide en dos especies: Salmonella enterica (se subdivide en
seis subespecies que son designados por nombres o nmeros romanos) y Salmonella bongori,
designada originalmente S. enterica subespecie V; desde entonces se ha designado como una
especie separada de Salmonella, sin embargo, por simplicidad y conveniencia, se sigue
denominando "subespecie V" (CDC, 2008).

NOM-114-SSA1-1994

39

Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo general para la determinacin de Salmonella en alimentos.
Fundamento:
Deteccin de Salmonella en alimentos en un esquema general de 5 pasos:
Preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, seleccin en medios slidos,
identificacin bioqumica, serotipificacin.
Procedimiento:
Preparacin de la muestra. Incubar de 18 h a 24 h a 35 C o para alimentos
fuertemente contaminados a 42 C. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y
estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una
tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico
Hektoen, agar sulfito de bismuto o agar SS). Incubar las placas por 24 h 2 h a
35 C. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de
Salmonella. Identificacin bioqumica (Seleccionar al menos dos colonias tpicas
de cada medio selectivo, inocular dos tubos, uno con agar triple azcar hierro
(TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), Incubar por (24 2) h a 35 C.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias de Salmonella.
Prueba de ureasa (prueba de ureasa convencional y rpida). Identificacin
serolgica (ensayo de los antgenos somticos de Salmonella). Pruebas
bioqumicas complementarias (Agar citrato Simmons, medio SIM, caldo RM-VP,
prueba de Voges-Proskauer (VP), prueba de rojo de metilo (RM), caldo
malonato, caldo manitol).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medios de preenriquecimiento (agua peptonada tamponada, caldo lactosado,
caldo de enriquecimiento, caldo selenito-cistina, caldo tetrationato, Vassiliadis-
Rappaport, caldo de soya tripticasa, leche descremada reconstituida, caldo de
soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio), medios de aislamiento
(Agar verde brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar xilosa lisina
desoxicolato (XLD), agar para Salmonella y Shigella (SS), agar entrico
Hektoen), medios para pruebas bioqumicas (Agar de tres azcares y hierro
(TSI), agar de hierro y lisina (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para sulfuro,
indol y movilidad), agar citrato de Simmons, caldo manitol, caldo malonato,
caldo urea, caldo de urea rpido, caldo infusin cerebro corazn), soluciones
(Disolucin verde brillante al 0.1 %, disolucin de yodo-yoduro, disolucin
salina al 0.85 %, disolucin salina formalizada, reactivo de Kovac, disolucin de
alfa-naftol al 5 %, disolucin de rojo de metilo, disolucin de hidrxido de
potasio al 40 %, disolucin de gelatinasa al 5 %, antisueros.
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora, microscopio, tubos, cajas Petri,
pipetas, varillas de vidrio.
Preparacin de
la muestra:
Procedimiento general para la preparacin de muestras: pesar aspticamente 25 g
de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en
homogeneizador peristltico (stomaquer). Adicionar 225 ml del medio de
preenriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado) y licuar si es necesario
durante un min. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un
recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a
temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6.8 0.2 con
hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Mezclar y cubrir el
recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 h 2 h a 35 C. Este
procedimiento puede variar dependiendo el tipo de muestra.

40

Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia de Salmonella en g o ml de muestra.
Informe de la
prueba:
Informar presencia o ausencia de Salmonella en g o ml de muestra.
Concordancia
con normas
internacionales:
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 6579:2003
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Mtodo horizontal para la deteccin de Salmonella, incluyendo S. typhi y S.
paratyphi. Aplicable a los productos para consumo humano o animal.
Fundamento:
Deteccin de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: preenriquecimiento en
medio lquido no selectivo, enriquecimiento en medio lquido selectivo, siembra
en placa e identificacin, confirmacin de identidad.
Procedimiento:
Preparacin de la muestra. Preenriquecimiento no selectivo. Incubacin a 37 C
por 18 h. Enriquecimiento selectivo. Incubacin a 41.5 C durante 24 h. Siembra
en placa e identificacin. Confirmacin (seleccin de colonias para
confirmacin), confirmacin bioqumica (Agar TSI, agar urea, medio para la
descarboxilacin de la L-lisina, deteccin de la -galactosidasa, medio para la
reaccin de Voges-Proskauer, medio para la reaccin del indol). Interpretacin de
las pruebas bioqumicas. Confirmacin serolgica y serotipado (eliminacin de
las cepas autoaglutinables, comprobacin de los antgenos O, comprobacin de
los antgenos Vi, comprobacin de los antgenos H). Interpretacin de las
reacciones bioqumicas y serolgicas. Confirmacin definitiva.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio de preenriquecimiento no selectivo (agua de peptona tamponada), primer
medio de enriquecimiento selectivo (medio de Rappaport-Vassiliadis con soya),
segundo medio de enriquecimiento selectivo: caldo de Muller - Kauffmann
tetrationato novobiocina), medios slidos selectivos en placa (agar xilosa lisina
desoxicolato, XLD), agar nutritivo, agar triple azcar hierro (TSI), agar urea,
medio para la descarboxilacin de la L-lisina, reactivo para la deteccin de la -
galactosidasa, reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer, reactivos para la
reaccin del indol, agar nutritivo semislido, disolucin salina fisiolgica, sueros.
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, baos de agua, tubos, cajas Petri, pipetas,
varillas de vidrio.
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de producto.

41

Informe de la
prueba:
Deber especificar: mtodo de toma de muestra empleado, cualquier desviacin
en el medio de enriquecimiento empleado o en las condiciones de incubacin,
todos los detalles operativos no especificados en esta norma internacional junto
con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber afectado a los
resultados, resultados obtenidos.
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 6579:2002.
Cepas de
referencia :
No especifica.

Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Preparacin de la muestra, aislamiento de cepas con medios selectivos,
identificacin de cepas con pruebas bioqumicas y serolgicas.
Procedimiento:
1. Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente la dilucin con muestra,
inocular en medio selectivo RV, TT o SC por 24 h a 35 C , 42 C o 43 C
dependiendo de la muestra. A partir del inculo anterior, sembrar en agar BS,
XLD y HE e incubar 24 h 2 h a 35 C. Examinar morfologa tpica y atpica.
Inocular colonias presuntivas en agar selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h 2 h
a 35 C. A los cultivos que viren alcalino el medio, ensayar las pruebas
bioqumicas. 2. Identificacin de Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular
en agar MacConkey, agar HE, o agar XLD, incubar las cajas durante (24 2) h a
35 C. Cultivos puros (prueba de ureasa convencional o rpida). Prueba
serolgica olivalente flagelar. Prueba serolgica Spicer-Edwards. Prueba para
muestras ureasa negativa (caldo lisina decarboxilasa, caldo fenol rojo dulcitol o
caldo base prpura con 0.5 % dulcitol. Caldo triptona (caldo cianida de potasio,
caldo malonato, prueba de indol, prueba serolgica flagelar (H) para Salmonella).
Prueba serolgica somtica (O) para Salmonella (prueba somtica polivalente O,
prueba de grupo somtica O). Pruebas bioqumicas adicionales caldo lactosa rojo
fenol lactosa o caldo prpura lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa o caldo prpura
sacarosa, caldo MR-VP. Agar citrato de Simons. Clasificacin de cultivos.
Identificacin genrica presuntiva de Salmonella (kits de pruebas bioqumicas
miniaturizadas). Tratamiento de cultivos negativos a la prueba flagelar (H).
Envo de cultivos para serotipificacin a las oficinas de la FDA.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada (reconstituida) (M111), caldo
selenito cistina (SC) (M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio Rappaport-
Vassiliadis (RV) (M132). NOTA: Medio RV debe ser preparado de ingredientes
individuales. Formulaciones comerciales no son aceptables, agar xilosa lisina
desoxicolato (XLD) (M179), agar Hektoen enterico (HE) (M61), agar sulfato de
bismuto (BS) (M19), agar triple azcar hierro (TSI) (M149), caldo triptona
(triptofano) (M164), caldo tripticasa de soya (M154), caldo tripticasa de soya con
sulfato de hierro (M186), caldo tripticasa triptosa de soya (M160), caldo MR-VP
(M104), agar citrato de Simmons (M138), caldo urea (M171), caldo urea (rpido)
(M172), caldo malonato (M92), agar lisina hierro (LIA) (M89), caldo lisina
decarboxilasa (M87), prueba en medio de movilidad (semislido) (M103), caldo

42

cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol rojo carbohidrato (M121), caldo
prpura carbohidrato (M130), agar MacConkey (M91), caldo nutriente (M114),
caldo infusin cerebro corazn (BHI) (M24), disolucin de papaina 5 % (M56a),
disolucin de celulasa 1 % (M187), agar base triptosa sangre (M166), caldo
universal de preenriquecimiento (M188), caldo universal de preenriquecimiento
(sin citrato amnico de hierro) (M188a), agua peptonada amortiguada (M192),
caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio anhdrido, disolucin de cloro, 200
ppm, conteniendo 0.1 % dodecil sulfato de sodio (R12a), etanol, 70 % (R23),
reactivo de Kovacs (R38), reactivo de prueba Voges-Proskauer (VP) (R89),
cristales de fosfato de creatina, disolucin de hidrxido de potasio, 40 % (R65),
disolucin hidrxido de sodio (R73), cido clorhdrico 1 N (R36), disolucin de
tincin verde brillante, 1 % (R8), disolucin de tincin prpura de bromocresol,
0.2 % (R9), indicador rojo de metilo (R44), agua destilada estril, tergitol
aninico 7 (R78), triton X-100 (R86), disolucin salina fisiolgica, 0.85 % (R63),
disolucin salina fisiolgica formalinizada (R27), antisuero Salmonella (O)
somtico polivalente, antisuero Salmonella (H) flagelar polivalente, antisuero
Salmonella grupo somtico (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G,
H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero Salmonella Spicer-Edwards
flagelar (H).
Aparatos e
instrumentos:
pipetas, varillas de vidrio, pH metro.
Preparacin de
la muestra:
Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de una unidad analtica de 25 g en
relacin 1:9 muestra: caldo. Dependiendo de la composicin, aadir caldo
suficiente para mantener esta relacin 1:9 a menos que se indique lo contrario.
Para las muestras analizadas en una base de peso no exacto, por ejemplo, ancas
de rana, seguir las instrucciones particulares. stas existen para los siguientes
productos: Yema de huevo, clara de huevo secos, huevos enteros secos, leche
lquida (leche descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y suero de leche),
mezclas preparadas en polvo (pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche
maternizada, y alimentacin por va oral o un tubo que contiene huevo. Huevos
en diferentes presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en polvo. Casena.
Harina de soya. Productos que contienen huevo (fideos, rollos de huevo,
macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas preparadas (jamn, huevo, pollo,
atn, pavo), frutas y verduras frescas, congeladas o secas, carnes de frutos secos,
crustceos (camarones, cangrejo, cigalas, langostinos, langosta), y pescado.
Levadura seca (levadura activa e inactiva). Coberturas para helado. Especias.
Revestimiento de dulces y golosinas (incluido el chocolate). Coco. Colorantes de
los alimentos y sustancias alimenticias para colorear. Gelatina. Carnes, sustitutos
de carne, subproductos de la carne, sustancias de origen animal, productos
glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las ancas de rana. Esqueleto o
carcasas de conejo. Goma guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no pasteurizado),
sidra de manzana (pasteurizada y no pasteurizada), jugo de manzana
(pasteurizada). Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para perro. Melones.
Mangos. Tomates. Ensayos ambientales. Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de
mamey. Vegetales de hojas verdes y hierbas (espinaca, lechuga romana, cilantro,
perejil rizado, perejil italiano, culantro, repollo y albahaca).
Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de producto.

43

Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
No especifica.

3.1.5 Deteccin de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus
Vibrio spp. son bacilos Gram negativos que pueden ser rectos, ligeramente curvos, curvos o en
forma de coma de (0.5-0.8) m x (1.4-2.6) m, mviles, anaerobios facultativos capaces de utilizar
metabolismo fermentativo y respiratorio, fermentan la glucosa a cido generalmente sin formacin
de gas y algunas especies producen acetoina y acetil metil carbinol (Imhoff, 2005). Se reconocen 73
diferentes especies del gnero Vibrio, de las cuales 13 se consideran patgenas para los humanos,
tres de las cuales estan asociadas principalmente con enfermedades transmitidas por alimentos:
Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus o Vibrio vulnificus, las cuales generan mayores
repercusiones en la salud pblica y en el comercio de pescados y mariscos (Oliver y Kaper, 1997,
Drake et al., 2007). Algunas especies como V. cholerae y V. parahaemolyticus se asocian con
enfermedades gastrointestinales, mientras que V. vulnificus se relaciona con enfermedades
extraintestinales, como la septicemia (Morris, 2003).
NOM-242-SSA1-2009
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Establecer los requisitos sanitarios para: las reas de captura de moluscos
bivalvos; los establecimientos que procesan productos de la pesca frescos,
refrigerados, congelados y procesados, incluyendo las embarcaciones de pesca y
recoleccin, as como las especificaciones sanitarias que deben cumplir dichos
productos. Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el
territorio nacional para las personas fsicas o morales que se dediquen a la
captura, extraccin, procesamiento, conservacin, almacenamiento, distribucin,
transporte, venta o importacin de productos de la pesca.
Fundamento:
Crecimiento en medio selectivo salino, diferenciacin e identificacin mediante
pruebas bioqumicas y pruebas serolgicas de aglutinacin.
Procedimiento:
Preparacin de la muestra (agua peptonada y diluciones seriadas), siembra en
medio slido selectivo, caracterizacin morfolgica, pruebas bioqumicas
selectivas, identificacin y confirmacin (pruebas bioqumicas previas, tincin de
Gram, pruebas bioqumicas, prueba serolgica de alutinacin).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Agua peptonada alcalina (APW), agar tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa
(TCBS), agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC), agar
T1N1 (Agar triptona y sal), agar gelatina (GA), agar gelatina con sal (GS), caldo
glucosa de Hugh-Leifson, medio base de descarboxilasa (Arginina, lisina y
ornitina), caldo triptona y caldos triptona sal T1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y

44

T1N10, caldo soya tripticasa (TSB), agar soya tripticasa (TSA), agar de hierro
Kligler (KIA), agar arginina glucosa inclinado (AGS), agar triple azcar y hierro
(TSI), agar de hierro y lisina (LIA), caldo rojo de metilo y Vogues Proskauer
(RM-VP), medio para prueba de movilidad (Semislida), prueba de rojo de
metilo, prueba de Vogues-Proskauer, prueba de oxidasa, reactivo de Kovac.
Aparatos e
instrumentos:
Licuadora y vasos de licuadora estriles, frascos de vidrio de boca ancha con tapa
de rosca, varilla de vidrio, balanza granataria y analtica, incubadoras, cucharas
estriles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos,
cajas Petri estriles de plstico, pipetas estriles, azas bacteriolgicas, tubos de
cultivo o de ensayo,tubos para bioqumicas o ensaye, tijeras y pinzas estriles,
lmpara (para observar reacciones serolgicas), mecheros, papel pH,
potencimetro, bolsas de polietileno con tapa resellable, aparato de filtracin y
membranas de 0.45 micras.
Preparacin de
la muestra:
Las submuestras de pescado ahumado en filete deben analizarse individualmente.
1. Incubacin de las muestras a 35 C -37 C. De cada submuestra tomar 25 g,
cortar en piezas pequeas e introducirlas en un vaso de licuadora de 500 ml de
capacidad que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina (APW) y
homogeneizar por 2 min a la mxima velocidad. Esta es la dilucin 1:10. De esta
dilucin preparar la dilucin 1:100 y 1:1000, en 9 o 90 ml de agua peptonada
alcalina. Incubar las tres diluciones de 35 C a 37 C. 2. Incubacin de las
muestras de 35 C -37 C y 42 C. Si se van a incubar los enriquecimientos a dos
temperaturas para una muestra, homogeneizar una porcin de 50 g de cada
submuestra en 450 ml de agua peptonada alcalina (APW). Esto hace la dilucin
1:10. Verter 250 ml (g) de la dilucin 1:10 a un segundo recipiente estril.
Prepare dos series de diluciones de 1:100 y 1:1000. Por lo tanto tenemos dos
series de 3 diluciones.
Incubar una serie de 35 C a 37 C y la otra a 42 C. Proseguir con el paso de
resiembra marcado en la NOM-031-SSA1-1993.
Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia en la porcin de la muestra en gramos o mililitros
Informe de la
prueba:
No especifica
Concordancia
con normas
internacionales:
Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice V. Anteproyecto de cdigo
internacional recomendado de prcticas para el pescado y los productos
pesqueros, Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice III. Anteproyecto
de enmienda a la norma de sardinas y productos anlogos en conserva, Codex
Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice VI. Anteproyecto de norma para el
arenque del atlntico salado y el espadn salado, Codex Alimentarius. ALINORM
95/18. Apndice VII. Proyecto de norma revisada para barritas, porciones y
filetes de pescado empanados o rebozados congelados rpidamente, Codex
Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice IX. Proyecto de norma revisada para
la carne de cangrejo en conserva, Codex Alimentarius. ALINORM 95/18.
Apndice X. Proyecto de norma revisada para pescados en conserva, Codex
Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XI. Proyecto de norma revisada para
el salmn en conserva, Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XII.
Proyecto de norma revisada para las sardinas y productos anlogos en conserva,
Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XIII. Proyecto de norma
revisada para los camarones en conserva, Codex Alimentarius. ALINORM

45

95/18. Apndice XIV. Proyecto de norma revisada para el atn y el bonito en
conserva., Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XV. Proyecto de
norma revisada para pescado salado y pescado seco salado de la familia Gadidae.
Cepas de
referencia :
No especifica

ISO/TS 21872-1:2007
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Dirigida a detectar cepas patgenes de V. parahaemolyticus y V. cholerae.
Productos para consumo humano y alimentacin animal, muestras ambientales en
el rea de manejo y produccin de alimentos.
Fundamento:
Crecimiento en dos medios lquidos de enriquecimiento y selectivos, aislamiento
e identificacin en placas de agar selectivo, confirmacin con pruebas
bioqumicas.
Procedimiento:
Porcin de prueba y suspensin inicial con medio de enriquecimiento, primer
medio selectivo de enriqueciomiento e incubar 37 C o 41.5 C por 6 h, segundo
medio selectivo de enriquecimiento e incubar a 41.5 C por 18 h, aislamiento en
medio slido selectivo 37 C por 24 h, identificacin presuntiva por kits
comerciales que usen medios selectivos similares a los descritos en la norma,
pruebas de oxidasa, observacin microscpica, pruebas bioqumicas para
seleccin, confirmacin por puebas bioqumicas.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio de enriquecimiento: Agua peptonada salina alcalina (ASPW), agar
sacarosa, tiosulfato, citrato y billis (TCBS), opcional: Agar soya peptona trifenil
cloro de tetrazolio (TSAT), agar nutriente salino (SNA), reactivo para deteccin
de oxidasa, agar triple azcar salino hierro (TSI), medio salino para la deteccin
de ornitina descarboxilasa (ODC), medio salino para deteccin de lisina
descarboxilasa (LDC), medio salino para deteccin de arginina dihidrolasa
(ADH), reactivo para deteccin de -galactosidasa, medio salino para deteccin
de indol, agua peptonada salina, disolucin de cloruro de sodio.
Aparatos e
instrumentos:
Hornos, autoclaves, incubadoras, baos de agua, material de vidrio bsico.
Preparacin de
la muestra:
Preparar la muestra de acuerdo a la parte correspondiente de ISO 6887 y/o ISO
8261 y cualquier estndar internacional concerniente al producto examinado.
Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia de Vibrio spp. potencialmente enteropatognico en una
porcin en gramos o mililitros del producto especificando el nombre de las
especies relevantes.
Informe de la
prueba:
Identificacin de la muestra, el mtodo de muestreo utilizado, caulquier
desviacin respecto a las condiciones del medio de enriquecimiento o las
condiciones de incubacin, todos los detalles operacionales no especificados u
opcionales en el estndar internacional ISO/TS 21872 junto con aquellos
incidentes que pudieron haber infludo en el resultado de la prueba, los resultados
obtenidos y en particular si fue confirmada la patogenicidad de la+AC14s cepas
aisladas.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica
Cepas de No especifica

46

referencia :

BS 5763: Part 14: 1991
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Productos para consumo humano y animal. Vibrio parahaemolyticus.
Fundamento:
Enriquecimiento en medio selectivo lquido incubacin a 35 C o 37 C durante 7
h u 8 h ; inoculacin en medio selectivo en placa a 35 C o 37 C durante 18 h,
24 h a 48 h; pruebas confirmatorias bioqumicas.
Procedimiento:
Dilucin, enriquecimiento, platos selectivos e identificacin, prueba
confirmatoria.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Medio enriquecimiento caldo sal-polimixina B, agua peptonada salina alcalina,
medio de cultivo salino de glucosa con dodecil sulfato de sodio. Medio de
plaqueo: Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa bilis (TCBS); agar cloruro de
trifeniltetrazolio triptona de soya (TSAT); agar nutriente salino. Medio de
indentificacin: Agar salino triple azcar hierro; agar salino carne levadura;
medio salino para deteccin de lisina descarboxilasa; medio y reactivos para
deteccin de indol (Medio salino triptona triptofano, reactivo de Kovacs);
reactivo para detectar oxidasa; reactivo para deteccin de -galactosidasa
(disolucin ONPG, disolucin tampn, reactivo completo); disolucin de cloruro
de sodio; polvo de zinc.
Aparatos e
instrumentos:
pipetas, varillas de vidrio.
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Presencia o ausencia x gramo o por mL.
Informe de la
prueba:
Concordancia
con normas
internacionales:
ISO 8914-1990.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BAM Chapter 9. V. cholerae
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas bioqumicas, kit de diagnstico
rpido API 20E, identificacin por medio de sondas de ADN, identificacin por

47

medio de PCR.
Procedimiento:
Enriquecimiento y siembra, deteccin y confirmacin, pruebas bioqumicas,
diferenciacin de biotipos el Tor y clsico, determinacin de enterotoxigenicidad,
deteccin genotpica del gen de la toxina del clera mediante la reaccin en
cadena de la polimerasa.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), Medio AKI (M7), placas de arginina
glucosa (AGS) (M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de levadura
casaminocidos (CAYE) (M34), agar modificado celobiosa polimixina colistina
(mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189), medio de prueba de
movilidad-1 % NaCl (M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-p-
fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90),
tampn salino de fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50 U Difco o
equivalente) (R64), disolucin salina 0.85 % en dH
2
O (R63), disolucin NaCl al
2 % (R71), desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH
2
O (R91), agar tiosulfato citrato
sales biliares sacarosa (TCBS) (M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o
3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10
(M161), agar tripti soya sulfato de magnesio 3 % NaCl (TSAMS) (32), caldo y
agar tripticasa de soya (TSB) (TSA) (M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24
% glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %)
(R71), anti suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de deteccin de
enterotoxina VET-RPLA TD920A (Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio
parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio vulnificus (VVA) (M190),
reactivos y tiras reactivas de diagnstico API 20E (BioMerieux).
Aparatos e
instrumentos:
asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitacin, filtros,
membranas de nylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones
extraccin de protenas y cidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos para
inmunuensayos.
Preparacin de
la muestra:
La muestra debe ser enfriada inmediatamente despus de ser colectada (alrededor
de 7 C a 10 C), las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible.
Se debe evitar el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y
la recuperacin de los vibrios. Los vibrios pueden ser daados por el
enfriamiento rpido, pero crecen rpidamente en productos del mar a temperatura
ambiente. De ser necesario, se recomienda congelar las muestras a una
temperatura de -80 C.
Expresin de
resultados:
Resultado positivo o negativo.
Informe de la
prueba:
El informe final para V. cholerae debe incluir la identificacin bioqumica y
serolgica de la cepa y los resultados enterotoxicidad.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
No especifica.


48

BAM Chapter 9. V. parahaemolycus
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Fundamento:
medio de PCR.
Procedimiento:
1. Enriquecimiento, aislamiento y enumeracin, 2. Deteccin y confirmacin
(identificacin bioqumica de los aislados, procedimiento de cuenta por filtracin
en membrana hidrofbica (HGMF), tipificacin serolgica), 3. Determinacin de
patogenicidad (deteccin genotpica de los genes de hemolisina de V.
parahaemolyticus).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio AKI (M7), placas de arginina
fenilenediamina-HCl en dH
2
O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90),
2
2
% glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %)
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones
de extraccin de protenas y cidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos
para inmunoensayos.
Preparacin de
la muestra:
Expresin de
resultados:
Informe de la
prueba:
No especifica.

49

Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BAM Chapter 9. V. vulnificus
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Productos para consumo humano de origen marino.
Fundamento:
medio de PCR.
Procedimiento:
Mtodo de identificacin y recuento: 1. Enriquecimiento, aislamiento y cuenta, 2.
Identificacin bioqumica de los aislados, 3. Identificacin del gen especfico de
especies especficas del gen citolisina vvhA por medio de sonda de ADN, 4.
Recuento de V. vulnificus por sondas de ADN, 5. Confirmacin de V. vulnificus
por reaccin en cadena de polimerasa.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio AKI (M7), placas de arginina
fenilenediamina-HCl en dH
2
O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90),
2
2
% glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2%)
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones
para extraccin de protenas y cidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos
para inmunoensayos.
Preparacin de
la muestra:

50

Expresin de
resultados:
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
No especifica.


51

3.2 COLECCIN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
NOM-109-SSA1-1994
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Establece los procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de
alimentos para su anlisis microbiolgico.
Fundamento: No especifca.
Procedimiento:
Obtencin (La toma de muestra de productos envasados con presentacin
comercial para venta al menudeo se llevar a cabo en forma aleatoria y no
asptica, tomndose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus anlisis.
Tratndose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir stos
y extraer la muestra en condiciones aspticas Los alimentos expuestos al aire
libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente
aspticas. En el caso de alimentos lquidos o semilquidos se deber agitar o
mezclar hasta conseguir homogeneizar y despus efectuar la toma de la muestra
en diferentes niveles). Identificacin de la muestra. Conservacin y transporte (El
manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se
impida su ruptura, alteracin o contaminacin, evitando su exposicin a la luz
solar directa). Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no est
permitido el empleo de sustancias qumicas.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Etanol o isopropanol al 70 %, agua clorada, tiosulfato de sodio.
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Autoclave, horno, licuadora, tubos, pipetas, varillas de vidrio, frascos, material
para toma de muestra.
Preparacin de
la muestra:
Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo
y transporte de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento,
debe estar limpio, estril y libre de sustancias que pudieran afectar la viabilidad
de los microorganismos. El material que se utilice para la toma de muestra debe
ser esterilizado. Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar
contaminacin posterior. De ser necesario, si se requiere mayor nmero de
utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparlos con etanol o
isopropanol al 70 %, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes
estriles para evitar su contaminacin o inmediatamente utilizarlos.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
Cepas de
referencia :
No especifica.


52

BAM Captulo 1. Muestreo de alimentos y preparacin de la muestra homogeneizada
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Procedimiento para el muestreo de alimentos y preparacin de una muestra
homogeneizada.
Fundamento:
La adecuacin y estado de la muestra o espcimen recibido para su evaluacin
son de importancia primordial. Si las muestras no son colectadas o manipuladas
adecuadamente o no son representativas del lote objeto de muestreo, los
resultados de laboratorio no tendr ningn sentido. Una muestra representativa es
esencial cuando los patgenos o toxinas estn escasamente distribuidos dentro de
la comida o cuando la eliminacin de un cargamento de alimentos depende del
contenido bacteriano demostrado, en base con una norma jurdica.
Procedimiento:
Recepcin de muestras. 1. La muestra oficial de los alimentos es recolectada por
el inspector de la FDA o el investigador. El analista debe tener en cuenta su
condicin fsica general. Si la muestra no puede ser analizada inmediatamente,
debe ser almacenada como se describe ms adelante. 2. Condiciones del
recipiente de muestreo. Revise de graves defectos fsicos a los contenedores de
muestras, de fugas, agujeros, marcas de pinchazos, fracturas, tapas sueltas.
Cualquier contaminacin cruzada como resultado de uno o ms de los defectos
anteriores invalidara la muestra. 3. Etiquetado y registros. Asegrese de que
cada muestra se acompaa de una copia completa del informe de la colecta
(Formulario FD-464), que se encuentra sellado con la cinta oficial (FD-415a),
que lleva el nmero de la muestra, el nombre del oficial que tom la muestra y la
fecha. Asigne a cada unidad de muestra un nmero de unidad individual y
analizar como una unidad discreta a menos que la muestra sea compuesta como
se describi anteriormente en este captulo. 4. La adherencia al plan de muestreo.
La mayora de los alimentos se recogen con un plan de muestreo diseado
especficamente. Los alimentos que se examinaron para Salmonella se muestrean
de acuerdo con un plan de muestreo con base estadstica diseada exclusivamente
para su uso con este patgeno. Dependiendo de la comida y el tipo de anlisis a
realizar, determinar si se han tomado muestras del alimento de acuerdo con el
plan de muestreo adecuado. 5. Almacenamiento. Examinar las muestras
inmediatamente despus de recibirla. Si el anlisis debe ser pospuesto, almacenar
las muestras congeladas a -20 C hasta su anlisis. Refrigerar las muestras
perecederas descongeladas a 0 C -4 C por no ms de 36 h. Los productos no
perecederos, alimentos enlatados o de baja humedad, sern almacenados a
temperatura ambiente hasta su anlisis. 6. Notificacin al departamento de toma
de muestra. Si una muestra no cumple con los criterios anteriores y por tanto no
se analiz, notificar al departamento de toma de muestra para que una muestra
vlida pueda obtenerse. C. Descongelacin. Manipule aspticamente el producto.
Antes de la manipulacin o el anlisis de la muestra, limpiar las reas de trabajo
y sus alrededores con una torunda impregnada con agente germicida comercial.
Preferentemente, no descongelar las muestras congeladas antes del anlisis. Si es
necesario templar una muestra congelada para obtener una porcin analtica,
descongelarlo en el envase original o en el recipiente en el que fue recibido en el
laboratorio. Evite la transferencia de la muestra a un segundo recipiente para la
descongelacin. Normalmente, una muestra puede ser descongelada a (2 5) C
durante 18 horas. Si se desea una descongelacin rpida, descongelar la muestra
a menos de 45 C durante no ms de 15 min. Cuando se descongele una muestra
a temperatura elevada, agitar continuamente la muestra en un bao de agua

53

controlado termostticamente. D. Mezclado. Agitar fuertemente las muestras
lquidas y mezclar las muestras secas con cucharas u otros utensilios
esterilizados, antes de tomar la unidad de anlisis de la muestra de 100 g o ms.
Utilice una unidad de anlisis de 50 g de lquido o alimento seco para determinar
el recuento en placa de bacterias aerbicas y el nmero ms probable de
coliformes. Pueden ser recomendados otros tamaos de las unidades de anlisis
(por ejemplo, 25 g de Salmonella), en funcin de un anlisis especfico a realizar.
Use el tamao de la unidad de anlisis y el volumen de diluyente recomendado
para el mtodo que se utiliza. Si el contenido del paquete no es homogneo (por
ejemplo, una comida congelada), macerar todo el contenido del paquete y retirar
la unidad de anlisis, o analizar cada porcin de comida diferente por separado,
dependiendo del propsito de la prueba. E. Pesado. Tarar el vaso de la licuadora,
luego aspticamente y con precisin ( 0.1 g) pesar los alimentos sin descongelar
(si est congelado) en el vaso. Si la muestra entera pesa menos de la cantidad
requerida, pesar la porcin equivalente a la mitad de la muestra y ajustar la
cantidad de diluyente o caldo. El volumen total en la licuadora debe cubrir
completamente las cuchillas. F. La mezcla y dilucin de las muestras que
requieren recuento de microorganismos. 1. Todos los alimentos que no sean
nueces enteras o comida con nueces. Aadir 450 ml de agua diluyente Butterfield
amortiguador de fosfato al vaso de la licuadora que contiene 50 g de unidad
analtica y mezclar durante 2 min, resultando una dilucin de 10
-1
. Sin demorar
hacer diluciones del homogeneizado original. Usar las capacidades adecuadas de
las pipetas. Preparar todas las diluciones decimales con 90 ml de diluyente estril
ms 10 ml de dilucin previa, a menos que se especifique lo contrario. Agitar
enrgicamente todas las diluciones 25 veces en forma de un arco de 30 cm (1 pie)
en 7 s. No deber transcurrir ms de 15 min entre la mezcla de la muestra y la
preparacin de todas las diluciones. 2. Nueces en mitad y pedazos ms grandes.
Aspticamente pesar una unidad analtica de 50 g en un frasco estril con tapn
de rosca. Aadir 50 ml de diluyente (G-1, arriba) y agitar vigorosamente 50 veces
en forma de arco de 30 cm para obtener una dilucin 100. Dejar reposar de 3 min
a 5 min y agitar 5 veces en forma de arco de 30 cm para volver a suspender justo
antes de hacer las diluciones seriadas y las inoculaciones. Comida con nueces.
Aspticamente pesar una unidad analtica de 10 g un un frasco estril con tapn
de rosca. Aadir 90 ml de diluyente (Gl, arriba) y agitar vigorosamente 50 veces
en forma de arco de 30 cm para obtener una dilucin 100. Dejar reposar de 3 min
a 5 min y agitar 5 veces en forma de arco de 30 cm para volver a suspender justo
antes de hacer las diluciones seriadas y las inoculaciones.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Hielo, agua diluyente Butterfield amortiguador de fosfatos (Rll).
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Licuadora mecnica con frasco de vidrio o metal esterilizable con tapa, balanza
de 2 000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g, vasos estriles, pipetas graduadas,
botellas, cuchillos, tenedores, esptulas, pinzas, tijeras, cucharas, abate lengua,
cinta adhesiva, horno, autoclave, recipientes limpios, secos, a prueba de fugas,
de boca ancha, estriles y de un tamao adecuado para las muestras del producto,
contenedores, tales como frascos de plstico o latas de metal pueden ser cerrados
hermticamente, cajas estriles de metal, latas, bolsas o paquetes con cierres
adecuados, bolsas de plstico estriles (para materiales secos, sin congelar
solamente) o botellas de plstico, cinta adhesiva.

54

Preparacin de
la muestra:
Planes de muestreo. 1. Especies de Salmonella; a) Colecta de la muestra, la
asignacin a una categora de muestreo de los alimentos depende de 1) la
sensibilidad del grupo de consumidores (por ejemplo, los ancianos, los enfermos
y los nios), 2) la posibilidad de que los alimentos pueden haber sufrido un paso
que pueda ser letal para Salmonella durante el proceso de manufactura o en el
hogar, y 3) la historia de la comida. Clasificacin de los alimentos I. - Los
alimentos que normalmente no seran sometidos a un proceso letal para
Salmonella entre el momento de la extraccin y el consumo y que estn
destinados para el consumo de los ancianos, los enfermos y los nios.
Clasificacin de los alimentos II. - Los alimentos que normalmente no seran
sometidos a un proceso letal para Salmonella entre el momento de la extraccin y
el consumo. Clasificacin de los alimentos III. - Alimentos que normalmente se
someten a un proceso letal para Salmonella entre el tiempo de muestreo y el
consumo. Una unidad de muestra se compone de un mnimo de 100 g y es
generalmente un recipiente del tamao de la porcin de consumo. Tome las
unidades de muestreo al azar para asegurar una muestra representativa del lote.
Cuando se utilizan envases para la muestra, deber presentar un control que
consiste en un recipiente con la muestra vaca que ser expuesta a las mismas
condiciones que aquellas en que se recolect la muestra. Tomar ms de una
unidad de muestra de los recipientes a granel de mayor tamao o cuando el
nmero de unidades de muestra requeridas excede el nmero de contenedores en
el lote. Una unidad de muestra consistir en ms de un contenedor cuando los
envases son ms pequeos que 100 g (por ejemplo, cuatro recipientes de 25 g
podra constituir una unidad de muestra). El nmero de unidades de muestra que
han de recogerse en cada categora de alimentos son los siguientes: Clasificacin
de los alimentos I, 60 unidades de la muestra; alimentos categora II, 30 unidades
de la muestra; alimentos categora III, 15 unidades de la muestra. Enviar todas las
muestras recogidas al laboratorio para su anlisis. Avisar al laboratorio antes del
envo de muestras perecederas. b) Anlisis de la muestra, tomar una unidad al
azar de 25 g de cada unidad de muestra de 100 g para su anlisis. Cuando una
unidad de muestra conste de ms de un contenedor, mezclar aspticamente los
contenidos de cada recipiente antes de tomar los 25 g de unidad analtica. Para
reducir la carga de trabajo analtico, las unidades de anlisis pueden ser
compuestas. El tamao mximo de una unidad compuesta es de 375 g 15
unidades de anlisis. El nmero mnimo de unidades compuestas para ser
analizadas para cada categora de alimentos es el siguiente: Clasificacin de los
alimentos I, 4 unidades compuestas; alimentos categora II, 2 unidades
compuestas; alimentos categora III, una unidad compuesta. Para cada muestra
compuesta de 375 g, la cantidad total de 375 g se analiz para Salmonella.
Conservar el resto de la unidad de muestra en un recipiente estril. El lote objeto
de muestreo es aceptable slo si todas las unidades de anlisis son negativas para
Salmonella. Si una o ms unidades de compuestos son positivos para Salmonella,
el lote es rechazado, siempre que el control analtico sea negativo para
Salmonella. Un lote no se vuelve a muestrear a menos que el control ambiental
para Salmonella sea positivo. Para todas las muestras positivas a Salmonella,
determinar el grupo somtico. c) Importaciones. Estos planes se aplican a los
productos alimenticios importados destinados al consumo humano. d)
Clasificacin de los productos alimentarios para la obtencin de muestras. Los
alimentos que se hayan clasificado en las 3 categoras descritas anteriormente
para la toma de muestras se enumeran en las categoras de acuerdo a la

55

nomenclatura y cdigo de producto de la industria. Clasificacin de los alimentos
I. - Los alimentos que normalmente no seran sometidos a un proceso letal para
Salmonella entre el momento de la extraccin y consumo, y estn destinados para
el consumo de los ancianos, los enfermos y los nios. Clasificacin de los
alimentos II. - Los alimentos que normalmente no seran sometidos a un proceso
letal para Salmonella entre el momento de la extraccin y el consumo. Alimentos
categora III: Los alimentos que normalmente se someten a un proceso letal para
Salmonella entre el momento de la toma de muestras y el consumo. 2. Mesfilos
aerobios, coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli (incluyendo
cepas enteropatgenas), Staphylococcus spp., Vibrio spp, Shigella spp.,
Campylobacter spp, Yersinia spp, Bacillus cereus y Clostridium perfringens. a)
Toma de muestras, de cualquier lote de alimentos, recoger diez submuestras de 8
onzas (o los paquetes de menudeo) al azar. No romper o cortar grandes paquetes
de menudeo para obtener una submuestra de 8-oz. Recoger la unidad intacta de
menudeo como la sub-muestra, incluso si es mayor de 8 oz. b) Anlisis de las
muestras. Analizar las muestras como se indica en los programas actuales.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
No especifica.
Cepas de
referencia :
No especifica.

BS 5763: Part 0: 1986
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Esta norma internacional provee las instrucciones generales para llevar a a cabo
exmenes microbiolgicos de acuerdo a estndares especficos. Adems ayuda a
asegurar la validez de los exmenes llevados a cabo, a que las tcnicas generales
usadas sean las mismas en todos los laboratorios y que contribuyan a la
proteccin de la salud del personal involucrado.
Fundamento:
Buenas prcticas de laboratorio. Sugerencias para el correcto procesamiento y
manipulacin de la muestra. Buen uso del material y equipo de laboratorio.
Procedimiento:
1. Muestreo. Llevar a acabo el muestreo de acuerdo a las apropiadas normas
internacionales especficas. Mantener el producto a muestrear bajo condiciones
que eviten cualquier cambio en el nmero de microorganismos presentes. 2.
Porcin a examinar, suspensin y dilucin inicial. Cuidar la contaminacin
cruzada y ambiental en la toma de las muestras. Para las diluciones seguir ISO
6887.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Etanol 70 % (v/v).
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Baos de agua, balanza de 2 000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g, vasos
estriles, pipetas graduadas, botellas, cuchillos, tenedores, esptulas, pinzas,
tijeras, cucharas, abate lengua, cinta adhesiva, horno, autoclave, recipientes

56

limpios, secos, a prueba de fugas, de boca ancha, estriles y de un tamao
adecuado para las muestras del producto, contenedores, tales como frascos de
plstico o latas de metal, pueden ser cerrados hermticamente, cajas estriles de
metal, latas, bolsas o paquetes con cierres adecuados, bolsas de plstico estriles
(para materiales secos, sin congelar solamente) o botellas de plstico, cinta
adhesiva.
Preparacin de
la muestra:
Etiquetar las muestras, contenedores, bolsas plsticas, botellas, tubos, cajas de
Petri, etc. para su fcil identificacin. Manipular las muestras bajo las siguientes
recomendacions: a) Productos empacados, limpiar el exterior del empaque en el
lugar donde ser abierto con etanol 70 % (v/v). Flamear de ser posible. b)
Cualquier instrumento usado para abrir el empaque deber estar estril.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
Esta norma es tcnicamente equivalente a la norma ISO 7218-1985. Tambin
hace referencia a la norma internacional ISO 6887.
Cepas de
referencia :
No especifica.


57

3.3 PREPARACIN DE DILUCIONES USANDO MEDIOS GRAVIMTRICOS
NOM-110-SSA1-1994
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Procedimiento para la preparacin de diluciones para el anlisis microbiolgico
de productos alimenticios.
Fundamento:
Se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una distribucin
lo ms uniforme posible de los microorganismos presentes en la porcin de la
muestra.
Procedimiento:
Preparacin de las diluciones decimales adicionales. El criterio para seleccionar
las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos esperado
es: Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos: donde sea posible
demostrar el microorganismo en 10 ml de la dilucin ms alta. Para la tcnica de
cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 colonias a
250 colonias, en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de
bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el
nmero especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.
Las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del
anlisis y stas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los
20 minutos posteriores a su preparacin.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Disolucin de hidrxido de sodio 1.0 N, soluciones diluyentes (Disolucin
reguladora de fosfatos, agua peptonada).
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Licuadora, tubos, pipetas, varillas de vidrio, frascos.
Preparacin de
la muestra:
Preparacin de la dilucin primaria (A partir de muestras lquidas: Agitar la
muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9
ml del diluyente, el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. A partir de muestras slidas o
semislidas: Pesar una cantidad de 10 g u 11 g de la muestra, adicionar un
volumen de 90 ml a 99 ml del diluyente, licuar y homogenizar, permitir que las
partculas grandes se sedimenten y transferir la cantidad deseada tomando de las
capas superiores de la suspensin).
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
Esta norma es tcnicamente equivalente a la norma ISO 6887-1983.
Cepas de
referencia :
No especifica.


