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Micrbios mostra na Escola

Introduo Microbiologia

manual para professores e estudantes dos ensino bsico e secundrio

Joo Margaa, Andr Barata, Amndio Madeira-Lopes e M. Conceio Loureiro-Dias

Junho de 2004

Prefcio Embora os nossos sentidos nos permitam realizar algumas observaes directas do mundo que nos rodeia, o maravilhoso mundo dos micrbios no nos est to acessvel sendo necessrias tcnicas auxiliares para a ele acedermos. Neste livro, coligimos um conjunto de metodologias, que foram desenvolvidas com a finalidade de permitirem a observao de micrbios que fazem parte do nosso quotidiano, utilizando, quase exclusivamente, materiais e equipamento disponveis em qualquer escola. Estas experincias podem realizar-se nas escolas do ensino secundrio, e tambm do ensino bsico, com a orientao dos professores, ou mesmo em casa, na cozinha, com pais to curiosos como os seus filhos, e com o desejo de partilhar estas aventuras. O desenvolvimento das metodologias, que descrevemos, teve lugar no mbito do Projecto Micrbios mostra na Escola, patrocinado pela Agncia Cincia Viva, entre 1999 e 2001, e foi executado no Departamento de Botnica e Engenharia Biolgica no Instituto Superior de Agronomia, inicialmente pela Ana Leal, ento finalista de Engenharia Agronmica, que teve ainda papel notvel na preparao da participao do projecto no Forum Cincia Viva de 1999. Integraram tambm este projecto a Escola do Ensino Bsico, 1 Ciclo, n 4 de Oeiras, a Escola Bsica 2,3 de Prof. Antnio Pereira Coutinho, em Cascais, e a Escola Secundria de Sebastio e Silva em Oeiras. Os protocolos que se foram desenvolvendo iam sendo discutidos com professores e executados por alunos destas escolas. Em funo dessa experincia, os protocolos foram optimizados e a sua redaco melhorada. Temos j saudades desses jovens (alguns deles muito jovens mesmo!) e estamos gratos s Professoras Manuela Castro Neves, Lusa Madeira, Dlia Abego, Ana Lopes, Eunice Santos, Isabel Flores, Manuela Venda e Lurdes Caldeira pelas suas sugestes e colaborao. A opinio pblica criou a ideia de que os micrbios so seres perigosos, que provocam doenas e dos quais no gostamos nem de ouvir falar. Pelo contrrio, neste livro, pomos mostra alguns dos micrbios que nos rodeiam e que nos so muito teis (ou que, pelo menos, no nos prejudicam muito). Lidamos com representantes de cada um dos trs domnios presentemente considerados nos seres celulares: a levedura de padeiro (domnio dos eucariontes ou Eucarya), as bactrias do iogurte (domnio das eubactrias ou Bacteria), e as halobactrias que constituem as manchas vermelhas no bacalhau (domnio das arquebactrias ou Archaea). Inclumos ainda um protocolo que, de maneira simplificada, permite mostrar como fazer e avaliar um antibiograma. Neste caso escolhemos uma bactria comercializada em cultura pura e liofilizada sob a forma de um medicamento e vrios antibiticos disponveis tambm como medicamentos. As experincias, acompanhando o crescimento microbiano, vendo colnias deles vista desarmada e observando-os ao microscpio, so muito divertidas e tambm educativas. que permitem ajudar na distino entre observaes e ideias, frequentemente confundidas nas notcias, consciencializando os jovens para uma participao social de rigor.

1. Apresentao da cincia dos micrbios 1.1. Como se faz a cincia: os processos e os mtodos cientficos 1.2. Como se utiliza a Cincia 1.3. Conhecimentos bsicos sobre os micrbios e os seres vivos em geral 1.3.1. Classificao e evoluo dos seres vivos 1.3.2. Energtica 1.3.3. Biossntese 1.3.4. Gentica, crescimento e multiplicao 2. Objectivos Gerais 3. Explicao das tcnicas utilizadas 3.1. Microscpio 3.1.1. Utilizao 3.1.2. Registo de observaes microscpicas 3.2. Medio de pH 3.3. Esterilizao no autoclave ou na panela de presso 3.4. Tcnicas de assepsia 3.5. Isolamento de micrbios 3.5.1. Placa de isolamento 3.5.2. Placa de individualizao 3.5.3. Placa de incorporao 3.6. Cuidados de manipulao e tratamento do material de vidro 4. Trabalhos experimentais 4.1. Um eucarionte: a levedura de padeiro 4.1.1. Observao microscpica de clulas de levedura 4.1.2. Preparao de meio para leveduras em placas de meio slido 4.1.3. Isolamento de leveduras 4.1.4. Observao microscpica e contagem de colnias 4.1.5. Observao de ascsporos de Saccharomyces cerevisiae 4.1.6. Crescimento de leveduras em sumo de uva 4.2. Eubactrias: as bactrias do iogurte 4.2.1. Observao microscpica das bactrias do iogurte 4.2.2. Preparao de meio para placas para bactrias do iogurte 4.2.3. Isolamento de bactrias do iogurte 4.3. Arquebactrias: as halobactrias do bacalhau 4.3.1. Observao microscpica a partir do bacalhau proteolisado 4.3.2. Meio de cultura em placas para halobactrias 4.3.3. Isolamento de halobactrias 4.4. Resistncia de bactrias a antibiticos 4.4.1. Meio para antibiogramas 4.4.2. Preparao de solues de antibiticos 4.4.3. Preparao do antibiograma 5. Sugestes para a adequao da execuo dos trabalhos 5.1. Ensino Bsico 5.2. Ensino Secundrio 6. Avaliao comportamental 6.1. Exemplo de exerccio, a utilizar no ensino secundrio 7. Publicaes relacionadas para possvel consulta