58

-EN ISO 6887-1:2000
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Define las reglas generales para la preparacin en condiciones aerbicas de la
suspensin inicial y de las diluciones decimales para los anlisis microbiolgicos
de los productos destinados al consumo humano o a la alimentacin animal.
Fundamento:
Preparacin de la suspensin inicial de manera que se obtenga una distribucin,
tan homognea como sea posible, de los microorganismos presentes en la
fraccin de ensayo. Preparacin de diluciones decimales destinadas a reducir el
nmero de microorganismos por unidad de volumen que permita, tras la
incubacin, la observacin de su crecimiento o la falta de l o el recuento de
colonias, segn se establece en cada norma especfica.
Procedimiento:
Dilucin base (pesar en un recipiente estril o en una bolsa de plstico estril una
masa o medir un volumen que sean representativos de la muestra de ensayo.
Aadir una cantidad de disolvente igual, esta cantidad se determinar
preferiblemente en relacin a la masa con una precisin del 5 %, o en relacin
al volumen, con una precisin del 5 %. Homogeneizar la mezcla de acuerdo
con las recomendaciones de la norma ISO 7218. Dejar sedimentar las partculas
grandes, durante un tiempo de hasta 15 min. Diluciones decimales sucesivas
(introducir, utilizando una pipeta de 1 ml de la suspensin inicial en un tubo que
contenga 9 ml de disolvente estril a la temperatura adecuada, mezclar, si es
necesario repetir estas operaciones utilizando la dilucin de 10
-2
y las diluciones
sucesivas utilizando una pipeta estril nueva en cada paso de dilucin). Duracin
del proceso (el tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de la
suspensin inicial y el instante en el que el inculo entra en contacto con el
medio de cultivo no deber ser superior a los 45 min).
Reactivos y
medios de
cultivo:
Disolventes (disolucin salina de peptona, disolucin tamponada de peptona).
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Autoclave, horno, agitador magntico, pHmetro, tubos, pipetas, varillas de vidrio,
frascos.
Preparacin de
la muestra:
Consltese la norma especfica correspondiente al producto en estudio. Si no
existe una norma especfica, se recomienda que las partes interesadas adopten un
acuerdo sobre este punto.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
Esta norma es la versin oficial, en espaol, de la norma europea EN ISO 6887-1
de febrero 1999, que a su vez adopta ntegramente la norma internacional ISO
6887-1:1999.
Cepas de
referencia :
No especifica.


59

UNE-EN ISO 6887-2:2004
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Especifica las reglas para la preparacin de muestras de carne y productos
crnicos y sus suspensiones para su examen microbiolgico, cuando estas
muestras necesiten una preparacin diferente a la del mtodo descrito en la
norma ISO 6887-1. La norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la
preparacin de la suspensin inicial y las diluciones decimales para el examen
microbiolgico. Esta parte de la norma ISO 6887 es aplicable a las siguientes
carnes frescas, crudas y elaboradas y a las carnes de ave y sus productos:
refrigerados o congelados; curados o fermentados; picados o triturados;
productos de charcutera; comidas precocinadas o comidas a base de ave; carnes
deshidratadas y ahumadas con diversos grados de deshidratacin; extractos de
carne concentrados.
Fundamento:
Se prepara una suspensin inicial para obtener una distribucin tan uniforme
como sea posible de los microorganismos contenidos en la muestra para anlisis.
Se prepara de la misma forma una suspensin de pre-enriquecimiento o de
enriquecimiento, empleando el medio recomendado por el mtodo de anlisis
concerniente. Se preparan diluciones decimales, si fuera necesario, para reducir el
nmero de microorganismos por unidad de volumen y permitir, despus de la
incubacin, la observacin de cualquier crecimiento (en el caso de medios
lquidos) o colonias (en el caso de placas de agar), como se establece en cada
norma especfica.
Procedimiento:
Tipos de muestras a enviar al laboratorio: La carne y los productos crnicos son
de los siguientes tipos: unidades de carne o productos crnicos, preparados o
elaborados y de dimensiones diversas; cortes de carne tomados de unidades con
una masa inferior a 2 kg; cortes de muestras de carne tomados de canales o cortes
de carne con una masa superior a 2 kg. El estado fsico de las muestras recibidas
pueden variar segn los siguientes factores: la temperatura (refrigerados,
congelados o ultracongelados), actividad de agua (aw) (no tratados, productos
crnicos parcialmente deshidratados cuya reduccin en el contenido de agua
inhibe la multiplicacin microbiana). Alimentos con alto contenido en materia
grasa (ms del 20 % de materia grasa de la masa total), el empleo de un diluyente
con un contenido entre 1 g/L y 10 g/L de monooleato de sorbitol aadido (Tween
80) puede mejorar la emulsificacin durante la suspensin. Propsito del anlisis:
el anlisis microbiolgico puede tener por objeto la deteccin o el recuento de la
flora microbiana profunda, la flora microbiana superficial, la flora microbiana
superficial y profunda (total). La preparacin de la muestra para anlisis debe
tener en cuenta la finalidad del anlisis y la naturaleza de la muestra.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Diluyentes para uso general (Disolucin salina de peptona, agua de peptona
tamponada). Diluyentes para casos especiales (Disolucin salina de peptona con
prpura de bromocresol).
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Bandeja estril, tijeras estriles, picadora mecnica de carne, equipo de
cauterizacin de superficie de carnes, plantilla para muestreo de superficie,
equipo para recoger una muestra congelada por el laboratorio (Taladro elctrico
de velocidad variable, broca para madera estril para taladro elctrico, martillo o
mazo de plstico).
Preparacin de
la muestra:
Productos congelados (Los productos que se almacenan congelados se deberan
llevar a una consistencia que permita el muestreo; es decir almacenndolos entre
18 C y 27 C durante 3 h como mximo, 2 C 2 C durante 24 h como
mximo. Las muestras deberan ser analizadas lo ms rpidamente posible tras

60

esto. Si el producto est an congelado en el momento de su corte, se puede
utilizar diluyente a temperatura del laboratorio para facilitar la descongelacin.
Productos duros y desecados (no hay que homogeneizar en un homogeneizador
rotatorio durante ms de 2.5 min seguidos). Para los productos secos y duros o
heterogneos, puede ser necesario picar o moler la muestra de laboratorio no ms
de 1 min. Productos lquidos y no viscosos (la muestra para anlisis debera
tomarse despus de haber agitado con la mano o por medios mecnicos para
asegurarse que los microorganismos estn distribuidos uniformemente).
Productos heterogneos (el muestreo se debera realizar tomando alcuotas de
cada componente representativo de sus proporciones en el producto inicial).
Tambin es posible homogeneizar toda la muestra para el laboratorio para
permitir el muestreo de una muestra para anlisis homogeneizada.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
de julio de 2003 que a su vez adopta ntegramente la norma internacional ISO
6887-2:2003.
Cepas de
referencia :
No especifica.

UNE-EN ISO 6887-3:2004
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Esta parte de la norma ISO 6887 especifica las reglas para la preparacin de
muestras de pescados y productos de la pesca y sus suspensiones para su examen
microbiolgico, cuando estas muestras necesiten una preparacin diferente a la
del mtodo descrito en la norma ISO 6887-1. La norma ISO 6887-1 define las
reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y las diluciones
decimales para el examen microbiolgico. Esta parte de la norma ISO 6887
describe nicamente los mtodos de preparacin que son aplicables a varios
microorganismos simultneamente. Excluye las preparaciones que slo se aplican
a la deteccin o recuento de un nico microorganismo para las cuales los
mtodos de preparacin estn descritos en la correspondiente norma internacional
concerniente a ese microorganismo.
Fundamento:
concerniente. Se preparan diluciones decimales para reducir el nmero de
microorganismos por unidad de volumen y permitir, despus de la incubacin, la
observacin de cualquier crecimiento (en el caso de medios lquidos) o colonias
(en el caso de placas de agar). Para restringir el mbito del recuento a un
intervalo dado, o si se prevn un alto nmero de microorganismos, es posible
sembrar slo las disoluciones decimales necesarias (al menos dos diluciones
consecutivas) para poder efectuar el recuento segn los clculos descritos en la
norma ISO 7218.

61

Procedimiento:
Todas las preparaciones y manipulaciones deberan realizarse segn las tcnicas
aspticas apropiadas y con un equipamiento estril para prevenir la
contaminacin microbiana de las muestras por fuentes externas. Productos
cidos: cuando se realice una suspensin de productos cidos, es importante
asegurarse que el pH se lleve a la neutralidad. El empleo de diluyente con un
indicador de pH aadido puede evitar la necesidad de emplear y esterilizar
sondas de pH; se aade hidrxido sdico (NaOH) para revirar la coloracin de la
suspensin hasta que el indicador empieza a cambiar. En el caso del empleo de
diluyentes tamponados, la adicin de NaOH es a menudo necesaria para
incrementar la capacidad tamponadora del componente alcalino. La
concentracin del NaOH aadido depende de la acidez del producto. La
concentracin ms adaptada es aquella que est todava prxima a la proporcin
de 1 en 9 de diluyente. Alimentos con alto contenido en materia grasa (por
ejemplo por encima del 20 % de materia grasa de la masa total). El empleo de un
diluyente con un contenido entre 1 g/L y 10 g/L de monooleato de sorbitol
(Tween 80) aadido, correspondiente aproximadamente a niveles de materias
grasas puede mejorar la emulsificacin durante la suspensin.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Diluyentes para uso general (disolucin salina de peptona, agua de peptona
tamponada). Diluyentes para casos especiales (disolucin salina de peptona con
Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Homogenizador, tijeras estriles, cuchillos, tenedores para marisco, bisturs y
cuchillos de carnicero grandes estriles, cepillo duro, taladro elctrico, pinzas.
Preparacin de
la muestra:
Productos congelados (los productos que se almacenan congelados) se deberan
(18 y 27) C durante 3 h como mximo, (2 2) C durante 24 h como mximo.
Las muestras deberan ser analizadas lo ms rpidamente posible tras esto. Si el
producto est an congelado en el momento de su corte, se puede utilizar
diluyente a temperatura del laboratorio para facilitar la descongelacin.
rotatorio durante ms de 2.5 min seguidos). Para los productos secos y duros o
heterogneos, puede ser necesario picar o moler la muestra del laboratorio no
ms de 1 min). Productos lquidos y no viscosos (la muestra para anlisis debera
asegurarse que los microorganismos estn distribuidos uniformemente).
Productos heterogneos (el muestreo se debera realizar tomando alcuotas de
cada componente representativo de sus proporciones en el producto inicial).
Tambin es posible homogeneizar toda la muestra para el laboratorio para
permitir el muestreo de una muestra para anlisis homogeneizada.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
de agosto de 2003, que a su vez adopta ntegramente la norma internacional ISO
6887-3:2003.
Cepas de No especifica.

62

referencia :

UNE-EN ISO 6887-4:2004
Objetivo y
campo de
aplicacin:
Esta parte de la Norma ISO 6887 especifica las reglas para la preparacin de
muestras y diluciones decimales para el examen microbiolgico de productos
alimentarios que no son cubiertos por las otras partes de la Norma ISO 6887. La
norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la preparacin de la
suspensin inicial y las diluciones decimales para el examen microbiolgico. Esta
parte de la norma ISO 6887 describe nicamente los mtodos de preparacin que
son aplicables a varios microorganismos simultneamente. Excluye las
preparaciones que slo aplican a la deteccin o recuento de un nico
microorganismo para el cual los mtodos de preparacin estn descritos en la
correspondiente norma internacional concerniente a ese microorganismo.
Fundamento:
concerniente. Se preparan diluciones decimales si fuera necesario para reducir el
nmero de microorganismos por unidad de volumen y permitir, despus de la
incubacin, la observacin de cualquier crecimiento (en el caso de medios
lquidos) o colonias (en el caso de placas de agar), como se establece en cada
norma especfica.
Para restringir el mbito del recuento a un intervalo dado, o si se prevn un alto
nmero de microorganismos, es posible sembrar slo las disoluciones decimales
necesarias (al menos dos diluciones consecutivas) para poder efectuar el recuento
segn los clculos descritos en la norma ISO 7218.
Procedimiento:
Todas las preparaciones y manipulaciones deberan realizarse segn las tcnicas
aspticas apropiadas y con un equipamiento estril para prevenir la
contaminacin microbiana de las muestras por fuentes externas. Productos
cidos: cuando se realice una suspensin de productos cidos, es importante
asegurar que el pH se lleve a la neutralidad. El empleo de diluyente con un
indicador de pH aadido puede evitar la necesidad de emplear y esterilizar
sondas de pH; se aade hidrxido sdico (NaOH) para revirar la coloracin de la
suspensin hasta que el indicador empieza a cambiar. En el caso del empleo de
diluyentes tamponados, la adicin de NaOH es a menudo necesaria para
incrementar la capacidad tamponadora del componente alcalino. La
concentracin del NaOH aadido depende de la acidez del producto. La
concentracin ms adaptada es aquella que est todava prxima a la proporcin
de 1 en 9 de diluyente. Alimentos con alto contenido en materia grasa (por
ejemplo por encima del 20 % de materia grasa de la masa total).
El empleo de un diluyente con un contenido entre 1 g/L y 10 g/L de monooleato
de sorbitol (Tween 80) aadido, correspondiente aproximadamente a niveles de
materias grasas puede mejorar la emulsificacin durante la suspensin.
Reactivos y
medios de
cultivo:
Diluyentes para uso general (disolucin salina de peptona, agua de peptona
tamponada). Diluyentes para casos especiales (disolucin salina de peptona con

63

Materiales,
aparatos e
instrumentos:
Homogenizador, tijeras estriles, cuchillos, tenedores para marisco, bisturs y
cuchillos de carnicero grandes estriles, esptulas, martillo, pinzas.
Preparacin de
la muestra:
Productos congelados (Los productos que se almacenan congelados se deberan
(18 y 27) C durante 3 h como mximo, (2 2) C durante 24 h como mximo.
Las muestras deberan ser analizadas lo ms rpidamente posible tras esto. Si el
producto est an congelado en el momento de su corte, se puede utilizar
diluyente a temperatura del laboratorio para facilitar la descongelacin.
rotatorio durante ms de 2.5 min seguidos. Para los productos secos y duros o
heterogneos, puede ser necesario picar o moler la muestra de laboratorio no ms
de 1 min). Productos lquidos y no viscosos (la muestra para anlisis debera
asegurarse que los microorganismos estn distribuidos uniformemente. Productos
heterogneos (el muestreo se debera realizar tomando alcuotas de cada
componente representativo de sus proporciones en el producto inicial). Tambin
es posible homogeneizar toda la muestra para el laboratorio, para permitir el
muestreo de una muestra para anlisis homogeneizada.
Expresin de
resultados:
No especifica.
Informe de la
prueba:
No especifica.
Concordancia
con normas
internacionales:
de agosto de 2003, que a su vez adopta ntegramente la norma internacional ISO
6887-4:2003.
Cepas de
referencia :
No especifica.

3.4 CLCULO DEL NMERO MS PROBABLE
NOM-112-SSA1-1994
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del periodo de
incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
La tabla 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando slo una dilucin muestra tres tubos positivos, elegir sta y las
diluciones mayores posteriores.
Ejemplo 2. Cuando ms de una dilucin muestra tres tubos positivos y la ltima da menos de tres,
elegir esta ltima y las dos diluciones anteriores ms bajas.
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilucin hay tres tubos positivos y stos se encuentran en ms de
tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.

64

Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos slo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g)
y en la primera dilucin (1 ml o 10
-1
g), seleccionar las tres primeras diluciones para el clculo del
nmero ms probable.
En cada caso se obtiene un nmero de tres cifras, lo cual es representado en las tablas 4 a la 7,
segn corresponda. En la columna que indica el nmero de tubos positivos se busca el ndice del
NMP.
La tcnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta
tcnica deben ser utilizados con precaucin. Los lmites de confianza estn representados en las
tablas 3 a la 7. Por ejemplo, para una muestra slida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los
lmites de confianza en el 95 % de los casos variarn de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3
de la tabla 3) y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los lmites de confianza
son de 3.6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 tabla 3).
Tabla 3. Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo del NMP.
Nmero de tubos positivos obtenidos de tres NMP
b
tubos incubados, para las siguientes cantidades
de muestra inoculada por tubo
a

mayor dilucin = menor concentracin
Producto
lquido
(ml)
10 1 10
-1
10
-2
10
-3

Producto
lquido
ml
-1

Otros
productos
g
-1

Otros
productos
(g)
1 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4

1 3 3 2 1 0 15 (5)* 150 (6)*
2 3 3 3 0 24 (5)* 240 (6)*
3 2 2 1 1 0 7 (6)* 70 (7)*
4 3 3 0 0 0 2.4 (4)* 24 (5)*
5 2 2 0 1 0 0.21 (4)* 2.1 (5)*

Tabla 4. ndice del NMP y lmites de confianza al 95 % para varias combinaciones de
resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 10, 1.0 y 0.1 g)
a
.
3 tubos por dilucin 5 tubos por dilucin
Lmites de confianza al
95 %
95 %
Combinacin
de positivos
ndice del
NMP por
Bajo Alto ndice del
NMP por
Bajo Alto

65

g g
0-0-0 <0.03 <0.005 <0.09 <0.02 <0.005 <0.07
0-0-1 0.03 <0.005 <0.09 0.02 <0.005 0.07
0-1-0 0.03 <0.005 0.13 0.02 <0.005 0.07
0-2-0 -- -- -- 0.04 <0.005 0.11
1-0-0 0.04 <0.005 0.20 0.02 <0.005 0.07
1-0-1 0.07 0.01 0.21 0.04 <0.005 0.11
1-1-0 0.07 0.01 0.23 0.04 <0.005 0.11
1-1-1 0.11 0.03 0.36 0.06 <0.005 0.15
1-2-0 0.11 0.03 0.36 0.06 <0.005 0.15
2-0-0 0.09 0.01 0.36 0.05 <0.005 0.13
2-0-1 0.14 0.03 0.37 0.07 0.01 0.17
2-1-0 0.15 0.03 0.44 0.07 0.01 0.17
2-1-1 0.20 0.07 0.89 0.09 0.02 0.21
2-2-0 0.21 0.04 0.,47 0.09 0.02 0.21
2-2-1 0.28 0.10 1.50 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 0.12 0.03 0.28
3-0-0 0.23 0.04 1.20 0.08 0.01 0.19
3-0-1 0.39 0.07 1.3 0.11 0.02 0.25
3-0-2 0.64 0.15 3.80 -- -- --
3-1-0 0.43 0.07 2.1 0.11 0.02 0.25
3-1-1 0.75 0.14 2.3 0.14 0.04 0.34
3-1-2 1.,20 0.30 3.8 -- -- --
3-2-0 0.93 0.15 3.80 0.14 0.04 0.34
3-2-1 1.,50 0.30 4.40 0.17 0.05 0.46
3-2-2 2.10 0.35 4.70 -- -- --
3-3-0 2.40 0.36 13.0 -- -- --
3-3-1 4.60 0.71 24.0 -- -- --

66

3-3-2 11.0 1.50 48.0 -- -- --
3-3-3 >11.0 >1.50 >48.0 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 0.13 0.03 0.31
4-0-1 -- -- -- 0.17 0.05 0.46
4-1-0 -- -- -- 0.17 0.05 0.46
4-1-1 -- -- -- 0.21 0.07 0.63
4-1-2 -- -- -- 0.26 0.09 0.78
4-2-0 -- -- -- 0.22 0.07 0.67
4-2-1 -- -- -- 0.26 0.09 0.78
4-3-0 -- -- -- 0.27 0.09 0.80
4-3-1 -- -- -- 0.33 0.11 0.93
4-4-0 -- -- -- 0.34 0.12 0.93
5-0-0 -- -- -- 0.23 0.07 0.70
5-0-1 -- -- -- 0.31 0.11 0.89
5-0-2 -- -- -- 0.43 0.15 1.14
5-1-0 -- -- -- 0.33 0.11 0.93
5-1-1 -- -- -- 0.46 0.16 1.2
5-1-2 -- -- -- 0.63 0.21 1.5
5-2-0 -- -- -- 0.49 0.,17 1.3
5-2-1 -- -- -- 0.70 0.23 1.70
5-2-2 -- -- -- 0.94 0.28 2.2
5-3-0 -- -- -- 0.79 0.25 1.9
5-3-1 -- -- -- 1.10 0.31 2.5
5-3-2 -- -- -- 1.4 0.37 3.4
5-3-3 -- -- -- 1.80 0.44 5.0
5-4-0 -- -- -- 1.30 0.35 3.0
5-4-1 -- -- -- 1.70 0.43 4.9
5-4-2 -- -- -- 2.20 0.57 7.0

67

5-4-3 -- -- -- 2.80 0.90 8.5
5-4-4 -- -- -- 3.50 1.20 10.,0
5-5-0 -- -- -- 2.40 0.68 7.5
5-5-1 -- -- -- 3.50 1.60 10.0
5-5-2 -- -- -- 5.40 1.80 14.0
5-5-3 -- -- -- 9.20 3.0 32.0
5-5-4 -- -- -- 16.09 6.40 58.0
5-5-5 -- -- -- -- -- --

resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 1.0, 0.1 y 0.01 g)
a
.
95 %
95 %
Combinacin
de positivos
ndice del
NMP por
g
Bajo Alto ndice del
NMP por
g
Bajo Alto
0-0-0 <0.3 <0.05 <0.9 <0.2 <0.05 <0.7
0-0-1 0.3 <0.05 <0.9 0.2 <0.05 0.7
0-1-0 0.3 <0.05 1.3 0.2 <0.05 0.7
0-2-0 -- -- -- 0.4 <0.05 0.11
1-0-0 0.4 <0.05 2.0 0.2 <0.05 0.7
1-0-1 0.7 0.1 2.0 0.4 <0.05 1.1
1-1-0 0.7 0.1 2.3 0.4 <0.05 1.1
1-1-1 1.1 0.3 3.6 0.6 <0.05 1.5
1-2-0 1.1 0.3 3.6 0.6 <0.05 1.5
2-0-0 0.9 0.1 3.6 0.5 <0.05 1.3
2-0-1 1.4 0.3 3.7 0.7 0.1 1.7
2-1-0 1.5 0.3 4.4 0.7 0.1 1.7

68

2-1-1 2.0 0.7 8.9 0.9 0.2 2.1
2-2-0 2.1 0.4 4.7 0.9 0.2 2.1
2-2-1 2.8 1.0 15.0 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 1.2 0.3 2.8
3-0-0 2.3 0.4 12.0 0.8 0.1 1.9
3-0-1 3.9 0.7 13.0 1.1 0.2 2.5
3-0-2 6.4 1.5 38.0 -- -- --
3-1-0 4.3 0.7 21.0 1.1 0.2 2.5
3-1-1 7.5 1.4 23.0 1.4 0.4 3.4
3-1-2 12.0 3.0 38.0 -- -- --
3-2-0 9.3 1.5 38.0 1.4 0.4 3.4
3-2-1 15.0 3.0 44.0 1.7 0.5 4.6
3-2-2 21.0 3.5 47.0 -- -- --
3-3-0 24.0 3.6 130.0 -- -- --
3-3-1 46.0 7.1 240.0 -- -- --
3-3-2 110.0 15.0 480.0 -- -- --
3-3-3 >110.0 >15.0 >480.0 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 1.3 0.3 3.1
4-0-1 -- -- -- 1.7 0.5 4.6
4-1-0 -- -- -- 1.7 0.5 4.6
4-1-1 -- -- -- 2.1 0.7 6.3
4-1-2 -- -- -- 2.6 0.9 7.8
4-2-0 -- -- -- 2.2 0.7 6.7
4-2-1 -- -- -- 2.6 0.9 7.8
4-3-0 -- -- -- 2.7 0.9 8.0
4-3-1 -- -- -- 3.3 1.1 9.,3
4-4-0 -- -- -- 3.4 1.2 9.3
5-0-0 -- -- -- 2.3 0.7 7.0

69

5-0-1 -- -- -- 3.1 1.1 8.9
5-0-2 -- -- -- 4.3 1.5 11.4
5-1-0 -- -- -- 3.3 1.1 9.3
5-1-1 -- -- -- 4.6 1.6 12.,0
5-1-2 -- -- -- 6.3 2.1 15.0
5-2-0 -- -- -- 4.9 1.7 13.0
5-2-1 -- -- -- 7.0 2.,3 17.0
5-2-2 -- -- -- 9.4 2.8 22.0
5-3-0 -- -- -- 7.9 2.5 19.0
5-3-1 -- -- -- 11.0 3.1 25.0
5-3-2 -- -- -- 14.0 3.7 34.0
5-3-3 -- -- -- 18.0 4.4 50.0
5-4-0 -- -- -- 13.0 3.5 30.0
5-4-1 -- -- -- 17.0 4.3 49.0
5-4-2 -- -- -- 22.0 5.7 70.0
5-4-3 -- -- -- 28.0 9.0 85.0
5-4-4 -- -- -- 35.0 12.0 100.0
5-5-0 -- -- -- 24.0 6.8 75.0
5-5-1 -- -- -- 35.0 12.0 100.0
5-5-2 -- -- -- 54.0 18.0 140.0
5-5-3 -- -- -- 92.0 30.0 320.0
5-5-4 -- -- -- 161.0 64.0 580.0
5-5-5 -- -- -- >161.0 >64.0 >580,0

resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 0.1, 0.01 y 0.001
g)
a
.

70

95 %
95 %
Combinacin
de positivos
ndice del
NMP por
g
Bajo Alto ndice del
NMP por
g
Bajo Alto
0-0-0 <3 <0.5 <9 <2 <0.5 <7
0-0-1 3 <0.5 9 2 <0.5 7
0-1-0 3 <0.5 13 2 <0.5 7
0-2-0 -- -- -- 4 <0.5 11
1-0-0 4 <0.5 20 2 <0.5 7
1-0-1 7 1 21 4 <0.5 11
1-1-0 7 1 23 4 <0.5 11
1-1-1 11 3 36 6 <0.5 15
1-2-0 11 3 36 6 <0.5 15
2-0-0 9 1 36 5 <0.5 13
2-0-1 14 3 37 7 1.0 17
2-1-0 15 3 44 7 1.0 17
2-1-1 20 7 89 9 2.0 21
2-2-0 21 4 47 9 2.0 21
2-2-1 28 10 150 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 12 3.0 28
3-0-0 23 4 120 8 1.0 19
3-0-1 39 7 13 11 2.0 25
3-0-2 64 15 380 -- -- --
3-1-0 43 7 210 11 2.0 25
3-1-1 75 14 230 14 4.0 34
3-1-2 120 30 380 -- -- --
3-2-0 93 15 380 14 4.0 34
3-2-1 150 30 440 17 5.0 46

71

3-2-2 210 35 470 -- -- --
3-3-0 240 36 130 -- -- --
3-3-1 460 71 240 -- -- --
3-3-2 1100 150 480 -- -- --
3-3-3 >1100 >150 >480 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 13 3.0 31
4-0-1 -- -- -- 17 5.0 46
4-1-0 -- -- -- 17 5.0 46
4-1-1 -- -- -- 21 7.0 63
4-1-2 -- -- -- 26 9.0 78
4-2-0 -- -- -- 22 7.0 67
4-2-1 -- -- -- 26 9.0 78
4-3-0 -- -- -- 27 9.0 80
4-3-1 -- -- -- 33 11.0 93
4-4-0 -- -- -- 34 12.0 93
5-0-0 -- -- -- 23 7.0 70
5-0-1 -- -- -- 31 11.0 89
5-0-2 -- -- -- 43 15.0 114
5-1-0 -- -- -- 33 11.0 93
5-1-1 -- -- -- 46 16.0 120
5-1-2 -- -- -- 63 21.0 150
5-2-0 -- -- -- 49 17.0 130
5-2-1 -- -- -- 70 23.0 170
5-2-2 -- -- -- 94 28.0 220
5-3-0 -- -- -- 79 25.0 190
5-3-1 -- -- -- 110 31.0 250
5-3-2 -- -- -- 140 37.0 340
5-3-3 -- -- -- 180 44.0 500

72

5-4-0 -- -- -- 130 35.0 300
5-4-1 -- -- -- 170 43.0 490
5-4-2 -- -- -- 220 57.0 700
5-4-3 -- -- -- 280 90.0 850
5-4-4 -- -- -- 350 120.0 1000
5-5-0 -- -- -- 240 68.0 750
5-5-1 -- -- -- 350 120.0 1000
5-5-2 -- -- -- 540 180.0 1400
5-5-3 -- -- -- 920 300.0 3200
5-5-4 -- -- -- 1600 640.0 5800
5-5-5 -- -- -- >1600 >640.0 >5800

resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 0.01, 0.001 y
0.0001 g)
a
.
95 %
95 %
Combinacin
de positivos
ndice del
NMP por
g
Bajo Alto ndice del
NMP por g
Bajo Alto
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70
0-2-0 -- -- -- 40 <5 110
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70
1-0-1 70 10 210 40 <5 110
1-1-0 70 10 230 40 <5 110
1-1-1 110 30 360 60 <5 150
1-2-0 110 30 360 60 <5 150

73

2-0-0 90 10 360 50 <5 130
2-0-1 140 30 370 70 10 170
2-1-0 150 30 440 70 10 170
2-1-1 200 70 890 90 20 210
2-2-0 210 40 470 90 20 210
2-2-1 280 100 1 500 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 120 30 280
3-0-0 230 40 1 200 80 10 190
3-0-1 390 70 1 300 110 20 250
3-0-2 640 150 3 800 -- -- --
3-1-0 430 70 2 100 110 20 250
3-1-1 750 140 2 300 140 40 340
3-1-2 1 200 300 3 800 -- -- --
3-2-0 930 150 3 800 140 40 340
3-2-1 1 500 300 4 400 170 50 460
3-2-2 2 100 350 4 700 -- -- --
3-3-0 2 400 360 13 000 -- -- --
3-3-1 4 600 710 24 000 -- -- --
3-3-2 11 000 1 500 48 000 -- -- --
3-3-3 >11 000 >1 500 >48 000 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 130 30 310
4-0-1 -- -- -- 170 50 460
4-1-0 -- -- -- 170 50 460
4-1-1 -- -- -- 210 70 630
4-1-2 -- -- -- 260 90 780
4-2-0 -- -- -- 220 70 670
4-2-1 -- -- -- 260 90 780
4-3-0 -- -- -- 270 90 800

74

4-3-1 -- -- -- 330 110 930
4-4-0 -- -- -- 340 120 930
5-0-0 -- -- -- 230 70 700
5-0-1 -- -- -- 310 110 890
5-0-2 -- -- -- 430 150 1 140
5-1-0 -- -- -- 330 110 930
5-1-1 -- -- -- 460 160 1 200
5-1-2 -- -- -- 630 210 1 500
5-2-0 -- -- -- 490 170 1 300
5-2-1 -- -- -- 700 230 1 700
5-2-2 -- -- -- 940 280 2 200
5-3-0 -- -- -- 790 250 1 900
5-3-1 -- -- -- 1 100 310 2 500
5-3-2 -- -- -- 1 400 370 3 400
5-3-3 -- -- -- 1 800 440 5 000
5-4-0 -- -- -- 1 300 350 3 000
5-4-1 -- -- -- 1 700 430 4 900
5-4-2 -- -- -- 2 200 570 7 000
5-4-3 -- -- -- 2 800 900 8 500
5-4-4 -- -- -- 3 500 1 200 10 000
5-5-0 -- -- -- 2 400 680 7 500
5-5-1 -- -- -- 3 500 1 200 10 000
5-5-2 -- -- -- 5 400 1 800 14 000
5-5-3 -- -- -- 9 200 3 000 32 000
5-5-4 -- -- -- 16 000 6 400 58 000
5-5-5 -- -- -- >16 000 >6 400 >58 000


75

Informe de la prueba: Informar "Nmero ms probable (NMP) de coliformes por gramo o
mililitro de muestra". En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml.
Concordancia con normas internacionales: Esta norma no tiene concordancia con normas
internacionales.

UNE-EN ISO 7218
Determinacin de los valores de NMP
Hay tres posibilidades distintas de determinar el valor de NMP: el clculo mediante frmulas
matemticas, la consulta de tablas de NMP o el empleo de programas informticos especficos.
Siempre que se basen en las mismas consideraciones estadsticas, las tres son igualmente vlidas.
Estos tres mtodos se detallan a continuacin.
1. Frmulas matemticas
1.1. Frmula aproximada para todos los casos
Los valores aproximados de NMP para cualquier nmero de diluciones y de tubos en paralelo se
obtienen aplicando la siguiente ecuacin (adaptada de Thomas, 1942):

Donde:
Zp es el nmero de tubos positivos;
m
r
es la masa de referencia de la muestra, en gramos;
m
s
es la masa total de la muestra en todos los tubos que han presentado reacciones negativas, en
gramos;
m
t
es la masa total de muestra en todos los tubos, en gramos.
El NMP se expresa por masa de referencia de la muestra, en gramos (generalmente 1 g, en
ocasiones 100 g).
1.2 Disolucin exacta para una serie de tubos
El valor de NMP para una serie nica de tubos viene dado por la frmula:

+
donde:
m
r
m
m
es la masa de muestra en cada tubo de la serie, en gramos;

76

ln es el logaritmo natural;
n es el nmero de tubos de la serie;
z
p
es el nmero de tubos con reaccin positiva.
1.3. Estimacin de la precisin en anlisis de dilucin nica
Los lmites de confianza al 95 % de la estimacin del NMP pueden calcularse de forma aproximada
mediante la ecuacin:

)
]

Donde:
x es el lmite superior o inferior del intervalo de confianza al 95 %;
m
r
m
m
es la masa de la muestra en cada tubo de la serie, en gramos;
ln es el logaritmo natural;
n es el nmero de tubos de la serie;
z
n
es el nmero de tubos con reaccin negativa.
El signo ms est relacionado con el lmite inferior y el signo menos con el lmite superior. La
aproximacin no es muy buena cuando la mayora de los tubos son negativos (estriles) pero mejora
al aumentar el nmero de tubos positivos.
1.4. Estimacin de la precisin en anlisis de dilucin mltiple simtricos
El logaritmo decimal de la incertidumbre estndar para un sistema de NMP de dilucin mltiple
simtrico puede obtenerse mediante la aproximacin de la ecuacin de Cochran (1950):

Donde:
SE es el error estndar del log10 NMP;
f es el factor de dilucin entre dos diluciones consecutivas (en la mayora de los casos, 10);
n es el nmero de tubos para cada dilucin;
Los lmites superior e inferior del intervalo de confianza al 95 % pueden aproximarse
respectivamente multiplicando y dividiendo la estimacin del NMP por el antilogaritmo de 2 x SE.
Este procedimiento tiende a exagerar el lmite de confianza superior.

77

2. Tablas de NMP
2.1. Tablas para sistemas de dilucin nica
Las tablas de la 8 a la 11 muestran los valores de NMP y los intervalos de confianza al 95 % por
porcin de anlisis para series de 10, 15, 20 y 25 tubos en paralelo [cada tubo se inocula con la
misma (nica) dilucin].
Para expresar el resultado por masa de referencia de la muestra (o de volumen para las muestras
lquidas), se multiplican los valores de NMP y de los lmites al 95 % por la relacin (masa de
referencia)/(masa de la porcin de anlisis).
La incertidumbre estndar logartmica no se multiplica. La masa de referencia en microbiologa de
los alimentos suele ser de 1 g. La masa de la porcin de anlisis corresponde a la cantidad de
muestra (en gramos) presente en el volumen utilizado para inocular los tubos, es decir, 0.1 g, si se
ha utilizado 1 ml de un homogenizado de 10
-1
.
2.2. Tablas para sistemas de diluciones mltiples: tres diluciones consecutivas
En los sistemas simtricos, es una prctica habitual utilizar tres diluciones sucesivas con tres (Tabla
12) o cinco (Tabla 14) rplicas. Se registra el nmero de resultados positivos de cada serie de tubos
y se determina, a partir de la tabla de NMP correspondiente al sistema de inoculacin utilizado, el
nmero ms probable de microorganismos presentes en el volumen de referencia de la muestra.
Hay combinaciones de tubos positivos con una probabilidad de aparicin mucho mayor que otras.
Por ejemplo, es mucho menos probable que aparezca una combinacin de resultados positivos de 0,
0, 3 que una combinacin de 3, 2, 1.
Para cuantificar esta probabilidad, se ha asignado un ndice de 0 a 3 a todas las combinaciones
posibles de resultados positivos. La categora 1 corresponde a los resultados de probabilidad ms
alta, mientras que los resultados de la categora 3 son raros y no son fciles de reproducir. Los casos
peores son los resultados de la categora 0; deberan considerarse con un alto grado de desconfianza.
Asumiendo que los resultados del anlisis son correctos, debera esperarse que el 95 % de las
combinaciones correspondan a la categora 1, el 4 % a la categora 2, el 0.9 % a la categora 3 y
solamente el 0.1 % a la categora 0. En la tabla B.6 se explican con mayor detalle las categoras.
En el caso en que se realicen ms de tres diluciones, la seleccin de la combinacin correcta de tres
diluciones consecutivas no siempre es muy evidente. Sin embargo, se puede hacer fcilmente
registrando todas las combinaciones posibles de tubos positivos, determinando en la tabla 17 a qu
categora corresponde.
Por consiguiente, se aplican las reglas siguientes:
1) Se selecciona la combinacin de tres diluciones consecutivas con un perfil de categora 1 para
obtener el ndice de NMP. Si se obtiene ms de una combinacin con perfil de categora 1, se utiliza
la que tenga un mayor nmero de tubos positivos.
2) Si no se encuentra ninguna combinacin de categora 1, se utiliza la que presente un perfil de
categora 2. Si se obtiene ms de una combinacin con perfil de categora 2, se utiliza la que tenga
un mayor nmero de tubos positivos.

78

3) Si no se encuentra ninguna combinacin de categora 2, se utiliza la que presente un perfil de
categora 3. Si se obtiene ms de una combinacin con perfil de categora 3, se utiliza la que tenga
un mayor nmero de tubos positivos.
3. Programas informticos
Los programas informticos ms verstiles no plantean restricciones en el nmero de diluciones ni
en la simetra o en los tubos en paralelo del sistema de NMP. El NMP Assay Analyzer es un
programa de acceso libre, basado en un programa previo (Hurley y Roscoe, 1983).
4. Expresin de los resultados
Utilizando el ndice de NMP determinado en la tabla 12 [segn la combinacin de tres (o cinco)
diluciones consecutivas escogidas], se determina la cantidad ms probable de microorganismos en
el volumen de referencia.
El resultado se expresa como el nmero ms probable de microorganismos (o de un grupo
especfico de microorganismos) por gramo o por mililitro. La masa o el volumen de referencia
pueden ser diferentes del g o del ml (por ejemplo 100 g o 100 ml).
5. Determinacin del nmero ms probable (NMP)
Tabla 8. Valores de NMP por porcin de anlisis y lmites del intervalo de confianza al 95 %
en una serie de 10 tubos, calculados conforme a Hurley y Roscoe (1983).
Nmero de
tubos
positivos
Series de 10 tubos
Lmites del intervalo de confianza al
95 %

NMP

Incertidumbre
estndar del
log
10
NMP
Inferior Superior
1 0.11 0.435 0.02 0.75
2 0.22 0.308 0.06 0.89
3 0.36 0.252 0.11 1.11
4 0.51 0.220 0.19 1.38
5 0.69 0.198 0.28 1.69
6 0.92 0.184 0.40 2.10
7 1,.20 0.174 0.55 2.64
8 1.61 0.171 0.75 3.48

79

9 2.30 0.179 1.03 5.16

Nmero de
tubos
positivos
Series de 15 tubos
NMP

Incertidumbre
estndar del
log
10
NMP
Lmites al 95 % de confianza

Inferior Superior
1 0.07 0.434 0.01 0.49
2 0.14 0.307 0.04 0.57
3 0.22 0.251 0.07 0.69
4 0.31 0.218 0.12 0.83
5 0.41 0.196 0.17 0.98
6 0.51 0.179 0.23 1.15
7 0.63 0.167 0.30 1.33
8 0.76 0.157 0.37 1.55
9 0.92 0.150 0.47 1.80
10 1.10 0.144 0.57 2.11
11 1.32 0.141 0.70 2.49
12 1.61 0.139 0.86 3.02
13 2.01 0.142 1.06 3.82
14 2.71 0.155 1.35 5.45

Nmero de
tubos
positivos
Series de 15 tubos
NMP

Incertidumbre
estndar del


80

log
10
NMP Inferior Superior
1 0.05 0.434 0.01 0.36
2 0.11 0.307 0.03 0.42
3 0.16 0.251 0.05 0.50
4 0.22 0.218 0.08 0.60
5 0.29 0.195 0.12 0.69
6 0.36 0.178 0.16 0.80
7 0.43 0.165 0.20 0.91
8 0.51 0.155 0.25 1.03
9 0.59 0.147 0.31 1.16
10 0.69 0.140 0.37 1.30
11 0.80 0.134 0.44 1.46
12 0.92 0.130 0.51 1.65
13 1.05 0.126 0.59 1.85
14 1.20 0.123 0.69 2.10
15 1.39 0.121 0.80 2.40
16 1.61 0.121 0.93 2.77
17 1.90 0.122 1.09 3.29
18 2.30 0.127 1.30 4.08
19 3.00 0.141 1.58 5.67

Nmero de
tubos
positivos
Series de 25 tubos
NMP

Incertidumbre
estndar del
log
10
NMP

Inferior Superior
1 0.04 0.434 0.01 0.29

81

2 0.08 0.307 0.02 0.33
3 0.13 0.251 0.04 0.40
4 0.17 0.217 0.07 0.47
5 0.22 0.195 0.09 0.54
6 0.27 0.178 0.12 0.61
7 0.33 0.165 0.16 0,69
8 0.39 0.154 0.19 0.77
9 0.45 0.146 0.23 0.86
10 0.51 0.139 0.27 0.96
11 0.58 0.133 0.32 1.06
12 0.65 0.128 0.37 1.16
13 0.73 0.123 0.42 1.28
14 0.82 0.119 0.48 1.41
15 0.92 0.116 0.54 1.55
16 1.02 0.113 0.61 1.70
17 1.14 0.111 0.69 1.88
18 1.27 0.109 0.78 2.09
19 1.43 0.108 0.88 2.33
20 1.61 0.108 0.99 2.62
21 1.83 0.109 1.12 2.99
22 2.12 0.111 1.29 3.50
23 2.53 0.117 1.49 4.28
24 3.22 0.123 1.77 5.85

Tabla 12. ndices de NMP y lmites del intervalo de confianza (95 %) cuando se utilizan tres
porciones de anlisis de 1 g (ml), tres de 0.1 g (ml) y tres de 0.01 g (ml).
Nmero de resultados
positivos
ndice de Categoras
b
Lmites de los resultados en un
intervalo de confianza (95 %)
a, c


82

NMP
a
Lmite inferior Lmite
superior
0 0 0 <0.30 0.00 0.94
0 0 1 0.30 3 0.01 0.95
0 1 0 0.30 2 0.01 1
0 1 1 0.61 0 0.12 1.7
0 2 0 0.62 3 0.12 1.7
0 3 0 0.94 0 0.35 3.5
1 0 0 0.36 1 0.02 1.7
1 0 1 0.72 2 0.12 1.7
1 0 2 1.1 0 0.4 3.5
1 1 0 0.74 1 0.13 2
1 1 1 1.1 3 0.4 3.5
1 2 0 1.1 2 0.4 3.5
1 2 1 1.5 3 0.5 3.8
1 3 0 1.6 3 0.5 3.8
2 0 0 0.92 1 0.15 3.5
2 0 1 1.4 2 0.4 3.5
2 0 2 2.0 0 0.5 3.8
2 1 0 1.5 1 0.4 3.8
2 1 1 2.0 2 0.5 3.8
2 1 2 2.7 0 0.9 9.4
2 2 0 2.1 1 0.5 4
2 2 1 2.8 3 0.9 9.4
2 2 2 3.5 0 0.9 9.4
2 3 0 2.9 3 0.9 9.4
2 3 1 3.6 0 0.9 9.4
3 0 0 2.3 1 0.5 9.4

83

3 0 1 3.8 1 0.9 10.4
3 0 2 6.4 3 1.6 181
3 1 0 4.3 1 0.9 181
3 1 1 7.5 1 1.7 199
3 1 2 12 3 3 36
3 1 3 16 0 3 38
3 2 0 9.3 1 1.8 36
3 2 1 15 1 3 38
3 2 2 21 2 3 40
3 2 3 29 3 9 99
3 3 0 24 1 4 99
3 3 1 46 1 9 198
3 3 2 110 1 20 400
3 3 3 >110
a Fuente: De Man (1983).
b Vase la tabla 13.
c Los lmites de confianza mostrados en esta tabla se ofrecen solamente para proporcionar una
indicacin de la influencia de las variaciones estadsticas sobre los resultados. Siempre van a existir
otras fuentes de variacin, que en ocasiones pueden ser incluso ms importantes.
Tabla 13. Explicacin sobre las categoras de los resultados.
Categora
a
Definicin
1 Cuando el nmero de bacterias de la muestra es igual al valor de NMP hallado, este
resultado es de los que tienen la mayor probabilidad de obtenerse. Como mucho, hay
un 5 % de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable que el de
menor probabilidad de esta categora.
resultado es de los que tienen una probabilidad de obtenerse menor que incluso el
resultado menos probable de la categora 1, pero hay, en el mejor de los casos,
solamente un 1 % de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable
que el de menor probabilidad de esta categora.
resultado menos probable de la categora 2, pero hay, en el mejor de los casos,

84

solamente un 0.1 % de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable
que el de menor probabilidad de esta categora.
resultado menos probable de la categora 3. Solamente hay un 0.1 % de probabilidad
de obtener un resultado de esta categora, incluso sin que se haya cometido ninguna
incorreccin.
a Antes de comenzar los anlisis, debera decidirse qu categora se va a aceptar, es decir,
solamente la categora 1, la 1 y la 2 o incluso la 1, la 2 y la 3. Cuando se vaya a tomar una decisin
de gran importancia en base a los resultados, solamente debera aceptarse la categora 1, o en todo
caso la 1 y la 2. Los resultados de la categora 0 deberan considerarse con un alto grado de
desconfianza.

Tabla 14. Valores de NMP por gramo de muestra y lmites del intervalo de confianza al 95 %
(cuando se utilizan cinco porciones de anlisis de 1 g, cinco de 0.1 g y cinco de 0.01 g).
Nmero de tubos que muestran una reaccin
positiva
NMP (por g)
5 de 1 g 5 de 0.1 g 5 de 0.01 g Inferior Superior
0 0 0 <0.2 <0.1 0.7
0 1 0 0.2 <0.1 0.7
0 2 0 0.4 <0.1 1.1
1 0 0 0.2 <0.1 0.7
1 0 1 0.4 <0.1 1.1
1 1 0 0.4 <0.1 1.1
1 1 1 0.6 <0.1 1.5
2 0 0 0.5 <0.1 1.3
2 0 1 0.7 0.1 1.7
2 1 0 0.7 0.1 1.7
2 1 1 0.9 0.2 2.1
2 2 0 0.9 0.2 2.1
2 3 0 1.2 0.3 2.8
3 0 0 0.8 0.1 1.9

85

3 0 1 1.1 0.2 2.5
3 1 0 1.1 0.2 2.5
3 1 1 1.4 0.4 3.4
3 2 0 1.4 0.4 3.4
3 2 1 1.7 0.5 4.6
3 3 0 1.7 0.5 4.6
4 0 0 1.3 0.3 3.1
4 0 1 1.7 0.5 4.6
4 1 0 1.7 0.5 4.6
4 1 1 2.1 0.7 6.3
4 1 2 2.6 0.9 7.8
4 2 0 2.2 0.7 6.7
4 2 1 2.6 0.9 7.8
4 3 0 2.7 0.9 8
4 3 1 3.3 1.1 9.3
4 4 0 3.4 1.2 9.3
5 0 0 2.3 0.7 7
5 0 1 3.1 1.1 8.9
5 0 2 4.3 1.5 11
5 1 0 3.3 1.1 9.3
5 1 1 4.6 1.6 12
5 1 2 6.3 2.1 15
5 2 0 4.9 1.7 13
5 2 1 7 2.3 17
5 2 2 9.4 2.8 22
5 3 0 7.9 2.5 19
5 3 1 11 3.1 25
5 3 2 14 3.7 34

86

5 3 3 18 4.4 50
5 4 0 13 3.5 30
5 4 1 17 4.3 49
5 4 2 22 5.7 70
5 4 3 28 9 85
5 4 4 35 12 100
5 5 0 24 6.8 75
5 5 1 35 12 100
5 5 2 54 18 140
5 5 3 92 30 320
5 5 4 160 64 580
5 5 5 >180

6. Precisin
Es bien conocido que con la tcnica del NMP en los resultados pueden presentarse diferencias
importantes. Los lmites de confianza especificados se basan completamente en una distribucin
aleatoria de los resultados. Otras fuentes de variacin, que pueden a veces ser incluso de mayor
importancia, no entran en la estimacin del NMP. Para considerar tales influencias, se emplean las
categoras de la tabla B.2 de la norma ISO 7218:1996. stas resumen las combinaciones posibles de
tubos segn la probabilidad de su aparicin.

BAM Apndice 2. Nmero ms probable de diluciones seriales
La prueba de diluciones seriales determina la concentracin de un microbio en particular en una
muestra con una estimacin llamada el nmero ms probable (NMP). El NMP es particularmente
til para bajas concentraciones de microorganismos (< 100/g), especialmente en la leche y el agua y
para aquellos alimentos que por las partculas en suspensin puede interferir con el recuento preciso
de colonias.
Slo organismos viables son contados por la determinacin de NMP. Si, en la experiencia del
microbilogo, las bacterias en la muestra preparada en cuestin, se encuentran unidas en cadenas
que no estn separadas por la preparacin y la dilucin, el NMP debe ser juzgado como una
estimacin de las unidades de crecimiento (GUs) o unidades formadoras de colonias (UFCs) en
lugar de las bacterias individuales. Sin embargo, por simplicidad en este apndice se habla de estos
GUS o UFC como bacterias individuales. Si una prueba de confirmacin incluye la seleccin de
colonias de la prueba, entonces se deber realizar un ajuste estadstico no incluido en este apndice.

87

Los siguientes supuestos son necesarios para apoyar el mtodo del NMP. Las bacterias se
encuentran distribuidas al azar dentro de la muestra. Las bacterias son independientes, no se
encuentran agrupada, y no se repelen entre s. Cada tubo (o la placa, etc), cuyo inculo contenga
incluso un organismo viable producir un cambio o crecimiento detectable. Los tubos individuales
de la muestra son independientes.
La esencia del mtodo NMP es diluir la muestra a tal grado que los inculos en los tubos a veces,
pero no siempre, contengan organismos viables. El "resultado", es decir, el nmero de tubos y el
nmero de tubos con el crecimiento en cada dilucin, implicar una estimacin de la concentracin
original sin diluir, de bacterias en la muestra. Con el fin de obtener estimaciones sobre una amplia
gama de posibles concentraciones, los microbilogos utilizan diluciones seriadas incubando los
tubos a varias diluciones.
El NMP es el nmero que hace que el resultado observado sea el ms probable. Es la disolucin
para , la concentracin, en la siguiente ecuacin:

donde exp (x) significa e
x
, y
K denota el nmero de diluciones,
g
J
denota el nmero de positivos (o crecimiento) en tubos de la dilucin j,
m
J
denota la cantidad de la muestra original poner en cada tubo en la dilucin j,
t
j
denota el nmero de tubos en la dilucin j.
En general, esta ecuacin se puede resolver por integracin.
Intervalos de confianza
Los intervalos de confianza del 95 % en las tablas tienen el siguiente significado:
Antes de que los tubos sean inoculados, la probabilidad es que al menos el 95 % del intervalo de
confianza asociado con el resultado final englobar la concentracin real.
Es posible construir muchos conjuntos diferentes de intervalos que satisfagan este criterio.
Precisin, desviacin y resultados extremos
El NMP y los lmites de confianza se han expresado en 2 dgitos significativos. Por ejemplo, la
entrada "400" se ha redondeado de un nmero entre 395 y 405.
Numerosos artculos han notado un sesgo hacia la sobreestimacin de las concentraciones
microbianas del NMP. Garthright (1993) ha demostrado, sin embargo, que no hay sesgo apreciable
cuando las concentraciones se expresan como logaritmos, las unidades usuales utilizadas para
regresiones y para combinar los resultados. Por lo tanto, estos NMP no se han ajustado para el
sesgo.

88

El resultado con todos los tubos positivos en cada dilucin no da el lmite superior de la
concentracin. Las tablas de este apndice listan el NMP para este resultado tan grande como el
NMP ms alto, para un resultado con al menos un tubo negativo. Del mismo modo, el resultado con
todos los tubos negativos aparece tan bajo, como el NMP ms bajo para un resultado con al menos
un tubo positivo.
Notas de seguridad
Los resultados improbables
Varios problemas potenciales pueden causar resultados improbables. Por ejemplo, para una prueba
confirmatoria se puede pasar por alto el microbio de inters debido a que puede haber interferencia
en diluciones bajas o seleccionando muy pocas colonias en diluciones bajas. Si el problema se cree
limitado a las diluciones bajas, utilizando slo las diluciones altas con tubos positivos podra ser
ms fiable. Si la causa del problema es desconocida, la estimacin puede ser poco fiable.
Los tubos no concluyentes
En casos especiales en que los tubos no pueden ser juzgados ya sea positivo o negativo (por
ejemplo, placas invadidas por la microflora que compite en diluciones bajas), los tubos deben ser
excluidos de los resultados. El resultado puede ser un nmero de tubos diferente de los que se
encuentran en las tablas de este apndice. Su NMP puede ser resuelto mediante algoritmos
informticos o estimado por la regla de Thomas. El mtodo de Haldane puede encontrar los lmites
de confianza.
Uso de tablas
Seleccin de tres diluciones para la tabla de referencia
Un NMP puede calcularse para cualquier nmero positivo de tubos en cualquier nmero positivo de
diluciones, pero a menudo las diluciones seriadas pueden usar tres o ms diluciones y una serie
decimal (Cada dilucin tiene una dcima parte de la muestra original tanto como la dilucin
anterior.) Las tablas de este apndice requieren la reduccin de un resultado a tres de sus diluciones
decimales. Este procedimiento de seleccin de tres diluciones fue desarrollado para los diseos
(nmero de tubos por dilucin y la relacin de diluciones) en estas tablas. Todos ellos tienen
diluciones decimales y un nmero relativamente pequeo de tubos por dilucin. Para otros diseos,
otros procedimientos pueden ser necesarios. Cuando el modelo de NMP las posee, las tres
diluciones decimales se eligen para dar una buena aproximacin al NMP del resultado completo. De
lo contrario, la reduccin puede eliminar la interferencia (posible de otra especie de microbio o una
sustancia txica) que se pueda diluir.
En primer lugar, retire la dilucin ms alta (el volumen ms pequeo de la muestra), si est y la
dilucin inmediatamente inferior tiene todos los tubos negativos. Mientras se mantiene esta
condicin y por lo menos quedan cuatro diluciones, puede continuar con la eliminacin de estas
diluciones.
Si ms de tres diluciones permanecen, entonces se debe encontrar la mayor dilucin con todos los
tubos positivos. Hay tres casos. En el primer caso, la mayor dilucin con todos los tubos positivos
est dentro de las tres diluciones ms altas restantes. A continuacin, utilice las tres diluciones ms
altas restantes.

89

En el segundo caso, la mayor dilucin con todos los tubos positivos no est dentro de las tres
diluciones ms altas restantes. A continuacin, seleccione las dos diluciones prximas ms altas que
la dilucin ms alta con todos los tubos positivos. Asignar la suma de los tubos positivos de
cualquier dilucin mayor a la tercera dilucin mayor.
En el tercer caso, no hay dilucin con todos los tubos positivos. A continuacin, seleccione las dos
diluciones ms bajas. Asignar la suma de los tubos positivos de cualquier dilucin mayor a la
tercera dilucin.
Si las tres diluciones seleccionadas no se encuentran en las tablas, entonces pudo haber ocurrido
algo inusual en la dilucin seriada. Esta es una advertencia de que el resultado es lo suficientemente
improbable para que los bsicos supuestos del NMP puedan ser cuestionados. Si es posible, volver a
hacer la prueba puede ser el procedimiento ms fiable. Si un valor de NMP an se desea, utilice las
tres diluciones ms altas restantes.
Conversin de unidades de las tablas
En las tablas descritas a continuacin se aplican para inculos de 0.1, 0.01 y 0.001 g. Cuando se
seleccionan diferentes inculos para hacer referencia a las tablas, multiplique el NMP/g y los
lmites de confianza por cualquier multiplicador hace que la inoculacin coincida con el inculo de
la tabla.
Lmites y aproximaciones para un diseo sin una tabla
El NMP para una serie de diluciones que no aparece en alguna tabla (por ejemplo, como resultado
de la prdida accidental de unos tubos) puede ser calculada por iteracin o delimitada de la
siguiente manera.

(

Cuando W y Q son dos conjuntos no continuos de diluciones que en conjunto contienen todas las
diluciones. El lmite inferior permite diluciones bajas con todos los tubos positivos que se pueden
eliminar del lmite.
A continuacin se da una estimacin del NMP. En primer lugar, seleccionar la dilucin ms baja
que no tenga todos los tubos positivos. En segundo lugar, seleccionar la dilucin ms alta con al
menos un tubo positivo. Por ltimo, seleccionar todas las diluciones entre ellos. Utilizar slo las
diluciones seleccionadas en la siguiente frmula de Thomas (1942):
)
(
)
(
)

donde la suma se extiende a las diluciones seleccionadas y

g
j
denota el nmero de tubos positivos en las diluciones seleccionadas,
t
j
m
j
denota los gramos de muestra en todos los tubos en las diluciones seleccionadas,
(t
j
-g
j
) m
j
indica los gramos de muestra en todos los tubos negativos en las diluciones
seleccionadas.

90

Tabla 15. Para 3 tubos cada uno con 0.1, 0.01, 0.001 g de inculo, el NMP por gramo y los
intervalos de confianza de 95 por ciento.
Tubos positivos MPN/g Lmites de
confianza
confianza
0.10 0.01 0.001 Inferior Superior 0.10 0.01 0.001 Inferior Superior
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1 000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1 000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2 000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1 100 180 4 100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1
100
420 --

Tabla 16. Para 5 tubos cada uno con .1, 0.01 y 0.001 g de inculo, el NMP y los intervalos de
confianza al 95 por ciento.

91

Tubos positivos MPN/g Lmites de confianza Tubos positivos MPN/g Lmites de
confianza
0 0 0 <1.8 -- 6.8 4 0 2 21 6.8 40
0 0 1 1.8 0.09 6.8 4 0 3 25 9.8 70
0 1 0 1.8 0.09 6.9 4 1 0 17 6 40
0 1 1 3.6 0.7 10 4 1 1 21 6.8 42
0 2 0 3.7 0.7 10 4 1 2 26 9.8 70
0 2 1 5.5 1.8 15 4 1 3 31 10 70
0 3 0 5.6 1.8 15 4 2 0 22 6.8 50
1 0 0 2 0.1 10 4 2 1 26 9.8 70
1 0 1 4 0.7 10 4 2 2 32 10 70
1 0 2 6 1.8 15 4 2 3 38 14 100
1 1 0 4 0.7 12 4 3 0 27 9.9 70
1 1 1 6.1 1.8 15 4 3 1 33 10 70
1 1 2 8.1 3.4 22 4 3 2 39 14 100
1 2 0 6.1 1.8 15 4 4 0 34 14 100
1 2 1 8.2 3.4 22 4 4 1 40 14 100
1 3 0 8.3 3.4 22 4 4 2 47 15 120
1 3 1 10 3.5 22 4 5 0 41 14 100
1 4 0 11 3.5 22 4 5 1 48 15 120
2 0 0 4.5 0.79 15 5 0 0 23 6.8 70
2 0 1 6.8 1.8 15 5 0 1 31 10 70
2 0 2 9.1 3.4 22 5 0 2 43 14 100
2 1 0 6.8 1.8 17 5 0 3 58 22 150
2 1 1 9.2 3.4 22 5 1 0 33 10 100
2 1 2 12 4.1 26 5 1 1 46 14 120
2 2 0 9.3 3.4 22 5 1 2 63 22 150

92

2 2 1 12 4.1 26 5 1 3 84 34 220
2 2 2 14 5.9 36 5 2 0 49 15 150
2 3 0 12 4.1 26 5 2 1 70 22 170
2 3 1 14 5.9 36 5 2 2 94 34 230
2 4 0 15 5.9 36 5 2 3 120 36 250
3 0 0 7.8 2.1 22 5 2 4 150 58 400
3 0 1 11 3.5 23 5 3 0 79 22 220
3 0 2 13 5.6 35 5 3 1 110 34 250
3 1 0 11 3.5 26 5 3 2 140 52 400
3 1 1 14 5.6 36 5 3 3 180 70 400
3 1 2 17 6 36 5 3 4 210 70 400
3 2 0 14 5.7 36 5 4 0 130 36 400
3 2 1 17 6.8 40 5 4 1 170 58 400
3 2 2 20 6.8 40 5 4 2 220 70 440
3 3 0 17 6.8 40 5 4 3 280 100 710
3 3 1 21 6.8 40 5 4 4 350 100 710
3 3 2 24 9.8 70 5 4 5 430 150 1 100
3 4 0 21 6.8 40 5 5 0 240 70 710
3 4 1 24 9.8 70 5 5 1 350 100 1 100
3 5 0 25 9.8 70 5 5 2 540 150 1 700
4 0 0 13 4.1 35 5 5 3 920 220 2 600
4 0 1 17 5.9 36 5 5 4 1 600 400 4 600
5 5 5 >1
600
700 --

Tabla 17. Para 10 tubos cada uno con 0.1, 0.01 y 0.001 g de inculo, el NMP y los intervalos de
confianza
confianza

93

0 0 0 <.90 -- 3.1 8 2 0 17 7.7 34
0 0 1 0.9 0.04 3.1 8 2 1 19 9 34
0 0 2 1.8 0.33 5.1 8 2 2 21 10 39
0 1 0 0.9 0.04 3.6 8 2 3 23 11 44
0 1 1 1.8 0.33 5.1 8 3 0 19 9 34
0 2 0 1.8 0.33 5.1 8 3 1 21 10 39
0 2 1 2.7 0.8 7.2 8 3 2 24 11 44
0 3 0 2.7 0.8 7.2 8 3 3 26 12 50
1 0 0 0.94 0.05 5.1 8 4 0 22 10 39
1 0 1 1.9 0.33 5.1 8 4 1 24 11 44
1 0 2 2.8 0.8 7.2 8 4 2 26 12 50
1 1 0 1.9 0.33 5.7 8 4 3 29 14 58
1 1 1 2.9 0.8 7.2 8 5 0 24 11 44
1 1 2 3.8 1.4 9 8 5 1 27 12 50
1 2 0 2.9 0.8 7.2 8 5 2 29 14 58
1 2 1 3.8 1.4 9 8 5 3 32 15 62
1 3 0 3.8 1.4 9 8 6 0 27 12 50
1 3 1 4.8 2.1 11 8 6 1 30 14 58
1 4 0 4.8 2.1 11 8 6 2 33 15 62
2 0 0 2 0.37 7.2 8 7 0 30 14 58
2 0 1 3 0.81 7.3 8 7 1 33 17 73
2 0 2 4 1.4 9 8 7 2 36 17 74
2 1 0 3 0.82 7.8 8 8 0 34 17 73
2 1 1 4 1.4 9 8 8 1 37 17 74
2 1 2 5 2.1 11 9 0 0 17 7.5 31
2 2 0 4 1.4 9.1 9 0 1 19 9 34
2 2 1 5 2.1 11 9 0 2 22 10 39

94

2 2 2 6.1 3 14 9 0 3 24 11 44
2 3 0 5.1 2.1 11 9 1 0 19 9 39
2 3 1 6.1 3 14 9 1 1 22 10 40
2 4 0 6.1 3 14 9 1 2 25 11 44
2 4 1 7.2 3.1 15 9 1 3 28 14 58
2 5 0 7.2 3.1 15 9 1 4 31 14 58
3 0 0 3.2 0.9 9 9 2 0 22 10 44
3 0 1 4.2 1.4 9.1 9 2 1 25 11 46
3 0 2 5.3 2.1 11 9 2 2 28 14 58
3 1 0 4.2 1.4 10 9 2 3 32 14 58
3 1 1 5.3 2.1 11 9 2 4 35 17 73
3 1 2 6.4 3 14 9 3 0 25 12 50
3 2 0 5.3 2.1 12 9 3 1 29 14 58
3 2 1 6.4 3 14 9 3 2 32 15 62
3 2 2 7.5 3.1 15 9 3 3 36 17 74
3 3 0 6.5 3 14 9 3 4 40 20 91
3 3 1 7.6 3.1 15 9 4 0 29 14 58
3 3 2 8.7 3.6 17 9 4 1 33 15 62
3 4 0 7.6 3.1 15 9 4 2 37 17 74
3 4 1 8.7 3.6 17 9 4 3 41 20 91
3 5 0 8.8 3.6 17 9 4 4 45 20 91
4 0 0 4.5 1.6 11 9 5 0 33 17 73
4 0 1 5.6 2.2 12 9 5 1 37 17 74
4 0 2 6.8 3 14 9 5 2 42 20 91
4 1 0 5.6 2.2 12 9 5 3 46 20 91
4 1 1 6.8 3 14 9 5 4 51 25 120
4 1 2 8 3.6 17 9 6 0 38 17 74
4 2 0 6.8 3 15 9 6 1 43 20 91

95

4 2 1 8 3.6 17 9 6 2 47 21 100
4 2 2 9.2 3.7 17 9 6 3 53 25 120
4 3 0 8.1 3.6 17 9 7 0 44 20 91
4 3 1 9.3 4.5 18 9 7 1 49 21 100
4 3 2 10 5 20 9 7 2 54 25 120
4 4 0 9.3 4.5 18 9 7 3 60 26 120
4 4 1 11 5 20 9 8 0 50 25 120
4 5 0 11 5 20 9 8 1 55 25 120
4 5 1 12 5.6 22 9 8 2 61 26 120
4 6 0 12 5.6 22 9 8 3 68 30 140
5 0 0 6 2.5 14 9 9 0 57 25 120
5 0 1 7.2 3.1 15 9 9 1 63 30 140
5 0 2 8.5 3.6 17 9 9 2 70 30 140
5 0 3 9.8 4.5 18 10 0 0 23 11 44
5 1 0 7.3 3.1 15 10 0 1 27 12 50
5 1 1 8.5 3.6 17 10 0 2 31 14 58
5 1 2 9.8 4.5 18 10 0 3 37 17 73
5 1 3 11 5 21 10 1 0 27 12 57
5 2 0 8.6 3.6 17 10 1 1 32 14 61
5 2 1 9.9 4.5 18 10 1 2 38 17 74
5 2 2 11 5 21 10 1 3 44 20 91
5 3 0 10 4.5 18 10 1 4 52 25 120
5 3 1 11 5 21 10 2 0 33 15 73
5 3 2 13 5.6 23 10 2 1 39 17 79
5 4 0 11 5 21 10 2 2 46 20 91
5 4 1 13 5.6 23 10 2 3 54 25 120
5 4 2 14 7 26 10 2 4 63 30 140
5 5 0 13 6.3 25 10 3 0 40 17 91

96

5 5 1 14 7 26 10 3 1 47 20 100
5 6 0 14 7 26 10 3 2 56 25 120
6 0 0 7.8 3.1 17 10 3 3 66 30 140
6 0 1 9.2 3.6 17 10 3 4 77 34 150
6 0 2 11 5 20 10 3 5 89 39 180
6 0 3 12 5.6 22 10 4 0 49 21 120
6 1 0 9.2 3.7 18 10 4 1 59 25 120
6 1 1 11 5 21 10 4 2 70 30 150
6 1 2 12 5.6 22 10 4 3 82 38 180
6 1 3 14 7 26 10 4 4 94 44 180
6 2 0 11 5 21 10 4 5 110 50 210
6 2 1 12 5.6 22 10 5 0 62 26 140
6 2 2 14 7 26 10 5 1 74 30 150
6 2 3 15 7.4 30 10 5 2 87 38 180
6 3 0 12 5.6 23 10 5 3 100 44 180
6 3 1 14 7 26 10 5 4 110 50 210
6 3 2 15 7.4 30 10 5 5 130 57 220
6 4 0 14 7 26 10 5 6 140 70 280
6 4 1 15 7.4 30 10 6 0 79 34 180
6 4 2 17 9 34 10 6 1 94 39 180
6 5 0 16 7.4 30 10 6 2 110 50 210
6 5 1 17 9 34 10 6 3 120 57 220
6 5 2 19 9 34 10 6 4 140 70 280
6 6 0 17 9 34 10 6 5 160 74 280
6 6 1 19 9 34 10 6 6 180 91 350
6 7 0 19 9 34 10 7 0 100 44 210
7 0 0 10 4.5 20 10 7 1 120 50 220
7 0 1 12 5 21 10 7 2 140 61 280

97

7 0 2 13 6.3 25 10 7 3 150 73 280
7 0 3 15 7.2 28 10 7 4 170 91 350
7 1 0 12 5 22 10 7 5 190 91 350
7 1 1 13 6.3 25 10 7 6 220 100 380
7 1 2 15 7.2 28 10 7 7 240 110 480
7 1 3 17 7.7 31 10 8 0 130 60 250
7 2 0 13 6.4 26 10 8 1 150 70 280
7 2 1 15 7.2 28 10 8 2 170 80 350
7 2 2 17 7.7 31 10 8 3 200 90 350
7 2 3 19 9 34 10 8 4 220 100 380
7 3 0 15 7.2 30 10 8 5 250 120 480
7 3 1 17 9 34 10 8 6 280 120 480
7 3 2 19 9 34 10 8 7 310 150 620
7 3 3 21 10 39 10 8 8 350 150 620
7 4 0 17 9 34 10 9 0 170 74 310
7 4 1 19 9 34 10 9 1 200 91 380
7 4 2 21 10 39 10 9 2 230 100 480
7 4 3 23 11 44 10 9 3 260 120 480
7 5 0 19 9 34 10 9 4 300 140 620
7 5 1 21 10 39 10 9 5 350 150 630
7 5 2 23 11 44 10 9 6 400 180 820
7 6 0 21 10 39 10 9 7 460 210 970
7 6 1 23 11 44 10 9 8 530 210 970
7 6 2 25 12 46 10 9 9 610 280 1 300
7 7 0 23 11 44 10 10 0 240 110 480
7 7 1 26 12 50 10 10 1 290 120 620
8 0 0 13 5.6 25 10 10 2 350 150 820
8 0 1 15 7 26 10 10 3 430 180 970

98

8 0 2 17 7.5 30 10 10 4 540 210 1 300
8 0 3 19 9 34 10 10 5 700 280 1 500
8 1 0 15 7.1 28 10 10 6 920 350 1 900
8 1 1 17 7.7 31 10 10 7 1 200 480 2 400
8 1 2 19 9 34 10 10 8 1 600 620 3 400
8 1 3 21 10 39 10 10 9 2 300 810 5 300
10 10 10 >2
300
1 300 --

Tabla 18. Para 8 tubos cada uno con 0.1, 0.01 y 0.001 g de inculo, el NMP y los intervalos de
Tubos positivos
NMP/g
Lmites de confianza
0.1 0.01 0.001 Inferior Superior
0 0 0 <1.2 -- 4.3
0 0 1 1.1 .057 4.3
0 0 2 2.3 .42 6.7
0 1 0 1.1 .058 4.4
0 1 1 2.3 .42 6.7
0 2 0 2.3 .42 6.7
0 2 1 3.4 1.0 9.1
0 3 0 3.4 1.0 9.1
1 0 0 1.2 .064 6.7
1 0 1 2.4 .42 6.8
1 0 2 3.6 1.0 9.1
1 1 0 2.4 .42 7.3
1 1 1 3.6 1.0 9.1
1 1 2 4.8 1.8 12
1 2 0 3.6 1.0 9.1

99

1 2 1 4.9 1.8 12
1 3 0 4.9 1.8 12
1 3 1 6.1 2.8 15
1 4 0 6.2 2.8 15
2 0 0 2.6 .47 9.1
2 0 1 3.8 1.0 9.1
2 0 2 5.1 1.8 12
2 1 0 3.9 1.0 9.9
2 1 1 5.2 1.8 12
2 1 2 6.5 2.8 15
2 2 0 5.2 1.8 12
2 2 1 6.5 2.8 15
2 2 2 7.9 3.3 18
2 3 0 6.6 2.8 15
2 3 1 7.9 3.3 18
2 4 0 8.0 3.3 18
2 5 0 9.4 4.3 19
3 0 0 4.1 1.2 12
3 0 1 5.5 1.9 12
3 0 2 6.9 2.8 15
3 1 0 5.6 1.9 13
3 1 1 7.0 2.8 15
3 1 2 8.4 4.0 18
3 2 0 7.0 2.9 15
3 2 1 8.5 4.0 18
3 2 2 10 4.3 19
3 3 0 8.6 4.0 18
3 3 1 10 4.3 19

100

3 3 2 12 5.2 24
3 4 0 10 4.3 19
3 4 1 12 5.2 24
3 5 0 12 5.2 24
4 0 0 6.0 2.1 15
4 0 1 7.5 2.9 15
4 0 2 9.1 4.1 18
4 1 0 7.6 2.9 18
4 1 1 9.2 4.1 19
4 1 2 11 4.3 22
4 2 0 9.3 4.1 19
4 2 1 11 4.3 22
4 2 2 13 5.7 24
4 3 0 11 4.3 22
4 3 1 13 5.7 24
4 3 2 14 6.6 28
4 4 0 13 5.7 24
4 4 1 15 6.6 29
4 5 0 15 6.6 29
4 5 1 16 7.2 33
4 6 0 17 7.2 33
5 0 0 8.3 3.3 18
5 0 1 10 4.3 19
5 0 2 12 5.2 24
5 0 3 14 6.6 29
5 1 0 10 4.3 22
5 1 1 12 5.2 24
5 1 2 14 6.6 29

101

5 1 3 16 6.7 32
5 2 0 12 5.3 24
5 2 1 14 6.6 29
5 2 2 16 7.2 33
5 2 3 18 7.2 33
5 3 0 14 6.6 29
5 3 1 16 7.2 33
5 3 2 18 7.2 33
5 4 0 16 7.2 33
5 4 1 18 7.6 33
5 4 2 21 9.0 39
5 5 0 19 7.6 33
5 5 1 21 9.0 39
5 6 0 21 9.0 39
6 0 0 11 4.3 24
6 0 1 13 5.7 25
6 0 2 16 6.6 32
6 0 3 18 7.2 33
6 1 0 14 5.8 29
6 1 1 16 6.6 32
6 1 2 18 7.2 33
6 1 3 21 9.0 39
6 2 0 16 6.7 33
6 2 1 18 7.4 33
6 2 2 21 9.0 39
6 2 3 23 11 50
6 3 0 19 7.6 35
6 3 1 21 9.0 39

102

6 3 2 24 11 50
6 3 3 27 12 53
6 4 0 21 9.0 40
6 4 1 24 11 50
6 4 2 27 12 53
6 6 1 31 13 69
6 7 0 31 13 69
7 0 0 16 6.6 32
7 0 1 18 7.2 33
7 0 2 21 9.0 40
7 0 3 25 11 50
7 1 0 19 7.9 39
7 1 1 22 9.0 40
7 1 2 25 11 50
7 1 3 29 12 54
7 2 0 22 9.0 45
7 2 1 25 11 51
7 2 2 29 13 68
7 2 3 33 13 69
7 3 0 26 11 53
7 3 1 30 13 68
7 3 2 34 13 69
7 3 3 39 17 91
7 4 0 30 13 69
7 4 1 35 13 69
7 4 2 39 17 91
7 4 3 45 18 101
7 5 0 36 14 75

103

7 5 1 40 17 91
7 5 2 46 18 101
7 5 3 52 21 117
7 6 0 41 17 91
7 6 1 47 21 117
7 6 2 53 21 117
7 6 3 59 24 146
7 7 0 48 21 117
7 7 1 55 21 117
7 7 2 61 24 146
7 8 0 56 21 119
8 0 0 23 9.7 50
8 0 1 28 12 54
8 0 2 34 13 69
8 0 3 41 17 91
8 1 0 29 12 68
8 1 1 35 13 75
8 1 2 43 17 91
8 1 3 52 21 120
8 1 4 63 28 150
8 2 0 36 14 91
8 2 1 45 17 100
8 2 2 55 21 120
8 2 3 67 28 150
8 2 4 81 32 190
8 3 0 47 18 120
8 3 1 58 21 150
8 3 2 72 28 150

104

8 3 3 87 39 190
8 3 4 102 39 190
8 3 5 118 50 240
8 4 0 62 24 150
8 4 1 77 28 190
8 4 2 94 39 190
8 4 3 110 44 220
8 4 4 130 53 250
8 4 5 150 68 280
8 5 0 84 32 190
8 5 1 100 39 220
8 5 2 120 50 250
8 5 3 140 67 280
8 5 4 170 74 340
8 5 5 190 74 340
8 5 6 210 90 400
8 6 0 110 45 240
8 6 1 140 53 280
8 6 2 160 68 340
8 6 3 190 74 340
8 6 4 220 90 400
8 6 5 250 120 490
8 6 6 290 120 520
8 7 0 160 68 340
8 7 1 190 74 400
8 7 2 230 90 490
8 7 3 270 116 520
8 7 4 310 150 710

105

8 7 5 370 150 720
8 7 6 430 190 1 000
8 7 7 510 190 1 000
8 8 0 240 99 490
8 8 1 300 120 710
8 8 2 380 150 1 000
8 8 3 510.0 190 1 200
8 8 4 700 240 1 700
8 8 5 980 340 2 200
8 8 6 1 400 490 3 100
8 8 7 2 100 710 5 100
8 8 8 >2 100 1 000 --

Tabla 19. Para 10 tubos con 10 ml de inculo, el NMP por 100 ml y los intervalos de confianza
del 95 por ciento.
Tubos positivos NMP/100ml Lmites de confianza
Inferior Superior
0 <1.1 - 3.3
1 1.1 .05 5.9
2 2.2 .37 8.1
3 3.6 .91 9.7
4 5.1 1.6 13
5 6.9 2.5 15
6 9.2 3.3 19
7 12 4.8 24
8 16 5.9 33
9 23 8.1 53
10 >23 12 -

106

4. GLOSARIO DE MEDIOS DE CULTIVO Y OTROS REACTIVOS
Para disear un medio de cultivo se debe tener en cuenta no slo los nutrientes requeridos por el
microorganismo que se desea estudiar, sino tambin las condiciones fsicas que le permitan crecer,
tal y como Hodges (2007), Willey et al., 2008 y Madigan et al., 2011 lo describen:
1. Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene
determinada por el rendimiento de un producto, adems de los requerimientos nutricionales del
microorganismo.
2. pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo como resultado de
las sustancias producidas por el propio microorganismo. Estos cambios pueden llegar a inhibir
el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH
mediante sistemas tampn, el ms utilizado en microbiologa es la combinacin de KH
2
PO
4
y
K
2
HPO
4
.
3. Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el O
2
y
CO
2
. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al O
2
libre clasificndose en 4
grupos:
Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O
2
libre.
Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O
2
libre.
Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en presencia o ausencia de O
2
libre.
Microaerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de O
2
libre.
4. Suministro de luz: Los organismos fotosintticos debern ser expuestos a una fuente de
iluminacin, la cual no debe plantear problemas de variacin de temperatura, por lo que suelen
usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor.
5. Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas y la
velocidad con que se efectan, las cuales estn influidas por la temperatura, por lo cual la
temperatura puede, en parte, determinar el crecimiento de los microorganismos en estudio.
Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento clasificndose segn
esto en:
Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima es alrededor de
los 15 C.
Mesfilas: crecen mejor entre 25 C y 40 C.
Termfilas: crecen mejor entre 45 C y 60 C.
6. Grado de humedad
7. Presin osmtica: generalmente se trabaja en condiciones de isofona (300 miliosmoles),
aunque existen bacterias que pueden crecer en concentraciones hipotnicas e hipertnicas
8. Esterilidad

107

9. Proteccin: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminacin microbiana
ambiental.
Agar-Agar
Sustancia mucilaginosa que se extrae de algunas algas rojas o Rodofceas, frecuentes en el ocano
atlntico, pacfico e ndico. Es una sustancia amorfa. Se emplea como medio de cultivo en
bacteriologa, como apresto de sedas, como sustituto de la gelatina, etc.
La forma seca del agar-agar se conoce de mediados del siglo XVIII, cuando un japons descubri,
accidentalmente, la manera de purificarlo y secarlo. Fue llevado de China a Europa y trado a
Amrica a mediados del siglo XIX, para utilizarse, principalmente, como substituto de la gelatina
en la confeccin de postres gelatinosos. Qumicamente, el agar-agar es una mezcla compleja de
sales de polisacridos, fundamentalmente, galactsidos. Las grandes molculas que lo constituyen
determinan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lo han hecho hasta ahora
insustituible. Adems de los polisacridos, el agar-agar contiene numerosos cationes asociados,
tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, etc. los cuales no est claramente establecida su
influencia sobre las propiedades de este producto.
Referente a las propiedades y contenidos del agar-agar, bsicamente, dependen de la materia prima
empleada, procedencia geogrfica, poca de cosecha y madurez del alga.
A continuacin, se caracterizarn los tipos de medios de cultivo segn su estado y composicin.
Estado:
Medios slidos: Su proporcin de agar es siempre por encima del 15 %.
Medios semislidos: Son medios intermedios entre los medios lquidos y slidos, su
proporcin de agar puede ser inferior al 5 %, pero siempre suele presentar cierta cantidad que le
proporcione una consistencia semislida.
Medios lquidos o caldos: No contiene agar y su composicin (adems de agua) suele
contener al menos una fuente de carbono, sales minerales, y a veces segn las caractersticas del
medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, aminocidos, entre otros.
Composicin:
Medios sintticos o qumicamente definidos: Llevan fuentes de carbono, nitrgeno, sales
que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, etc.), otros elementos como estimuladores de crecimiento pero
siempre a concentraciones conocidas.
Medios complejos o de composicin indefinida: Estos medios llevan ingredientes como
extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes
en abundancia, pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos
nutrientes.
Medios de enriquecimiento: Son medios complejos, normalmente, con aditivos adicionales
para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente hetertrofos
exigentes). Tales como: adicin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de
un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento

108

de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ejemplo: CO
2
como fuente de
carbono es selectivo para auttrofos, adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los
Gram (+), utilizando maltosa como nica fuente de carbono, slo crecern los que usen maltosa.
Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de
microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.
Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia lactosa (+)
de lactosa (-).
Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el
crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Por ejemplo: al aadir
glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es
preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

4.1 Escherichia coli y coliformes
NOM-112-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lactosado (concentracin 1.5, concentracin sencilla).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Peptona de
gelatina
Lactosa Agua
Cantidades
(concentracin
sencilla)
4.5 g 7.5 g 7.5 g 1 000 ml
Cantidades
(concentracin 1.5)
3.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los ingredientes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio
completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera
que despus de la esterilizacin ste sea de 6.9 0.2 a 25 C. Distribuir en volmenes de 10 ml en
tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm el medio de concentracin sencilla y de 20 ml en tubos
de 20 mm x 200 mm el medio de concentracin 1.5, cada tubo debe tener campana de
fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C. Enfriar rpidamente para
evitar una exposicin excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se puede
utilizar una concentracin doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearn 10 ml del caldo
preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lauril sulfato triptosa (concentracin 1.5, concentracin
sencilla).
Ingredientes:
Ingredientes Triptosa Lactosa
Fosfato
dipotsico
Fosfato
monopotsico
Cloruro
de sodio
Lauril
sulfato de
sodio
Agua

109

Cantidades
(concentracin
sencilla)
3.0 g 7.5 g 4.125 g 4.125 g 7.5 g 0.15 g
1 000
ml
Cantidades
(concentracin
1.5)
20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 5.0 g 0.1g
1 000
ml

Preparacin: Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio de
cultivo completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH de tal
manera que despus de la esterilizacin ste sea de 6.8 0.2 a 25 C. Distribuir en volmenes de 10
ml en tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm el medio de concentracin sencilla y de 20 ml en
tubos de 20 mm x 200 mm el medio de concentracin 1.5, cada tubo debe tener campana de
fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C. Se recomienda almacenar
el medio una vez preparado. Las campanas de fermentacin no deben de contener burbujas de aire
despus de la esterilizacin. Se puede utilizar una concentracin doble del medio de cultivo, en
cuyo caso se emplearn 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lactosa bilis verde brillante.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Lactosa Sales biliares
Verde
brillante
Agua
Cantidades 10 g 10 g 20 g 0.0133 g 1.0 L

Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es
necesario. Ajustar el pH, de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 7.2 a 25 C.
Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 mm X 160 mm conteniendo campana de
fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C. Las campanas de
fermentacin no deben contener burbujas de aire despus de la esterilizacin.
NOM-113-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA).
Ingredientes:
Ingredientes Peptona
Extracto de
levadura
Lactosa Sales biliares
Cloruro de
sodio
Cantidades 7.0 g 3.0 g 10.0 g 1.5 g 1.0 L

Preparacin: Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7.4 con cido clorhdrico 0.1N o con hidrxido de sodio
0.1N a 25 C, de tal forma que despus del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con
agitacin constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un bao de
agua hasta que llegue a 45 C. Evitar el sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en
autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas despus de su preparacin. En el caso de
utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.