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1. Apresentao da cincia dos micrbios


1.1. Como se faz a cincia: os processos e os mtodos cientficos
A parte da Cincia que se dedica ao estudo dos micrbios tem os nomes de Microbiologia ou de Biologia Microbiana. Na elaborao do seu conhecimento, a Microbiologia utiliza os processos vulgares das cincias experimentais, e muitos dos mtodos da biologia, da qumica, da fsica, e alguns mtodos que lhe so especficos. Os processos cientficos compreendem processos essencialmente sensoriais ou observacionais e processos essencialmente mentais ou conceptuais. Os processos sensoriais, a que se chega atravs dos sentidos (como a viso, a audio, o paladar), correspondem s observaes dos fenmenos que, se resultarem de experincias planeadas, podem ainda designar-se por resultados experimentais. Os processos conceptuais correspondem s ideias ou conceitos que resultam da interpretao das observaes. So as hipteses, s viveis se forem apoiadas pelas observaes. O conhecimento evolui a partir da interaco dos dois tipos de processos, que se desencadeiam mutuamente, e ambos so essenciais para o progresso da cincia e das suas aplicaes. O nome apropriado o de processos cientficos, por no haver receitas envolvidas nesta interaco, e no de mtodo cientfico, como h ainda quem sustente. Mtodos so sequncias de tcnicas (ver abaixo). Em geral, pode usar-se o termo observao, mesmo para resultados de experincias planeadas, mas deve evitar usar-se o termo resultado para observaes simples que no tenham provindo de planeamento experimental. Os conceitos ou ideias so formulaes da mente, baseadas ou apoiadas em observaes sistematizadas e reprodutveis. Os conceitos mais simples so as generalizaes de observaes. Os modelos e as teorias so hipteses mais elaboradas. O que no deve usar-se em Cincia so as palavras facto, concluso, provas, evidncias usadas pela poltica, pelo direito, e pela comunicao social. A Cincia mais modesta, lida com a descrio de observaes, que podem apoiar ou refutar a formulao de conceitos, necessariamente provisrios. No jornalismo de divulgao cientfica encontra-se, por vezes, a afirmao de que dantes pensava-se ... mas hoje sabe-se .... Em Cincia, dantes pensava-se ... , hoje pensa-se ..., e daqui a uns anos, ou sculos, pensa-se ..., e no se chega a concluses, isto , a saberes definitivos. As hipteses e as teorias, por mais bem apoiadas experimentalmente, no passam a factos. O conceito de evoluo dos seres vivos uma teoria, como so teorias, as chamadas leis e os princpios da fsica, como as leis do movimento ou as teorias da relatividade. Os conceitos cientficos tm a ver com probabilidade: por haver fortes apoios experimentais, mais provvel que haja evoluo do que no haja. Por exemplo, para o fsico Feynman, mais provvel que os conceitos relativos existncia de discos voadores e do contacto com seres extraterrestres (elaboraes mentais apoiadas em observaes casuais, no sistematizadas nem reprodutveis) sejam mais devidos irracionalidade dos terrestres do que racionalidade dos extraterrestres.

As observaes descrevem-se com o verbo no passado, enquanto que as hipteses se formulam com o verbo no presente. Encontrmos bactrias neste iogurte, a descrio duma observao; as bactrias so os agentes da produo do iogurte, a formulao duma hiptese. Esta hiptese apoiada pelas observaes de que se encontraram bactrias num determinado iogurte, e noutro, e noutro, e no se encontraram bactrias num leite, nem noutro, nem noutro, que no se transformou em iogurte. Outras observaes consubstanciam esse apoio experimental, como a observao da produo de cido lctico pelas bactrias do iogurte, obteno de energia por essas bactrias na transformao da lactose em cido lctico, etc. A ideia de que a transformao do leite em iogurte mediada por bactrias dos gneros Streptococcus e Lactobacillus uma hiptese com fortes apoios experimentais. Mas no uma observao e muito menos um facto. A observao correspondente a esta ideia : em presena daquelas bactrias, o leite transformou-se em iogurte. Mtodos so conjuntos sequenciais de tcnicas, as receitas que usa a cincia experimental na execuo das suas experincias. A tcnica de suspender leveduras de padeiro em gua, com a tcnica de espalhar essa suspenso de clulas superfcie duma lmina de vidro, com a tcnica de cobrir a suspenso com uma lamela, com a tcnica de utilizao do microscpio, conjugam-se no mtodo de observao microscpica das clulas de levedura. Embora os mtodos possam ser alterados, e so-no frequentemente de acordo com os objectivos planeados para as experincias (tal como sucede com as receitas culinrias), os processos da cincia no obedecem a receitas nem a planos prestabelecidos: so mais abertos. Os resultados que surgem das experincias podem diferir dos resultados esperados e o observador deve estar atento para descrever as observaes dos fenmenos que se manifestam. Deve haver esforo no sentido de que o processo da descrio de observaes seja o mais objectivo possvel.