110

Reactivo o medio de cultivo: Disolucin reguladora de fosfatos.
Ingredientes:
Ingredientes Fosfato monopotsico Agua destilada
Cantidades 34.0 g 1.0 L

Preparacin: Disolver el fosfato en el agua y ajustar el pH a 7.2 con disolucin de hidrxido de
sodio 1 N. Llevar con agua a 1 litro. Esterilizar por 15 min a 121 C. Conservar en refrigeracin
(disolucin concentrada). Tomar 1.25 ml de la disolucin concentrada y llevar a un litro de agua
(disolucin de trabajo). Distribuir en porciones segn se requieran. Esterilizar por 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Agua peptonada.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona NaCl Agua destilada
Cantidades 1.0 g 8.5 g 1.0 L

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH 1 N.
Distribuir en porciones de 99 ml, 90 ml y 9 ml o en cualquier volumen mltiplo de nueve segn se
requiera. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C.
UNE-EN ISO 16654:2002
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona soya modificado (mTSB) + novobiocina (N).
Ingredientes:
Ingredientes Cantidades
Digerido enzimtico de casena 17.0 g
Digerido enzimtico de soya 3.0 g
D(+)-glucosa 2.5 g
Sales biliares n 3 1.5 g
Cloruro de sdio 5.0 g
Dipotasio hidrgeno fosfato (K
2
HPO
4
) 4.0 g
Agua 1 000 ml
*Novobiocina 0.45 g y agua 100 ml
Preparacin: Se disuelven en agua los constituyentes del medio completo deshidratado, calentando
si fuera necesario. Se ajusta el pH si fuera necesario, utilizando el pHmetro, de manera que despus
de la esterilizacin sea de 7.4 0.2 a 25 C. Se reparte el medio en cantidades adecuadas en

111

matraces o frascos. Se esteriliza durante 5 min en autoclave regulado a 121 C. * Se disuelve la
novobiocina en agua y se esteriliza mediante filtracin por membrana. Se prepara el da de su
utilizacin. Preparacin del medio completo: inmediatamente antes de su uso se aade 1 ml 4 ml
de la disolucin de novobiocina a 225 ml a 900 ml respectivamente de mTSB enfriado. La
concentracin final de novobiocina es de 20 mg por litro de mTSB.
Reactivo o medio de cultivo: Agar cefixima telurito sorbitol MacConkey agar (CT-SMAC).
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido
enzimtico
de casena
Digerido
enzimtico
de tejidos
animales
Sorbitol
Sales
biliares
n 3
Cloruro
de
sdio
Rojo
neutro
Violeta
cristal
Agar Agua
Cantidades 17.0 g 3.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g
0.001
g
9.0 g
a
18.0
g
1 000
ml
* Telurito potsico para uso bacteriolgico 5 mg, agua 100 ml. ** Cefixima 5 mg, agua 100 ml.
***Medio completo: medio base 1 000 ml, disolucin de telurito potsico 1 ml, disolucin de
cefixima 1 ml.
Preparacin: Se disuelven en agua mediante ebullicin los constituyentes bsicos, o la base
deshidratada completa. Se ajusta el pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.1 0.2 a
25 C. Se esteriliza durante 15 min en autoclave regulado a 121 C. * Se disuelve el telurito
potsico en el agua y se esteriliza mediante filtracin por membrana. Esta disolucin puede ser
almacenada hasta un mes a temperatura ambiente, pero se desecha si se forma un precipitado
blanco. ** Se disuelve la cefixina en agua y se esteriliza mediante filtracin por membrana, puede
almacenarse la disolucin a 3 C 2 C durante una semana. *** En el caso de medio base recin
esterilizado, se enfra a una temperatura entre 44 C y 47 C y en el caso del medio base
esterilizado previamente y solidificado, se funde en corriente de vapor y a continuacin se enfra
entre 44 C y 47 C. Se aade el telurito y la cefixima al medio base, se mezcla y se vierten
cantidades de unos 15 ml en cajas Petri estriles y se deja solidificar. Antes de su uso, se secan las
placas del agar con las tapas retiradas y con la superficie del agar mirando hacia abajo, en una
estufa regulada entre 25 C y 50 C, no se deben secar demasiado. Si se preparan con antelacin,
las placas sin secar se pueden almacenar en la oscuridad en bolsas de plstico en una nevera a 3 C
2 C durante 2 semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Agar nutritivo.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agar Agua
Cantidades 3.0 g 5.0 g 9.0 a 18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los constituyentes del medio completo deshidratado en el agua mediante
calentamiento si es necesario. Se ajusta el pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.1
0.2 a 25 C . Se transfiere el medio a matraces o frascos de capacidad adecuada. Se esteriliza
durante 15 min en autoclave regulada a 121 C.

112

Reactivo o medio de cultivo: Medio triptona / triptofano.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Cloruro sdico D-L-Triptfano Agua
Cantidades 10.0 g 5.0 g 1.0 g 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los constituyentes en el agua por ebullicin si es necesario. Se ajusta el
pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.1 0.2 a 25 C. Se distribuye en cantidades
de 5 ml en tubos de ensayo o frascos. Se esteriliza durante 15 min en autoclave.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de indol de Kovak.
Ingredientes:
Ingredientes
p-
dimetilaminobenzaldehdo
2-metil-1-butanol 1-
pentanol
cido
clorhdrico
Cantidades 5.0 g 75.0 ml 1 000 ml

Preparacin: Se disuelve el p-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol, calentando si es necesario
entre 44 C y 47 C. Se enfra a temperatura ambiente y se aade el cido clorhdrico. Proteger de
la luz en frasco de vidrio marrn y almacenar a 3 C 2 C. El reactivo deber ser amarillo claro o
marrn claro y libre de precipitado.
Reactivo o medio de cultivo: Tampn fosfato modificado, 0.01 mol/l, pH 7.2.
Ingredientes:
Ingredientes
Cloruro
sdico
Cloruro
potsico
Disodio
hidrgeno
fosfato
(anhidro)
Potasio
dihidrgeno
fosfato
(anhidro)
Monolaurato
de
polioxietileno
sorbitn
(Tween 20
jarabe)
Agua
Cantidades 8.0 g 0.2 g 1.44 g 0.24 g 0.2 ml 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los constituyentes en el agua por ebullicin si es necesario. Se ajusta el
pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.1 0.2 a 25 C. Se distribuye en cantidades
de 5 ml en tubos de ensayo o frascos. Se esteriliza durante 15 min en autoclave. La disolucin
puede parecer turbia pero se aclara tras mantenerla en reposo.

BS 5763: Part 10: 1993
Reactivo o medio de cultivo: Agar glutamato con modificacin mineral.
Ingredientes:

113

Ingredientes
Glutamato de
sodio
Lactosa Formiato de sodio L-cistina
L-cido
asprtico
L-arginina
Cantidades 6.35 g 10 g 0.25 g 0.02 g 0.02 g 0.024 g

Ingredientes
cido
nicotnico
cido
Pantotnico
Sulfato de
magnesio
Citrato de
hierro
amoniacal
(III)
Cloruro de
calcio
dihidratado
Fosfato
dipotsico de
hidrgeno

Ingredientes Cloruro de amonio Tiamina Agar Agua destilada
Cantidades 2.5 g 0.001 g 12 g a 18 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver el cloruro de amonio en el agua. Adicionar los otros componentes y disolver
por agitacin y calentamiento. Ajustar el pH despus de la esterilizacin a 6.7 0.2 a 25 C.
Transferir volmenes de 100 ml del medio a envases adecuados y esterilizar en autoclave por 10
minutos a 115 C. Adicionar a cajas Petri de 12 ml a 15 ml del medio estril y enfriado a
aproximadamente 45 C. Dejar solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona y bilis.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Sales biliares Agar
Agua
destilada
Cantidades 20 g 1.5 g 12 g a 18 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH despus de la
esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C. Transferir volmenes de 100 ml del medio a contenedores
adecuados y esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 C. Adicionar a cajas Petri
estriles de 12 ml a 15 ml del medio enfriado a 45 C. Dejar solidificar y almacenar a 0 C 5 C.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base
Ingredientes:
Ingredientes Triptona
Extracto
de
levadura
Extracto de
carne

Glicina
Cloruro
de litio

Agar
Agua
destilada
Disolucin
de
sulfamezatina
(solo de ser
necesario)
Cantidades 10 g 1 g 5 g 12 g 5 g
12 g
a 20
g
1 000 ml 27.5 ml


114

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por calentamiento. Si es necesario, adicionar los
27.5 ml de la disolucin de sulfamezatina (sulfamidina, INN). Ajustar el pH despus de la
esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C. Transferir volmenes de 90 ml del medio a frascos o botellas de
capacidad no mayor a 300 ml. Esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de telurito
Ingredientes:
Ingredientes
Disolucin de telurito de
potasio
Agua destilada
Cantidades 1 g 100 ml

Preparacin: Disolver el telurito de potasio en el agua con mnimo calentamiento. Esterilizar por
filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de sulfamezatina (sulfadimina, INN), solo en sospecha de
presencia de Proteus.
Ingredientes:
Ingredientes Sulfamezatina
Disolucin de
hidrxido de sodio
(0.1 mol/l)
Agua destilada
Cantidades 0.2 g 10 ml 100 ml

Preparacin: Disolver la sulfamezatina en la disolucin de hidrxido de sodio. Llevar hasta un
volumen final de 100 ml con el agua destilada.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de piruvato de sodio.
Ingredientes:
Ingredientes Piruvato de sodio Agua destilada

Preparacin: Disolver el piruvato en el agua destilada. Filtrar
Reactivo o medio de cultivo: Emulsin yema de huevo.
Ingredientes:
Ingredientes Piruvato de sodio Agua destilada


115

Preparacin: usar huevos frescos, separar las yemas de las claras. Mezclar las yemas
vigorosamente con 4 veces su volumen de agua. Calentar la mezcla en bao de agua, a temperatura
controlada de 45 C, por 2 horas y dejar de 18 h a 24 h a 0 C para permitir que se forme un
precipitado. Decantar el lquido supernadante y esterilizar por filtracin, la emulsin debe ser
separada aspticamente. La emulsin debe almacenarse entre 0 C -5 C por no ms de 72 h.
Reactivo o medio de cultivo: Medio completo.
Ingredientes:
Ingredientes
Medio
base
Disolucin de piruvato
de sodio
Emulsin yema de
huevo
potasio

Cantidades 90 ml 5 ml 5 ml 1 ml

Preparacin: Disolver el medio base y enfriar a aproximadamente 50 C. Adicionar los otros
lquidos, mezclando bien despus de cada adicin. Distribuir de 15 ml a 20 ml del medio completo
en cajas Petri y dejar solidificar.
5763:Part 10:1993
Reactivo o medio de cultivo: Caldo glucosa bilis verde brillante tamponado (caldo E.E.).
Ingredientes:
Medio doble
Ingredientes Peptona Glucosa Na
2
HPO
4
KH
2
PO
4

Bilis Ox
deshidratada
Verde
brillante
Agua destilada
Cantidades 20 g 10 g 12.9 g 4 g 40 g 0.03 g 1 000 ml

Medio simple
Ingredientes Peptona Glucosa Na
2
HPO
4
KH
2
PO
4

Bilis Ox
deshidratada
Verde
brillante
Agua destilada
Cantidades 10 g 5 g 6.45 g 2 g 20 g 0.015 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los ingredientes en el agua destilada por medio de calentamiento. No
calentar el medio por ms de 30 minutos. Enfriar el medio rpidamente. Ajustar el pH despus del
calentamiento a 7.2 a 25 C. Transferir porciones de 10 ml a tubos o botes estriles. El medio no
debe ser esterilizado en autoclave.
Reactivo o medio de cultivo: Agar glucosa bilis rojo violeta (VRBG) .
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Glucosa
Extracto de
levadura
Cloruro de
sodio
Sales
biliares

Cantidades 7 g 10 g 3 g 5 g 1.5 g


116

Ingredientes Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada por medio de calentamiento. No
calentar el medio por ms de 30 minutos. Ajustar el pH despus del calentamiento a 7.2 a 25 C.
Transferir el medio de cultivo a tubos, botellas o frascos estriles de capacidad no mayor a 500 ml.
El medio no debe ser esterilizado en autoclave. Preparar el medio justo antes de su uso. Preparacin
en cajas Petri: distribuir aproximadamente 15 ml del medio de cultivo, enfriado a aproximadamente
a 45 C, en cajas Petri y dejar solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Agar glucosa.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Glucosa
Extracto
de
levadura
Cloruro
de
sodio
Prpura de
bromocresol
Agar Agua destilada
Cantidades 10 g 10 g 1.5 g 5 g 0.015 g
8 g a 18
g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada por medio de calentamiento. Ajustar el
pH despus de la esterilizacin a 7.0 a 25 C. Distribuir 15 ml del medio de cultivo a tubos o
frascos. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 C. Colocar los tubos o frascos en posicin
vertical.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Peptona Agar Agua destilada
Cantidades 3 g 5 g 8 g a 18 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada por medio de calentamiento. Ajustar el
pH despus de la esterilizacin a 7.0 a 25 C. Trasferir el medio de cultivo a tubos, botellas o
frascos de capacidad no mayor a 500 ml. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 C. Preparacin
en cajas Petri: distribuir aproximadamente 15 ml del medio de cultivo, enfriado a aproximadamente
45 C, en cajas Petri y dejar solidificar.

BS 5763: Part 13: 1989
Ingredientes:

117

Ingredientes
Glutamato de
sodio
L-cido
asprtico
L-arginina

Ingredientes
cido
nicotnico
cido
pantotnico
Sulfato de
magnesio
Citrato de
hierro
amoniacal
(III)
Cloruro de
calcio
dihidratado
Fosfato
dipotsico de
hidrgeno


Preparacin: Disolver el cloruro de amonio en el agua. Adicionar los otros componentes y disolver
por agitacin y calentamiento. Ajustar el pH despus de la esterilizacin a 6.7 0.2 a 25 C.
Transferir volmenes de 100 ml del medio a envases adecuados y esterilizar en autoclave por 10
minutos a 115 C. Adicionar a cajas Petri de 12 ml a 15 ml del medio estril y enfriado a
aproximadamente 45 C. Dejar solidificar.
Ingredientes:
Agua
destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH despus de la
esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C. Transferir volmenes de 100 ml del medio a contenedores
adecuados y esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 C. Adicionar a cajas Petri
estriles de 12 ml a 15 ml del medio enfriado a 45 C. Dejar solidificar y almacenar de 0 C 5 C.

BAM Captulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias coliformes
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lactosa bilis verde brillante.
Ingredientes:

118

Ingredientes Peptona Lactosa Sales biliares
Verde
brillante
Agua
Cantidades 10.0 g 10.0 g 20.0 g 0.0133 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver la peptona y lactosa en 500 ml de agua destilada. Adicionar las sales biliares
a 200 ml de agua destilada. El pH de la disolucin es aproximadamente de 7.0-7.5. Mezclar y aadir
agua hasta un volumen final de 975 ml. Ajustar el pH a 7.4. Adicionar 13.3 ml de verde brillante (1
%) disuelto en agua destilada. Aadir agua destilada hasta completar 1 000 ml. Distribuir el medio
en tubos. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C. Las campanas de fermentacin
no deben contener burbujas de aire despus de la esterilizacin.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lauril sulfato triptosa (LST).
Ingredientes:
Ingredientes Triptosa Lactosa
Fosfato
dipotsico
Fosfato
monopotsico
Cloruro
de sodio
Lauril
sulfato
de
sodio
Agua
destilada
Cantidades 20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 5.0 g 0.1 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en 1 000 ml de agua. Distribuir en volmenes de 10 ml en
tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm, cada tubo debe tener campana de fermentacin.
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C. pH final 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo EC.
Ingredientes:
Ingredientes Triptosa Sales biliares n 3
Fosfato
dipotsico
Fosfato
monopotsico
Cloruro
de
sodio
Agua
destilada
Cantidades 20.0 g 1.5 g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1 000 ml

Preparacin: Distribuir en volmenes de 8 ml en tubos de dimensiones de 16 mm x 150 mm con
tubos de fermentacin invertidos de 10 mm x 75 mm. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121
C. pH final 6.9 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Levine de Eosin-Azul de metileno (L-EMB).
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Lactosa K
2
HPO
4
Agar Eosin Y
Azul de
metileno
Agua
destilada

119

Preparacin: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullicin si es necesario.
Aadir agua para obtener el volumen original. Distribuir en porciones de (100 o 200) ml y
esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C. pH final 7.1 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Agua
Cantidades 10.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver y distribuir en cantidades de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm
o 16 mm x 150 mm. Se esteriliza durante 15 min en autoclave a 121 C. Ajustar el pH a 6.9 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo MR-VP.
Ingredientes:
Medio 1:
Fosfato
dipotsico
(K
2
HPO
4
)
Agua destilada

Medio 2:
Ingredientes
Digerido
pancretico
de casena
Digerido
enzimtico de
tejidos
animales
Dextrosa
Fosfato de
potasio
Agua destilada

Medio 3:
Ingredientes Peptona Glucosa Buffer de fosfatos Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes con calentamiento si es necesario. Distribuir en cantidades
de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min. Ajustar
el pH a 6.9 0.2. Medio 3: Disolver los ingredientes en agua. Distribuir en cantidades de 10 ml en
tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min. Ajustar el pH a 7.5
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo citrato de Koser.

120

Ingredientes:
Ingredientes
NaNH
4
HPO
4
4H
2
O
(monobsico)
MgSO
4
7H
2
O
Citrato de
sodio 2H
2
O
Agua
destilada

Preparacin: Distribuir en cantidades necesarias en tubos de rosca. Esterilizar en autoclave durante
15 min. Ajustar el pH a 6.7 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar recuento en placa.
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Dextrosa Agar
Agua
destilada

Preparacin: Calentar para disolver los ingredientes. Colocar el medio en tubos o frascos.
Esterilizar 15 min a 121 C. pH final 7.0 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Amortiguador de fosfato.
Ingredientes:
Ingredientes KH
2
PO
4
Agua destilada
Cantidades 34.0 g 500 ml

Preparacin: Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1 N. Llevar el volumen a 1 litro con agua destilada.
Esterilizar 15 min a 121 C. Almacenar en refrigeracin.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de indol de Kovak.
Ingredientes:
Ingredientes p-dimetilaminobenzaldehdo
2-metil-1-butanol
1-pentanol
cido
clorhdrico

Preparacin: Se disuelve el p-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol, calentando si es necesario
entre 44 C y 47 C. Enfriar a temperatura ambiente y se aade el cido clorhdrico.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para prueba Voges-Proskauer (VP)
Ingredientes:
Disolucin 1:
Ingredientes -Naftol 5 g Alcohol (absoluto)

121


Disolucin 2:
Ingredientes Hidrxido de potasio Agua destilada

Preparacin: Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y aadir 0.6 ml de la disolucin 1 y 0.2 ml de la
disolucin 2. Agitar despus de cada adicin. Para intensificar y apresurar la reaccin, aadir unos
cristales de creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados despus de
4 h de adicionar los reactivos.
Reactivo o medio de cultivo: Cristal violeta de Hucker.
Ingredientes:
Disolucin A:
Ingredientes Cristal violeta (90 %) Etanol (95 %)

Disolucin B:
Ingredientes Oxalato de amonio Agua destilada

Preparacin: Mezclar las soluciones A y B. Almacenar por 24 h y filtrar con papel filtro.
Reactivo o medio de cultivo: LUGOL.
Ingredientes:
Ingredientes Yodo Yoduro de potasio (KI) Agua destilada
Cantidades 1.0 g 2.0 g 300 ml

Preparacin: Colocar el yoduro de potasio en el mortero, aadir el yodo, moler de 5 min a 10 min.
Aadir de manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada
aplicacin. Verter esta disolucin en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y
adicionar a la botella del reactivo.
Reactivo o medio de cultivo: Contraste de Hucker (disolucin stock)
Ingredientes:
Ingredientes Safranina O Agua destilada


122

Preparacin: Disolucin de trabajo: aadir 10 ml de la disolucin stock a 90 ml de agua destilada.
Reactivo o Medio de cultivo: Tincin de Gram.
Ingredientes: Cristal violeta, LUGOL y Contraste de Hucker.
Preparacin: Transferir a una laminilla la muestra del cultivo. Pasar la laminilla por la flama varias
veces muy rpido y esperar que la muestra se seque. Aadir una gota de cristal violeta, esperar 1
min a que seque. Lavar con agua. Esperar a que se seque. Colocar una gota de LUGOL, dejar secar
y lavar con agua. Secar. Decolorar con etanol al 95 %. Lavar con agua. Dejar secar. Agregar una
gota de safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente. Observar al
microscopio.
Reactivo o medio de cultivo: Indicador rojo de metilo.
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Etanol al 95 % Agua destilada para un
volumen final de 500 ml Cantidades 0.10 g 300 ml

Preparacin: Disolver el rojo de metilo en el etanol. Ajustar el volumen a 500 ml con agua
destilada.
Reactivo o medio de cultivo: Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (BRVA).
Ingredientes:
Extracto
de
levadura
Lactosa
Sales
biliares
Cloruro
de
sodio
Rojo
neutro
Cristal
violeta
Agar
Agua
destilada
0.002
g
15.0 g
1 000
ml

Preparacin: Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7.4. Calentar con agitacin constante y hervir durante 2
minutos. No esterilizar. Antes de su uso enfriar el medio en un bao de agua hasta que llegue a 45
C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar BRVA-MUG.
Ingredientes:
Ingredientes MUG Medio VRBA

Preparacin: Aadir 0.1 g de MUG a los ingredientes de 1 litro de VRBA, continuar con el
procedimiento para VRBA.

123

Reactivo o Medio de cultivo: Medio EC-MUG.
Ingredientes:
Ingredientes MUG Caldo EC
Cantidades 50 mg 1 000 ml

Preparacin: Preparar como el caldo EC, pero adicionar 50 mg de MUG por litro, antes de
esterilizar.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lauril triptosa MUG (LST-MUG).
Ingredientes:
Ingredientes Triptosa Lactosa K
2
HPO
4
KH
2
PO
4

Cloruro de
sodio
Lauril
sulfato
de sodio
MUG
Agua
destilada
50.0
mg
1 000 ml

Preparacin: Preparar el caldo lauril triptosa y aadir MUG. Disolver con agitacin y
calentamiento si es necesario. Distribuir en porciones de 10 ml en tubos de ensayo de 20 mm x 150
mm con tubo de fermentacin de 10 mm x 75 mm. Esterilizar 15 min a 121 C. pH final 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Diluyente peptona.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Agua destilada

Preparacin: Esterilizar 15 min a 121 C. pH final 7.0 0.2.

BAM: Captulo 4A. Escherichia coli diarreognica
Medio de cultivo: Caldo triptona fosfato (TP).
Ingredientes:
Ingredientes Triptona K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
NaCl
Polisorbato 80
(Tween 80)
Agua
destilada
Cantidades 20.0 g 2.0 g 2.0 g 5.0 g 1.5 ml 1 L

Preparacin: Disolver los constituyentes en el agua destilada, calentar si es necesario. Esterilizar
15 min a 121 C. pH final , 7.0 0.2.

124

Medio de cultivo: Caldo y agar infusin cerebro corazn (BHI).
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes
Infusin
de
cerebro
de ternera
Infusin
de 250 g
de corazn
de res
Peptona
proteoso
(Difco) o
polipeptona
(Bioquest)
NaCl Na
2
HPO
4
* Dextrosa
Agua
destilada
Cantidades 200.0 g 2.0 g 10 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 1 L
*Difco no especifica aguas de hidratacin
Medio 2:
Ingredientes
Infusin
cerebro
corazn
Digerido
pptico de
tejido
animal
NaCl Dextrosa
Digerido
pancretico de
gelatina
Na
2
H
PO
4
*
*
Agua
destilada
Cantidades 6.0 g 6.0 g 5.0 g 3.0 g 14.5 g 2.5 g 1 L
**BBL no especifica aguas de hidratacin.
Preparacin: Medio 1: Disolver los ingredientes del medio 1 en agua destilada con calentamiento
suave. Medio 2: Suspender los ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir durante 1 min
hasta disolver completamente. Para ambos medios 1 y 2, verter el caldo dentro de botellas o tubos
para su almacenamiento. Esterilizar 15 min a 121 C. pH final , 7.4 0.2. BHI comercial tambin es
aceptable. Para preparar el agar infusin cerebro corazn, adicionar 15 g de agar a 1 litro de caldo
BHI. Calentar hasta disolver el agar antes de verter en botellas o matraces. Esterilizar 15 min a 121
C.
Medio de cultivo: Agar Levine de Eosin-Azul de metileno (L-EMB).
Ingredientes:

2
HPO
4
Agar Eosin Y
Azul de
metileno
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 10.0 g 2.0 g 15.0 g 0.4 g 0.065 g 1 L

Preparacin: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullicin si es necesario.
Aadir agua para obtener el volumen original. Distribuir en porciones de (100 o 200) ml y
esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C. pH final 7.1 0.2.
Medio de cultivo: Agar McConkey.
Ingredientes:

125

Ingredientes
Peptona
proteos
a o
polipep
tona
Peptona
o
gelisado
Lactosa
Sales
biliares
no. 3 o
mezcla de
sales
biliares
NaCl
Rojo
neutro
Cristal
violeta
Agar
Agua
destil
ada
Cantidades 3.0 g 17.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g 0.001 g 13.5 g 1 L

Preparacin: Suspender los ingredientes y calentar con agitacin hasta disolver. Hervir por 1 min a
2 min. Esterilizar 15 min a 121 C, enfriar a 45 C -50 C, y verter porciones de 20 ml dentro de
cajas Petri estriles de 15 mm x 100 mm. Secar a temperatura ambiente con la tapa cerrada. No usar
cajas hmedas. pH final , 7.1 0.2.
Medio de cultivo: Agar triple azcar hierro (agar TSI).
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes Polipeptona NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa
Cantidades 20.0 g 5.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g

Ingredientes Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
6H
2
O Na
2
S
2
O
3
Rojo fenol Agar
Agua
destilada
Cantidades 0.2 g 0.2 g 0.025 g 13 g 1 000 ml

Medio 2:
Ingredientes
Extracto de
carne
Extracto de
levadura
Peptona
Peptona
proteosa
Cloruro
sdico
(NaCl)
Lactosa

Ingredientes Sacarosa Glucosa
Sulfato
frrico
Tiosulfato
sdico
Rojo fenol Agar Agua
Cantidades 10. 0 g 1.0 g 0.2 g 0.3 g 0.024 g 12.0 g 1 000 ml

Preparacin: Puede utilizarse cualquiera de los dos medios. Medio 1: Se disuelven los
componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fuera necesario. Se reparte
el medio en tubos de ensayo. Se esteriliza en autoclave regulado a 118 C durante 15 min. pH 7.3
0.2. Medio 2: se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave
regulado a 121 C durante 15 min. pH 7.4 0.2.
Medio de cultivo: Agar sangre base (Agar infusin) BAB.
Ingredientes:

126

Ingredientes
Infusin de
msculo de
corazn
Triptona NaCl Agar Agua destilada
Cantidades 375 g 10.0 g 5.0 g 15.0 g 1 L

Preparacin: Calentar suavemente hasta disolver. Esterilizar 20 min a 121 C. pH final, 7.3 0.2.
Tambin puede utilizarse agar de infusin de corazn deshidratado comercial.
Medio de cultivo: Caldo triptona (Triptfano), 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona o tripticasa Agua destilada
Cantidades 10.0 g 1 L

Preparacin: Disolver y verter porciones de 5 ml en tubos de ensayo de (16 x 125) mm o 16 mm x
150 mm. Esterilizar 15 min a 121C. pH final, 6.9 0.2.
Medio de cultivo: Caldo prpura de bromocresol suplementado individualmente con 0.5 % (p/v) de
cada uno: glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa.
Ingredientes:
Extracto de
carne de res
NaCl
Prpura de
bromocresol
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 3.0 g 5.0 g 0.04 g 1 L

Preparacin: Verter porciones de 2.5 ml de disolucin base dentro de tubos de ensayo de 13 mm x
100 mm conteniendo tubos de fermentacin de 6 mm x 50 mm invertidos. Esterilizar 10 min a 121
C. pH final, 7.0 0.2. Esterilizar (en autoclave) por separado disoluciones madre de carbohidratos
(50 % p/v) o preferentemente por filtracin (0.2 m tamao de poro). Adicionar 0.278 ml 0.002
ml de la disolucin madre de carbohidratos a 2.5 ml de medio basal para dar una concentracin final
de carbohidratos de 5 % p/v.
Medio de cultivo: Caldo urea.
Ingredientes:
Ingredientes Urea
Extracto de
levadura
Na
2
HPO
4
KH
2
PO
4
Rojo de fenol
Agua
destilada
Cantidades 20.0 g 0.1 g 9.5 g 9.1 g 0.01 g 1 L

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. No calentar. Esterilizar por filtracin a
travs de una membrana de 0.45 m. Verter aspticamente porciones de 1.5 ml a 3.0 ml dentro de
tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm. pH final, 6.8 0.2.
Medio de cultivo: Caldo lisina descarboxilasa.
Ingredientes:

127

Extracto de
levadura
Glucosa L-lisina
Prpura de
bromocresol
Agua
destilada

Preparacin: Calentar hasta disolver. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapn de rosca
de 16 mm x 125 mm. Autoclave 15 min a 121 C. pH final 6.8 0.2.
Medio de cultivo: Caldo cianuro de potasio (KCN).
Ingredientes:
Ingredientes
Cianuro de
potasio
(KCN)
Proteasa
peptona N 3
o
polipeptona
NaCl KH
2
PO
4
Na
2
HPO
4

Agua
destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio. Autoclave 15 min a 121 C.
Enfriar y refrigerar entre 5 C y 8 C. pH final 7.6 0.2. Preparar el KCN disolviendo 0.5 g de
KCN en 100 ml de agua destilada estril y a una temperatura entre 5 C y 8 C. Pipetear 15 ml de la
disolucin fra de KCN a 1 L del medio base estril y fro. Mezclar y distribuir porciones de 1 ml
a1.5 ml en tubos de ensayo estriles. Utilizando una tcnica asptica tapar los tubos con tapones de
corcho impregnados con parafina. Almacenar los tubos a 5 C a 8 C. No pipetear con la boca.
Usar guantes. No almacenar por ms de 2 semanas.
Medio de cultivo: Caldo MR-VP.
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes
Agua peptonada
amortiguada en
polvo
Glucosa K
2
HP0
4
Agua destilada

Medio 2:
Ingredientes
Digerido
pancretico de
casena
Digerido
pptico de
tejido animal
Dextrosa
Fosfato de
potasio
Agua destilada

Medio 3:
Amortiguador de
fosfato
Agua destilada

128

Preparacin: Medio 1 y 2: Disolver los ingredientes en agua con agitacin y calentamiento
moderado. Distribuir porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar en autoclave
durante 15 min a 118 C a 121 C. pH final 6.9 0.2. Medio 3: Disolver los ingredientes en agua.
Verter 10 ml dentro de tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm y esterilizar 15 min a 121 C. pH final,
7.5 0.2.
Medio de cultivo: Medio indol nitrito (Nitrato trptico).
Ingredientes:
Ingredientes Tripticasa Na
2
HPO
4
Dextrosa KNO
3
Agar
Agua
destilada
Cantidades 20.0 g 2.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 L

Preparacin: Calentar con agitacin suave. Mezclar y verter porciones de 11 ml dentro de tubos de
16 mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 118 C. pH final, 7.2 0.2.
Medio de cultivo: Agar acetato.
Ingredientes:
Ingredientes
Acetato
de sodio
NaCl
MgSO
4

(anhidro)
Fosfato
de
amonio
K
2
HPO
4

Azul de
bromotimol
Agar
Agua
destilada
Cantidades 2.0 g 5.0 g 0.2 g 1.0 g 1.0 g 0.08 g 20.0 g 1.0 L

Preparacin: Adicionar todos los ingredientes excepto MgSO
4
a 1 litro de agua destilada. Calentar
a ebullicin con agitacin. Adicionar MgSO
4
y ajustar el pH. Verter porciones de 8 ml dentro de
tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 121C. Inclinar los tubos para obtener inclinacin
de 5 cm. pH final, 6.7.
Medio de cultivo: Caldo mucato.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona cido mcico
Azul de
bromotimol
Agua destilada
Cantidades 10.0 g 10.0 g 0.024 g 1.0 L

Preparacin: Disolver la peptona. Disolver el cido mcico aadiendo lentamente NaOH 5 N y
agitando. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos con tapn de rosca de 13 mm x 100 mm.
Esterilizar 10 min a 121 C. pH final, 7.4 0.1.
Medio de cultivo: Caldo control mucato.
Ingredientes:

129

Ingredientes Peptona Azul de bromotimol Agua destilada
Cantidades 10.0 g 0.024 g 1.0 L

Preparacin: Disolver los ingredientes. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos de tapn de rosca
de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 10 min a 121 C. pH final, 7.4 0.1.
Medio de cultivo: Caldo malonato.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
(NH
4
)
2
SO
4
K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
NaCl

Malonato de sodio Glucosa Azul de bromotimol Agua destilada
3.0 g 0.25 g 0.025 g 1.0 L
Preparacin: Disolver, calentando si es necesario. Verter porciones de 3 ml dentro de tubos de
ensayo de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 15 min a 121 C. pH final, 6.7 0.2.
Medio de cultivo: Caldo citrato de Koser.
Ingredientes:
Ingredientes NaNH
4
HPO
4
4H
2
O
KH
2
PO
4

(monobsico)
MgSO
4
7H
2
O
Citrato de
sodio 2H
2
O
Agua
destilada
Cantidades 1.5 g 1.0 g 0.2 g 3.0 g 1.0 L

Preparacin: Verter dentro de tubos de tapn de rosca como se desee. Esterilizar 15 min a 121 C.
pH final, 6.7 0.2. Esta formulacin se enlista en los mtodos oficiales de anlisis de la AOAC
Internacional y los mtodos estndar para la examinacin de aguas residuales de la APHA. La
composicin difiere del medio deshidratado comercial. Este ltimo es satisfactorio.
Medio de cultivo: Disolucin de bicarbonato de sodio 10 %.
Ingredientes:
Ingredientes Bicarbonato de sodio Agua destilada para aforar
Cantidades 100.0 g 1 L

Preparacin: No se especifica la preparacin.
Medio de cultivo: Prueba de ONPG.
Disolucin de fosfato monosdico 1.0 M pH 7:
Ingredientes NaH
2
PO
4
H
2
0 Agua destilada
Disolucin NaOH
30 % (p/v)

130

Cantidades 6.9 g 45.0 ml 3.0 ml

0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactsido (ONPG):
Ingredientes ONPG Agua destilada a 37 C
Disolucin de fosfato
monosodico 1.0 M pH 7
Cantidades 80.0 mg 15.0 ml 5.0 ml

Preparacin: Disolucin de fosfato monosdico 1.0 M pH 7: Disolver el NaH
2
PO
4
H
2
O en agua
destilada. Adicionar la disolucin de 30 % NaOH y ajustar a pH 7. Aforar a 50 ml con agua
destilada y almacenar en refrigeracin (alrededor de 4 C). 0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactosido
(ONPG): Disolver el ONPG en agua destilada a 37 C. Adicionar la disolucin 1.0 M de NaH
2
PO
4
.
La disolucin no debe tener color. Almacenar en refrigeracin (alrededor de 4 C). Calentar una
porcin suficiente para el nmero de pruebas a 37 C antes de usar.
Medio de cultivo: Amortiguador salino de fosfatos 0.01 M (pH 7.5).
Ingredientes:
Disolucin madre (Stock, 0.1 M):
Ingredientes
NaH
2
PO
4
(anhidro)
NaH
2
PO
4
H
2
0 NaCl Agua destilada
Cantidades 12.0 g 2.2 g 85.0 g 1.0 L

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada y aforar a 1 litro. Diluir la disolucin
madre 1
9
en agua doble destilada. Mezclar bien. Ajustar pH a 7.5 con HCl 0.1 N o NaOH 0.1 N si
es necesario. Se encuentra disponible comercialmente en Difco Laboratories y BBL en su forma
deshidratada.
Medio de cultivo: Agua de dilucin amortiguador de fosfatos de Butterfield.
Ingredientes:
Ingredientes KH
2
PO
4
Agua destilada

Preparacin: Ajustar pH a 7.2 con NaOH 1 N. Aforar a 1 litro con agua destilada. Esterilizar 15
min a 121 C. Almacenar en refrigeracin. Blancos de dilucin: Tomar 1.25 ml de la disolucin
madre descrita anteriormente y aforar a 1 litro con agua destilada. Verter dentro de frascos a 90 ml
o 99 ml 1 ml. Esterilizar 15 min a 121 C.
Medio de cultivo: Reactivo de Kovacs.
Ingredientes:
Ingredientes p-Dimetilaminobenzaldehdo
Alcohol amlico
(normal)
HCl (concentrado)

131


Preparacin: Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amlico normal. Lentamente
adicionar HCl. Almacenar a 4 C. Para la prueba de indol, adicionar de 0.2 ml a 0.3 ml del reactivo
a 5 ml de un cultivo de 24 h en caldo triptona. Una capa color rojo oscuro en la superficie es una
prueba positiva para la prueba de indol.
Medio de cultivo: Reactivos para prueba Voges-Proskauer (VP).
Ingredientes:
Disolucin 1:
Ingredientes -Naftol Alcohol (absoluto)

Disolucin 2:

Preparacin: Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y aadir 0.6 ml de la disolucin 1 y 0.2 ml de la
disolucin 2. Agitar despus de cada adicin. Para intensificar y apresurar la reaccin, aadir unos
cristales de creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados despus de
4 h de adicionar los reactivos.
Medio de cultivo: Reactivo para oxidasa.
Ingredientes:
Ingredientes N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenediaminea2HCl Agua destilada

Preparacin: Usar un preparado fresco, sin embargo, el reactivo puede ser usado hasta por 7 das,
si es almacenado en un frasco de vidrio oscuro en refrigeracin. Aplicar la disolucin recientemente
preparada (fresca) directamente a un cultivo joven (24 h) en cajas Petri o tubos inclinados. Las
colonias oxidasa-positivas desarrollan un color rosa que progresivamente se torna prpura oscuro.
Transferir las colonias fuera del reactivo dentro de 3 min, si es que los cultivos se van a conservar
debido a que el reactivo es txico para los organismos. Mtodo opcional: Transferir una pequea
cantidad de cultivo a un papel filtro impregnado con el reactivo. Un color prpura oscuro dentro de
10 s indica una prueba positiva. Usar un asa de platino, un aplicador de madera o un palillo estril
debido a que las asas que contienen hierro (ejem. asa de nicromo) dan reacciones falso positivas.
Alternativamente, la prueba se puede hacer con una disolucin al 1 % de hidroclrido de N,N-
dimetil-p-fenilenediamina. Aplicar la disolucin directamente al cultivo en caja o tubo inclinado.
Medio de cultivo: Reactivos para deteccin de nitritos.

132

Ingredientes:
Reactivo cido sulfanlico:
Ingredientes cido sulfanlico cido actico 5 N
Cantidades 1.0 g 125.0 ml

Reactivo N-(1-naftil) etilendiamina:
Ingredientes
N-(1-naftil) etilendiamina
dihidrocloruro
cido actico 5 N

Reactivo -Naftol:
Ingredientes -Naftol cido actico 5 N

Reactivos alternativos para la prueba: El cido sulfnico 5-Amino-2-naftileno (cido de Cleve) y
N,N-dimetil- 1-naftilamina han sido recomendados como sustitutos para la preparacin del reactivo
B. Etanol absoluto puede ser sustituido por cido actico en el reactivo C. Sin embargo, se debern
realizar evaluaciones comparativas antes de sustituir los reactivos originales.
Preparacin: Para preparar el cido actico 5 N, adicionar 28.75 ml de cido actico glaciar a
71.25 ml de agua destilada. Almacenar los reactivos en frascos color mbar. Para realizar la prueba
adicionar de 0.1 ml -0.5 ml de los reactivos A y reactivos B o reactivos C (segn lo descrito en el
mtodo) a un cultivo en medio lquido o semislido. El desarrollo de un color rojo-violeta con los
reactivos A y B o un color naranja con los reactivos A y C indica que el nitrato ha sido reducido a
nitrito. Debido a que el color producido por los reactivos A y B puede desvanecerse o desaparecer
en muy pocos minutos la reaccin debe registrarse tan pronto como el color aparezca. Si no se
desarrolla color, la prueba de presencia de nitrato por la adicin de una pequea cantidad de polvo
de zinc. Si se desarrolla color, el nitrato no ha sido reducido. Prueba de reduccin del nitrato para E.
coli enteropatognica. Para 3 ml de un cultivo de 18 h -24 h en medio indol-nitrito, adicionar 2
gotas de los reactivos A y B. Un color rojo-violeta indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito.
Revisar las pruebas negativas aadiendo pequeas cantidades de polvo de zinc; si el color rojo-
violeta no aparece, el nitrato ha sido reducido.
Medio de cultivo: Aceite mineral.
Preparacin: Esterilizar 30 min a 121 C. Usar contenedores con tapn de rosca a la mitad de su
capacidad con 20 ml-50 ml.
Medio de cultivo: Cristal violeta de Hucker.
Ingredientes:
Disolucin A:

133

Ingredientes Cristal violeta (90 %) Etanol (95 %)

Disolucin B:
Ingredientes Oxalato de amonio Agua destilada

Preparacin: Mezclar las disoluciones A y B. Almacenar por 24 h y filtrar con papel filtro.
Medio de cultivo: LUGOL.
Ingredientes:
Ingredientes Yodo Yoduro de potasio (KI) Agua destilada

Preparacin: Colocar el yoduro de potasio en el mortero, aadir el yodo, moler por 5 min a 10
min. Aadir de manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada
aplicacin. Verter esta disolucin en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y
adicionar a la botella del reactivo.
Medio de cultivo: Contraste de Hucker (disolucin stock).
Ingredientes:
Ingredientes Safranina O Agua destilada

Preparacin: Disolucin de trabajo: aadir 10 ml de la disolucin stock a 90 ml de agua destilada.
Medio de cultivo: Tincin de Gram.
Ingredientes: Cristal violeta, LUGOL y contraste de Hucker
Preparacin: Transferir a una laminilla la muestra del cultivo, pasar la laminilla por la flama varias
veces de manera rpida y esperar que la muestra se seque, aadir una gota de cristal violeta, esperar
1 min a que seque, lavar con agua, esperar a que se seque, colocar una gota de LUGOL, dejar secar
y lavar con agua, secar, decolorar con etanol al 95 %, lavar con agua, dejar secar, agregar una gota
de safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente, observar al microscopio.
Reactivo o medio de cultivo: Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) (M192a).
Ingredientes:
Ingredientes Peptona NaCl Na
2
HPO
4
Casaminocidos
Cantidades 10.0 g 5.0 g 3.6 g 5.0 g


134

Ingredientes
Extracto de
levadura
Lactosa Piruvato de sodio Agua destilada

Preparacin: Esterilizar en autoclave. pH 7.2 0.2.

Reactivo o medio de cultivo: Suplemento de acriflavina-Cefsulodina-Vancomicina (ACV)
(M192a).
Ingredientes:
Ingredientes Acriflavina Cefsulodina Vancomicina Agua destilada
Cantidades 1.1250 g 1.125 g 0.9 g 500.0 ml

Preparacin: Disolver cada uno de los suplementos en 500 ml de agua destilada. Esterilizar por
filtracin. Aadir 1 ml de cada uno a 225 ml de mBPWp.
Reactivo o medio de cultivo: Oligonucletidos iniciadores y para STEC/O157 especficos para la
plataforma de PCR en tiempo real (Tabla 20).
Ingredientes:
Tabla 20. Secuencias de oligo/sonda para su uso en la plataforma SmartCycler II y
LightCycler 2.0.
Oligos
1
GenBank # Bases 5' 3' Secuencia
Stx1F934 M19473 26
gTg gCA TTA ATA CTg AAT TgT CAT CA
Stx1R1042 M19473 21 gCg TAA TCC CAC ggA CTC TTC
Stx2F1218 X07865 24
gAT gTT TAT ggC ggT TTT ATT TgC
Stx2R1300 X07865 26
Tgg AAA ACT CAA TTT TAC CTT Tag CA
UidAF241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg
UidAR383 AF305917 22
ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T
IAC55F2 17 ATg ggT gCC gTT CgA gc
IAC186R
2
19
Cga gaC gAT gCa gCC aTT C
uidA F 241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg
Secuencias de los oligos y sondas para su uso en la plataforma LightCycler 2.0.
Oligos1 GenBank # Bases 5' 3' Secuencia
uidA R 383 AF305917 22
ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T
stx1 F 406 M19573 25 gAg gAA ggg Cgg TTT AAT AAT CTA C
stx1 R 667 M19573 27
CAC TAT gCg ACA TTA AAT CCA gAT AAg

135

stx2 F 492 X07865 28
gTT TTg ACC ATC TTC gTC TgA TTA TTg A
stx2 R 737 X07865 22
ACT CCA TTA ACg CCA gAT ATg A
1 Nombre de oligo compuesto por gen de inters (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F), oligo reverso
(R), posicin de la base 5' del oligonucletido en la respectiva secuencia del gen especificada en la
columna 2
2 Los oligos y sondas para control interno de amplificacin (IAC) estn cubiertos por U.S. Patent
Application 0060166232.
Preparacin: Disolucin de trabajo para oligos iniciadores 10 M de cada oligo listado en a tabla
20. La disolucin de trabajo puede prepararse rehidratando los oligos sintetizados comercialmente
con purificacin bsica de desalado (Fisher/Genosys o equivalente) con agua destilada a la
concentracin apropiada. Almacenar de -20 C a -70 C en un congelador sin escarcha.
Reactivo o medio de cultivo: OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR
(Cepheid o Fisher).
Reactivo o medio de cultivo: Agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC) (M194).
Ingredientes:
Ingredientes Telurito de potasio Cefixima
Cantidades 2.5 mg/L 0.05 mg/L

Preparacin: Preparar Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139) como se indic anteriormente.
Despus de esterilizar y temperar aadir los 2 aditivos, 250 L de una disolucin 1 % de telurito de
potasio y 1 mL de una disolucin 50 mg/L de cefixima en 95 % EtOH . Esterilizar por filtracin.

Reactivo o medio de cultivo: Agar cromognico selectivo agar E. coli O157:H7 R&F agar (R&F
Laboratories, Downers Grove, IL).
Preparacin: Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Rainbow O157 (BIOLOG, Hayward, CA).
Preparacin: Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80).
Ingredientes:
2
HPO
4
Agar Eosina
Azul de
metileno
Agua
destilada

Preparacin: Hervir para disolver la peptona, el fosfato, y el agar en 1 litro de agua, aadir agua
para completar el volumen original, distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml cada vez y

136

esterilizar en autoclave 15 minutos a no ms de 121 C. Antes de su uso, aadir a cada porcin de
100 ml: 5 ml de disolucin estril de lactosa al 20 %; 2 ml de disolucin acuosa de eosina al 2 % y
4.3 ml de disolucin acuosa de azul de metileno al 0.15 %; cuando se usa el producto deshidratado
completo, hervir para disolver todos los ingredientes en un litro de agua, distribuir porciones de 100
ml o 200 ml. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C. El pH final es de 7.1 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153).
Ingredientes:
Ingredientes
Agar soya
tripticasena
Extracto de levadura Agua destilada
Cantidades 40.0 g 6.0 g 1 000 ml

Preparacin: Pesar los ingredientes, adicionar agua y mezclar, esterilizar en autoclave por 15 min a
121 C. pH final 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Amortiguador de fosfato Butterfield (R11).
Ingredientes:
Ingredientes KH
2
PO
4
Agua destilada

Preparacin: Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 0.1 N, ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada,
esterilizar por 15 min a 121 C, almacenar en refrigeracin, dilucin de los blancos, tomar 1.25 ml
de la disolucin madre anterior y ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada, distribuir en
botellas de 90 ml o 99 ml 1 ml, esterilizar por 15 minutos a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin fisiolgica salina (0.85 % NaCl).
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de Kovacs (R38).
Ingredientes:
Ingredientes
-
dimetilaminobenzaldehido
Alcohol amlico HCl (concentrado)

Preparacin: Disolver el -dimetilaminobenzaldehido en alcohol amlico, lentamente adicionar
HCl, almacenar a 4 C, para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml a 0.3 ml del reactivo a 5 ml de
cultivo bacteriano de 24 h en caldo triptona.
Reactivo o medio de cultivo: ColiComplete Discs conteniendo substrato MUG fluorognico para
GUD y X-gal cromognico para GAL (BioControl, Bellevue, WA).
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo latex Anti-O157 y anti-H7 (Remel, Lenexa, KS, o
equivalente).
Reactivo o medio de cultivo: API20E o VITEK GNI (BioMerieux, St. Louis, MO).

137

ISO 7251:2005 (E)
Medio de cultivo: Caldo lauril sulfato.
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido
enzimtico
de tejidos
de plantas
o animales
Lactosa K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
NaCl
Lauril
sulfato de
sodio
Agua
destilada
Cantidades
(concentracin
simple)
20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 5.0 g 0.1 g
1 000 ml
Cantidades
(concentracin
doble)
40.0 g 10.0 g 5.5 g 5.5 g 10.0 g 0.2 g

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, ajustar el pH
a 6.8 0.2. Para el caso de medio de concentracin simple, distribuir 9 ml de medio en tubos de
ensayo de 16 mm x 160 mm con campana Durham, para el medio de concentracin doble, distribuir
10 ml de medio en tubos de ensayo de 18 mm x 180 mm o 20 mm x 200 mm con campana Durham.
Esterilizar por 15 min a 121 C.
Medio de cultivo: Caldo EC.
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido
enzimtico
de casena
Lactosa
Sales
biliares No.
3
K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
NaCl
Agua
destilada

a 6.8 0.2, distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 160 mm con
campana Durham, esterilizar por 15 min en autoclave a 121 C. La campana Durham no debe tener
burbujas de aire despus de la esterilizacin.
Medio de cultivo: Agua peptonada libre de indol.
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido enzimtico de
casena
NaCl Agua destilada

138

a 7.3 0.2, distribuir el medio en cantidades de 5 ml o 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 160
mm, esterilizar por 15 min en autoclave a 121 C.
Ingredientes:
Ingredientes 4-Dimetilaminobenzaldehido cido clorhdrico 2-Metilbutan-1-ol o pentan-1-ol

Preparacin: Disolver el 4-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol calentando lentamente por
medio de bao Mara mantenido entre 50 C y 55 C. Enfriar y aadir el cido, proteger de la luz y
almacenar a aproximadamente 4 C.

4.2 Listeria spp. y L. monocytogenes
NOM-143-SSA1-1995
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya tripticaseina con 0.6 % de extracto de levadura
(CSTEL).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticaseina Extracto de levadura Agua

Preparacin: Agitar hasta disolver los ingredientes,esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min, el
pH final de la disolucin debe ser 7.3 0.2, un litro de caldo soya tripticaseina con extracto de
levadura (CSTEL) debe contener caldo de enriquecimiento.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7.3.
Ingredientes:
Ingredientes
Clorhidrato
de acriflavina
cido
nalidxico
(sal sdica)
Cicloheximida
cido pirvico (sal sdica) disolucin
al 10 % (p/v)
Cantidades 15.0 mg 40.0 mg 50 mg 11.1 mL

Preparacin: Preparar los suplementos de acriflavina y nalidxico a partir de una disolucin al 0.5
% (p/v) con agua, el suplemento de cicloheximida prepararlo como una disolucin al 1.0 % (p/v) en
una disolucin al 40 % (v/v) de etanol en agua, esterilizar por filtracin los suplementos, agregar en
condiciones aspticas los suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo antes de su

139

uso. Para la preparacin de un litro del medio CSTEL se debe partir de las soluciones anteriores,
agregando las siguientes cantidades: 3.0 ml de acriflavina, 8.0 ml de cido nalidxico y 5.0 ml de
disolucin de cicloheximida. La cicloheximida es una sustancia qumica altamente txica, durante
su manejo deben emplearse guantes, lentes de proteccin y lavarse las manos inmediatamente
despus de usarla. * Utilizar cido pirvico solamente cuando se sospeche que las clulas de
Listeria estn daadas.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de cloruro de litio feniletanol-moxolactam (LMP).
Ingredientes:
Ingredientes
Agar fenil
etanol
Glicina
anhidra
Cloruro de litio
Disolucin de
moxolactam al 1 % en
amortiguador de fosfatos
pH 6.0
Agua
Cantidades 35.5 g 10.0 g 5.0 g 2.0 ml 1 000 ml

Preparacin: Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 C 1 C durante 15 min,
enfriar de 48 C a 50 C y agregar la disolucin de moxolactam previamente esterilizada por
filtracin, distribuir volmenes de 12 ml a 15 ml del medio en cajas de Petri estriles, las placas
delgadas facilitan la observacin de las colonias.
Reactivo o Medio de cultivo: Medio Oxford.
Ingredientes:
Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos:
Ingredientes Cicloheximida
Sulfato de
colistina
Acriflavina Cefotetn Fosfomicina
Cantidades 400 mg 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10 mg

Preparacin: Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetn y la
fosfomicina en 10 ml de una mezcla 1:1 de etanol: agua, esterilizar por filtracin antes de agregar al
medio base, mezclar y vaciar en cajas Petri estriles, las placas del medio Oxford se pueden
almacenar como mximo dos semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base Oxford (OXA).
Ingredientes:
Ingredientes
Base de agar
Columbia
Esculina
Citrato frrico
amnico
Cloruro de litio Agua

Preparacin: Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullicin hasta disolucin
completa, esterilizar en autoclave a 121 C 1 C durante 15 min, enfriar a 50 C el medio base y en
condiciones aspticas agregar los suplementos.

140

Reactivo o medio de cultivo: Agar soya tripticasena con 0.6 % de extracto de levadura (ASTEL).
Ingredientes:
Ingredientes Agar soya tripticasena Extracto de levadura Agua

Preparacin: Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar, esterilizar a 121 C 1 C
durante 15 min, pH final de 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre de carnero.
Ingredientes:
Ingredientes Base de agar sangre Sangre de carnero desfibrinada
Cantidades 95.0 ml 5.0 ml

Preparacin: Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante, enfriar a 45 C 2
C y agregar aspticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a
temperatura ambiente (20 25 ) C, homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estriles de
12 ml a 15 ml para la prueba de CAMP y de 15 ml a 20 ml para la prueba de hemlisis.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nitritos.
Ingredientes:
Ingredientes Nitrato de potasio Cloruro de sodio Peptona Agua

Preparacin: Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolucin completa, verter
en tubos de 13 mm x 100 mm con tapn de rosca, esterilizar en autoclave a 121 C 1 C durante
15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de SIM.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
casena
Peptona de
carne
Sulfato de
fierro y
amonio
Tiosulfato
de sodio
Agar Agua

Preparacin: Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar, envasar en porciones de 4 ml en
tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar en autoclave a 121 C 1 C durante 15 min, pH final de 7.3
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio MTM.

141

Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona
Cloruro de sodio
(NaCl)
Agar Agua

tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar en autoclave a 121 C 1 C durante 15 min, pH final de 7.4
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo prpura para fermentacin de carbohidratos.
Ingredientes:
Ingredientes
Proteosa
peptona No. 3
Cloruro
de sodio
Extracto de
carne
Prpura de
bromocresol
Agua

Preparacin: Calentar si es necesario para disolver los ingredientes, esterilizar en autoclave
durante 15 min. a 121 C 1 C, pH final 6.8 0.2, agregar la disolucin del carbohidrato,
previamente esterilizada, por filtracin en cantidad suficiente para obtener una concentracin final
de 0.5 %.
UNE-EN ISO 11290-1:1997
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de Fraser de concentracin media.
Ingredientes:
Ingredientes Base
Disolucin de
cloruro de litio
Sal sdica
del cido
nalidxico
Clorhidrato de
acriflavina
Citrato amnico de
hierro
Cantidades 100 ml 1 ml 0.1 ml 0.5 ml 1.0 ml

Preparacin: Inmediatamente antes de su uso, aadir las cuatro disoluciones a cada porcin de 100
ml de la base.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base (Caldo Fraser).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de carne
(digestato pptico de
tejido animal)
Triptona (digestato
pptico de casena)
Extracto de carne Cloruro de sodio


142

Fosfato de hidrgeno disdico
dihidratado
Fosfato de hidrgeno
potsico
Esculina Agua
12.0 g 1.3 g 1.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes calentando si es necesario, ajustar el pH despus de la
esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C, dispensar en frascos, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121
C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de cloruro de litio.
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro de litio Agua

Preparacin: Aadir el cloruro de litio al agua, esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de la sal sdica de cido nalidxico.
Ingredientes:
Ingredientes Sal sdica del cido nalidxico Disolucin de hidrxido sdico 0.05 mol/l

Preparacin: Disolver la sal del cido nalidixico en el hidrxido sdico y esterilizar por filtracin.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin de hidrocloruro de acriflavina.
Ingredientes:
Ingredientes Clorhidrato de acriflavina Agua

Preparacin: Disolver el hidrocloruro de acriflavina en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin de citrato amnico de hierro (III).
Ingredientes:
Ingredientes Citrato amnico de hierro (III) Agua

Preparacin: Disolver el citrato amnico de hierro (III) en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo Fraser.
Ingredientes:

143

Ingredientes Medio base
Disolucin de clorhidrato de
acriflavina
Disolucin de citrato amnico de
hierro (II)
Cantidades 10 ml 0.1 ml 0.1 ml

Preparacin: Inmediatamente antes de su uso aadir 0.1 ml de las soluciones a cada tubo con 10
ml de medio base, mezclar agitando con suavidad, ajustar el pH despus de la esterilizacin a 7.2
0.2 a 25 C.
Reactivo o Medio de cultivo: Medio base (Caldo Fraser).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
carne
(digestato
pptico de
tejido
animal)
Triptona
(digestato
pptico de
casena)
Extracto de
carne
Extracto de
levadura
Cloruro
sdico
Fosfato de
hidrgeno
disdico
dihidratado

Ingredientes
Fosfato de
hidrgeno
potsico
Esculina
Cloruro de
litio
Sal sdica de
cido
nalidxico
Agua

esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C, dispensar en tubos, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121
C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Oxford.
Ingredientes: Medio base, suplementos.
Preparacin: Enfriar la base hasta 47 C y aadir aspticamente el suplemento, dispensar
cantidades de 5 ml del medio en placas Petri estriles y dejar solidificar, almacenar el medio
protegido de la luz.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base (Agar Oxford).
Ingredientes:
Ingredientes
Agar
Columbia
Esculina
Citrato amnico de
hierro (III)
Cloruro de
litio
Agua


144

Preparacin: Disolver los componentes en agua por ebullicin, ajustar el pH despus de la
C. *Agar Columbia: Almidn 1 g, proteosa peptona 23 g, cloruro sdico 5 g, agar de 9 g a 18 g.
Reactivo o medio de cultivo: Suplemento para un medio de 1 000 ml (Agar Oxford).
Ingredientes:
Ingredientes
Ciclohexim
ida
Sulfato de
colistina
Clorhidrat
o de
acriflavina
Cefotetan
Fosfomici
na
Etanol Agua
Cantidades 400 mg 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10 mg 5 ml 5 ml

Preparacin: Disolver los componentes en la mezcla etanol/agua, esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - medio base.
Ingredientes:
Ingredientes Peptonas Almidn
Cloruro de
sodio
Extracto de
levadura
Agar D-glucosa
9.0 g a
18.0 g
0.5 g

Ingredientes D-manitol Esculina
Citrato
amnico de
hierro (III)
Rojo de fenol
Cloruro de
litio
Agua
Cantidades 10.0 g 0.8 g 0.5 g 0.08 g 15.0 g 960 ml

C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de sulfato de polimixina B.
Ingredientes:
Ingredientes Sulfato de polimixina B (100 000 UI) Agua

Preparacin: Disolver el sulfato de polimixina B en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de ceftazidima sdica pentahidrato.

145

Ingredientes:
Ingredientes Ceftazidima sdica pentahidratada Agua

Preparacin: Disolver la ceftazidima sdica en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - medio completo
Ingredientes:
Ingredientes Base
Disolucin de
sulfato de
poliximina
Disolucin de
clorhidrato de
acriflavina
Disolucin de ceftazidima sdica
pentahidratada
Cantidades 960 ml 10.0 ml 10.0 ml 20.0 ml

Preparacin: Aadir las soluciones a la base fundida (47 C), agitando suavemente entre cada
adicin, dispensar cantidades de 15 ml del medio en placas Petri estriles y dejar solidificar,
almacenar el medio protegido de la luz.
Reactivo o Medio de cultivo: Agar triptona soya-extracto de levadura (TSYEA).
Ingredientes:
Ingredientes
Caldo triptona
soya*
Extracto de
levadura
Agar Agua
Cantidades 30.0 g 6.0 g 9.0 a 18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por
ebullicin, ajustar el pH si es necesario para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25
C, dispensar el medio en tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el
anlisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 C, permitir su estabilizacin en una
posicin inclinada, dispensar el medio en placas Petri estriles, en cantidades adecuadas para el
anlisis, esperar a su solidificacin, *Caldo triptona soya: Triptona 17 g, peptona de soya 3 g,
cloruro de sodio 5 g, fosfato de hidrgeno dipotsico 2.5 g, glucosa 2.5 g.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona soya-extracto de levadura (TSYEB).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo triptona soya Extracto de levadura Agua
Cantidades 30 g 6.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua calentando si
es necesario, ajustar el pH si es pertinente, para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a

146

25 C, dispensar el medio en frascos o tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades
adecuadas para el anlisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 C.
Reactivo o Medio de cultivo: Agar sangre de cordero (Base).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
carne
Digestato
enzimtico de
hgado
Extracto
de
levadura
Cloruro
sdico
Agar Agua
9.0 g a
18.0 g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por ebullicin, ajustar el pH si es necesario,
para que despus de la esterilizacin sea de 7.2 0.2 a 25 C, dispensar el medio en frascos de
capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el anlisis, esterilizar en la autoclave a
121 C durante 15 min.
Reactivo o Medio de cultivo: Sangre de cordero desfibrinada.
Ingredientes:
Ingredientes Base Sangre de cordero desfibrinada
Cantidades 100 ml 5.0 ml a 7.0 ml

Preparacin: Aadir la sangre a la base previamente enfriada a 47 C, mezclar convenientemente,
dispensar el medio en placas Petri estriles, en cantidades adecuadas para el anlisis, dejar
solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilizacin de carbohidratos (ramnosa y xilosa) - base.
Ingredientes:
Ingredientes
Proteasa
peptona
Extracto de
carne
Cloruro sdico
Prpura de
bromocresol
Agua

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentando si es necesario, ajustar el pH si es
necesario, para que despus de la esterilizacin sea de 6.8 0.2 a 25 C, dispensar el medio en
tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el anlisis, esterilizar en la
autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Soluciones de carbohidratos.
Ingredientes:
Ingredientes Carbohidrato (L-ramnosa o D-xilosa) Agua


147

Preparacin: Disolver separadamente cada carbohidrato en 100 ml de agua, esterilizar por
filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilizacin de carbohidratos (ramnosa y xilosa) - medio
completo.
Ingredientes: Medio base, soluciones de carbohidratos.
Preparacin: Para cada carbohidrato aadir aspticamente x ml de la disolucin de carbohidratos a
9 ml x ml de la base.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo motilidad.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
casena
Peptona de carne Agar Agua

para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25 C, dispensar el medio en tubos en
cantidades de unos 5 ml, esterilizar en el autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen).
Ingredientes: Base agar sangre de cordero, medio de sangre de cordero desfibrinada (descritos
previamente).
Preparacin: Dispensar cantidades de 10 ml del medio base en placas Petri estriles y esperar a
que se solidifiquen, verter una capa muy fina del medio de sangre utilizando cantidades inferiores a
3 ml por placa, esperar a que se solidifiquen, si el medio sangre se aade a placas conteniendo la
base (medio base) que han sido preparadas de antemano, puede ser necesario calentar las placas
durante 20 min en una incubadora regulada a 37 C antes de verter la capa del medio de sangre.
Para esta prueba pueden utilizarse placas de agar sangre de cordero, pero es preferible utilizar
placas de agar con doble capa, con una capa de sangre muy fina.
Reactivo o medio de cultivo: Cepas para la reaccin de CAMP.
Ingredientes: Para llevar a cabo la prueba de CAMP se necesitan una cepa b-hemoltica de S.
aureus (por ej. NCTC 1803 o ATCC 25923) y una cepa de R. equi (por ej. NCTC 1621 o ATCC
6939). No todas las cepas de S. aureus son vlidas para la prueba de CAMP.
Preparacin: Mantener los cultivos de reserva de S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. nnocua
y L. ivanovii inoculndolos en pendiente de TSYEA, incubndolos a 35 C o 37 C de 24 h a 28 h,
o hasta que se haya producido crecimiento y almacenndolos en el refrigerador a 3 C 2 C. Se
recomienda hacer subcultivos al menos mensualmente.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin tampn de fosfato salino (PBS).
Ingredientes:

148

Ingredientes
Fosfato de hidrgeno
disdico dihidratado
Fosfato de dihidrgeno
sdico
Cloruro
de sodio
Agua

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, ajustar el pH si es necesario, para que despus
de la esterilizacin sea de 7.2 0.2 a 25 C, esterilizar en la autoclave a 121 C durante 15 min.
UNE-EN ISO 11290-2:2000
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin tamponada de peptona.
Ingredientes:
Ingredientes
Digestato
enzimtico de
tejidos
animales
Cloruro de
sodio
(NaCl)
Fosfato de hidrgeno
disdico
dodecahidratado
(Na
2
HPO
4
12H
2
O)
Fosfato de
hidrgeno
potsico
(KH
2
PO
4
)
Agua

Preparacin: Se disuelven en agua los componentes, calentando si es necesario, se ajusta el pH si
es necesario, de tal manera que tras la esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C, se vierte el medio en
matraces de capacidades adecuadas para obtener alcuotas apropiadas para el ensayo, se esteriliza en
la autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base para el caldo semi-Fraser con citrato de amonio hierro
(III).
Ingredientes: Medio base para el caldo semi-Fraser y disolucin de citrato de amonio hierro (III)
(descritos a continuacin).
Preparacin: Se aade 1 ml de la disolucin de citrato de amonio y hierro (III) a cada una de las
alcuotas del medio base del caldo semi-Fraser inmediatamente antes de su uso. El caldo base semi-
Fraser sin la adicin de agentes de seleccin puede utilizarse como disolvente para las muestras de
alimentos o de preparados cuando, tanto el mtodo de deteccin, como este mtodo de recuento se
realizan sobre una misma muestra de ensayo. Este procedimiento sirve para evitar preparar dos
suspensiones iniciales; los agentes de seleccin se aaden a la suspensin una vez que se ha
utilizado la porcin de ensayo para el recuento. El seguimiento de este procedimiento debera
sealarse en el informe de ensayo.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base para el caldo semi-Fraser.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de carne
(digestato pptico de
tejido animal)
Triptona (digestato
pptico de casena)
Extracto de
carne
Cloruro de sodio


149

Ingredientes
Fosfato de
hidrgeno disdico
dihidratado
Fosfato de
hidrgeno potsico
Esculina Agua

esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C, dispensar en frascos, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121
C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de citrato amnio de hierro (III).
Ingredientes:
Ingredientes Citrato amnico de hierro (III) Agua

Preparacin: Disolver el citrato amnico de hierro (III) en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - medio base.
Ingredientes:
Cloruro de
sodio
Extracto de
levadura
Agar D-glucosa
9.0 g a 18.0
g
0.5 g

Ingredientes D-manitol Esculina
Citrato
amnico de
hierro (III)
Rojo de
fenol
Cloruro de
litio
Agua
Cantidades 10.0 g 0.8 g 0.5 g 0.08 g 15.0 g 960. 0 ml

esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de sulfato de polimixina B.
Ingredientes:
Ingredientes Sulfato de polimixina B (100 000 UI) Agua

Preparacin: Disolver el sulfato de polimixina B en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de clorhidrato de acriflavina.

150

Ingredientes:
Ingredientes Clorhidrato de acriflavina Agua

Preparacin: Disolver el hidrocloruro de acriflavina en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de ceftazidima sdica pentahidrato.
Ingredientes:
Ingredientes Ceftazidima sdica pentahidrato Agua

Preparacin: Disolver la ceftazidima sdica en el agua y esterilizar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - completo.
Ingredientes:
Ingredientes Agar base
Disolucin de sulfato
de polimixina B
Disolucin de
clorhidrato de
acriflavina
Disolucin de
ceftazidima sdica
pentahidrato
Cantidades 960.0 ml 10.0 ml 10.0 ml 20.0 ml

Preparacin: Se aaden las disoluciones de los apartados al medio fundido a 47 C, mezclando
concienzudamente tras cada adicin, el pH del medio completo deber ser de 7.2 0.2 a 25 C. Se
vierten cantidades apropiadas de medio completo recin preparado en un nmero adecuado de
placas Petri, se deja solidificar, los medios se almacenarn en un lugar oscuro.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona soya-extracto de levadura (TSYEA).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo triptona soya* Extracto de levadura Agar Agua
Cantidades 30.0 g 6.0 g
9.0 g a 18.0
g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por
ebullicin, ajustar el pH si es necesario para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25
C, dispensar el medio en tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el
anlisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 C, permitir su estabilizacin en una
posicin inclinada. Para la preparacin de placas de agar, dispensar el medio en placas Petri
estriles, en cantidades adecuadas para el anlisis, esperar a su solidificacin. *Caldo triptona soya:
Triptona 17 g, peptona de soya 3 g, cloruro sdico 5 g, fosfato de hidrgeno dipotsico 2.5 g, D-
glucosa 2.5 g.
Ingredientes:

151

Ingredientes Caldo triptona soya* Extracto de levadura Agua

Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua calentando si
es necesario, ajustar el pH si es necesario, para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25
C, dispensar el medio en frascos o tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades
adecuadas para el anlisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre de oveja (Base).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
carne
Digestato
enzimtico
de hgado
Extracto de
levadura
Cloruro
sdico
Agar Agua
9.0 g a 18.0
g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por ebullicin, ajustar el pH si es necesario para
que despus de la esterilizacin sea de 7.2 0.2 a 25 C, dispensar el medio en frascos de capacidad
apropiada para obtener cantidades adecuadas para el anlisis, esterilizar en la autoclave a 121 C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre de oveja (completo).
Ingredientes:
Ingredientes Base Sangre de oveja desfibrinada
Cantidades 100.0 ml 5.0 ml a 7.0 ml

Preparacin: Aadir la sangre a la base previamente enfriada a 47 C, mezclar convenientemente,
dispensar el medio en placas Petri estriles, en cantidades adecuadas para el anlisis, dejar
solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilizacin de carbohidratos (ramnosa y xilosa) (Base).
Ingredientes:
Ingredientes
Proteasa
peptona
Extracto de
carne
Cloruro
sdico
Prpura de
bromocresol
Agua

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentando si es necesario, ajustar el pH si es
necesario, para que despus de la esterilizacin sea de 6.8 0.2 a 25 C, dispensar el medio en
tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el anlisis, esterilizar en la
autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Soluciones de carbohidratos.

152

Ingredientes:
Ingredientes Carbohidrato (L-ramnosa o D-xilosa) Agua

Preparacin: Disolver separadamente cada carbohidrato en 100 ml de agua, esterilizar por
filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilizacin de carbohidratos (ramnosa y xilosa) - medio
completo.
Ingredientes: Medio base, soluciones de carbohidratos.
Preparacin: Para cada carbohidrato aadir aspticamente x ml de la disolucin de carbohidratos a
9 x ml de la base.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de movilidad.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona de
casena
Peptona de carne Agar Agua

para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25 C, dispensar el medio en tubos en
cantidades de unos 5 ml, esterilizar en la autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen).
Ingredientes: Base agar sangre de cordero, medio sangre de cordero desfibrinada.
Preparacin: Dispensar cantidades de 12 ml de la base en placas Petri estriles y esperar a que se
solidifiquen, verter una capa muy fina del medio de sangre utilizando cantidades inferiores a 3 ml
por placa, esperar a que se solidifiquen, si el medio sangre se aade a placas conteniendo la base
que han sido reparadas de antemano, puede ser necesario calentar las placas durante 20 min en un
incubador regulado a 37 C antes de verter la capa del medio de sangre, para esta prueba pueden
utilizarse placas de agar sangre de cordero, pero es preferible utilizar placas de agar con doble capa,
con una capa de sangre muy fina.
Reactivo o medio de cultivo: Cepas para la reaccin de CAMP.
Ingredientes: Para llevar a cabo la prueba de CAMP se necesitan una cepa b-hemoltica de S.
aureus (por ej. NCTC 1803 o ATCC 25923) y una cepa de R. equi (por ej. NCTC 1621 o ATCC
6939). No todas las cepas de S. aureus son vlidas para la prueba de CAMP.
Preparacin: Mantener los cultivos de reserva de S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. nnocua
y L. ivanovii inoculndolos en pendiente de TSYEA, incubndolos a 35 C o 37 C de 24 h a 28 h,
o hasta que se haya producido crecimiento y almacenndolos en el refrigerador a 3 C 2 C. Se
recomienda hacer subcultivos al menos mensualmente.

153

Reactivo o medio de cultivo: Disolucin tampn de fosfato salino (PBS).
Ingredientes:
Ingredientes
Fosfato de
hidrgeno disdico
dihidratado
Fosfato de
hidridgeno sdico
Cloruro de sodio Agua

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, ajustar el pH si es necesario, para que despus
de la esterilizacin sea de 7.2 0.2 a 25 C, esterilizar en la autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Suspensin de eritrocitos de sangre de oveja.
Ingredientes: Sangre de oveja, tampn PBS.
Preparacin: Se mantienen las clulas de la sangre de oveja a 3 C 2 C antes de su uso, se
examina la presencia de seales de hemlisis (enrojecimiento) en la capa superior de suero antes de
su uso, si no aparece hemlisis, se aaden 2 ml de la capa inferior de eritrocitos sobre 98 ml de
tampn PBS, si se ha producido hemlisis, se suspenden unos 4 ml de la capa de clulas rojas en 10
ml de tampn PBS y se mezcla suavemente, centrifugando a continuacin, si el sobrenadante es
visiblemente rojo debido a una hemlisis muy significativa, no se utilizar y se descartar la
suspensin inicial, si no es as, se decanta el sobrenadante y se aaden 2 ml de esta suspensin de
clulas a 98 ml de tampn PBS. La suspensin puede guardarse hasta 5 das a +3 C 2 C. Si
aparece hemlisis, se desechar.
BAM Captulo 10: Listeria monocytogenes
Reactivo o medio de cultivo: Agar moxalactam feniletanol cloruro de litio (LPM).
Ingredientes:
Ingredientes
Agar
feniletanol
Glicina
anhidra
Cloruro de
litio
Disolucin
stock
moxalactam (en
buffer de
fosfato 1 %, pH
6.0)
Agua destilada
Cantidades 35.5 g 10.0 g 5.0 g 2 ml 1 000 ml

Preparacin: Esterilizar el medio sin moxalactam a 121 C durante 15 min, enfriar a 48 C - 50 C
y aadir la disolucin stock moxalactam esterilizada por filtracin, disolucin stock moxalactam:
disolver 1 g de sal moxalactam (amonio o sodio) en 100 ml de buffer de fosfato potasio 0.1 M pH
6.0. Almacenar la disolucin filtrada-esterilizada congelada en alcuotas de 2 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Esculina e iones de hierro (suplemento para LPM).
Ingredientes:
Ingredientes Esculina Citrato de amonio frrico

154

Cantidades 1 g 0.5 g

Preparacin: Aadir estos ingredientes al medio LPM, esterilizar el medio, enfriar y aadir la
disolucin de moxalactam como se describe en el medio LPM.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nitrato.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona KNO
3
Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes, distribuir en alcuotas de 5 ml en tubos de 16 mm x 125
mm, esterilizar 15 min a 121 C, pH final de 7.0 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la deteccin de nitrato.
cido sulfanlico
Ingredientes:
Ingredientes cido sulfanlico cido actico 5 N

Ingredientes:
Ingredientes
dihidrocloruro
cido actico 5 N

-Naftol
Ingredientes:
Ingredientes -Naftol cido actico 5 N

Preparacin: Preparar el cido actico 5 N, adicionando 28.75 ml de cido actico glacial a 71.25
ml de agua destilada, almacenar los reactivos en frascos color mbar con tapa de rosca, para la
prueba, adicionar de 0.1 ml a 0.5 ml de cada reactivo al medio de cultivo slido o semislido.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nutritivo.
Ingredientes:

155

Ingredientes Extracto de carne Peptona Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes por calentamiento, distribuir en alcuotas de 225 ml en
matraces Erlenmeyer de 500 ml, esterilizar durante 15 min a 121 C, pH final de 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina fisiolgica 0.85 % (estril).
Ingredientes:
Ingredientes NaCl Agua destilada

Preparacin: Disolver el NaCl en el agua, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C,
almacenar a temperatura ambiente.
Ingredientes:
Ingredientes
Proteasa
peptona N 3
Extracto
de carne
NaCl
Prpura de
bromocresol
Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes, distribuir en porciones de 2.5 ml en tubos de 13 mm x 100
mm con tubos de fermentacin invertidos de 6 mm x 50 mm, esterilizar en autoclave 10 min a 118
C. pH final 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de SIM.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
casena
Peptona de
carne
Sulfato de
fierro y
amonio
Tiosulfato de
sodio
Agar

tubos de rosca de 16 mm x 125 mm, esterilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante. pH
final 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar motilidad semislido.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Peptona NaCl Agar Agua destilada

156


Preparacin: Disolver con agitacin y calentamiento, hervir durante 1 min para disolver el agar,
distribuir en porciones de 8 ml en tubos de rosca de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave
durante 15 min a 121 C. pH final 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar soya tripticasena con 0.6 % de extracto de levadura (TSYEA).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticasena Extracto de levadura Agua

Preparacin: Agitar hasta disolver los ingredientes, esterilizar a 121C 1 C durante 15 min. El
pH final de la disolucin debe ser 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya tripticasena con 0.6 % de extracto de levadura (TSYEB).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticasena Extracto de levadura Agua

Preparacin: Agitar hasta disolver los ingredientes, esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min. El
pH final de la disolucin debe ser de 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio Oxford.
Ingredientes:
Ingredientes
Agar base sangre
Columbia
Esculina
Citrato frrico
amoniacal
Cloruro de litio
Cantidades 39.0 g 1.0 g 500.0 mg 15.0 g

Ingredientes Cicloheximida
Sulfato de
colistina
Acriflavina Cefotetn Fosfomicina
Cantidades 400.0 mg 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10.0 mg

Preparacin: Disolver los primeros cuatro ingredientes en 1 L de agua destilada, esterilizar en
autoclave a 121 C por 15 min, enfriar a 50 C y adicionar de manera asptica los suplementos.
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetn y la fosfomicina en 10 ml
de una mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtracin antes de agregar al medio base, mezclar
y vaciar en cajas Petri estriles.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de enriquecimiento amortiguado (para listeria), pH 7.3 0.1.
Ingredientes: TSYEB suplementado con:

157

Ingredientes
Fosfato de
monopotasio
(anhidro)
Fosfato
disdico
(anhidro)
Acriflavina
HCl
cido
nalidxico
(sal sdica)
Cicloheximida
cido
pirvico
Cantidades 1.35 g/l 9.6 g/l 10 mg/l 40 mg/l 50 mg/l
11.1
ml/l

Preparacin: Esterilizar el medio de enriquecimiento sin los tres agentes selectivos en autoclave a
121 C durante 15 min. Despus aadir 2.5 ml de cido pirvico al 10 % (p/v) filtrado-esterilizado
(el cido puede ser adicionado antes de meter a la autoclave), aadir aspticamente los tres agentes
selectivos a 225 ml del caldo de enriquecimiento despus de 4 h de incubacin a 30 C, aadir 25 g
de la muestra del alimento, preparar la acriflavina y el cido nalidxico como una disolucin stock
al 0.5 % (p/v) en agua destilada, preparar la cicloheximida como una disolucin stock al 1 % (p/v)
en una disolucin etanol - agua al 40 % (v/v). Esterilizar por filtracin los 3 ingredientes selectivos,
aadir las soluciones stock: 0.455 ml acriflavina, 1.8 ml cido nalidxico y 1.15 ml de
ciclohexamida a 225 ml de caldo de enriquecimiento con la muestra.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam.
Ingredientes:
Medio base:
Cloruro de
sodio
Agar
Columbia
D-glucosa

Ingredientes
D-
manitol
Esculina
Citrato
amnico de
hierro (III)
Rojo de
fenol
Cloruro de
litio
Agua

Agentes selectivos: Sulfato de polimixina B 10 mg, acriflavina 5 mg, ceftazidina 20 mg, agua
destilada 2 ml.
Ingredientes Sulfato de polimixina B Acriflavina Ceftazidina Agua destilada
Cantidades 10.0 mg 5.0 mg 20.0 mg 2.0 ml

Preparacin: Para hacer 500 ml del medio, pesar 34.4 g de medio basal en polvo (todos los
ingredientes menos los 3 agentes selectivos) y suspender en 500 ml de agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121 C durante 15 min. Disolver la mezcla de agentes selectivos en agua destilada a
17.5 g/ml y esterilizar por filtracin. Aadir 1 ml del agente selectivo en disolucin a 500 ml del
medio basal estril que ha sido enfriado a 50 C. Mezclar y dispensar en placas estriles. pH final
7.2 0.1.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Oxford modificado.
Ingredientes:

158

Ingredientes
Agar base
sangre
Columbia
Agar Esculina
Citrato
frrico
amoniacal
Cloruro
de litio
Buffer colistina
metansulfonato
Agua
Cantidades
39.0-44.0
g
2.0 g 1.0 g 0.5 g 15.0 g 1.0 ml 1 000 mL

Preparacin: Disolver el medio basal por agitacin en agua destilada, ajustar el pH a 7.2 0.1.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 10 min, mezclar nuevamente, enfriar rpidamente a 46 C
en bao de agua, adicionar 2 ml de disolucin moxalactam amortiguada y mezclar. Dispensar 12 ml
en cajas Petri. Disolucin colistina amortiguada al 1 % (p/v): colistina metansulfonato 1 g, buffer
de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.0 0.1, 100 ml. Disolucin moxalactam amortiguada al 1 %
(p/v): moxalactam 1 g, buffer fosfato de potasio 0.1 M pH 6.0 0.1, 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Medio ALOA.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona
carne
Triptona
Extracto de
levadura
Piruvato
de sodio
Glucosa
Glicerofosfato
de magnesio
Sulfato
de
magnesio
Cantidades 18.0 g 6.0 g 10.0 g 2.0 g 2.0 g 1.0 g 0.5 g

Ingredientes
Clorhidrato
de sodio
Clorhidrato
de litio
Fosfato
hidrogenado
disdico
anhidro
5-bromo-4-cloro-
3-indolyl--D-
glucopyranosido
Agar Agua
Cantidades 5.0 g 10.0 g 2.5 g 0.05 g
12.0 g a
18.0 g
925 ml a
930 ml

Preparacin: Disolver los componentes, ajustar el pH a 7.2 0.2, esterilizar en autoclave por 15
min a 121 C. Medio completo: 925 ml o 930 ml de agar base, 5 ml disolucin de cido nalidxico,
5 ml disolucin ceftazidima, 5 ml disolucin cicloheximida, 5 ml polimixina B (o 10 ml de
anfotericina B), 50 ml L--fosfatidilinositol. Suplementos: Disolver 2 g de L--fosfatidilinositol en
50 ml de agua fra, agitar aproximadamente por 30 min hasta obtener una suspensin homognea,
esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, enfriar entre 48 C y 50 C, disolver los siguientes
componentes individualmente en sus respectivos solventes y esterilizar por filtracin: 0.02 g cido
nalidxico en 5 ml de agua; 0.02 g de ceftazidima en 5 ml de agua; 76700 U de polimixina B en 5
ml de agua; 0.05 g cicloheximida en 2.5 ml de etanol y adicionar 2.5 ml de agua; 0.01 de
anfotericina B en una mezcla de 2.5 ml HCl (1 M) y 7.5 ml de dimetilformamida.
Reactivo o medio de cultivo: Medio Rapid'L mono.
Ingredientes:

159

Extracto de
carne
Extracto de
levadura
Clorhidrato
de litio
Suplementos selectivos
(informacin no
especificada)
Cantidades 30.0 g 5.0 g 1.0 g 9.0 g 20.0 ml

Ingredientes D-xilosa Rojo fenol
Agar B
(informacin no
especificada)
Sustrato
cromognico
(informacin no
especificada)
Agua destilada
Cantidades 10.0 g 0.12 g 13.0 g 1.0 ml 1 000 ml

Preparacin: pH final 7.3 0.1, almacenar entre 2 C - 8 C en obscuridad, el medio se encuentra
disponible comercialmente en Bio-Rad http://www.biorad.com.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo y agar triptosa (para serologa).
Ingredientes:
Ingredientes Difco Bacto triptosa NaCl Dextrosa Agar Agua destilada

Preparacin: Pesar los ingredientes, aadir el agua y mezclar, esterilizar en autoclave 15 min a 121
C, pH final 7.2 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: CHROMagar Listeria.
Preparacin: Medio selectivo comercial. Se encuentra disponible en www.chromagar.com
Reactivo o medio de cultivo: Agar cromognico para Listeria.
Preparacin: Medio selectivo comercial. Se encuentra disponible en www.oxoid.com
Reactivo o medio de cultivo: Medio cromognico para Listeria M. (BSM)
Preparacin: Se puede obtener comercialmente como un medio deshidratado basal ms
suplementos.