1.2. Como se utiliza a Cincia


Podemos entender a utilizao da Cincia de trs maneiras. A utilizao mais conhecida no Cincia, mas resulta da aplicao do conhecimento cientfico: a tecnologia, como por exemplo a biotecnologia. A fabricao de iogurte, de medicamentos ou de detergentes so actividades tecnolgicas, de indstria alimentar, farmacutica ou domstica. Um segundo aspecto da Cincia a prpria actividade cientfica, o desenvolvimento do conhecimento pelo conhecimento. Utiliza processos e mtodos, como os que foram esquematizados acima, e costuma designar-se por cincia bsica ou fundamental. uma actividade cultural, ao nvel das actividades artsticas, das literrias de fico ou doutras, e no tem mais valor, mas tambm no tem menos valor do que elas. A organizao do conhecimento em qualquer rea ajuda-nos a estabelecer esquemas mentais, que devem reformular-se sempre que seja necessrio. O terceiro, muito importante aspecto da Cincia, tem a ver com a aplicao da maneira de adquirir o conhecimento cientfico ao nosso dia-a-dia sensorial e conceptual. o desenvolvimento e utilizao de descries objectivas e rigorosas, formulao de ideias que as observaes apoiem ou refutem, logicamente 5

explicitadas, e, muito importante, a nfase na distino entre as descries de observaes e o que da resulta: a elaborao mental das ideias. Voltando ao jornalismo, como que possvel ler, ou ouvir, descries to diferentes do mesmo acontecimento, misturadas com a formulao de ideias interpretativas do que foi observado, sem nitidamente mostrar, dizer, separar umas das outras, apartar as observaes das ideias? As descries correctas, objectivas, devem situar-se acima dos interesses, nomeadamente quando se pretende informar. A criao e o desenvolvimento de conscincias honestas passa, eventualmente, pela experimentao cientfica simples, pela descrio de observaes, e pela exposio das ideias que as observaes sugeriram. Separadamente, distintamente, honestamente!

1.3. Conhecimentos bsicos sobre os micrbios e os seres vivos em geral


As generalizaes que se seguem traduzem aspectos muito bsicos e rudimentares de ideias formuladas sobre os seres vivos, e presentemente apoiadas por muitas observaes. Algumas manter-se-o talvez durante anos, mas outras esto j a ser postas em causa por resultados experimentais recentes, e sero talvez brevemente reformuladas. Embora provisrias, elas so, no entanto, necessrias como mesa de trabalho, suporte mental, das experincias a que nos iremos dedicar.

1.3.1. Classificao e evoluo dos seres vivos Considera-se, presentemente, que existem os seres celulares constitudos por clulas e os seres subcelulares que tm apenas pores qumicas duma clula na sua constituio. So seres subcelulares, por exemplo, os vrus. So seres celulares os animais, as plantas, os fungos, os protozorios, as algas e as bactrias. s bactrias tambm se d o nome de procariontes, seres com um pr-ncleo, ou de protocariontes, que significa seres com um ncleo primitivo; todos os outros organismos so os eucariontes, que significa seres com ncleo bom, por o ncleo das suas clulas possuir um invlucro. Eucariontes so os animais, as plantas, os fungos, os protozorios e as algas. Estes dois ltimos dividem-se, presentemente, por vrios reinos. Consideram-se trs domnios de seres celulares (Fig. 1) as Eubactrias (ou Bacteria), as Arquebactrias (ou Archaea) e os Eucariontes (ou Eucarya) que se definem, essencialmente, em termos moleculares (composio dos cidos nucleicos DNA e RNA e das protenas). Mas geralmente possvel distinguir, microscopicamente, as clulas dos Eucariontes, maiores e mais complexas, das clulas das Eubactrias e das Arquebactrias a cujo conjunto, como vimos, se chama Procariontes. H vrias observaes que apoiam a ideia de que as eubactrias e as arquebactrias constituem dois troncos evolutivos separados embora tivessem tido um antepassado comum. Os eucariontes, por seu lado, tero inicialmente resultado da associao duma arquebactria com trs ou mais eubactrias.

Figura 1. Os trs domnios dos seres vivos, presentemente aceites as Eubactrias, as Arquebactrias e os Eucariontes e as suas relaes evolutivas. As hipteses, em que se baseia a construo desta rvore, apoiam-se em muitas observaes experimentais, e esto em reformulao constante, medida que se acrescentam novas observaes. Deste modo se vai modificando a rvore.