BAM Captulo 10: Listeria monocytogenes. BAM Protocolo: Confirmacin simultnea de
especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por PCR en tiempo real
Reactivo o medio de cultivo: Agua grado molecular estril

160

Reactivo o medio de cultivo: OmniMix-HS PCR Reagent Beads (Cepheid, Sunnyvale, CA.
Tambin disponible en Fisher).
Reactivo o medio de cultivo: Oligos iniciadores para especies de Listeria y el gen iap de L.
monocytogenes (Tabla 21).
Tabla 21. Secuencias de los oligos para usar en la plataforma SmartCycler II (Cepheid,
Sunnyvale, CA) basada en la secuencia GenBank Accession X52268.
Oligos
1
Bases 5' 3' Secuencia
Lm835F 28 AACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTA
Lm998R 20 TAGGCGCAGGTGTAGTTGCT
Lall1055F 24 GTTAAAAGCGGTGACACTATTTGG
Lall1163R 31 TTTGACCTACATAAATAGAAGAAGAAGATAA
1
El nombre del oligo iniciador se compone del objetivo (Lall = todas las especies de Listeria, Lm =
L. monocytogenes), Posicin 5' de la base del oligonucletido en la respectiva secuencia especfica
del gen especificada en la columna 2 y oligo delantero (F) u oligo reverso (R).

4.3 Staphylococcus aureus
NOM-115-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Medio de Baird-Parker
Ingredientes: Medio base 95 ml, disolucin de telurito de potasio 1 ml, emulsin de yema de huevo
5 ml; cuando el medio base est a 45 C, agregar los dems ingredientes y mezclar. Colocar de 15 a
20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a
temperatura de 0 C a 5 C.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base de Baird-Parker
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Extracto de levadura Extracto de carne Glicina
Cantidades 10.0 g 1.0 g 5.0 g 12.0 g

Ingredientes Cloruro de litio Piruvato de sodio Agar Agua

Preparacin: Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitacin constante y
hervir durante 1 min, esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45
C.
Ingredientes:

161

Ingredientes Telurito de potasio Agua

Preparacin: Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar, la disolucin puede ser
almacenada por varios meses a temperatura de 0 C a 5 C.
Reactivo o medio de cultivo: Emulsin de yema de huevo.
Ingredientes y preparacin: Huevos frescos, tintura de yodo (disolucin alcohlica al 2 %),
cloruro mercrico (1:1000). Lavar con agua y jabn los huevos frescos que sean necesarios y
limpiarlos con una disolucin de tintura de yodo o sumergirlos en disolucin de cloruro mercrico,
enjuagar con agua estril y secar con gasa estril, en campana de flujo laminar o en condiciones
aspticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estril, transferir las yemas a una
probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con disolucin salina isotnica, verter la
emulsin a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estril y agitar fuertemente para formar la
emulsin, filtrar a travs de gasa, las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su
preparacin.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin salina isotnica
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro de sodio Agua

Preparacin: Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de infusin cerebro-corazn (BHI)
Ingredientes:
Ingredientes
Infusin de
cerebro de
ternera
Infusin de
corazn de
res
Peptona de
gelatina
Cloruro
de sodio
Fosfato disdico
dodecahidratado
Glucosa Agua
Cantidades 200.0 ml 250.0 ml 10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g
1 000
ml

Preparacin: Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: cido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.
Ingredientes: cido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera o equivalente a 0.03 g, agar
1 g, cloruro de calcio anhidro (Disolucin 0.01 M) 0.10 ml, cloruro de sodio 1 g, azul de toluidina
(Disolucin 0.1 M) 0.3 ml, Tris-(hidroximetil-aminometano) (Tris disolucin 0.05 M, pH 9) 100
ml.

162

Ingredientes
cido
desocirribonucleico
helicoidal de timo
de ternera o
equivalente
Agar
Cloruro de
calcio
anhidro
(Disolucin
0.01 M)
Cloruro
de sodio
Azul de
toluidina
(Disolucin
0.1 M)
Tris-
(hidroximetil-
aminometano)
(Tris disolucin
0.05 M, pH 9)
Cantidades 0.03 g 1.0 g 0.10 ml 1.0 g 0.3 ml 100 ml

Preparacin: Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidina agitando hasta completar la
disolucin del cido desoxirribonucleico y calentar a ebullicin, agregar el azul de toluidina,
distribuir en frascos pequeos con tapn de hule, no es necesario esterilizar. Este medio es estable a
temperatura ambiente hasta 4 meses y funciona perfectamente an despus de fundirlo varias veces;
tomar un porta objetos limpio y agregar 3 ml del medio fundido esparcindolo por la superficie,
cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de una pipeta Pasteur, conservar en
refrigeracin para evitar la deshidratacin.
Reactivo o medio de cultivo: Plasma de conejo
Ingredientes: Plasma de conejo deshidratado o rehidratado, cido etilendiaminotetractico (EDTA)
0.1 %, emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del
fabricante y agregar cido etilendiaminotetractico (EDTA) en disolucin al 0.1 % en plasma
rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estril en proporcin de 1:3. Puede
emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA, no debe emplearse sangre citratada.
UNE-EN ISO 6888-1:2000
Reactivo o medio de cultivo: Medio de agar de Baird-Parker
Ingredientes:
Disolucin de
telurito potsico
Emulsin de
yema de huevo
Disolucin de
sulfametacina

Preparacin: Medio base 100 ml, disolucin de telurito potsico 1 ml, emulsin de yema de huevo
5 ml, disolucin de sulfametacina 2.5 ml. Se funde el medio base y a continuacin se deja enfriar
aproximadamente hasta 47 C utilizando el bao de agua, aadir en condiciones aspticas las otras
dos disoluciones y si es necesario (si se sospecha la presencia de especies de Proteus en la muestra
de ensayo) la disolucin de sulfametacina, habiendo calentado previamente las disoluciones a 47 C
en el bao de agua, mezclar bien.
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido
pancretico de
casena
Extracto de
levadura
Extracto de carne Piruvato sdico
Cantidades 10.0 g 1.0 g 5.0 g 10.0 g


163

Ingredientes L-glicina Cloruro de litio Agar Agua
Cantidades 12.0 g 5.0 g
Entre 12.0 g y
22.0 g
Hasta un volumen
final de 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los componentes del medio base completo deshidratado en agua en
ebullicin, ajustar pH a 7.2 0.2 a 25 C, trasvasar el medio en alicuotas de 100 ml, esterilizar
durante 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de telurito potsico
Ingredientes:
Ingredientes Telurito potsico Agua

Preparacin: Disolver el telurito potsico en el agua, calentando mnimamente, esterilizar por
filtracin utilizando membranas de tamao de poro de 0.22 m, almacenar aproximadamente 1 mes
a 3 C 2 C, desechar si se forma un precipitado blanco.
Reactivo o medio de cultivo: Emulsin de yema de huevo
Ingredientes y preparacin: Huevos frescos, etanol (70 %). Se lavan los huevos con un cepillo y
detergente lquido, aclarar bajo el chorro de agua y desinfectar las cscaras por inmersin en etanol
(70 %) durante 30 s y dejarlas secar al aire libre o rociarlas con alcohol seguido de esterilizacin
con llama, trabajando en condiciones aspticas, se rompe la cscara de cada huevo en dos y se
separa la yema de la clara transfiriendo repetidamente la yema de una mitad de la cscara a la otra,
se introducen las yemas en un matraz estril y se aade un volumen de agua estril igual a cuatro
veces el volumen de las yemas, se mezcla completamente, se calienta la mezcla en el bao de agua
conectado a 47 C durante 2 h y se deja entre 18 h y 24 h a 3 C 2 C para dejar que se forme un
precipitado, se recoge el lquido sobrenadante en condiciones aspticas y se introduce en un matraz
estril nuevo. Almacenar a 3 C 2 C durante un mximo de 72 h.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de sulfametacina
Ingredientes:
Ingredientes Sulfametacina Disolucin de hidrxido sdico Agua

Preparacin: Disolver la sulfametacina en la disolucin de hidrxido sdico, esterilizar por
filtracin utilizando membranas de tamao de poro de 0.22 m, la disolucin puede almacenarse
durante un mes a 3 C 2 C.
Reactivo o Medio de cultivo: Infusin de cerebro y corazn.
Ingredientes:

164

Ingredientes
Digerido
enzimtico
de tejidos
animales
Infusin de
cerebro de
ternera
deshidratada
Infusin de
corazn de
buey
deshidratada
Glucosa
Cloruro
de sodio
Fosfato de
hidrgeno
disdico
(Na
2
HPO
4
)
anhidro
Agua

ebullicin, ajustar pH a 7.2 0.2 a 25 C, trasvasar el medio en alicuotas de 5 ml y 10 ml, esterilizar
Reactivo o Medio de cultivo: Plasma de conejo
Ingredientes: Se utilizar plasma deshidratado de conejo comercial y se rehidratar de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Si no se tuviera acceso a plasma deshidratado de conejo, se diluir
un volumen de plasma fresco estril de conejo con tres volmenes de agua estril, si se utiliz
citrato potsico o citrato sdico como anticoagulantes de plasma, se aadir una disolucin de
EDTA, de forma que resulte una concentracin de 0.1 % de EDTA en el plasma rehidratado o
diluido. Salvo que las instrucciones del fabricante indiquen lo contrario, el plasma rehidratado o
diluido se utilizar inmediatamente; antes de utilizarse se analizar cada lote de plasma con cepas
de estafilococos coagulasa-positivos y cepas de estafilococos coagulasa-negativos.
UNE-EN ISO 6888-2:2000
Reactivo o medio de cultivo: Medio de agar de plasma de conejo y fibringeno
Ingredientes:
Disolucin
telurito potsico
Disolucin de
fribringeno bovino
Disolucin de
plasma de conejo y
del inhibidor de
tripsina

Preparacin: Medio base 90 ml, disolucin telurito potsico 0.25 ml, disolucin de fibringeno
bovino 7.5 ml, disolucin de plasma de conejo y del inhibidor de tripsina 2.5 ml. Fundir el medio
base y despus dejarlo enfriar a 48 C en bao de agua; en condiciones aspticas, aadir las tres
soluciones previamente calentadas a 48 C en bao de agua, mezclar completamente por rotacin
tras cada adicin, para minimizar la formacin de espuma, utilizar el medio completo
inmediatamente despus de su preparacin, a fin de evitar la precipitacin del plasma.
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido
pancretico
de casena
Extracto
de
levadura
Extracto
de carne
Piruvato
sdico
L-
glicina
Cloruro
de litio
Agar Agua

165

Entre
12.0 g
a 22.0
g
Hasta un
volumen
final de 1
000 ml

ebullicin, ajustar el pH a 7.2 0.2 a 25 C; trasvasar el medio en alicuotas de 100 ml, esterilizar
Ingredientes:

filtracin utilizando membranas de tamao de poro de 0.22 m; almacenar aproximadamente 1 mes
a 3 C 2 C; desechar si se forma un precipitado blanco.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de fibringeno bovino
Ingredientes:
Ingredientes Fibringeno bovino Agua estril
Cantidades 5.0 g a 7.0 g 100 ml

Preparacin: En condiciones aspticas, disolver el fibringeno bovino en agua justo antes de su
utilizacin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de plasma de conejo y del inhibidor de la tripsina
Ingredientes: Plasma de conejo con EDTA para la coagulasa (plasma coagulasa EDTA) 30 ml,
inhibidor de la tripsina 30 mg. En condiciones aspticas, disolver el fibringeno bovino en agua
justo antes de su utilizacin.
UNE-EN ISO 6888-3:2003
Reactivo o medio de cultivo: Caldo Giolitti y Cantoni modificado
Ingredientes: Medio base, telurito potsico; poco tiempo antes de su uso, se calienta el medio base
durante 15 min a 100 C para expulsar el aire, se enfra entre 44 C y 47 C y se aade
aspticamente la disolucin de telurito potsico utilizando 0.1 ml por tubo de medio de
concentracin simple y 0.2 ml por tubo de medio de concentracin doble.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base (medio doble, medio simple).
Ingredientes:
Medio doble:

166

Ingredientes
Digestato
enzimtico de
casena
Extracto de
carne
Cloruro de
litio
Manitol
Cloruro
sdico
Cantidades 20.0 mg 10.0 g 10.0 g 40.0 g 10.0 g

Ingredientes Glicina Piruvato sdico
Mono-oleato de sorbitn
polioxietilenado, Tween
80
Agua

Medio simple:
Ingredientes
Digestato
enzimtico de
casena
Extracto de
carne
Cloruro de
litio
Manitol Cloruro sdico
Cantidades 10.0 mg 5.0 g 5.0 g 20.0 g 5.0 g

Ingredientes Glicina Piruvato sdico
Mono-oleato de sorbitn
polioxietilenado, Tween
80
Agua

Preparacin: Se disuelven los ingredientes en el agua, mediante calentamiento y mezclando si
fuera necesario, para obtener una disolucin completa. Se enfra a temperatura ambiente y se ajusta
el pH; dispensar el medio en cantidades apropiadas en tubos, esterilizar 15 min.
Ingredientes:

filtracin utilizando membranas de tamao de poro de 0.22 m, almacenar aproximadamente 1 mes
a 3 C 2 C, desechar si se forma un precipitado blanco.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de agar
Ingredientes:
Ingredientes Agar Agua
Cantidades 15.0 g a 20.0 g 1 000 ml


167

Preparacin: Se suspende el agar en el agua mediante ebullicin y, se esteriliza en autoclave a 121
C durante 15 min, se enfra entre 44 C y 47 C antes de su empleo, se reparte en tubos de
capacidad adecuada, almacenar de acuerdo a la Norma ISO 7218.
Reactivo o medio de cultivo: Medio agar de Baird-Parker
Ingredientes: Vase la norma ISO 6888-1:1999.
Reactivo o medio de cultivo: Medio agar de plasma de conejo y fibringeno
Reactivo o medio de cultivo: Caldo infusin de cerebro y corazn.
Reactivo o medio de cultivo: Plasma de conejo.
Ingredientes: Refirase a la norma ISO 6888-1:1999.

BS 5763: Part 7: 1983
Ingredientes:
Ingredientes
Glutamato de
sodio
L-cido
asprtico
L-arginina

Ingredientes
cido
nicotnico
cido
pantotnico
Sulfato de
magnesio
Citrato de
hierro
amoniacal
(III)
Cloruro de
calcio
dihidratado
Fosfato
dipotsico de
hidrgeno


Preparacin: Disolver el cloruro de amonio en el agua, adicionar los otros componentes y disolver
por agitacin y calentamiento, ajustar el pH despus de la esterilizacin a 6.7 0.2 a 25 C,
transferir volmenes de 100 ml del medio a envases adecuados y esterilizar en autoclave por 10
minutos a 115 C, adicionar a cajas Petri de 12 ml a 15 ml del medio estril y enfriado a
aproximadamente 45 C, dejar solidificar.

168

Ingredientes:
Agua
destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por calentamiento, ajustar el pH despus de la
esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C, transferir volmenes de 100 ml del medio a contenedores
adecuados y esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 C, adicionar a cajas Petri
estriles de 12 ml a 15 ml del medio enfriado a 45 C, dejar solidificar y almacenar a 0 C 5 C.
Ingredientes:
Extracto
de
levadura
Extracto de
carne

Glicina
Cloruro
de litio

Agar
Agua
destilada
Disolucin
de
sulfamezatina
(solo de ser
necesario)
Cantidades 10 g 1 g 5 g 12 g 5 g
12 g
a 20
g
1 000 ml 27.5 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua por calentamiento, si es necesario, adicionar los
27.5 ml de la disolucin de sulfamezatina (sulfamidina, INN), ajustar el pH despus de la
esterilizacin a 7.2 0.2 a 25 C, transferir volmenes de 90 ml del medio a frascos o botellas de
capacidad no mayor a 300 ml, esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 C.
Ingredientes:
Ingredientes
potasio
Agua destilada

Preparacin: Disolver el telurito de potasio en el agua con mnimo calentamiento, esterilizar por
filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de sulfamezatina (sulfadimina, INN), solo en sospecha de
presencia de Proteus.
Ingredientes:
Ingredientes Sulfamezatina
Disolucin de
hidrxido de sodio
(0.1 mol/l)
Agua destilada

169


Preparacin: Disolver la sulfamezatina en la disolucin de hidrxido de sodio, llevar hasta un
volumen final de 100 ml con el agua destilada.
Ingredientes:
Ingredientes Piruvato de sodio
Agua destilada
Cantidades 20 g
100 ml

Preparacin: Disolver el piruvato en el agua destilada.
Ingredientes:
Agua destilada
Cantidades 20 g
100 ml

Preparacin: Disolver el piruvato en el agua destilada, filtrar por filtracin.
Reactivo o medio de cultivo: Emulsin yema de huevo.
Ingredientes:
Agua destilada
Cantidades 20 g
100 ml

Preparacin: Usar huevos frescos, separar las yemas de las claras, mezclar las yemas
vigorosamente con 4 veces su volumen de agua, calentar la mezcla en bao de agua, a temperatura
controlada de 45 C, por 2 horas y dejar de (18 a 24) h a 0 C para permitir que se forme un
precipitado, decantar el lquido supernadante y esterilizar por filtracin, la emulsin debe ser
separada aspticamente. La emulsin debe almacenarse a 0 C -5 C por no ms de 72 h.
Reactivo o medio de cultivo: Medio completo.
Ingredientes:
Disolucin de
piruvato de
sodio
Emulsin
yema de
huevo
Disolucin de
telurito de
potasio

Cantidades 90 ml 5 ml 5 ml 1 ml


170

Preparacin: Disolver el medio base y enfriar a aproximadamente 50 C, adicionar los otros
lquidos, mezclando bien despus de cada adicin, distribuir de 15 ml a 20 ml del medio completo
en cajas Petri y dejar solidificar.

BAM Captulo 12: Staphylococcus aureus
Reactivo o Medio de cultivo: Medio Baird-Parker, pH 7.0
Ingredientes:
Ingredientes Medio base Disolucin de telurito de potasio-emulsin de yema de huevo

Aspticamente adicionar 5 ml de la disolucin yema de huevo-telurito a 95 ml del medio base
precalentado (45 - 50) C y mezclar, colocar de 15 ml a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar
solidificar, secar las placas antes de usarlas. Las placas pueden almacenarse hasta 5 das a
temperatura de (20 a 25) C.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base de Baird-Parker
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Extracto de carne Glicina
Cantidades 10.0 g 1.0 g 5.0 g 12.0 g

Ingredientes Cloruro de litio Piruvato de sodio Agar Agua

Preparacin: Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitacin constante y
hervir durante 1 min, esterilizar a (121 1) C durante 15 min, enfriar y mantener el medio a (48
50) C, enriquecimiento: Emulsin yema de huevo telurito.
Reactivo o medio de cultivo: Agar soya-triptona (TSA)
Ingredientes:
Preparacin: Disolver el agar por calentamiento y agitacin, hervir 1 min, repartir en tubos o
frascos de capacidad adecuada, esterilizar 15 min a 121 C, pH final 7.0 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo y agar de infusin cerebro-corazn (BHI).
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes
Peptona de
soya
Peptona de
casena
Cloruro de
sodio
Agar Agua destilada

171


Medio 2:
Ingredientes
Infusin
cerebro-
corazn
Digerido
enzimtico
de tejidos
animales
Cloruro de
sodio
Dextrosa
Peptona
de
gelatina
Na
2
HPO
4
Agua

Preparacin: Disolver el medio 1 en agua destilada con calentamiento moderado, suspender los
ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir por 1 min para disolver completamente,
distribuir ambos medios en tubos o botellas para almacenar, esterilizar 15 min a 121 C, pH final
7.4 0.2, para preparar el agar aadir 15 g de agar a 1 L de medio BHI, calentar para disolver
completamente, distribuir en botellas o frascos para almacenar, esterilizar 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar DNAsa azul de toluidina.
Ingredientes:
Ingredientes DNA Agar CaCl
2
(anhidro) NaCl
Azul de
toloudina
TRIS
aminometano
Agua
destilada
Cantidades 0.3 g 10.0 g 1.1 mg 10.0 g 0.083 g 6.1 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver el TRIS en 1 L de agua destilada, ajustar el pH a 9.0, adicionar el resto de
los ingredientes menos el azul de tolouidina, disolver por calentamiento; disolver el azul de
toluidina en el medio, distribuir en tubos con rosca. No es necesario esterilizar si se utiliza
inmediatamente; el medio estril es estable por 4 meses a temperatura ambiente.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona extracto de levadura
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Carbohidrato
Morado de
bromocresol
Agar
Agua
destilada

Preparacin: Disolver el agar con calentamiento y agitacin, ajustar el pH a 7.0 0.2, llenar 2/3 de
tubos de 16 mm x 125 mm, esterilizar por 20 min a 115 C.
Reactivo o medio de cultivo: Buffer fosfato salino 0.02 M (pH 7.3 - 7.4)
Ingredientes:
Disolucin stock 1:

172

Ingredientes Na
2
HPO
4
(anhidro) NaCl Agua destilada

Disolucin stock 2:
Ingredientes NaH
2
PO
4
H
2
O (monohidratado) NaCl Agua destilada

Preparacin: Para obtener el buffer (0.85 %), tomar diluciones 1:10 de cada disolucin stock.

Se usan los mismos medios y reactivos descritos para la metodologa de cuenta directa (BAM
Captulo 12: Staphylococcus aureus) previamente descrita. Adicionalmente:
Medio de cultivo: Caldo soya tripticasa conteniendo 10 % NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
tripticasa
(triptona)
Fitona
(soytona)
Cloruro
de sodio
Fosfato
dipotsico
Dextrosa
Piruvato
de sodio
Agua
destilada

Preparacin: El caldo deshidratado de tripticasa o tripti soya es adecuado si se adiciona con 95 g
de NaCl y 10 g de piruvato de sodio por litro. Verter 10 ml dentro de tubos 16 mm x 150 mm,
esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, pH final, 7.3 0.2, almacenar hasta un mes a 4 C
1C.

4.4 Salmonella spp.
NOM-114-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Agua de peptona tamponada.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Cloruro sdico
Fosfato sdico
dibsico
Fosfato
potsico
monobsico
Agua

Preparacin: Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario, ajustar el pH, si es
necesario, despus de la esterilizacin a 7.0. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la

173

capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba, esterilizar por 20 min a
121 C 1 C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lactosado.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65 C, distribuir en porciones de 225
ml, en frascos de 500 ml, esterilizar durante 15 min a 121 C 1 C, pH final: 6.9 0.2 a 25C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo selenito-cistina.
Ingredientes:
Ingredientes
Triptona o
polipeptona
Lactosa
Fosfato
disdico
Selenito
cido de
sodio
L-cistina Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril y distribuir en
volmenes de 10 ml y 225 ml en recipientes estriles, segn se requiera; el caldo as preparado es
transparente. De preferencia usarlo el mismo da de su preparacin, si se desea conservar el medio
por varios das, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110 C 1 C, tomando entonces
un color salmn, pH final: 7.0 0.2 a 25 C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo tetrationato.
Ingredientes:
Ingredientes Proteosa
peptona o
triptona
Sales biliares Carbonato de
calcio
Tiosulfato de
sodio
pentahidratado
Agua
destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril, distribuir, agitando
constantemente, en porciones de 10 ml y 225 ml, en recipientes estriles, guardar en refrigeracin.
Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una disolucin yodo-yoduro y 1 ml de disolucin de verde
brillante al 0.1 % por cada 100 ml de caldo; el medio una vez adicionado de yodo no debe
calentarse y debe usarse el mismo da de su preparacin, pH final: 7.0 0.1.
Reactivo o medio de cultivo: Vassiliadis-Rappaport.
Ingredientes:
Disolucin A:

174

Ingredientes Triptona Cloruro de sodio
Fosfato de potasio
dihidrogenado
Agua destilada

Disolucin B:
Ingredientes Cloruro de magnesio hexahidratado Agua destilada
Cantidades 400 g 1 000 ml

Disolucin C:

Ingredientes
Oxalato de verde de
malaquita
Agua destilada

Medio completo:
Ingredientes Disolucin A Disolucin B Disolucin
Cantidades 1 000 ml 100 ml 10 ml

Preparacin: Disolucin A: Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70 C.
Disolucin B: Disolver el cloruro de magnesio en agua. Como esta sal es muy higroscpica es
conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente
abierto de tal modo que la concentracin de la disolucin sea de 0.4 g/ml. Conservar en frasco
mbar a temperatura ambiente. Disolucin C: Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua,
conservar en frasco mbar a temperatura ambiente. Medio completo: Adicionar 1 000 ml de la
disolucin A, 100 ml de la disolucin B y 10 ml de la disolucin C; ajustar el pH si es necesario, de
tal manera que despus de la esterilizacin sea de 5.2; distribuir antes de usar dentro de tubos en
cantidades de 10 ml, almacenar en refrigeracin.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de soya tripticasa.
Ingredientes:
Ingredientes
Tripticasa o
triptosa
Fitona Glucosa
Cloruro de
sodio
Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su
disolucin completa, distribuir porciones de 225 ml dentro de matraces de 500 ml y esterilizar en
autoclave durante 15 min a 121 C 1 C.
Reactivo o medio de cultivo: Leche descremada reconstituida.

175

Ingredientes: Leche en polvo, agua.
Preparacin: Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada, agitar
circularmente hasta disolucin, distribuir en volmenes de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500
ml, esterilizar a 121 C 1 C por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio.
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticasa Sulfito de potasio
Cantidades 1 000 ml 5.0 g

Preparacin: Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1 000 ml de
medio, quedando una concentracin final de sulfito de potasio del 0.5 %. Adicionar el sulfito de
potasio antes de esterilizar en autoclave en la forma habitual.
Reactivo o medio de cultivo: Agar verde brillante (VB).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
Polipeptona
(Proteosa
peptona No. 3)
Cloruro de
sodio
Lactosa Sacarosa

Ingredientes Rojo de fenol Agar Verde brillante Agua destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullicin, hasta
disolucin completa, ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C 1 C; el
sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad, enfriar el medio a 50 C y distribuirlo en
cajas de Petri estriles; el aspecto del medio es obscuro, de color marrn. pH final: 6.9 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar con sulfito de bismuto.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne de res
Mezcla de
peptonas
Glucosa
Fosfato
disdico
(anhidro)
Sulfato
ferroso
(anhidro)

Ingredientes Sulfito de Verde brillante Agar Agua destilada

176

bismuto

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua, calentar hasta su disolucin completa,
agitando frecuentemente, ajustar el pH, enfriar a 45 C y verter en cajas de Petri estriles,
distribuyendo de manera homognea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es
opaco, de color verde plido y deben usarse el mismo da de su preparacin, si la coloracin es
parda, no deben utilizarse; el medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta
su selectividad, pH final: 7.6 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).
Ingredientes:
Ingredientes Xilosa L-lisina Lactosa Sacarosa
Cloruro de
sodio
Extracto de
levadura

Ingredientes
Rojo de
fenol
Agar
Desoxicolato
de sodio
Citrato
frrico-
amnico
Tiosulfato
de sodio
Agua
destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar en bao de agua a
55 C, agitando frecuentemente, hasta disolucin completa, ajustar el pH, enfriar a 50 C y verter en
cajas de Petri estriles, no se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitacin; la
reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeas; el aspecto
del medio es claro y de color rojo brillante, pH final: 6.9 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar para Salmonella y Shigella (SS).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Polipeptona Lactosa
Sales
biliares
Citrato de
sodio
dihidratado
Tiosulfato de
sodio
pentahidratado

Ingredientes Citrato frrico Agar Rojo neutro Verde brillante Agua destilada
Cantidades 1.0 g 13.5 g 0.025 g 0.330 mg 1 000 ml

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estril y calentar a ebullicin
hasta disolucin completa, ajustar el pH, no esterilizar en autoclave, enfriar a 50 C y distribuir en

177

cajas de Petri estriles en condiciones aspticas, el aspecto del medio fundido es claro y de color
rosado, pH final: 7.0 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar entrico Hektoen.
Ingredientes:
Ingredientes
Proteosa
peptona
Extracto
de
levadura
Lactosa Sacarosa Salicina
Sales
biliares
Cloruro
de sodio

Ingredientes
Tiosulfato
de sodio
Citrato
amnico
frrico
Azul de
bromotimol
Fuscina
cida
Agar Agua

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitacin hasta completa
disolucin del agar, no sobrecalentar, dejar enfriar a 55 C -60 C y distribuir en cajas de Petri
estriles en condiciones aspticas, pH final: 7.5 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de tres azcares y hierro (TSI).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
carne
Peptona de
casena
Cloruro de
sodio
Lactosa Sacarosa Glucosa

Ingredientes Agar
Rojo de
fenol
Sulfato ferroso
amnico
pentahidratado
Tiosulfato de
sodio
Agua
destilada
Cantidades 1.3 g 2.5 mg 20.0 mg 20.0 mg 100 ml

Preparacin: Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada, calentar a ebullicin,
agitando ocasionalmente, hasta disolucin completa, enfriar a 60 C y ajustar el pH, distribuir en
volmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm y esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min,
inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una
profundidad de 4 cm; el medio es de color rojo, pH final: 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de hierro y lisina (LIA).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
gelatina
Extracto de
levadura
Glucosa L-lisina
Citrato frrico
amnico

178

Cantidades 0.5 g 0.3 g 0.1 g 1.0 g 50.0 mg

Ingredientes
Tiosulfato de
sodio anhidro
Prpura de
bromocresol
Agar Agua destilada
Cantidades 4.0 mg 2.0 mg 1.5 g 100 ml

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta
ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa, ajustar el pH, distribuir
en volmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm, con tapn de rosca, esterilizar en autoclave a
121 C 1 C durante 12 min, dejar que los tubos se enfren en posicin inclinada, de tal modo que
se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm, el medio ya preparado
es de color prpura, pH final: 6.7 0.2.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agar Agua destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua, dejar reposar de 5 min a 10 min, calentar a
ebullicin hasta disolucin completa, distribuir en tubos de 13 mm x 100 mm, en cantidades de 1/3
de su volumen, esterilizar a (121 1) C por 15 min, inclinar los tubos antes que el agar solidifique,
pH final: 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de SIM (para sulfuro, indol y movilidad).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Peptona
Hierro
peptonizado
Tiosulfato de
sodio
Agua destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullicin agitando
frecuentemente hasta lograr una disolucin completa, enfriar a 50 C y ajustar el pH, distribuir el
medio en volmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 C 1
C durante 15 min, se dejan enfriar los tubos en posicin vertical, pH final: 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar citrato de Simmons.
Ingredientes:
Ingredientes
Fosfato
de
amonio
Fosfato
dipotsico
Cloruro
de sodio
Citrato de
sodio
Sulfato
de
magnesio
Azul de
bromotimol
Agar
Agua
destilada
Cantidades 1.0 g 1.0 g 5.0 g 2 0.2 g 0.08 g
15.0
g
1 000 ml


179

frecuentemente hasta lograr una disolucin completa, ajustar el pH final: 6.8 0.2, distribuir el
C durante 15 min, dejar enfriar los tubos en posicin inclinada.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer).
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Dextrosa
Difosfato de
potasio
Agua destilada

C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo manitol.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Proteosa
peptona
Cloruro de
sodio
Rojo de
fenol
Manitol Agua

Preparacin: Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH,
distribuir en volmenes de 2 ml a 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar a 121 C 1 C
durante 15 min, pH final: 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo malonato.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
Sulfato de
amonio
Fosfato
dipotsico
Fosfato
monopotsico
Cloruro de
sodio

Ingredientes Malonato Glucosa Azul de bromotimol Agua

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH, distribuir en tubos de 13
mm x 100 mm en cantidades de 3 ml, esterilizar en autoclave a (121 1) C durante 15 min, pH
final: 6.7 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo urea.
Ingredientes:

180

Ingredientes Urea
Extracto de
levadura
Fosfato
monopotsico
Fosfato
disdico
Rojo de fenol Agua

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por
filtracin a travs de membrana 0.45 m o en autoclave de 5 lb a 8 lb de presin durante 15 min,
distribuir aspticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos estriles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de urea rpido.
Ingredientes:
Ingredientes Urea
Extracto de
levadura
Fosfato
monopotsico
Fosfato
disdico
Rojo de fenol

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por
filtracin a travs de membrana 0.45 m, distribuir aspticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos
estriles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo infusin cerebro corazn.
Ingredientes:
Ingredientes
Infusin
cerebro
corazn
Infusin
de
corazn
de res
Proteosa
peptona
Cloruro
de sodio
Fosfato
disdico
dodecahidratado
Dextrosa
Agua
destilada
Cantidades 200 g 250 g 10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 1000 ml

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente, distribuir y
esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min, pH final: 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin verde brillante al 0.1 % (1:1000).
Ingredientes:
Ingredientes Verde brillante Agua destilada estril

Preparacin: Disolver 0.1 g de verde brillante en agua destilada estril hasta completar 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de yodo-yoduro.
Ingredientes:
Ingredientes Cristales de yodo Yoduro de potasio Agua destilada

181


Preparacin: Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100
ml, conservar en frasco mbar.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina al 0.85 %
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro de sodio Agua destilada

Preparacin: Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121 C 1 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina formalizada.
Ingredientes:
Ingredientes Disolucin de
formaldehdo (36 %-38
%)
Cloruro de sodio Agua destilada
Cantidades 6.0 ml 8.5 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver 8.5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada, esterilizar a 121 C
1 C durante 15 min, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 6 ml de la disolucin de
formaldehdo, no esterilizar despus de la adicin de formaldehdo.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de Kovac.
Ingredientes:
Ingredientes p-dimetil-aminobenzaldehdo Alcohol
amlico
cido clorhdrico
concentrado

Preparacin: Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehdo en el alcohol amlico y despus agregar el
cido clorhdrico lentamente, conservar en frasco mbar en refrigeracin.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin de alfa-naftol al 5 %.
Ingredientes:
Ingredientes Alfa-naftol Alcohol

Preparacin: Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 ml.

182

Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de rojo de metilo.
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Alcohol etlico Agua destilada c.b.p.

Preparacin: Disolver el rojo de metilo en el alcohol etlico y adicionar agua hasta completar 500
ml.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de hidrxido de potasio al 40 %.
Ingredientes:

Preparacin: Disolver 40 g de hidrxido de potasio en agua hasta completar 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de gelatinasa al 5 %.
Ingredientes:
Ingredientes Gelatinasa Agua

Preparacin: Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR.
UNE-EN ISO 6579:2003
Ingredientes:
Ingredientes
Digestato
enzimtico de
casena
Cloruro
sdico
(NaCl)
Fosfato cido de
sodio dodecahidrato
(Na
2
HPO
4
12H
2
O
Fosfato
dicido de
potasio
(KH
2
PO
4
)
Agua

Preparacin: Se disuelven en agua los componentes, calentando si es necesario. Se ajusta el pH si
es necesario, de tal manera que tras la esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C, se vierte el medio en
matraces de capacidades adecuadas para obtener alcuotas apropiadas para el ensayo, se esteriliza en
la autoclave a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de Rappaport-Vassiliadis con soya (caldo RVS).
Ingredientes: Disolucin A:

183

Ingredientes
Digerido
enzimtico de
soya
Cloruro
sdico
Fosfato dicido
de potasio
(KH
2
PO
4
)
Fosfato cido
de potasio
(K
2
HPO
4
)
Agua

Disolucin B:
Ingredientes
Cloruro de magnesio hexahidratado
(MgCl
2.
6H
2
O)
Agua

Disolucin C:
Ingredientes Oxalato verde de malaquita Agua

Medio completo:
Ingredientes Disolucin A Disolucin B Disolucin C

Preparacin: Disolucin A: se disuelven los componentes en el agua calentando a unos 70 C si
fuera necesario; la disolucin debe prepararse en el mismo da que se prepare el medio RVS
completo. Disolucin B: Se disuelve el cloruro de magnesio en el agua; como esta sal es muy
higroscpica, se aconseja disolver el contenido entero de un recipiente recin abierto de MgCl
2

6H
2
O siguiendo la formulacin. Por ejemplo, 250 g de MgCl
2.
6H
2
O se aaden a 625 ml de agua,
dando una disolucin con un volumen total de 788 ml y una concentracin en peso de unos 31.7 g
por 100 ml de MgCl
2.
6H
2
O. La disolucin puede mantenerse en frascos de vidrio de color mbar
bien cerrados y a temperatura ambiente durante 2 aos como mnimo. Disolucin C: Se disuelve el
oxalato verde de malaquita en el agua. La disolucin puede mantenerse en frascos de vidrio de color
mbar a temperatura ambiente durante 8 meses como mnimo. Medio completo: Se aaden a 1 000
ml de la disolucin A, 100 ml de la disolucin B y 10 ml de la disolucin C, se ajusta el pH, si fuera
necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 5.2 0.2, antes de su uso se reparte en
tubos de ensayo en cantidades de 10 ml, se esteriliza durante 15 min en el autoclave ajustado a 115
C, se almacena el medio preparado a 3 C 2 C; el medio ha de utilizarse el da de su
preparacin, la composicin final del medio es: digerido enzimtico de soya, 4.5 g/l; cloruro sdico,
7.2 g/l; fosfato dicido de potasio (KH
2
PO
4
+ K
2
HPO
4
), 1.44 g/l; cloruro de magnesio anhidro
(MgCl
2
), 13.4 g/l o cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl
2
6H
2
O), 28.6 g/l; oxalato verde de
malaquita, 0.036 g/l.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de Muller-Kauffmann tetrationato novobiocina (MKTTn) -
medio base.
Ingredientes:

184

Ingredientes Extracto de carne
Digerido
enzimtico de
casena
Cloruro sdico
(NaCl)
Carbonato clcico
(CaCO
3
)

Ingredientes
Tiosulfato sdico
pentahidrato
(Na
2
S
2
O
3
5H
2
0)
Bilis de buey para
uso bacteriolgico
Verde brillante Agua
Cantidades 47.8 g 4.78 g 9.6 mg 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los componentes bsicos deshidratados o el medio completo
deshidratado en el agua mediante ebullicin durante 5 min, se ajusta el pH, si fuera necesario, de
manera que sea de 8.2 0.2 a 25 C, se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser
almacenado durante 4 semanas a 3 C 2 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de yodo-yoduro.
Ingredientes:
Ingredientes Yodo Yoduro potsico (KI) Agua

Preparacin: Se disuelve completamente el yoduro potsico en 10 ml de agua, luego se aade el
yodo y se diluye hasta 100 ml con agua estril, no calentar, se almacena la disolucin preparada en
la oscuridad a temperatura ambiente en un recipiente hermticamente cerrado.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de novobiocina.
Ingredientes:
Ingredientes Sal sdica de novobiocina Agua

Preparacin: Se disuelve la sal sdica de novobiocina en el agua y se esteriliza por filtracin. Se
puede almacenar hasta 4 semanas a 3 C 2 C.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo de Muller-Kauffmann tetrationato novobiocina (MKTTn) -
medio completo.
Ingredientes:
Disolucin yodo-
yoduro
Disolucin de
novobiocina
Cantidades 1000 ml 20.0 ml 5.0 ml


185

Preparacin: Se aaden aspticamente 5 ml de la disolucin de novobiocina a 1 000 ml del medio
base, se mezcla y luego se aaden 2 ml de la disolucin yodo-yoduro, se mezcla bien, se reparte el
medio aspticamente en matraces estriles de capacidad adecuada para obtener las porciones
necesarias para los anlisis, el medio completo debe utilizarse el da de su preparacin.
Reactivo o medio de cultivo: Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura en
polvo
Cloruro
sdico
(NaCl)
Xilosa Lactosa Sacarosa
Hidrocloruro
de L-Lisina

Ingredientes
Tiosulfato
sdico
Citrato
amnico de
hierro (III)
Rojo fenol
Desoxicolato
sdico
Agar Agua
Cantidades 6.8 g 0.8 g 0.08 g 1.0 g De (9 a 18) g 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los componentes bsicos deshidratados o el medio base completo
deshidratado en el agua mediante calentamiento, con agitacin frecuente, hasta que el medio
comience a hervir, ha de evitarse el sobrecalentamiento, se ajusta el pH, si fuera necesario, de
manera que despus de la esterilizacin sea de 7.4 0.2 a 25 C, se vierte el medio en tubos o
matraces de capacidad adecuada, se calienta con agitacin frecuente hasta que el medio hierva y se
disuelva el agar, no sobrecalentar.
Ingredientes:
Cantidades 3.0 g 5.0 g De 9.0 g a 18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua,
calentando si fuera necesario, se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la
esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C, se reparte el medio de cultivo a tubos o frascos de capacidad
adecuada, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min.
Reactivo o mdio de cultivo: Agar triple azcar hierro (agar TSI).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne
Extracto de
levadura
Peptona
Cloruro sdico
(NaCl)
Lactosa

Ingredientes Glucosa Citrato de Tiosulfato Rojo fenol Agar Agua

186

hierro (III) sdico
Cantidades 1.0 g 0.3 g 0.3 g 0.024 g
De 9.0 g a
18.0 g
1 000 ml

Preparacin: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua,
calentando si fuera necesario, se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la
esterilizacin sea de 7.4 0.2 a 25 C, se reparte el medio en tubos de ensayo o placas en
cantidades de 10 ml, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min, se deja reposar en
posicin inclinada de manera que se obtenga una parte profunda de unos 2.5 cm a 5 cm.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea (Christensen) - Medio base.
Ingredientes:
Cloruro
sdico
(NaCl)
Fosfato
dicido de
potasio
(KH
2
PO
4
)
De 9 g
a 18 g
1 000
ml

Preparacin: Se disuelven los componentes o la base completa deshidratada en el agua, calentando
si fuera necesario, se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea
de 6.8 0.2 a 25 C, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea (Christensen) - Disolucin de urea.
Ingredientes:
Ingredientes Urea Agua
Cantidades 400.0 g Cantidad suficiente para un volumen final de 1 000 ml

Preparacin: Se disuelve la urea en el agua, se esteriliza por filtracin y se comprueba la
esterilidad. Vase la Norma ISO 7218: 1996.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea (Christensen) - Medio completo.
Ingredientes:
Ingredientes Medio base Disolucin de urea
Cantidades 950 ml 50 ml

Preparacin: Se aade, en condiciones aspticas, la disolucin de urea a la base, fundida
previamente y luego enfriada entre 44 C y 47 C; se reparte el medio completo en tubos estriles
en cantidades de 10 ml, se deja reposar en posicin inclinada.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de la -galactosidasa. Disolucin tampn.

187

Ingredientes:
Ingredientes
Fosfato dicido de sodio
(NaH
2
PO
4
)
Hidrxido sdico,
disolucin 10 ml/l
Agua
Cantidades 6.9 g Unos 3 ml
Para un volumen
final de 50 ml

Preparacin: Se disuelve el fosfato dicido de sodio en unos 45 ml de agua en un matraz aforado,
se ajusta el pH a 7.0 0.2 a 25 C con la disolucin de hidrxido sdico, se aade agua para un
volumen final de 50 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de la -galactosidasa. Disolucin ONPG.
Ingredientes:
Ingredientes -Nitrofenil -D-galactopiransido (ONPG) Agua

Preparacin: Se disuelve el ONPG en el agua a 50 C aproximadamente, se enfra la disolucin.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de la -galactosidasa. Completo.
Ingredientes:
Ingredientes Disolucin tampn Disolucin de ONPG

Preparacin: Se aade la disolucin tampn a la disolucin de ONPG.
Reactivo o Medio de cultivo: Reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer (VP). Medio VP.
Ingredientes:
Fosfato cido de potasio
(K
2
HPO
4
)
Agua

Preparacin: Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario, se ajusta el
pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 6.9 0.2 a 25 C; se
reparte el medio en tubos en cantidades de 3 ml, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer (VP). Disolucin de
creatina (N-amidinosarcosina).
Ingredientes:

188

Ingredientes Monohidrato de creatina Agua

Preparacin: Se disuelve el monohidrato de creatina en el agua.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer (VP). 1-Naftol,
disolucin etanlica.
Ingredientes:
Ingredientes 1-Naftol Etanol 96 % (fraccin volumen)

Preparacin: Se disuelve el 1-naftol en el etanol.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer (VP). Disolucin de
hidrxido de potasio.
Ingredientes:
Ingredientes Hidrxido de potasio Agua

Preparacin: Se disuelve el hidrxido de potasio en el agua.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reaccin del indol. Medio triptona/triptfano.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Cloruro sdico (NaCl) DL-Triptfano Agua

Preparacin: Se disuelven los componentes en el agua hirviendo, se ajusta el pH, si fuera
necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.5 0.2 a 25 C; se reparte el medio,
en cantidades de 5 ml, en los tubos, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reaccin del indol. Reactivo de Kovacs.
Ingredientes:
Ingredientes 4-Dimetilaminobenzaldehdo
cido clorhdrico, = 1.18
g/ml a 1.19 g/ml
2-metil-2-
butanol

Preparacin: Se mezclan los componentes.

189

Reactivo o medio de cultivo: Agar nutritivo semislido.
Ingredientes:
Cantidades 3.0 g 5.0 g De 4 a 9 g 1 000 ml

pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C; se
reparte el medio en matraces de capacidad adecuada, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Agar nutritivo semislido.
Ingredientes:
Cantidades 3.0 g 5.0 g De 4 g a 9 g 1 000 ml

pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C, se
reparte el medio en matraces de capacidad adecuada, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C
durante 15 min; se vierten unos 15 ml del medio recin preparado en placas de Petri pequeas. No
hay que dejar que las placas se sequen.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin salina fisiolgica.
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro sdico (NaCl) Agua

Preparacin: Se disuelve el cloruro sdico en el agua, se ajusta el pH, si fuera necesario, de
manera que despus de la esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C, se reparten cantidades de la
disolucin en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml despus de la
esterilizacin; se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lactosado.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada

Preparacin: Colocar porciones de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml, esterilizar en
autoclave 15 min a 121 C, pH final 6.9 0.2.

190

Reactivo o medio de cultivo: Leche desgrasada en polvo.
Ingredientes:
Ingredientes Leche desgrasada en polvo Agua destilada

Preparacin: Suspender la leche en el agua destilada, agitar hasta disolver, esterilizar en autoclave
por 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo selenito cistina.
Ingredientes:
Ingredientes
Triptona o
polipeptona
Lactosa
Fosfato
disdico
Selenito
cido de
sodio
L-cistina Agua

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril y distribuir en
volmenes de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm, de preferencia usarlo el mismo da de su
preparacin. NO ESTERILIZAR.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo tetrationato (TT).
Ingredientes:
Ingredientes Polipeptona Sales biliares
Carbonato de
calcio
Tiosulfato de
sodio.5H
2
O
Agua destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada, mezclar y calentar hasta ebullicin. NO
ESTERILIZAR, enfriar a 45 C, pH final 8.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Vassiliadis-Rappaport.
Ingredientes:
Solucin A:
Cloruro de
sodio
Fosfato de potasio
dihidrogenado
Agua destilada

Disolucin B:
Ingredientes Cloruro de magnesio hexahidratado Agua destilada

191

Disolucin C:
Ingredientes Oxalato de verde de malaquita Agua destilada

Medio completo:
Ingredientes Disolucin A Disolucin B Disolucin C

Preparacin: Disolucin A: Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70 C.
Disolucin B: Disolver el cloruro de magnesio en agua, como esta sal es muy higroscpica es
conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente
abierto de tal modo que la concentracin de la disolucin sea de 0.4 g/ml, conservar en frasco
mbar a temperatura ambiente. Disolucin C: Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.
Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente. Medio completo: Adicionar 1 000 ml de la
disolucin A, 100 ml de la disolucin B y 10 ml de la disolucin C, ajustar el pH si es necesario, de
tal manera que despus de la esterilizacin sea de 5.2, distribuir antes de usar dentro de tubos en
cantidades de 10 ml, almacenar en refrigeracin. Vida til 1 mes.
Reactivo o medio de cultivo: Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura en
polvo
Cloruro
sdico
(NaCl)
Xilosa Lactosa Sacarosa L-Lisina

Ingredientes
Tiosulfato
sdico
Citrato
amnico de
hierro (III)
Rojo fenol
Desoxicolato
sdico
Agar Agua

Preparacin: Se disuelven los componentes bsicos deshidratados en el agua mediante
calentamiento, con agitacin frecuente, hasta que el medio comience a hervir, pH de 7.4 0.2 a 25
C, no sobrecalentar.
Reactivo o medio de cultivo: Agar entrico Hektoen.
Ingredientes:
Ingredientes
Proteosa
peptona
Extracto de
levadura
Lactosa Sacarosa Salicina
Sales
biliares

192

Ingredientes
Cloruro
de sodio
Tiosulfato
de sodio
Citrato
amnico
frrico
Azul de
bromotimol
Fuscina
cida
Agar Agua

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitacin hasta completa
disolucin del agar, no sobrecalentar, dejar enfriar a 55 C -60 C y distribuir en cajas de Petri
estriles en condiciones aspticas, pH final: 7.5 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar con sulfito de bismuto.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto
de carne
de res
Mezcla
de
peptonas
Dextrosa
Fosfato
disdico
(anhidro)
Sulfato
de
bismuto
Verde
brillante
Agar
Agua
destilada
Cantidades 5.0 g 10.0 g 5.0 g 4.0 g 8.0 g 0.025 g 20.0 g 1 000 ml

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua, calentar hasta su disolucin completa,
agitando frecuentemente, enfriar entre 45 C y 50 C y verter en cajas de Petri estriles,
distribuyendo de manera homognea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es
opaco, de color verde plido y deben usarse el mismo da de su preparacin; si la coloracin es
parda, no deben utilizarse; el medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta
su selectividad, pH final: 7.7 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triple azcar hierro (agar TSI).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto
de carne
Extracto
de
levadura
Peptona
Peptona
preoteosa
Cloruro
sdico
(NaCl)
Lactosa Sacarosa

Ingredientes Glucosa
Sulfato
frrico
Tiosulfato
sdico

Medio 2:
Ingredientes Polipeptona NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa


193

Ingredientes Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
6H
2
O Na
2
S
2
O
3

Rojo
fenol
Agar
Agua
destilada

Preparacin: Puede utilizarse cualquiera de los dos medios. Medio 1: Se disuelven los
componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fuera necesario, se reparte
el medio en tubos de ensayo, se esteriliza en autoclave regulado a 118 C durante 15 min, pH 7.3
0.2. Medio 2: Se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave
regulado a 121 C durante 15 min, pH 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona, 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona o tripticasa Agua destilada

Preparacin: Disolver y distribuir porciones de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm o 16
mm x 150 mm; esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C durante 15 min, pH final 6.9 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de soya tripticasa.
Ingredientes:
Ingredientes
Tripticasa o
peptona
Fitona Glucosa
Cloruro de
sodio
K
2
HPO
4

Agua
destilada

autoclave durante 15 min a 121 C, pH final 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de soya tripticasa adicionado con sulfato de hierro.
Ingredientes:
Ingredientes
Tripticasa
o peptona
Fitona Glucosa
Cloruro
de sodio
K
2
HPO
4

Sulfato de
hierro
Agua
destilada
Cantidades 17.0 g 3.0 g 2.5 g 5.0 g 2.5 g 35.0 mg 1 000 ml

autoclave durante 15 min a 121 C, pH final 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya-triptosa tripticasa.
Ingredientes:

194

Ingredientes
Caldo soya
tripticasa
Caldo triptosa
Extracto de
levadura
Agua destilada

Preparacin: Disolver ingredientes en agua destilada, calentar lentamente hasta disolver, distribuir
porciones de 5 ml en tubos de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C,
pH final 7.2 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo MR-VP.
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes
Agua peptonada
amortiguada en
polvo
Glucosa K
2
HP0
4
Agua destilada

Medio 2:
Ingredientes
Digerido
pancretico
de casena
Digerido
pptico de
tejido animal
Dextrosa
Fosfato de
potasio
Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua con agitacin y calentamiento moderado, distribuir
porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min a 118 C -
121 C, pH final 6.9 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar citrato de Simmons.
Ingredientes:
Ingredientes
Fosfato
de
amonio
Fosfato
dipotsico
Cloruro
de sodio
Citrato
de
sodio
Sulfato
de
magnesio
Azul de
bromotimol
Agar
Agua
destilada

medio en volmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo urea.
Ingredientes:

195

Ingredientes Urea
Extracto de
levadura
Fosfato
monopotsico
Fosfato
disdico
Rojo de
fenol
Agua

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR, esterilizar por
filtracin a travs de membrana 0.45 m o en autoclave de 5 lb a 8 lb de presin durante 15 min,
distribuir aspticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos estriles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de urea rpido.
Ingredientes:
Ingredientes Urea
Extracto de
levadura
Fosfato
monopotsico
Fosfato
disdico
Rojo de
fenol
Agua

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, NO CALENTAR, esterilizar por
filtracin a travs de membrana 0.45 m o en autoclave de 5 lb a 8 lb de presin durante 15 min.
Distribuir aspticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos estriles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo malonato.
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
Sulfato de
amonio
Fosfato
dipotsico
Fosfato monopotsico

Ingredientes
Cloruro de
sodio
Malonato de
sodio
Glucosa
Azul de
bromotimol
Agua

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH, distribuir en tubos de 13
mm x 100 mm en cantidades de 3 ml, esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min, pH final:
6.7 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de hierro y lisina (LIA).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
gelatina
Extracto de
levadura
Glucosa L-lisina
Citrato frrico-
amnico

Ingredientes Tiosulfato de Prpura de Agar Agua destilada

196

sodio anhidro bromocresol

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta
ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa, distribuir en volmenes
de 4 ml en tubos de 13 mm x 100 mm, con tapn de rosca, esterilizar en autoclave a 121 C durante
12 min, dejar que los tubos se enfren en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas
de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. pH final: 6.7 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lisina descarboxilasa.
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Glucosa L-lisina
Prpura de
bromocresol
Agua
destilada

Preparacin: Calentar hasta disolver, distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapn de rosca
de 16 mm x 125 mm, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, pH final 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio prueba de movilidad (semislido).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne

Preparacin: Calentar con agitacin y hervir de 1 min a 2 min hasta disolver el agar, distribuir
porciones de 20 ml en tubos de tapn de rosca de 20 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave por 15
min a 121 C, enfriar a 45 C, pH final 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo cianuro de potasio (KCN).
Ingredientes:
Ingredientes
Cianuro de
potasio
(KCN)
Proteasa
peptona N
3 o
polipeptona
NaCl KH
2
PO
4
Na
2
HPO
4
Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en autoclave por
15 min a 121 C, enfriar y refrigerar entre 5 C y 8 C, pH final 7.6 0.2. Preparar el KCN
disolviendo 0.5 g de KCN en 100 ml de agua destilada estril y a una temperatura entre 5 C y 8 C,
pipetear 15 ml de la disolucin fra de KCN a 1 L del medio base estril y fro, mezclar y distribuir
porciones de 1 ml -1.5 ml en tubos de ensayo estriles, utilizando una tcnica asptica tapar los

197

tubos con tapones de corcho impregnados con parafina, almacenar los tubos a 5 C -8 C, no
pipetear con la boca, usar guantes, no almacenar por ms de 2 semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo Rojo de fenol para fermentacin de carbohidratos.
Ingredientes:
Ingredientes
Tripticasa o
preteosa de
peptona N
3
NaCl
Extracto de
carne
(opcional)
Rojo fenol
Agua
destilada
Carbohidrato
5 g dulcitol o 10
g lactosa o 10 g
sacarosa

Preparacin: Distribuir porciones de 2.5 ml en tubos de 13 mm x 100 mm con tubos de
fermentacin invertidos de 6 mm x 50 mm, esterilizar en autoclave por 10 min a 118 C, pH final
7.4 0.2.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
proteosa N 3
Extracto de
carne
NaCl
Prpura de
bromocresol
Agua
destilada

Preparacin: Distribuir porciones de 2.5 ml en tubos de 13 mm x 100 mm con tubos de
fermentacin invertidos de 6 mm x 50 mm, esterilizar en autoclave por 10 min a 118 C, pH final
7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar MacConkey.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
proteosa o
polipeptona
Peptona Lactosa
Sales biliares
N 3
NaCl

Ingredientes Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes y calentar con agitacin hasta disolver, hervir de 1 min - 2
min, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min, enfriar de 45 C a 50 C y colocar
porciones de 20 ml en cajas Petri estriles, secar a temperatura ambiente sin la tapa cerrada, pH
final 7.1 0.2, no usar placas mojadas.

198

Reactivo o medio de cultivo: Caldo nutritivo.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agua destilada

Preparacin: Calentar hasta disolver, distribuir porciones de 10 ml en tubos o porciones de 250 ml
en matraces Erlenmeyer de 500 ml, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, pH final 6.8 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo y agar de infusin cerebro-corazn (BHI).
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes
Infusin de
cerebro de
ternera
Infusin de
corazn de
res
Mezcla de
peptonas
Cloruro
de
sodio
Na
2
HPO
4
Dextrosa
Agua
destilada
Cantidades
A partir de
200 g
A partir de
250 g
10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 1 000 ml

Medio 2:
Ingredientes
Infusin
cerebro-
corazn
Digerido
enzimtico
de tejidos
animales
Cloruro
de sodio
Dextrosa
Peptona de
gelatina
Na
2
HPO
4

Agua
destilada

Preparacin: Disolver el medio 1 en agua destilada con calentamiento moderado, suspender los
ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir por 1 min para disolver completamente,
distribuir ambos medios en tubos o botellas para almacenar, esterilizar por 15 min a 121 C, pH
final 7.4 0.2. Para preparar el agar aadir 15 g de agar a 1 L de medio BHI, calentar para disolver
completamente, distribuir en botellas o frascos para almacenar, esterilizar por 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de papana al 5 %.
Ingredientes:
Ingredientes Papana Agua destilada

Preparacin: Adicionar la papana estril al agua destilada y agitar hasta disolver completamente,
distribuir porciones de 100 ml en frascos.

199

Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de celulasa.
Ingredientes:
Ingredientes Celulasa Agua destilada

Preparacin: Disolver la celulasa en 99 ml de agua destilada estril, esterilizar por filtracin
utilizando papel filtro de 0.45 m, almacenar a 2 C -5 C por 2 semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Agar base sangre triptosa.
Ingredientes:
Ingredientes Triptosa Extracto de carne NaCl Agar
Agua
destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada, mezclar y calentar agitando
ocasionalmente, hervir cerca de 1 min, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, dejar que los
tubos se enfren en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm-5
cm y una superficie inclinada de 2 cm-3 cm.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo preenriquecimiento universal.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Proteasa peptona KH
2
PO
4
NaCl Dextrosa

Ingredientes MgSO
4

Citrato de amonio
frrico
Piruvato de sodio Agua destilada

Preparacin: Calentar con agitacin hasta disolver, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C,
pH final 6.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo preenriquecimiento universal (sin citrato de amonio frrico).
Ingredientes:
Proteasa
peptona
KH
2
PO
4
Na
2
HPO
4
NaCl Dextrosa MgSO
4

Piruvato
de sodio
Agua
destilada
Cantidades 5.0 g 5.0 g 15.0 g 7.0 g 5.0 g 0.5 g 0.25 g 0.2 g
1 000
ml


200

Preparacin: Calentar con agitacin hasta disolver, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C,
pH final 6.3Reactivo o medio de cultivo: Agua peptonada amortiguada.
Ingredientes:
Cloruro de
sodio
Fosfato
disdico
Fosfato mono
potsico
Agua destilada

Preparacin: Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, pH final 7.2 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo Dey-Engley.
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Glucosa
Tioglicolato de
sodio
Tiosulfato de
sodio

Ingredientes
Bisulfito de
sodio
Polisorbato 80
Lecitina de
soya
Prpura de
bromocresol
Agua destilada

Preparacin: Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, pH final 7.6 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Dilucin de cloro, 200 mg/L, conteniendo sulfato de sodio dodecil al
0.1 %.
Ingredientes:
Ingredientes
Blanqueador comercial
(hipoclorito de sodio al 5.25 %)
Agua destilada (conteniendo 1.0
g de sulfato de sodio dodecil)

Preparacin: Disolver el sulfato de sodio dodecil en el agua destilada, adicionar el blanqueador
comercial y mezclar, preparar inmediatamente antes de usar.
Reactivo o medio de cultivo: Etanol al 70 %.
Ingredientes:
Ingredientes Etanol al 95 % Agua destilada
Cantidades 700.0 ml
Lo necesario para completar el volumen
final de 960 ml

Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de Kovac.
Ingredientes:

201

Ingredientes p-dimetil-aminobenzaldehdo
Alcohol
amlico
cido clorhdrico
concentrado

Preparacin: Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehdo en el alcohol amlico y despus agregar el
cido clorhdrico lentamente, conservar en frasco mbar en refrigeracin. Para la prueba de indol,
adicionar 0.2 ml-0.3 ml del reactivo a 5 ml del medio triptona de 24 h de cultivo.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la prueba de Voges-Proskauer (VP).
Ingredientes:
Disolucin 1:

Disolucin 2:
cido clorhdrico
concentrado
Cantidades 40.0 g Para hacer 100 ml 25.0 ml

Preparacin: Prueba de Voges-Proskauer (VP): Transferir 1 ml del cultivo de 48 h a un tubo de
ensayo y aadir 0.6 ml de la disolucin 1 y 0.2 ml de la disolucin 2, agitar despus de la aplicacin
de cada disolucin. Para intensificar y apresurar la reaccin, aadir unos cristales de creatina a la
mezcla, dejar a temperatura ambiente, leer resultados a 4 h despus de haber agregado los reactivos.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de hidrxido de potasio al 40 %.
Ingredientes:
Ingredientes KOH Agua destilada
Cantidades 40.0 g Para hacer 100 ml

Preparacin: No se especifca.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de hidrxido de sodio 1N.
Ingredientes:
Ingredientes NaOH Agua destilada
Cantidades 40.0 g Para hacer 100 ml

Preparacin: No se especifca, unicamente se establece que su uso es para ajustar el pH del medio
de cultivo.
Reactivo o medio de cultivo: cido clorhdrico 1 N.
Ingredientes -Naftol Alcohol (absoluto) cido clorhdrico concentrado
Cantidades 5.0 g 100 ml 25.0 ml

202

Ingredientes:
Ingredientes HCl (concentrado) Agua destilada
Cantidades 89.0 ml Para hacer 100 ml

Preparacin: No se especifca.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin colorante verde brillante al 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Tinta verde brillante Agua destilada (estril)

Preparacin: Disolver 1 g del colorante en el agua destilada estril, diluirse a 100 ml. Antes de
usar, probar la toxicidad con todos los lotes de tinte con microorganismos de ensayo positivos y
negativos.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin colorante prpura de bromocresol al 0.2 %.
Ingredientes:
Ingredientes Tinta prpura de bromocresol Agua destilada

Preparacin: Disolver 0.2 g del colorante en el agua destilada, diluir a 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Indicador rojo de metilo
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Etanol al 95 % Agua destilada
Cantidades 0.1 g 300 ml Para hacer 500 ml

Preparacin: Disolver el rojo de metilo en el etanol, ajustar el volumen a 500 ml con agua
destilada.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina fisiolgica al 0.85 % (estril).
Ingredientes:

Preparacin: Disolver el NaCl en el agua, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, almacenar
a temperatura ambiente.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina fisiolgica formalinizada.

203

Ingredientes:
Ingredientes
Disolucin de
formaldehdo (36 %-38
%)
NaCl Agua destilada
Cantidades 6.0 ml 8.5 ml 1 000 ml

Preparacin: Disolver el NaCl en el agua destilada, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C,
enfriar a temperatura ambiente, adicionar la disolucin de formaldehdo; no esterilizar en autoclave
despus de adicionar el formaldehdo.

4.5 Vibrio
NOM-242-SSA1-2009
Medio de cultivo: Agua peptonada alcalina (APW).
Ingredientes:

Preparacin: Disolver los ingredientes, ajustar el pH de tal forma que despus de esterilizar sea de
8.5, esterilizar en autoclave a 121 C durante 10 minutos.

Medio de cultivo: Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
Peptona Sacarosa
Tiosulfato de
sodio .5H
2
O
Sales
biliares
Citrato de
sodio.2H
2
O

Ingredientes
Bilis de
buey
Citrato
frrico
NaCl
Azul de
bromotimol
Azul de
timol
Agar
Agua
destilada

Preparacin: Preparar en un matraz por lo menos 3 veces ms grande que el volumen requerido de
medio, adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitacin constante hasta
ebullicin e inmediatamente retirar del calor, no esterilizar, enfriar a 50 C y colocar en cajas Petri,
dejar secar las placas de 37 C -45 C antes de usar.

Medio de cultivo: Agar modificado de celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC).
Ingredientes:

204

Extracto de
carne
NaCl
Disolucin
Stock de
colorante 1
000 X
Agar
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1 ml 15.0 g 900 ml

Preparacin: Ajustar el pH a 7.6, hierva hasta que se disuelva el agar, esterilizar por autoclave
durante 15 min a 121 C, enfriar entre 48 C -55 C.

Medio de cultivo: Disolucin stock de colorantes 1 000 X.
Ingredientes:
Ingredientes Azul de bromotimol Rojo de cresol Etanol al 95 %

Preparacin: Para obtener un color firme del medio usar una disolucin colorante stock en lugar de
estar pesando repetidamente los colores en polvo, disuelva el colorante en etanol hasta obtener una
disolucin al 4 % (peso/volumen), agregue 1 ml de esta disolucin a cada litro de agar mCPC, la
cual tendr al final 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por litro.

Medio de cultivo: Disolucin de celobiosa, polimixina B y colistina.
Ingredientes:
Ingredientes Celobiosa Polimixina B Colistina Agua destilada
Cantidades 10.0 g 100 000 UI 400 000 UI 100 ml

Preparacin: Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfrie y agregue los
antibiticos; esterilice por filtracin, agregue esta disolucin al agar, mezclar y distribuir en cajas
Petri.

Medio de cultivo: Agar triptona y sal (T1N1).
Ingredientes:
Ingredientes
Triptona o
tripticasa
Cloruro de sodio Agar Agua destilada

Preparacin: Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolucin del agar, si lo desea inclinado,
distribuya en tubos, esterilice en autoclave por 15 min a 121 C. Deje solidificar los tubos
inclinados, para placas enfrie el medio de 45 C -50 C y distribuya en cajas de Petri estriles.
Medio de cultivo: Agar gelatina (GA).
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Gelatina Agar
Agua
destilada

205


Preparacin: Suspender los ingredientes y hervir hasta disolver la gelatina y el agar, ajustar el pH a
7.2, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, enfriar entre 45 C -50 C y distribuir en cajas
Petri estriles.
Medio de cultivo: Agar gelatina con sal (GS).
Ingredientes:
Ingredientes Agar gelatina (GA) Cloruro de sodio
Cantidades 1 000 ml 30.0 g

Preparacin: Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de cloruro de sodio por cada
litro, suspender los ingredientes y hervir hasta disolver la gelatina y el agar, ajustar el pH de 7.2,
esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min, enfriar entre 45 C -50 C, colocar en cajas Petri. Si es
necesario para inhibir la diseminacin de Vibrio spp. tal como V. alginolyticus, use de 25 g a 30 g
de agar por litro.
Medio de cultivo: Caldo glucosa de Hugh-Leifson.
Ingredientes:
Extracto
de
levadura
Cloruro
de sodio
Dextrosa
Prpura de
bromocresol
Agar
Agua
destilada
Cantidades 2.0 g 0.5 g 20.0 g 10.0 g. 0.015 g 3.0 g 1 000 ml

Preparacin: Suspender los ingredientes y hervir hasta disolver el agar, ajustar el pH a 7.4, colocar
en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min.
Medio de cultivo: Medio base de descarboxilasa (Arginina, lisina, ornitina).
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Dextrosa
(D-glucosa)
Prpura de
bromocresol
Agar
Agua
destilada
Cantidades 5.0 g 3.0 g 1.0 g. 0.02 g 3.0 g 1 000 ml

Preparacin: Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicionar 5 g de L-aminocido a 1 000 ml de
base. Como control, usar base sin suplemento (aminocido); para Vibrio spp. haloflicos, adicionar
15 g de cloruro de sodio por litro, ajustar el pH de tal manera que despus de la esterilizacin sea de
6.5. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave por 10 minutos a 121 C.
Medio de cultivo: Caldo triptona y caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3 y T1N6, T1N8, y
T1N10.
Ingredientes:

206

Ingredientes Triptona o tripticasa Cloruro de sodio Agua destilada
Cantidades 10.0 g
0 g, 10.0 g, 30.0 g,
60.0 g, 80.0 g o
100.0 g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue cloruro de sodio,
para T1N1 usar 10 g de cloruro de sodio (1 % p/v concentracin de cloruro de sodio); as
respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3 % p/v concentracin de cloruro de
sodio); distribuir en tubos de tapn de rosca de 16 mm X 150 mm, tapar los tubos, esterilizar en
autoclave durante 15 min a 121 C, ajustar el pH a 7.2.
Medio de cultivo: Caldo soya tripticasa (TSB).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
tripticasa
(triptona)
Peptona de
fitona
(soytona)
Cloruro de
sodio
Fosfato
dipotsico
Dextrosa
Agua
destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta ebullicin, distribuir
225 ml en matraces de 500 ml, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C, el pH final debe ser
de 7.2.
Medio de cultivo: Agar soya tripticasa.
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona de
tripticasa
(triptona)
Peptona de
fitona
(soytona)
Cloruro de
sodio
Agar
Agua
destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta ebullicin, distribuir en
tubos o matraces, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C, dejar solidificar los tubos
inclinados o dejar enfria de 45 C -50 C y distribuir en cajas Petri, el pH final debe ser de 7.3.
Medio de cultivo: Agar de hierro Kligler (KIA).
Ingredientes:
Ingrediente
s
Peptona
polipepton
a
Lactos
a
Dextros
a
Clorur
o de
sodio
Citrato
frrico
amoniaca
l
Tiosulfat
o de
sodio
Rojo
de
feno
l
Aga
r
Agua
destilad
a
0.02
5 g
15 g
1 000
ml


207

Preparacin: Suspender los ingredientes y hervir hasta disolver el agar, distribuir en tubos de tapn
de rosca, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, dejar solidificar los tubos inclinados, ajustar
el pH a 7.4.
Medio de cultivo: Agar arginina glucosa inclinado (AGS).
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Tristona
Cloruro de
sodio
Glucosa
Tiosulfato de
sodio

Ingredientes
Prpura de
bromocresol
L-Arginina
(hidrocloruro)
Citrato
frrico
amnico
Agar
Agua
destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolver el agar y distribuir
en cantidades de 5 ml en tubos de 13 mm X 100 mm, ajustar el pH a 6.8 - 7.0, esterilizar en
autoclave de 10 min a 12 mina 121 C, dejar solidificar el medio inclinado.
Medio de cultivo: Agar triple azcar y hierro (TSI).
Ingredientes:
Ingredientes Polipeptona Lactosa Sacarosa Glucosa
Cloruro de
sodio
Tiosulfato de
sodio

Ingredientes Rojo de fenol
Sulfato ferroso
amnico
Agar Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar bien y calentar a ebullicin,
agitando ocasionalmente hasta completa disolucin, enfriar a 60 C y ajustar el pH a 7.3.
Medio de cultivo: Agar hierro y lisina (LIA).
Ingredientes:
Ingredientes
Peptona o
gelisato
Extracto de
levadura
L-lisina Glucosa
Citrato
frrico
amnico
Tiosulfato de
sodio

Ingredientes Prpura de bromocresol Agar Agua destilada


208

Preparacin: Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta
ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa, esterilizar en autoclave
por 12 min a 121 C, enfriar a 50 C -60 C y ajustar el pH a 6.7, distribuir en volmen de 13 mm X
100 mm. Los tubos se enfrian en posicin inclinada, de tal modo que se obtangan columnas de
medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.
Medio de cultivo: Agar rojo de metilo y Voges Proskauer (RM-VP).
Ingredientes:
Fosfato
dipotsico
Glucosa Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia, filtrar, enfriar a 20 C y diluir a 1
litro, distribuir en tubos, esterilizar en autoclave de 15 a 20 min a 121 C, ajustar el pH a 6.9.
Medio de cultivo: Medio para prueba de movilidad (semislida).
Ingredientes:
Extracto de
carne
Cloruro de
sodio
Agar Agua destilada

Preparacin: Calentar con agitacin y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolucin del agar, distribuir
en tubos con tapn de rosca, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C, ajustar el pH a 7.4.
Medio de cultivo: Prueba rojo de metilo.
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Alcohol etlico Agua destilada

Preparacin: Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada. Para realizar la
prueba aadir 5 gotas de la disolucin a 5 ml del cultivo problema; una coloracin roja demuestra
un pH menor a 4.5 y la prueba es positiva; un color amarillo se reporta como prueba negativa.
Medio de cultivo: Prueba de Voges Proskauer.
Ingredientes:
Ingredientes Alfa-Naftol Alcohol etlico absoluto

Preparacin: Aadir 0.6 ml de la disolucin de alfa-naftol y 0.2 ml de una disolucin acuosa al 40
% de KOH a 1 ml del cultivo. El desarrollo de una coloracin roja en 15 minutos constituye una
reaccin positiva.

209

Medio de cultivo: Reactivo de Kovac.
Ingredientes:
Ingredientes
p-
dimetilaminobenzaldehido
Alcohol amlico o
alcohol isoamlico
cido clorhdrico
concentrado

Preparacin: Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol amlico y agregar el cido
clorhdrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco color mbar con tapn
esmerilado, el color del reactivo va del amarillo al caf claro; se debe conservar a 4 C.

ISO/TS 21872-1:2007
Medio de cultivo: Agua salina peptonada alcalina (ASPW).
Ingredientes:

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, mezclar bien
y distribuir en cantidades requeridas para la examinacin en los recipientes finales, esterilizar en
autoclave a 121 C durante 15 minutos, ajustar el pH de manera que despus de la esterilizacin sea
de 8.6 0.2.
Medio de cultivo: Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS).
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
Peptona Sacarosa
Tiosulfato
de sodio
Citrato de
sodio
Bilis seca
de bovino

Ingredientes NaCl
Citrato
frrico
Azul de
bromotimol
Azul de
timol
Agar
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 1.0 g 0.04 g 0.04 g
8.0 g a 18.0
g
1 000 ml

Preparacin: Aadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver; llevar a ebullicin
y retirar inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE, enfriar a 50 C y verter en
cajas Petri, ajustar el pH a 8.6 0.2.
Medio de cultivo: Agar nutritivo salino (SNA).
Ingredientes:

210

Ingredientes
Extracto de
carne
Cantidades 5.0 g 3.0 g 10 .0 g 8.0 g a 18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes deshidratados o el medio completo deshidratado en el
agua, calentar si es necesario, ajustar el pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.2
0.2, transferir el medio en contenedores de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave por 15 min
a 121 C.
Medio de cultivo: Reactivo para deteccin de oxidasa.
Ingredientes:
Ingredientes N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina 2HCl Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes en agua fra inmediatamente antes de su uso.
Medio de cultivo: Agar triple azcar hierro (TSI).
Ingredientes:
Extracto de
carne
Extracto de
levadura
NaCl Lactosa Sacarosa

Ingredientes Glucosa
Citrato de
hierro (III)
Rojo fenol Agar Agua destilada
Cantidades 1.0 g 0.3 g 0.024 g 8.0 a 18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, si es necesario por medio de calentamiento,
distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave
por 15 min a 121 C, dejar solidificar en posicin inclinada con un fondo de aproximadamente 5
cm, ajustar el pH para que el valor despus de la esterilizacin sea de 7.4 0.2.
Medio de cultivo: Medio salino para la deteccin de ornitina descarboxilasa (ODC).
Ingredientes:
Ingredientes
L-ornitina
monoclorhidrato
Extracto de
levadura
Glucosa
Prpura de
bromocresol
NaCl
Agua
destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario, distribuir el medio en
volmenes de 2 ml-5 ml en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min, mpH
final 6.8 0.2.

211

Medio de cultivo: Medio salino para la deteccin de lisina descarboxilasa (LDC).
Ingredientes:
Ingredientes
L-lisina
monoclorhidrato
Extracto de
levadura
Glucosa
Prpura de
bromocresol
NaCl
Agua
destilada

volmenes de 2 ml-5 ml en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min, pH final
6.8 0.2.
Medio de cultivo: Medio salino para la deteccin de arginina dehidrolasa (ADH).
Ingredientes:
Ingredientes
Arginina
monoclorhidrato
Extracto de
levadura
Glucosa
Prpura de
bromocresol
NaCl
Agua
destilada

volmenes de 2 ml-5 ml en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min, pH final
6.8 0.2.
Medio de cultivo: Reactivos para deteccin de -galactosidasa.
Ingredientes:
Disolucin ONPG:
Ingredientes
2-o-Nitrofenil--D-galactopiransido
(ONPG)
Agua destilada

Disolucin Buffer:
Ingredientes NaH
2
PO
4
NaOH 0.1 N Agua destilada
Cantidades 6.9 g Aprox. 3 ml Cantidad suficiente para aforar a 50 ml

Reactivo completo:
Ingredientes Disolucin buffer Disolucin ONPG

Preparacin: Disolucin ONPG: Disolver el ONPG en agua a aproximadamente a 50 C, enfriar
la disolucin. Disolucin buffer: Disolver el NaH
2
PO
4
en aproximadamente 45 ml de agua en un
matraz volumtrico, ajustar el pH a 7.0 0.2 con la disolucin de NaOH, aforar a 50 ml con agua

212

destilada. Reactivo completo: Aadir la disolucin buffer a la disolucin de ONPG, almacenar
entre 0 C y 5 C.
Medio de cultivo: Medio triptfano.
Ingredientes:
Ingredientes
Digerido enzimtico de
casena
D-L-
Triptfano
NaCl Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, si es necesario por medio de calentamiento y
filtrar, ajustar el pH de modo que despus de la esterilizacin sea de 7.0 0.2, distribuir el medio en
cantidades de 5 ml en tubos de capacidad adecuada, esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
min.
Ingredientes:
Ingredientes
4-
Dimetilaminobenzaldehdo
cido clorhdrico 2-Metilbutan-2-ol

Preparacin: Mezclar los componentes.
Medio de cultivo: Agua peptona salina.
Ingredientes:
Cantidades 10.0 g 0/20/60/80/100 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, por calentamiento si es necesario, ajustar el pH
de modo que despus de la esterilizacin, sea de 7.5 0.2, distribuir en tubos de capacidad
adecuada, esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min.
Medio de cultivo: Disolucin de cloruro de sodio.
Ingredientes:

Preparacin: Disolver el componente en el agua destilada, esterilizar en autoclave por 15 min a
121 C, pH final 7.5 0.2.


213

BS 5763: Part 14: 1991
Medio de cultivo: Caldo sal-polimixina B.
Ingredientes:
Extracto de
levadura
NaCl Agua destilada

Disolucin polimixina B:
Ingredientes Polimixina B Agua destilada
Cantidades 100 000 UI 100 ml

Medio completo:
Ingredientes Base Disolucin polimixina B

Preparacin: Disolver todos los componentes deshidratados en el agua destilada, calentar si es
necesario, ajustar el pH despus de la esterilizacin a 7.4, esterilizar en autoclave a 121 C durante
15 minutos. Disolucin polimixina B: Disolver la polimixina B en el agua destilada, esterilizar por
filtracin. Medio completo: Adicionar de manera asptica el preparado fresco de disolucin de
polimixina B a la base previamente enfriada, distribuir el medio en botellas o frascos de capacidad
adecuada, usar preferentemente el mismo da o almacenar durante la noche a 0 C - 5 C.
Medio de cultivo: Agua peptonada salina alcalina.
Ingredientes:

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario, ajustar el pH despus
de la esterilizacin a 8.6, esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Medio de cultivo: Medio de cultivo salino de glucosa con dodecil sulfato de sodio (GST).
Ingredientes:
Extracto
de carne
NaCl Glucosa
Violeta de
metilo
Dodecil
sulfato de
sodio
Agua
destilada


214

Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua destilada,
calentar si es necesario, distribuir el medio en botellas o frascos de capacidad apropiada, esterilizar
en autoclave a 121 C durante 15 minutos, ajustar el pH de manera que despus de la esterilizacin
sea de 8.6.

Medio de cultivo: Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS).
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Citrato
de sodio
Tiosulfato de
sodio
Citrato de
hierro
Cloruro de
sodio

Ingredientes
Bilis
disecada
Sacarosa
Azul de
bromotimol
Azul de
timol
Agar Agua destilada
Cantidades 8.0 g 20.0 g 0.04 g 0.04 g 8.0-18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada por ebullicin, ajustar el pH a 8.6, no
esterilizar.

Medio de cultivo: Agar cloruro de trifeniltetrazolio triptona de soya (TSAT).
Ingredientes:
Peptona de
soya
NaCl Sacarosa
Sales
biliares
Agar
Agua
destilada
Cantidades 15.0 g 5.0 g 30.0 g 20.0 g 0.05 g 8.0-18.0 g 1 000 ml

Disolucin de cloruro de trifeniltetrazolio:

Ingredientes Cloruro de trifeniltetrazolio Agua destilada

Medio completo:

Ingredientes Base
Disolucin de cloruro de
trifeniltetrazolio al 1 %
Cantidades 1 000 ml 3 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, distribuir el
medio en botellas o frascos de capacidad adecuada, esterilizar en autoclave 15 min a 121 C, ajustar
el pH despus de la esterilizacin a 7.1. Disolucin de cloruro de trifeniltetrazolio: Disolver el
componente en el agua, esterilizar por filtracin. Medio completo: Adicionar aspticamente al
medio base previamente enfriado a 45 C, la disolucin esterilizada de cloruro de trifeniltetrazolio y
mezclar.


215

Medio de cultivo: Agar nutriente salino.
Ingredientes:
Extracto de
carne
NaCl Agar Agua destilada
Cantidades 5.0 g 3.0 g 30.0 g 8.0 g -18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, transferir el
medio a contenedores de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min, pH
final 8.5.

Medio de cultivo: Agar salino triple azcar hierro (Agar salino TSI).
Ingredientes:
Extracto
de carne
Extracto
de
levadura
NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa

Ingredientes
Citrato de
hierro
Rojo fenol
Tiosulfato de
sodio
Agar Agua destilada
Cantidades 0.03 g 0.024 g 0.03 g 8.0 g-18.0 g 1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en agua destilada, calentar si es necesario, transferir 10 ml
del medio a tubos de ensayo de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave a 121 C por 10 min,
ajustar el pH a 7.4.

Medio de cultivo: Agar salino carne-levadura.
Ingredientes:
Extracto
de carne
Extracto
de
levadura
NaCl
Hidrocloruro
de cistena
Glucosa Agar
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 2.0 g 6.0 g
30.0
g
0.03 g 2.0 g
5.0 g-
8.0 g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, transferir el
medio en cantidades de 4 ml a tubos de ensayo de 9 mm X 180 mm, esterilizar en autoclave a 121
C por 15 min, pH final 7.5. Antes de usar, calentar los tubos en bao de agua caliente por 10 min,
enfriar rpidamente a 45 C.
.
Medio de cultivo: Medio salino para la deteccin de lisina descarboxilasa.
Ingredientes:
Ingredientes L-lisina Extracto Glucosa Purpura de NaCl Agua

216

monoclorhidrato de
levadura
bromocresol destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, transferir
aproximadamente 2 ml del medio a tubos de ensayo de 9 mm X 180 mm, esterilizar en autoclave a
121 C por 15 min, pH final 6.8.

Medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de indol: Medio salino triptona/triptofano.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona D-L-triptofano NaCl Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario y filtrar,
transferir el medio en cantidades de 5 ml a tubos de ensayo de capacidad apropiada, esterilizar en
autoclave a 121 C por 15 min, pH final 7.5.

Medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de indol: Reactivo de Kovacs.
Ingredientes:
Ingredientes (A) 4-Dimetilaminobenzaldehido
(B) cido
clorhdrico
(C) 2-
Metilbutan-2-
ol

Preparacin: Disolver A en C, despus aadir lentamente B, almacenar el reactivo en la oscuridad.

Medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de oxidasa.
Ingredientes:
Ingredientes
N, N, N ', N'-tetrametil-p-
fenilendiamina.2HCl
Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes en agua fra inmediatamente antes de su uso

Medio de cultivo: Reactivo para la deteccin de -galactosidasa.
Ingredientes:
Disolucin ONPG:
Ingredientes
2-o-Nitrofenil--D-galactopiransido
(ONPG)
Agua destilada

217


Disolucin buffer:

Ingredientes NaH2PO4 Agua destilada
Cantidades 6.9 g
Cantidad suficiente
para aforar a 50 ml

Reactivo completo:

Ingredientes Disolucin buffer Disolucin ONPG

Preparacin: Disolucin ONPG: Disolver el ONPG en agua a aproximadamente 50 C, enfriar la
disolucin. Disolucin buffer: Disolver el NaH
2
PO
4
en aproximadamente 45 ml de agua en un
matraz volumtrico, ajustar el pH a 7.0 0.2 con la disolucin de NaOH, aforar a 50 ml con agua
destilada. Reactivo completo: Aadir la disolucin buffer a la disolucin de ONPG, almacenar
entre 0 C y 5 C.

Medio de cultivo: Disolucin de cloruro de sodio.
Ingredientes:

Preparacin: Disolver el componente en el agua destilada, esterilizar en autoclave por 20 min a
121 C, pH final 7.5.