1.3.2. Energtica Os seres vivos utilizam energia, geralmente sob a forma dum composto qumico, o ATP, que as clulas fabricam de trs maneiras distintas: respirao, fotossntese e fermentao. Na respirao e na fotossntese, a formao de ATP est associada a membranas das clulas ou das suas organelas, enquanto que na fermentao a formao do ATP no est associada a membranas. Por outro lado, tanto na respirao como na fermentao a energia provm de substncias qumicas, isto , a fonte de energia qumica, ao passo que na fotossntese a fonte de energia luminosa (Tabela I). Os animais, os fungos, os protozorios e muitas bactrias utilizam a respirao ou tambm a fermentao, ao passo que as plantas, as algas e vrias bactrias utilizam essencialmente a fotossntese.

Tabela I. Comparao entre os trs processos energticos conhecidos dos seres vivos: a respirao, a fotossntese e a fermentao.

Respirao Fotossntese Fermentao

Origem da energia composto qumico luz composto qumico

Local de formao de ATP associado a membranas associado a membranas no-associado a membranas

1.3.3. Biossntese Os organismos vivos so constitudos por uma grande quantidade de gua 70 a 90% ou ainda mais e por vrios elementos qumicos, componentes dos compostos, que se organizam em estruturas celulares. o carbono o elemento mais abundante cerca de 50% da biomassa seca (isto , com excluso da gua) e outros elementos importantes so o oxignio, o azoto, o hidrognio, o fsforo, o enxofre, o sdio, o potssio, o clcio, o magnsio, o cloro e o ferro. Dos organismos que utilizam substncias orgnicas como fonte de carbono das suas clulas, diz-se que fazem heterotrofismo. Dos que utilizam principalmente uma fonte inorgnica, como o dixido de carbono, CO2, diz-se que fazem autotrofismo. As plantas, as algas e vrias eubactrias fazem autotrofismo associado a fotossntese, enquanto que vrias eubactrias e arquebactrias fazem autotrofismo associado a respirao. O heterotrofismo est associado a respirao e a fermentao em animais, fungos, protozorios e muitas bactrias, e est associado a fotossntese em vrias eubactrias e vrias arquebactrias (Tabela II). Dentre os organismos a que este manual se dedica: As bactrias do iogurte (eubactrias) fazem fermentao e heterotrofismo. As halobactrias do bacalhau (arquebactrias) fazem fotossntese, ou respirao, associadas a heterotrofismo. As leveduras (eucariontes) geralmente fermentam, e tambm so capazes de respirar, com heterotrofismo.
Tabela II. Combinaes da energtica e da biossntese e os grupos de organismos onde essas combinaes se encontraram. Autotrofismo Qumio-autotrofismo: vrias eubactrias e vrias arquebactrias Foto-autotrofismo: plantas, algas e vrias eubactrias desconhecido Heterotrofismo Qumio-heterotrofismo: animais, fungos, protozorios, muitas eubactrias e vrias arquebactrias Foto-heterotrofismo: vrias eubactrias e algumas arquebactrias Qumio-heterotrofismo: animais, fungos, protozorios, muitas eubactrias e vrias arquebactrias

Respirao

Fotossntese

Fermentao

1.3.4. Gentica, crescimento e multiplicao As clulas, que constituem os organismos, multiplicam-se utilizando os nutrientes do meio e diz-se que a sua populao cresce. A informao gentica, que cada clula contm, multiplica-se com ela, e as clulas-filhas mantm-se idnticas s suas progenitoras, excepto em caso de mutao, em que surgem clulas diferentes, que podem conduzir evoluo. Nos organismos com muitas clulas h diferenciao,

isto , modificao das clulas em tecidos e rgos, mas no h modificao gentica das clulas que propagam o ser vivo.

2. Objectivos Gerais
Pretende divulgar-se um conjunto de protocolos que mostrem os micrbios, recorrendo a metodologias muito simples baseadas, sempre que possvel, em substncias de uso corrente culinrio e farmacutico: as leveduras do po, do vinho e da cerveja, as bactrias do iogurte, as halobactrias do bacalhau, a aco de antibiticos e sua especificidade, e o efeito da temperatura, ilustrando os princpios bsicos da esterilizao e da conservao dos alimentos. Embora o estudo das actividades microbianas propostas seja executado com organismos no-patognicos, utilizar-se-o todos os cuidados de assepsia, usados num laboratrio normal de microbiologia, de modo a incutir nos jovens esses princpios. Os protocolos experimentais foram j testados junto de alunos do ensino bsico e do secundrio. Pretende-se que os alunos ao realizarem experincias, descrevam os resultados obtidos e formulem hipteses interpretativas. Desta maneira, sero levados a distinguir entre os processos cientficos essencialmente sensoriais (observaes, resultados) e os processos essencialmente mentais (conceitos, hipteses, modelos, teorias).

3. Explicao das tcnicas utilizadas


Os processos sensoriais so levados a cabo pelos nossos sentidos. H aparelhos que auxiliam os sentidos, fazendo com que consigamos observar fenmenos por extenso dos nossos sentidos. Os microscpios permitem-nos observar objectos mais pequenos, ampliando-os, tornando-os acessveis nossa viso. Os aparelhos medidores do pH permitem-nos apreciar, com mais rigor do que o nosso sentido do paladar (e tambm com mais segurana), se um lquido mais ou menos cido, mais ou menos alcalino.

3.1. Microscpio
3.1.1. Utilizao importante familiarizarmo-nos com os componentes do microscpio (Fig. 2) e com a sua manipulao, que deve ser efectuada com muito cuidado. Quando se termina a utilizao, deve verificar-se que se deixa tudo em condies, de modo a melhorar a conservao do aparelho e a facilitar o seu uso posterior: desligar a iluminao, deixar a platina, as objectivas e as oculares devidamente limpas, proteger o microscpio do p com pano ou capa, e guard-lo em local apropriado.

Figura 2. Esquema do microscpio.

Aquando de nova utilizao, deve verificar-se se as lentes esto limpas, incluindo as objectivas (1), as oculares (5), e as do condensador (7). Para remover manchas de gordura ou de corantes, marcas de dedos, ou restos de leo de imerso deixados na objectiva, deve usar-se papel suave seco ou muito levemente humedecido com xilol. O xilol no deve nunca aplicar-se directamente nas lentes, pois pode descollas. A maioria dos microscpios pode montar-se com um canho (2) binocular. Uma vez que a distncia interpupilar varivel de pessoa para pessoa, deve o observador ajustar a distncia entre as oculares, de maneira a fazer coincidir as duas imagens do campo ptico. Nas operaes de focagem, deve comear por utilizar-se a objectiva de menor ampliao (10x), rodando o revlver (4) at que esta objectiva encaixe na sua posio (fazendo um clique). Ajusta-se a preparao, previamente colocada na platina (6), no suporte mvel ou presa nas pinas, de modo a que a objectiva fique sobre a parte do material a observar. Seguidamente, liga-se a iluminao (ou desloca-se o espelho - 8) e ajusta-se a quantidade de luz que atravessa a preparao, fechando o diafragma. Com o auxlio do parafuso de focagem de maiores deslocamentos (parafuso macromtrico ou cremalheira: 3 em cima), desloca-se o canho, acompanhando visualmente esse movimento, de maneira a que a objectiva se situe bem perto da preparao, mas sem lhe tocar. Ainda com a cremalheira, inicia-se ento o afastamento lento da objectiva, observando pela ocular o surgimento da imagem no campo ptico. Se se tratar de microrganismos de pequenas dimenses e de reduzido contraste, pode ser de ajuda procurar focar uma das arestas da lamela, ou uma bolha de ar que tenha ficado aprisionada entre a lmina e a lamela). Ajusta-se o foco com o parafuso de deslocamentos menores

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(parafuso micromtrico: 3 em baixo). Desloca-se a preparao com auxlio dos parafusos da platina, ou com movimentos cuidadosos dos dedos, no caso de a lmina estar fixada por pinas, mantendo sempre o indicador e o polegar duma das mos sobre o parafuso micromtrico, de maneira a ir refocando os campos em observao. Uma vez focada a imagem do objecto pretendido, com a objectiva de menor ampliao, pode passar-se para a objectiva de ampliao imediatamente superior (40x), sem mexer na focagem, e acompanhando visualmente de lado a rotao do revlver porta-objectivas, no esteja a objectiva mal colocada! Um leve ajustamento com o parafuso micromtrico, trar ento a imagem ao seu foco. Dever ser ainda necessrio um ajuste na iluminao, abrindo o diafragma ou mesmo aumentando a intensidade luminosa. Para utilizar a objectiva de imerso (100x), comea por rodar-se parcialmente o revlver, at a lente frontal estar perto da preparao. Coloca-se uma pequena gota de leo de imerso sobre a superfcie da lamela (ou sobre a superfcie da prpria preparao no caso de esfregaos secos), no ponto atravessado pelo feixe luminoso, e completa-se a rotao do revlver at se sentir a objectiva prender e mergulhar no leo. Leve movimento do parafuso micromtrico levar obteno duma imagem ntida. Se tal no acontecer, deve procurar-se a causa, que pode estar numa deficiente iluminao (a iluminao tem de ser aumentada sempre que se passa para objectivas de maior ampliao), que pode ter motivado termos passado pelo foco sem nos termos apercebido. Mais uma vez, cuidado: no aproximar a objectiva da preparao, com os olhos na ocular! A aproximao da objectiva deve ser seguida por observao lateral directa; s o afastamento da objectiva da preparao, para focagem, deve ser seguido por observao pelo interior. O no-seguimento destas regras pode levar a danos nas preparaes e, pior do que isso, nas lentes frontais das objectivas, que podem riscar-se, ficando com defeitos pticos caros de reparar. Quanto elaborao das preparaes a observar, devem utilizar-se pequenas quantidades das culturas originais e de gua, se for o caso. No caso de haver muito lquido, deve retirar-se o excesso com um pedao de papel absorvente (o papel higinico suficientemente bom!). Deve tambm evitar-se a utilizao de leo de imerso em excesso e que ele se misture com a gua da preparao.