BAM Captulo 9. V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus
Reactivo o Medio de cultivo: Agua peptonada alcalina (APW)
Ingredientes:

Preparacin: Ajustar el pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 8.5 0.2, distribuir
en tubos con tapn de rosca, esterilizar por 10 min a 121 C.
Reactivo o Medio de cultivo: Medio AKI
Ingredientes:

218

Extracto de
levadura
NaCl
Agua
destilada
NaHCO
3
(10 %
acuosa,
esterilizada por
filtracin)
Cantidades 15.0 g 4.0 g 5.0 g 970 ml 30 ml

Preparacin: El da de su uso, disolver peptona, extracto de levadura y el NaCl en agua destilada,
autoclave 15 min a 121 C, enfriar, adicionar el NaHCO3 recin preparado y esterilizado y mezclar,
distribuir aspticamente porciones de 15 ml en tubos con tapn de rosca de 16 mm x 125 mm, pH
final 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio inclinado arginina-glucosa (AGS)
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Triptona NaCl Glucosa
L-arginina
(clorhidrato)

Ingredientes
Citrato de
amonio frrico
Tiosulfato de
sodio
Prpura de
bromocresol
Agar Agua destilada

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada y hervir para disolver, distribuir 5 ml
en tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar durante 10 min-12 min a 121 C, pH final 6.8 7.0.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre
Ingredientes:
Fitona o
soytona

Preparacin: Calentar con agitacin hasta disolver el agar, esterilizar por 15 min a 121 C, enfriar
a 50 C, aadir 5 ml de glbulos rojos de oveja desfibrinada a 100 ml de agar fundido, mezclar y
verter en porciones de 20 ml en cajas Petri estriles, el pH final del medio debe ser 7.3 0.2. El
agar tripticasa soya, agar tripticasena soya pueden ser usados como medio basal.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo casaminocidos-extracto de levadura-sales (CAYE)
Ingredientes:
Ingredientes Casaminocidos
Extracto de
levadura
NaCl K
2
HPO
4

Disolucin
de
elementos
traza
(opcional)
Agua
destilada

219

Cantidades 20.0 g 6.0 g 2.5 g 8.71 g 1.0 ml 1 000 ml

Preparacin: Ajustar el pH para que el valor despus de la esterilizacin sea de 8.5 0.2,
esterilizar por 15 min a 121 C, disolucin de elementos traza: MgSO4 50 g, MnCl2 5 g, FeCl2 5 g,
agua destilada 1 000 ml. Suspender los ingredientes. Adicionar suficiente H
2
SO
4
0.1 N para
disolver, esterilizar por filtracin a travs de una membrana de 0.45 , aadir 1 ml a 100 ml del
medio base, distribuir en porciones de 10 ml en matraces de 50 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Agar modificado celobiosa-polimixina B-colistina (mCPC)
Ingredientes:
Disolucin 1:
Extracto de
carne
NaCl
Disolucin
stock de
colorante
1000X
Agar
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 ml 15.0 g 900 ml

Disolucin 2:
Ingredientes Celobiosa Colistina Polimixina B Agua destilada
Cantidades 10.0 g 400 000 unidades 100 000 unidades 100 ml

Preparacin:
Disolucin 1: Ajustar el pH a 7.6, hervir para disolver el agar, enfriar a 48 C -55 C. Disolucin 2:
Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave, enfriar, aadir los antibiticos,
adicionar la disolucin 2 a la disolucin 1 enfriada, mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:
Verde oscuro a verde marrn.
Disolucin stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 %
100 ml. Disolver los colorantes en etanol para una disolucin stock al 4 % (p/v). Utilizanto 1 ml de
esta disolucin por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol
por litro.
Disolucin 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente, enfriar, adicionar los
antibiticos y esterilizar por filtracin, adicionar la disolucin 2 a la disolucin 1 enfriada, mezclar,
y distribuir en cajas Petri, el color final es de un verde oscuro a un verde caf.
NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere de esterilizacin por autoclave.
El medio puede ser almacenado por 2 semanas a temperatura de refrigeracin.
Reactivo o medio de cultivo: Agar celobiosa-colistina (CC).
Ingredientes:
Disolucin 1:

220

Extracto de
carne
NaCl
Disolucin
stock
colorante
1000X
Agar
Agua
destilada
Cantidades 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 ml 15.0 g 900 ml

Disolucin 2:
Ingredientes Celobiosa Colistina Agua destilada
Cantidades 10.0 g 400 000 unidades 100 ml

Preparacin:
Disolucin 1: Ajustar el pH a 7.6, hervir para disolver el agar, enfriar a 48 C -55 C. Disolucin 2:
Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave, enfriar, aadir el antibitico,
adicionar la disolucin 2 a la disolucin 1 enfriada, mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:
Verde oscuro a verde marrn.
Disolucin stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 %
100 ml. Disolver los colorantes en etanol para una disolucin stock al 4 % (p/v), utilizando 1 ml de
esta disolucin por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol
por litro.
Disolucin 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente, enfriar, adicionar los
antibiticos y esterilizar por filtracin, adicionar la disolucin 2 a la disolucin 1 enfriada, mezclar,
y distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde caf.
NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilizacin por autoclave. El
medio puede ser almacenado por 2 semanas a temperatura de refrigeracin.
Reactivo o medio de cultivo: Medio prueba de motilidad (semislido)
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
carne

Preparacin: Aadir NaCl hasta una concentracin final de 2 %-3 %, calentar con agitacin y
hervir de 1 min-2 min para disolver el agar, distribuir 8 ml en tubos con tapn de rosca de 16 mm x
150 mm, esterilizar por 15 min a 121 C, pH final 7.4 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo oxidasa
Ingredientes:
Ingredientes N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina.2HCl Agua destilada


221

Preparacin: El reactivo puede ser utilizado recin preparado o se puede utilizar en un mximo de
7 das, si se guarda en un frasco de vidrio oscuro en condiciones de refrigeracin. Aplique la
disolucin recin preparada directamente al cultivo joven (24 h) en la placa de agar.
Reactivo o medio de cultivo: Sal diluyente-peptona-tween (PTS)
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Tween 80 Cloruro de sodio Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, ajustar el pH a 7.2, distribuir en botellas
de volumen deseado, esterilizar por 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Tampn fosfato salino (PBS), pH 7.4
Ingredientes:
Ingredientes NaCl Na
2
HPO
4
anhidro KH
2
PO
4
Agua destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, ajustar el pH a 7.4 (con NaOH 0.1 N),
esterilizar por 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina fisiolgica al 0.85 % (estril)
Ingredientes:

Preparacin: Disolver el NaCl en el agua destilada, esterilizar por 15 min a 121 C, enfriar a
temperatura ambiente.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de cloruro de sodio al 2 % y 3 %.
Ingredientes y preparacin: NaCl, agua destilada, disolucin al 2 %: Disolver 20 g de NaCl en
1000 ml de agua destilada. Disolucin al 3%: Disolver 30 g de NaCl en 1 000 ml de agua destilada,
esterilizar por 15 min a 121 C.
Reactivo o medio de cultivo: Desoxicolato de sodio al 0.5 % en agua estril.
Ingredientes:
Ingredientes Desoxicolato de sodio Agua destilada

Preparacin: El pH de la disolucin no tiene que ser ajustado y puede ser almacenado en una
botella con tapn de rosca a temperatura ambiente.

222

Reactivo o medio de cultivo: Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)
Ingredientes:
Ingredientes
Extracto de
levadura
Peptona Sacarosa
Tiosulfato de
sodio 5 H
2
O
Citrato de
sodio 2 H
2
O
Colato
de sodio

Ingredientes Oxgall NaCl
Citrato
frrico
Azul de
bromotimol
Azul de
timol
Agua
destilada

Preparacin: Preparar en un matraz de al menos 3 veces ms grande que el volmen requerido de
medio, aadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullicin y retirar
inmediatamente del fuego, NO UTILIZAR AUTOCLAVE, enfriar a 50 C y verter en cajas Petri.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona sal (T1 N agar1 y T1 N agar2).
Ingredientes:
Ingredientes
Tripticasa o
triptona

Preparacin: Suspender los ingredientes y hervir para disolver el agar, esterilizar por 15 min a 121
C. Para T1 N agar2: usar 20 g de NaCl en lugar de los 10 g especificados para T1 N agar 1.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona y caldo triptona sal (T1N0, T1N1, T1N3, T1N6,
T1N8, T1N10)
Ingredientes: Tripticasa o triptona 10 g, NaCl 0 g, 10 g, 30 g, 60 g, 80 g o 100 g, agua destilada 1
000 ml.
Ingredientes Tripticasa o triptona NaCl Agua destilada
Cantidades 10.0 g
0 g /10 g /30 g /60 g /80
g /100 g
1 000 ml

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. Para T1N0 no aadir NaCl, para T1N1
usar 10 g de NaCl/l, para T1N3 usar 30 g de NaCl/l, etc. Distribuir en tubos con tapn de rosca de
16 mm x 125 mm, apretar las tapas para mantener la concentracin correcta de sal en el tubo,
esterilizar por 15 min a 121 C, pH final 7.2 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar tripticasa de soya (TSA)
Ingredientes:
Ingredientes Tripticasa o peptona Peptona de fitona NaCl Agar
Agua
destilada

223


Preparacin: Calentar con agitacin para disolver el agar, hervir 1 min, distribuir en tubos o
frascos adecuados, esterilizar por 15 min a 121 C, pH final 7.3 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo urea
Ingredientes:
Ingredientes Urea
Extracto de
levadura
Na
2
PO
4
KH
2
PO
4
Rojo fenol
Agua
destilada

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, NO CALENTAR, esterilizar por
filtracin con una membrana de 0.45 , distribuir aspticamente en tubos estriles, pH final 6.8
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea de Christensen
Ingredientes:
Ingredientes Urea Peptona NaCl Dextrosa KH
2
PO
4

Rojo
fenol
Agar
Agua
destilada

Preparacin: Disolver todos los ingredientes excepto urea en 900 ml de agua destilada, esterilizar
por 15 min a 121 C, enfriar a 50 C -55 C, disolver urea en 100 ml de agua destilada, filtrar por
esterilizacin, adicionar aspticamente al medio base enfriado, mezclar, pH final 6.8 0.1,
distribuir en tubos o cajas Petri estriles.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sacarosa Vibrio parahaemolyticus (VPSA)
Ingredientes:
Ingredientes Triptosa Triptona
Extracto de
levadura
Sacarosa NaCl

Ingredientes
Sales biliares N.
3
Azul de
bromotimol
Agar Agua destilada

Preparacin: Hervir para disolver los ingredientes y enfriar a 50 C -55 C, ajustar el pH a 6.8 con
NaOH 1 N, distribuir en cajas Petri estriles.

224

Reactivo o medio de cultivo: Agar Vibrio vulnificus (VVA)
Ingredientes:
Disolucin 1:

Disolucin 2:
Ingredientes Celobiosa Agua destilada

Preparacin: Disolucin 1: Ajustar el pH 8.2, hervir para disolver el agar, esterilizar por 15 min a
121 C. Disolucin 2: Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave, enfriar y
esterilizar por filtracin. Disolucin stock de colorante 100X: Azul de bromotimol 0.6 g, etanol al
70 % 100 ml, disolver el colorante en etanol.

4.6 Coleccin y transporte de muestras.
NOM-109-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Etanol o isopropanol al 70 %.
Preparacin: No especifica.
Reactivo o Medio de cultivo: Agua clorada y tiosulfato de sodio.
Preparacin: No especifica.

BAM Captulo 1. Muestreo de alimentos y preparacin de la muestra homogeneizada
Reactivo o medio de cultivo: Agua de dilucin amortiguador fosfato de Butterfield (Butterfield's
Phosphate-Buffered Dilution Water, R11).
Ingredientes KH
2
PO
4
Agua destilada

Preparacin: Ajustar el pH a 7.2 con 1 N NaOH, ajustar el volumen a un litro con agua destilada.
Esterilizar por 15 min a 121C, almacenar en refrigerador.
Ingredientes Peptona NaCl
Disolucin
stock de
colorante
100X
Agar
Agua
destilada
Cantidades 20.0 g 30.0 g 10 ml 25.0 g 900 ml

225

4.7 Preparacin de diluciones usando medios gravimtricos.
NOM-110-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin de hidrxido de sodio 1.0 N.
Ingredientes Hidrxido de sodio Agua destilada

Preparacin: Disolver el hidrxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin reguladora de fosfatos (disolucin concentrada).
Ingredientes Fosfato de sodio monobsico Agua destilada

Preparacin: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7.2 con disolucin de
hidrxido de sodio 1.0 N. Llevar a un litro con agua, esterilizar durante 15 minutos a 121C
1.0C. Conservar en refrigeracin (disolucin concentrada), tomar 1.25 ml de la disolucin
concentrada y llevar a un litro con agua (disolucin de trabajo), distribuir en porciones de 99 ml, 90
ml y 9 ml segn se requiera, esterilizar a 121C 1.0C durante 15 minutos. Despus de la
esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la disolucin de trabajo debern ser iguales a los
iniciales.

Reactivo o Medio de cultivo: Agua peptonada.
Ingredientes Peptona Cloruro de sodio Agua destilada

Preparacin: Disolver los componentes en un litro de agua, ajustar el pH a 7 0.1 con hidrxido
de sodio 1.0 N, distribuir en porciones de 99 ml, 90 ml y 9 ml o en cualquier volumen mltiplo de
nueve segn se requiera, esterilizar a 121 C 1.0 C durante 15 minutos, despus de la
esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la disolucin de trabajo debern ser iguales a los
iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una
temperatura entre 0 C a 5C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no
alteren su volumen o composicin.

UNE-EN ISO 6887-1:2000
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina de peptona.

226

Ingredientes
Digestato enzimtico de
casena

Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentando si fuese necesario, ajustar el pH si
fuese necesario, de tal manera que tras la esterilizacin fuera de 7.0 0.2 a 25 C. El disolvente se
repartir en matraces de una capacidad conveniente, dispensando en ellos los volmenes necesarios
para la preparacin de las suspensiones iniciales; el disolvente se repartir en tubos de ensayo o en
matraces, dispensando en ellos los volmenes necesarios para la preparacin de las diluciones
decimales. La cantidad a aadir ser la necesaria para que, tras la esterilizacin, el volumen que
quedase en cada tubo o matraz sea de 9.0 ml. La imprecisin en la medida de este volumen final,
tras la esterilizacin, no deber ser mayor del 2 %. Cerrar los tubos o los matraces, esterilizar en
el autoclave a 121 C durante 15 min.

Ingredientes
Digestato
enzimtico de
tejidos animales
Cloruro de
sodio
Na
2
HPO
4

12H
2
O
KH
2
PO
4

Agua
destilada

es necesario, de tal manera que tras la esterilizacin fuese de 7.0 0.2 a 25 C. El disolvente se
para la preparacin de las suspensiones iniciales; el disolvente se repartir en tubos de ensayo o en

UNE-EN ISO 6887-2:2004
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina de peptona. Vase la norma ISO 6887-1:2000,
previamente descrita.
Reactivo o medio de cultivo: Agua de peptona tamponada. Vase la norma ISO 6887-1:2000,
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina de peptona con prpura de bromocresol.
Ingredientes
Digestato
enzimtico de
casena
Prpura de
bromocresol
disolucin de
alcohol al 0.04

227

%, por ejemplo
disolucin en
etanol 0.1 ml

Preparacin: Se aaden 0.1 ml de prpura de bromocresol a 1 000 ml de disolucin salina de
peptona. Esta disolucin puede emplearse para el anlisis de ciertos productos cidos, de tal forma
que se pueda realizar el ajuste del pH sin emplear una sonda de pH estril. El prpura de
bromocresol es amarillo a pH cido, cambiando a prpura a pH por encima de 6.8; el disolvente se
para la preparacin de las suspensiones iniciales. El disolvente se repartir en tubos de ensayo o en

UNE-EN ISO 6887-3:2004
Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina de peptona con prpura de bromocresol. Vase la
norma ISO 6887-2:2004, previamente descrita.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin de peptona.
Ingredientes Digerido enzimtico de casena Agua destilada

fuese necesario, de tal manera que tras la esterilizacin fuera de 7.0 0.2 a 25 C. Esta disolucin
puede emplearse para moluscos bivalvos, gasterpodos y otros mariscos marinos. El disolvente se
para la preparacin de las suspensiones iniciales. El disolvente se repartir en tubos de ensayo o en

UNE-EN ISO 6887-4:2003

228

Reactivo o medio de cultivo: Disolucin salina de peptona con prpura de bromocresol. Vase la
norma ISO 6887-2:2004, previamente descrita.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolucin de tampn fosfato.
Ingredientes Na
2
HPO
4.
12H
2
O
KH
2
PO
4

Agua destilada

pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7.0 0.2 a 25 C. Se
reparten 180 ml en cada matraz, se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min, la
disolucin de tampn fosfato se utiliza como diluyente para las muestras de gelatina y otras
muestras. El disolvente se repartir en tubos de ensayo o en matraces, dispensando en ellos los
volmenes necesarios para la preparacin de las diluciones decimales. La cantidad a aadir ser la
necesaria para que, tras la esterilizacin, el volumen que quedase en cada tubo o matraz sea de 9.0
ml. La imprecisin en la medida de este volumen final, tras la esterilizacin, no deber ser mayor
del 2 %. Cerrar los tubos o los matraces, esterilizar en el autoclave a 121 C durante 15 min.

Reactivo o medio de cultivo: Oligos iniciadores para identificar especies de Vibrio.
Tabla 22. Oligos iniciadores para detectar genes de toxinas de V. vholerae, V.
parahaemolyticus y V. vulnificus.
Especie Gen objetivo Sentido Anti-sentido
V. cholerae Gen ctx
(777 pb)
5'-tga aat aaa gca gtc agg
tg-3'
5'-ggt att ctg cac aca aat
cag-3'
V.
parahaemolyticus
Gen tlh
(450 pb)
L-TL: 5' aaa gcg gat tat
gca gaa gca ctg 3'
R-TL: 5' gct act ttc tag cat
ttt ctc tgc 3'
Gen trh
(500 pb)
VPTRH-L: 5' ttg gct
tcg ata ttt tca gta tct 3'
VPTRH-R: 5' cat aac
aaa cat atg ccc att tcc g 3'
Gen tdh
(270 pb)
VPTDH-L: 5' gta aag
gtc tct gac ttt tgg ac 3'
VPTDH-R: 5' tgg aat
aga acc ttc atc ttc acc 3'
V. vulnificus Gen vvhA
(519 pb)
Vvh-785F: 5' ccg cgg
tac agg ttg gcg ca 3'
Vvh-1303R 5'cgc cac
cca ctt tcg ggc c 3'

Preparacin: Preparar soluciones de trabajo a 10 pmol/l.

229


230

DESCRIPCIN DE BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO
La implementacin de un sistema de aseguramiento de la calidad en un laboratorio de microbiologa
requiere la adopcin de Buenas Prcticas de Laboratorio, las cuales son principios, normas o
directrices que proveen un marco de trabajo que asegura la confiabilidad de los resultados obtenidos
durante los estudios. Estas prcticas cubren aspectos del trabajo diario en el laboratorio tales como
el mantenimiento de las instalaciones, limpieza del material, mantenimiento de los equipos, etc.
5.1 INSTALACIONES
5.1.1Limpieza y desinfeccin
Tanto la limpieza como la desinfeccin son imprescindibles en un laboratorio de microbiologa;
mientras que la primera remueve el polvo y la materia orgnica, la segunda elimina los
microorganismos.
Los procedimientos de limpieza debern documentarse y monitorearse para asegurar su efectividad
(Pouch-Downes e Ito, 2001).
Los pasos bsicos de cualquier procedimiento de limpieza son los siguientes:
1. Pre-enjuague para remover partculas, limpieza con un agente especial (para remover polvo,
mugre, materia orgnica), enjuague y desinfeccin (McLandsborough, 2005).
2. Limpieza del piso con trapeadores hmedos con una disolucin desinfectante-detergente
(por ejemplo: las sales cuaternarias de amonio) para evitar la acumulacin de polvo en el
piso. Se debe poner especial atencin a esquinas y reas escondidas. Se recomienda evitar
barrer ya que esta prctica contribuye al esparcimiento del polvo en el ambiente (Pouch-
Downes e Ito, 2001).
3. Limpieza y desinfeccin de las mesas de trabajo antes y despus de su uso (Pouch-Downes
e Ito, 2001).
4. El personal encargado de realizar la limpieza y desinfeccin del laboratorio deber recibir
un curso de induccin sobre seguridad para prevenir accidentes. As mismo deber reportar
cualquier incidente ocurrido durante las operaciones de limpieza (Pouch-Downes e Ito,
2001).
5.1.2 Orden
El orden en un laboratorio es imprescindible para evitar accidentes, reducir al mnimo los
desplazamientos y realizar los anlisis con eficiencia. Los requisitos bsicos de orden en un
laboratorio son los siguientes:
1. Los equipos y mesas de trabajo debern distribuirse de tal forma que haya espacio
suficiente para desplazarse.
2. Las funciones bsicas del laboratorio deben realizarse de preferencia en salas separadas o
en lugares definidos para:
a. Recepcin y preparacin de muestras
b. Manipulacin de patgenos

231

c. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo
d. Esterilizacin del material de vidrio
e. Limpieza de material de vidrio y equipo
f. Inoculacin
g. Incubacin
h. Lectura de cultivos de microorganismos
i. Interpretacin y preparacin de informes.
Nota: Si no es posible contar con diversas salas, basta con distinguir y diferenciar las zonas
limpias de las zonas sucias (Lightfoot y Maier, 1998).
j. Se deber contar con un almacn de muestras, material de laboratorio y reactivos.
k. Las pertenencias personales debern almacenarse en un guardarropa. Las batas, equipo
de seguridad y el resto de ropa de proteccin deber ser almacenada en un lugar
especial.
l. Evitar usar las mesas de trabajo para almacenar equipos, medios de cultivo o material
de laboratorio.
m. Evitar colocar un equipo que produzca vibraciones (bao Mara) cerca de equipos
sensibles como las balanzas y microscopios (Lightfoot y Maier, 1998).
n. Evitar la exposicin de equipo sensible (por ejemplo: las incubadoras) a los rayos
directos del sol (BS 5763-0:1986).
5.1.3 Condiciones ambientales y servicios
5.1.3.1 Ventilacin, temperatura y humedad
El laboratorio debe contar con un sistema de ventilacin controlado, que elimine el calor producido
por los equipos y minimice las variaciones de temperatura. El sistema debe ser limpiado con
regularidad para evitar la acumulacin de microorganismos, polvo y partculas. Se recomienda
mantener una temperatura de 21C a 23C y una humedad del 45 % al 50 % en el laboratorio
(Lightfoot y Maier, 1998).
5.1.3.2 Iluminacin
La ubicacin de la iluminacin debe de evitar la generacin de sombras, contraluces y reflexiones
molestas en las superficies de trabajo. Se aconsejan sistemas fluorescentes para conseguir una
iluminacin ambiental uniforme. Para zonas donde se requiere una luz ms intensa deben utilizarse
sistemas incandescentes con un nivel de iluminacin mnimo de 500 luxes (Lightfoot y Maier,
1998).


232

5.1.3.3 Agua
Se requiere que el agua de laboratorio se encuentre libre de partculas txicas o nutritivas que
inhiban o influyan en el crecimiento de microorganismos. Los parmetros de control de calidad del
agua deben incluir:
Trazas de metales: (< a 0.05 mg/L)
Metales totales: (hasta 1 mg/L).
Conductividad elctrica: (no mayor a 1S/cm)
pH de 5.5 a 7.5
Cloro residual (< de 0.1 mg/L, Pouch-Downes e Ito, 2001).
5.1.4 Mantenimiento e inspeccin
Las instalaciones deben mantenerse en buen estado para evitar en la medida de lo posible
contaminaciones cruzadas, accidentes o cualquier otro incidente.
5.1.5 Monitoreo del medio ambiente del laboratorio
Para comprobar la eficacia de los procedimientos de limpieza y desinfeccin, y para establecer un
perfil microbiolgico del medio ambiente del laboratorio se deber establecer un sistema de
monitoreo regular de la calidad microbiolgica del aire y de las superficies (mesas, estantes,
equipos).
5.2 PERSONAL
El laboratorio de microbiologa deber contar con personal calificado (formacin acadmica,
competencias tcnicas y experiencia) que cumpla con los requisitos y necesidades del laboratorio.
En la tabla 23 se describen algunas recomendaciones:
Tabla 23. Nivel de formacin y cualificacin requeridas para cada puesto.
Funciones Formacin requerida
Limpieza de material y preparacin de
medios de cultivo y muestras.
Personal sin cualificacin formal, entrenado en
el laboratorio.
Anlisis rutinarios siguiendo instrucciones
normalizadas.
Formacin bsica o capacitacin para alcanzar
dicha formacin.
Anlisis complejos, trabajo independiente,
supervisin de programas de formacin y
cualificacin.
Analistas con una formacin tcnica completa.
Interpretacin de resultados.
Profesionista con formacin tcnica completa y
experiencia prctica en anlisis microbiolgicos.
(Lic. en microbiologa, QFB, IBQ, Bilogo, etc).
(Lightfoot y Maier, 1998)

233

5.2.2Capacitacin
Deber contarse con un programa y registros de capacitacin del personal del laboratorio (esto
incluye tanto personal de nuevo ingreso como del personal actualmente en funciones).
Se deber llevar a cabo una evaluacin continua cualitativa y cuantitativa de la calidad del trabajo
del personal.
5.2.3 Higiene
Las prcticas de higiene personal tienen por objetivo evitar la contaminacin de la muestra y del
medio de cultivo, pero a su vez evitar el riesgo de infeccin del personal que trabaja en el
laboratorio. Se recomienda tomar en cuenta los siguientes lineamientos para este fin:
1. Usar bata blanca de laboratorio, de preferencia de algodn u otra fibra natural que limite los
riesgos de flamabilidad. Deber conservarse limpia y en buenas condiciones. Evitar usarla
fuera de las reas de trabajo, sobre todo en zonas pblicas donde se consuman alimentos y
bebidas. Conservarla en un lugar designado en el laboratorio.
2. Lavarse las manos meticulosamente y aplicar desinfectante (que debe conservarse en un
dispensador limpio). Realizar esta prctica con frecuencia: antes y despus de los anlisis
microbiolgicos, inmediatamente despus de acudir al sanitario y despus de retirarse los
guantes. Secar las manos con toallas desechables.
3. Usar guantes desechables cuando se trabaje con microorganismos patgenos.
4. Mantener las uas cortas y limpias.
5. Cuando se est llevando a cabo la inoculacin, evitar hablar, toser, estornudar y cualquier
accin que provoque flujo de aire brusco.
6. No tomar alimentos y bebidas en el laboratorio.
7. No mascar chicle, no fumar ni aplicar crema labial, evitar cualquier accin que tenga que
ver con introducir objetos a la boca.
8. No pipetear nunca con la boca, usar dispositivos de pipeteo.
9. Transportar los elementos contaminados (cultivos, medios de cultivo, residuos) en
recipientes hermticos y sellados.
10. Desinfectar/esterilizar los residuos y material de vidrio del laboratorio antes de lavar,
reutilizar o eliminar.
11. Se debern tomar precauciones especiales con personas que presenten infecciones o
enfermedades, ya que los grmenes presentes pueden invalidar los resultados obtenidos de
los anlisis.
12. No se deber colocar comida para consumo personal en los refrigeradores del laboratorio.


234

5.2.4 Seguridad
Con el objetivo de garantizar la seguridad personal los empleados del laboratorio debern tomar en
cuenta las siguientes precauciones:
1. Mantener la mesa de trabajo libre de materiales, excepto los que se estn utilizando.
2. Recogerse el cabello para evitar riesgos de incendio.
3. Permitir el acceso al laboratorio nicamente a las personas autorizadas.
4. Durante la realizacin de pruebas se debe limitar el acceso a las reas de anlisis
nicamente a las personas requeridas para conducir la prueba.
5. Usar equipo de proteccin personal: lentes de seguridad, guantes (acorde a la actividad),
mscaras. Los lentes de seguridad deben usarse cuando se trabajen cultivos que puedan
contener altos niveles de microorganismos patgenos. Para el personal que usa lentes de
contacto, los lentes de seguridad sern obligatorios.
6. Familiarizarse con el equipo de seguridad disponible que incluye: la localizacin del
botiqun de primeros auxilios, la localizacin de las salidas de emergencia, regaderas para
ojos, regaderas de seguridad, extintores, alarmas de incendio y telfonos disponibles en el
laboratorio para contactar servicios de rescate.
7. Mantener las puertas y ventanas del laboratorio cerradas.
8. Usar los mecheros con seguridad. Apagarlos cuando no se estn utilizando y antes de salir
del laboratorio. Mantener los solventes y sustancias flamables mnimo a 45 cm de los
mecheros.
9. Emplear campanas de bioseguridad clase II tipo B2 con extraccin para proteger las
muestras y reducir el riesgo de infeccin humana.
10. Mantener recipientes separados para desechar vidrios rotos, agujas de laboratorio,
disolventes y otros residuos peligrosos.
11. No permitir que un empleado trabaje solo en un laboratorio.
12. El personal deber familiarizarse con las hojas de seguridad de los reactivos usados en el
laboratorio.
5.3 MANEJO DE MUESTRAS
La calidad de los resultados de un anlisis microbiolgico depende directamente de la calidad de la
muestra recogida y analizada (Lightfoot y Maier, 1998).
5.3.1 Recepcin de la muestra
El personal de recepcin deber revisar la condicin de la muestra y asegurarse de que no ha sido
daada durante el transporte. Se recomienda tomar en cuenta los siguientes criterios de aceptacin:

235

1. Que la muestra est debidamente identificada y porte consigo la documentacin que incluya: el
lugar de donde fue tomada, la fecha y hora del muestreo (en especial cuando la muestra es de
naturaleza perecedera), los motivos del muestreo (cumplimiento de especificaciones, anlisis de
rutina, etc.), el tipo de muestreo realizado, los anlisis requeridos y las condiciones de
almacenamiento.
2. Que la muestra se presente ntegra y en sus condiciones originales.
3. Que la cantidad de muestra sea suficiente para los anlisis requeridos.
4. Que las condiciones de temperatura en las que la muestra fue transportada sean las adecuadas
para el tipo de producto, con el fin de evitar cualquier alteracin el nmero de microorganismos
presentes. En la tabla 24 se presentan las temperaturas a las que deben ser almacenadas las
muestras dependiendo del tipo de producto.
Tabla 24. Temperatura a la que deben ser almacenadas las muestras.
Tipo de producto
Temperatura de
transporte/almacenamiento
Productos estables Temperatura ambiente
Productos frescos y refrigerados Entre 0 C y 4 C
Productos congelados Debajo de -18 C
Productos pasteurizados y similares Entre 0 C y 4 C
Alimentos sensibles (como pescado fresco) Entre 0 C y 2 C
(BS 5763-0:1986)
Una vez que se aceptan las muestras deber llevarse un registro que contenga los siguientes datos:
fecha de recepcin, fecha del muestreo, caractersticas de la muestra, nombre del solicitante del
anlisis, nombre de la empresa que requiere el anlisis (si es de una empresa externa) y anlisis
requeridos (BS 5763-0:1986).
5.3.2 Almacenamiento de las muestras
El manejo apropiado de las muestras una vez que entran al laboratorio permitir evitar confusiones,
contaminacin cruzada, contaminacin del medio ambiente o infecciones del personal encargado.
Las muestras deben ser almacenadas bajo condiciones apropiadas que prevengan cualquier
alteracin en el nmero de microorganismos presentes hasta que stas sean analizadas. Se debe
tomar en consideracin las temperaturas de almacenamiento (ver tabla 24) as como el tiempo en
que deben ser examinadas de acuerdo al tipo de producto (ver tabla 25).


236

Tabla 25. Tiempo en que deben ser examinadas las muestras.
Tipo de producto Tiempo en ser examinadas
Productos estables Tan pronto como sea posible
Productos frescos y refrigerados
Dentro de las 24 h posteriores a su recepcin. Si
no se pueden analizar en este tiempo congelar la
muestra tan pronto como sea posible a -18 C.
Productos pasteurizados y similares Tan pronto como sea posible.
Tomado de BS 5763-0:1986
Las muestras almacenadas a temperatura ambiente debern permanecer en contenedores sellados
para prevenir la proliferacin de microorganismos (Pouch-Downes e Ito, 2001).
5.3.3 Instalaciones y personal encargado
El laboratorio deber contar con un espacio especfico para las muestras que an no han sido
analizadas o estn analizndose y otro espacio para las muestras que an cuando ya se han
completado los anlisis se requiere mantenerlas por un periodo de tiempo ms largo.
Tambin es recomendable designar a una persona encargada de llevar un registro de las muestras
que entran y salen del laboratorio adems de monitorear el proceso completo que incluye:
1. Recepcin de las muestras, verificar la identidad de las muestras y tomar en cuenta los criterios
de aceptacin.
2. Registro de la entrada de una muestra al laboratorio.
3. Almacenamiento de las muestras de acuerdo a las instrucciones que acompaan a la muestra.
4. Registro de la fecha en que las muestras son destinadas a los analistas para ser examinadas.
5. Registro de la fecha en la que regresan a ser almacenadas.
6. Desecho de las muestras una vez que los resultados han sido entregados.
5.3.4 Toma de porciones de muestra para los anlisis
Es recomendable que para evitar la contaminacin del medio ambiente, el pesado de las porciones
de muestra requeridas para el anlisis, se lleve a cabo en un espacio cerrado o en una cabina de
seguridad. Sin embargo, si no se cuenta con un espacio con estas caractersticas en el laboratorio,
las muestras debern pesarse cerca de la flama. Las que contengan pocos microorganismos
(productos pasteurizados o trmicamente tratados) debern ser examinadas antes que las muestras
que presenten contaminacin elevada.
El manejo de las muestras debe prevenir cualquier tipo de contaminacin por lo que se debern
tomar en cuenta las siguientes precauciones:
Si se trata de un producto empacado, se recomienda lavar el empaque con etanol al 70 % y
una vez abierto tomar la muestra cerca de la flama.

237

Los instrumentos usados para abrir empaques (tijeras, sierra, etc.) debern estar estriles.
Los instrumentos para la toma de muestras (cucharas, pinzas, pipetas, etc.) debern estar estriles
(BS 5763-0:1986).
5.3.5 Desecho de las muestras
Las muestras debern ser conservadas y almacenadas a la temperatura apropiada hasta que se
reporten los resultados del o los anlisis. Una vez que se emitan los resultados, las muestras podrn
ser desechadas. El personal encargado deber descontaminar las muestras que se encuentren en
estado de descomposicin previo a su deshecho.
5.4 EQUIPO
Se recomienda el establecimiento de un programa de mantenimiento, inspeccin y calibracin de
equipos e instrumentos de laboratorio tales como balanzas, termmetros, potencimetros, baos de
agua, espectrofotmetros, micropipetas y todos aquellos involucrados en la precisin y exactitud del
resultado de una medicin.
5.5 MATERIALES
Los materiales de laboratorio (pipetas, tubos de ensayo, cajas Petri) deben ser sometidos a un
proceso que garantice su limpieza y esterilidad hasta el momento de su uso.
5.5.1 Limpieza
Todo el material deber permanecer limpio y libre de residuos de medios de cultivo. Deber
almacenarse bajo condiciones que ayuden a conservar su limpieza y lo protejan del polvo y la
contaminacin ambiental (BS 5763-0:1986).
Se recomienda tomar en cuenta el siguiente procedimiento de limpieza:
1. Lavar con detergente comercial a 70 C. En ausencia de un detergente comercial puede
usarse una disolucin de carbonato de sodio al 0.125 % (p/p), seguida de una inmersin en
cido diluido (HCl 0.1 mol/l) (BS 5763-0:1986).
2. Enjuagar con agua a 80 C.
3. Enjuagar con agua destilada o desionizada.
4. Secar el material.
Para los materiales nuevos es conveniente dejarlos reposar una noche en agua destilada,
comprobndose la neutralidad de su pH.
Para confirmar la ausencia de residuos cidos o alcalinos (enjuague efectivo), se recomienda
realizar anlisis rutinarios sobre el material aplicando azul de bomotimol, el cual es un indicador
que cambia de amarillo a verde-azul en un rango de pH de 6.5 a 7.3. Dado que las soluciones de
limpieza son en su mayora cidos o bases, la aplicacin de unas gotas de este indicador sirve para
asegurar su ausencia (Lightfoot y Maier, 1998).


238

5.5.2 Esterilizacin
La esterilizacin del material de laboratorio puede realizarse siguiendo los lineamientos de los
estndares britnicos (BS 5763-0:1986) que a continuacin se describen:
1. Esterilizacin en autoclave: proceso trmico a 121 C durante 15 minutos. Los envases y
material que tengan tapa debern estar abiertos o con un cierre flojo para permitir la entrada
del vapor en el recipiente.
2. Esterilizacin en estufa de aire caliente: el material se esteriliza a 170 C-180 C durante al
menos una hora.
El material esterilizado deber acomodarse en contenedores especiales o envuelto en un material
apropiado y almacenarse bajo condiciones que mantengan su esterilidad.
Cuando se esterilice un material deber escribirse la fecha de caducidad de la esterilidad. El
material sellado hermticamente puede ser almacenado por 3 meses antes de ser usado. El material
empacado que no est hermticamente sellado puede almacenarse por un periodo de tiempo ms
corto, por ejemplo 8 das (BS 5763-0:1986).
Se puede hacer uso de materiales desechables (cajas Petri, pipetas, botellas). Sin embargo es
importante asegurarse con el productor de que el material es apropiado para llevar a cabo anlisis
microbiolgicos: que sea estril y que no contenga sustancias que inhiban el crecimiento de los
microorganismos (BS 5763-0:1986).
5.5.3 Descontaminacin
Despus de uso (cultivo de microorganismos o contacto con microorganismos) y antes de ser
desechado o limpiado, el material y su contenido debern ser descontaminados. El proceso de
descontaminacin puede llevarse a cabo por medio de las dos tcnicas siguientes:
1. Esterilizacin en autoclave por al menos 30 min a 121C mnimo, para todo el material que
ha estado en contacto con cultivos de microorganismos.
2. Descontaminacin por inmersin en una disolucin desinfectante para materiales pequeos
resistentes a la corrosin como por ejemplo pipetas (BS 5763-0:1986).

El material desechable deber descontaminarse antes de ser enviado a los residuos (BS 5763-
0:1986).
5.6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
La calidad de los anlisis microbiolgicos depende tambin de la adecuada preparacin de los
reactivos y medios de cultivo. Aunado a ello, es necesario almacenar los medios y reactivos en
condiciones adecuadas para evitar su degradacin o transformacin.

5.6.1 Recepcin

239

Se deber mantener un registro de todos los reactivos y medios de cultivo que entran al laboratorio
que contenga los siguientes datos:
a. Datos sobre el reactivo/medio: nombre del producto, cdigo del fabricante, no. de lote y
fecha de caducidad.
b. Fecha de recepcin.
c. Empleado que lo recibi.
d. Localizacin del almacn en que se encontrar el producto (Pouch-Downes e Ito, 2001).
Se recomienda etiquetar los envases de los medios/reactivos indicando la fecha de recepcin,
apertura y fecha de caducidad para detectar los productos que deben desecharse.
5.6.2 Almacenamiento
Se recomienda tomar en cuenta las recomendaciones del fabricante para el almacenamiento de
medios y reactivos. En general se pueden tomar en consideracin los siguientes lineamientos:
1. Los medios de cultivo contenidos en tubos, recipientes o cajas Petri debern tener una
etiqueta que contenga la siguiente informacin: nombre del medio, fecha de preparacin y
fecha de caducidad.
2. Mantener los envases con medios de cultivo deshidratados bien cerrados para evitar que se
humedezcan. Almacenarlos en un lugar fresco, seco y protegidos de la luz.
3. Todos los medios de cultivo y reactivos que se colocan en tubos y botellas y que no son
usados inmediatamente deben protegerse de la luz y desecacin (BS 5763-0:1986).
4. Los medios de cultivo preparados pueden conservarse durante tres meses en refrigeracin
(entre 4 C y 6 C) o un mes mximo a una temperatura entre los 18 C y los 23 C (BS
5763-0:1986).
5. Los medios de cultivo esterilizados en autoclave deben fundirse una sola vez y se podrn
mantener en este estado a 45 C -50 C durante un mximo de 8 horas antes de su uso
6. Evitar un almacenamiento mayor a seis meses de un medio o reactivo.
7. Los reactivos/medios que presenten cambios en la consistencia o color deben ser
desechados.
8. Los medios que contengan tintes debern protegerse de la luz mediante su almacenamiento
en un cuarto oscuro, en envases oscuros o cubrindolos con papel aluminio (Pouch-Downes
e Ito, 2001).
9. Las disoluciones de colorantes y antibiticos no debern conservarse por ms de tres meses
10. El almacenamiento de las cajas Petri debe ser en refrigeracin y en la oscuridad, por una
semana mximo (BS 5763-0:1986).
5.6.3 Preparacin de los medios de cultivo

240

Durante la preparacin de los medios de cultivo debe tomarse en cuenta los siguientes aspectos:
1. Deber usarse agua destilada y desionizada que cumpla con los parmetros mencionados en
el punto 1.3.3. Los recipientes deben estar limpios, ser neutros y no txicos (Lightfoot y
Maier, 1998).
2. Despus de la esterilizacin y enfriamiento a 25 C los medios deben ser monitoreados en
los siguientes parmetros: pH, color, esterilidad. El pH no debe modificarse despus de
esterilizado el medio, en caso contrario deber ajustarse al pH requerido usando HCl 1N o
NaOH 1N (Lightfoot y Maier, 1998).
3. Se debe llevar un registro de la preparacin de los medios que contenga los siguientes
datos:
Nombre del medio
Fecha de preparacin del medio
Persona que lo prepar
Fecha de caducidad del medio
Nmero y volmenes de contenedores preparados (tubos, frascos)
Cantidad de polvo deshidratado y de cada componente
Volumen de agua
Condiciones de esterilizacin del autoclave
5.7 MANTENIMIENTO DE REGISTROS
Se recomienda contar con un sistema de organizacin que permita almacenar y recuperar
rpidamente los registros.
Los registros con los que debe contar un laboratorio son:
1. Registros (bitcoras) sobre informacin analtica de las muestras que incluye la descripcin
de la muestra, las condiciones de almacenamiento de la muestra, la descripcin de los
mtodos analticos utilizados, datos obtenidos, observaciones, clculos y conclusiones.
2. Registros sobre investigaciones realizadas para desarrollar o actualizar mtodos analticos.
3. Registros sobre la informacin para el aseguramiento de la calidad que se expiden cuando
se realiza cualquiera de las siguientes operaciones:
Calibracin de instrumentos analticos.
Registro de temperaturas de baos de agua, refrigeradores, congeladores,
incubadoras, etc.
Registro de presin y temperatura de las autoclaves.


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