3.1.2. Registo de observaes microscpicas O registo de observaes, e sua interpretao, em microscopia ptica, obedece a vrios requisitos que emanam da natureza da preparao e da informao pretendida. Seguem-se alguns exemplos, que pretendem ilustrar a aplicao concreta das normas: a. Descrever a observao, com auxlio dum desenho, e compar-la com a informao pretendida. b. O processo de registo deve realizar-se durante a observao e nunca de memria. c. Deve registar-se a morfologia celular desenhando as formas mais representativas, com dimenses tais que facilitem a sua percepo: a escala do registo fornecida pela ampliao indicada e no pela dimenso do registo. Se as clulas ocorrerem em grupos, deve indicar-se o tipo de agregao.

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d. Para o registo e a identificao de estruturas intracelulares deve recorrer-se a uma legenda. e. Caso ocorra, deve indicar-se o tipo de movimento observado. Devem identificar-se as organelas que forem observveis. f. A representao a cor s relevante quando for observada.

3.2. Medio de pH
Atravs do paladar temos a sensao se um alimento mais ou menos cido. Os qumicos estabeleceram uma escala que permite quantificar a acidez em termos de pH. O pH 7 quando o lquido neutro, como o caso da gua pura, e o seu valor tanto mais baixo quanto mais cido for o lquido. O sumo de limo e o vinagre tm o pH baixo. Se o lquido contiver menos protes do que a gua diz-se que bsico e o seu pH mais alto que 7. , por exemplo, o caso da lixvia ou de uma soluo de bicarbonato de sdio. O pH varia de 1 a 14. Lquidos com o pH muito alto (muito bsicos) ou com o pH muito baixo (muito cidos) so muito reactivos, tornando-se corrosivos. Muitos microrganismos s se multiplicam numa gama estreita de pH, sendo por isso muitas vezes necessrio ajustar o pH dos meios de cultura. Para medir o pH usam-se actualmente pequenos aparelhos digitais (Fig. 3), formados por um elctrodo que se mergulha no lquido e um mostrador onde se l directamente o pH.

Figura 3. Esquema do medidor de pH.

Para o seu bom funcionamento, o elctrodo deve ser passado por gua limpa e limpo com papel absorvente antes de ser mergulhado na amostra cujo pH se pretende medir. Aps a imerso, a leitura do pH no mostrador pode demorar algum tempo a estabilizar (no mximo 2 ou 3 min). Para se obter um valor fivel, necessrio calibrar o aparelho com alguma frequncia. Para tal so necessrias duas solues padro com pH 7 e pH 4. O aparelho dispe de dois pequenos parafusos que permitem o ajuste a esses valores de pH com uma pequena chave de fendas.

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Quando se guarda o aparelho, deve desligar-se e colocar-se a tampa de proteco do elctrodo.

3.3. Esterilizao no autoclave ou na panela de presso


O autoclave ou a panela de presso (Fig. 4) utilizam-se na esterilizao de meios de cultura, contidos em frascos ou em bales de Erlenmeyer. Os frascos devem conter meio somente at ao mximo de dois teros da sua capacidade. Devem ser rolhados com algodo cardado que pode proteger-se com papel de estanho ou de embrulho atado com cordel. No caso de terem rolha de enroscar, a rolha no deve ficar muito apertada, de modo a deixar sair o vapor de gua que se libertar durante a esterilizao.

Figura 4. Pequeno autoclave (panela de presso com manmetro).

A esterilizao s eficiente se for realizada sob presso de vapor a 1 atmosfera (correspondente a 120C) acima da presso ambiental, durante entre 20minutos (para recipientes de pequenas dimenses, at 1 litro) a 30 minutos. Presses mais elevadas, ou maior durao da esterilizao, so eficientes mas podem danificar componentes dos meios de cultura. Antes de fechar o autoclave para que a presso suba, deve deixar-se sair o ar com sada contnua e forte de vapor e, depois de a presso atingir 1 atmosfera, deve iniciar-se a contagem do tempo e vigiar-se (ligando ou desligando as resistncias elctricas) para que a presso se mantenha durante o tempo de esterilizao. No caso da panela de presso, comea a contar-se o tempo quando se liberta o ar com vapor forte. Terminado o tempo, desliga-se e deixa-se arrefecer antes de abrir. Agitam-se cuidadosamente os meios que tiverem tendncia para formar depsitos (todos os meios que contm agar), e podem utilizar-se imediatamente para fazer placas em caixas de Petri. Os meios s devem ser inoculados com microrganismos, depois de arrefecerem temperatura conveniente, que pode diferir de organismo para organismo. A temperatura ambiente geralmente apropriada para a maioria dos microrganismos

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serem inoculados, o que no significa que seja essa a sua temperatura ptima de crescimento.

3.4. Tcnicas de assepsia


A manipulao de microrganismos e de meios de cultura deve realizar-se assepticamente, em cmaras esterilizadas apropriadas (Fig. 5) ou, alternativamente e mais vulgarmente, junto a um bico de gs (Fig. 6). Manipulaes rpidas e de menor importncia, ou que digam respeito a culturas que no necessitem de grandes perodos de incubao, podem efectuar-se junto a uma lamparina de lcool. A chama esteriliza pelo seu calor e cria uma corrente de ar quente que afasta o ar contaminado. Correntes de ar exterior durante a manipulao podem prejudicar a eficincia da operao. Devem passar-se rpida, mas determinadamente, pela chama os bucais dos frascos ou dos bales (Fig. 7), assim como as pipetas. As ansas de repicagem devem ir ao rubro, necessitando por isso de arrefecimento posterior nas placas, nos bales, ou no prprio meio de cultura, antes de serem usadas no transporte dos microrganismos.

Figura 5. Esquema de cmara de fluxo laminar para manipulao em assepsia.

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Figura 6. Esquemas de bico de gs e de lamparina para manipulao em assepsia.

Figura 7. Preparao de placas atravs da manipulao assptica de caixas de Petri e de meio de cultura contido num balo de Erlenmeyer.

3.5. Isolamento de micrbios


A partir duma amostra, retirada da natureza, geralmente possvel isolar alguns dos microrganismos que l se encontram, desde que se tenha meio de cultura apropriado para o seu crescimento. Embora o crescimento seja mais rpido e homogneo em meios de cultura lquidos, para a separao dos micrbios uns dos outros, isto , para o seu isolamento em cultura pura, tm necessariamente de se utilizar meios slidos. Aps isolamento, das colnias em placas de meio slido, a cultura, obtida a partir duma colnia, deve manter-se no mesmo meio.

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3.5.1. Placa de isolamento Com uma ansa de repicagem, inocula-se a cultura, ou a suspenso contendo microrganismos, superfcie do meio slido contido numa placa. O trao inicial, feito a um canto da placa, espalhado imediatamente por passeios apertados, de maneira a ir diluindo a amostra e a separar as clulas. Assim, cada colnia que crescer isoladamente das outras deve ser proveniente duma nica clula. Alternativamente, geralmente mais eficiente ir diluindo a cultura que ficou no trao inicial, aps esterilizaes sucessivas da ansa (Fig. 8). Seja como for, esteriliza-se sempre a ansa ao rubro e, antes de cada utilizao, arrefece-se numa zona da placa que no contenha clulas (centro da placa).

Figura 8. Operaes da tcnica de placa de isolamento.

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3.5.2. Placa de individualizao O objectivo desta tcnica a obteno de colnias bem separadas de modo a poderem contar-se (Fig. 9). Com auxlio duma pipeta esterilizada, inocula-se, no centro duma placa com meio slido, 0,1ml duma suspenso de clulas convenientemente diluda. Espalha-se por toda a placa, com uma vareta de vidro, dobrada em L, e imediatamente antes esterilizada com chama de lcool (molhada em lcool e passada pela chama, somente para que o lcool arda). Antes da utilizao, arrefece-se a vareta na parte interior da tampa da caixa de Petri.

Figura 9. Tcnica da placa de individualizao

Para adequada previso dos resultados, e clculo da fraco das clulas viveis da populao inoculada, deve fazer-se uma contagem microscpica prvia, em cmara de contagem (Fig. 10), das clulas da suspenso. geralmente necessrio fazer uma diluio da suspenso, antes da sua inoculao no meio slido.

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Figura 10. Cmara de contagem de clulas ao microscpio.

3.5.2.1. Utilizao da cmara de contagem (seguir com o auxlio da Fig. 9). A cmara de contagem, tambm conhecida pelo nome de hemocitmetro, constituda por uma lmina, mais grossa do que as lminas nornais utilizadas em observaes microscpicas. Tem uma parte central a um nvel 0,1mm inferior do que o resto da lmina, de modo a deixar um intervalinho de 0,1mm de altura quando, nas partes laterais, assenta uma lamela (mais espessa do que as lamelas vulgares). Na parte central, h duas grelhas em cruz, sendo o centro de cada cruz um quadrado grande de 1 mm de lado, dividido em 25 quadrados mdios, cada um dos quais, por sua vez, dividido em 25 quadrados pequenos. O quadrado grande constitui a base de observao para a contagem de organismos contidos num prisma quadrangular com 1mm2 de base e 0,1mm de altura, ou seja, com 0,1mm3 de volume. A lamela deve, previamente, aderir aos seus assentos, fazendo passar nestes um dedo levemente humedecido em gua, e pressionando a lamela com movimentos curtos e firmes, na direco perpendicular maior dimenso da lmina. Uma vez a lamela aderente, do modo a no cair se a lmina for invertida, coloca-se uma gota duma suspenso de organismos (bem agitada, para que a amostra seja significativa da populao) na margem da lamela onde ela se separa (os tais 0,1mm)

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da lmina: por capilaridade, a gota vai penetrar no espao prismtico. Coloca-se a cmara de contagem no microscpio e realiza-se a contagem. Aps utilizao, deve lavar-se a cmara e a lamela com gua corrente, sec-las com papel higinico e guard-las na caixa.

3.5.3. Placa de incorporao particularmente til para organismos que no tolerem muito o oxignio, e que resistam a temperaturas at 45C, como as bactrias do iogurte. Inocula-se 1ml duma suspenso de clulas, em cerca de 20ml de meio slido, previamente preparado e esterilizado, conservado fundido num tubo a 45C. Agita-se e deita-se para uma caixa de Petri esterilizada, que se fecha logo com a tampa, e qual se imprimem leves e curtos movimentos rotativos. Deixa-se repousar e solidificar, incuba-se e aguarda-se at se obter crescimento das colnias, que devem ficar isoladas, distribudas por todo o meio slido. A partir do tubo inicial, com o meio ainda liquefeito, podem fazer-se, rapidamente para evitar que o meio solidifique no tubo, diluies para meio idntico contido em novos tubos (1ml/20ml), que se despejam para outras tantas caixas de Petri. As placas, que assim se obtm, contm, eventualmente, uma diluio apropriada contagem e isolamento do organismo em que estamos interessados. Para mais adequada previso dos resultados, deve fazer-se uma contagem microscpica prvia, em cmara de contagem, das clulas da suspenso, de forma a obter cerca de 300 clulas no primeiro tubo.

3.6. Cuidados de manipulao e tratamento do material de vidro


Devem seguir-se, rigorosamente, todos os passos dos protocolos. Embora os organismos utilizados no sejam patognicos, podem crescer nos meios de cultura populaes doutros organismos desconhecidos se as manipulaes no forem cuidadosas, ou apesar de serem cuidadosas. No ambiente que nos rodeia, existem esporos e clulas vegetativas de bactrias ou de fungos, em maior ou menor quantidade, que podem tornar-se prejudiciais se propiciarmos a sua multiplicao. As caixas de Petri devem selar-se em toda a volta, com fita gomada, e esterilizaremse numa panela de presso (ou autoclave) durante 30 minutos, antes de serem abertas para se lavarem. Alternativamente, deixam-se mergulhadas em lixvia diluda, dum dia para o outro, antes de se deitarem fora em sacos de plstico fechados (se as caixas de Petri forem de plstico), ou antes de serem lavadas (se forem de vidro). Idnticos cuidados devem seguir-se para bales de Erlenmeyer e para tubos de ensaio.

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4. Trabalhos experimentais
4.1. Um eucarionte: a levedura de padeiro
As leveduras so organismos do domnio dos eucariontes, reino dos fungos. So estirpes da espcie Saccharomyces cerevisiae que medeiam a produo de po, de vinho e de cerveja. Esta espcie geralmente obtm energia por fermentao alcolica, produzindo etanol, embora tambm tenha capacidade para respirar aerobiamente. Pode cultivar-se em meios lquidos, como sumo de uva, ou em placas de meios slidos, como os que a seguir se descrevem. As leveduras que contituem o fermento de padeiro so diplides. possvel obter cuturas haplides (a e ) a partir de ascsporos induzidos em meio de esporulao (ver adiante). O ciclo meitico e os ciclos mitticos de Saccharomyces cerevisiae esto esquematizados na Fig. 11.

Ciclo mittico diplide

aD
Ciclo meitico

zigoto

asco

D a
a a
ascsporos

D
Ciclos mitticos haplides

Figura 11. Ciclo meitico e ciclos mitticos da levedura Saccharomyces cerevisiae.

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4.1.1. Observao microscpica de clulas de levedura

Material
Poro de fermento de padeiro fresco gua Lminas Lamelas Microscpio

Execuo
Suspender cerca de 0,25g de fermento de padeiro em 10ml de gua. Retirar uma gota da suspenso de clulas e colocar sobre uma lmina; cobrir com a lamela (Fig. 12). Observar ao microscpio, comeando pela objectiva de menor ampliao.

Figura 12. Elaborao duma preparao microscpica.

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4.1.2. Preparao de meio para leveduras em placas de meio slido

Material
Bales de Erlenmeyer de 0,5 litro Mel Agar Autoclave ou panela de presso Caixas de Petri esterilizadas

Execuo
Deitar 100ml de gua para um balo. Adicionar 2 a 4g de mel. Adicionar 2g de agar. Autoclavar durante 20minutos a 1 atmosfera ou ferver durante o mesmo tempo na panela de presso. Deitar para caixas de Petri esterilizadas junto chama (Fig. 6), e deixar arrefecer.

4.1.3. Isolamento de leveduras

Material
Poro de fermento fresco gua esterilizada Placas com meio slido Ansa Tubo de ensaio estril Chama

Execuo
(Trabalhar junto chama) Suspender um pedao muito pequeno de fermento em 5ml de gua esterilizada contida num tubo de ensaio. Esterilizar a ansa chama. Arrefecer no interior do tubo sem tocar na suspenso. Mergulhar a ansa na suspenso e fazer uma placa de isolamento no meio slido contido na placa. Se possvel, fazer placas de incorporao e tambm de indidualizao, aps contagem na cmara e diluies apropriadas. Colocar as placas a 25C ou temperatura ambiente. Aps alguns dias observar as colnias. 22

4.1.4. Observao microscpica a partir de colnias isoladas (Fig. 13) e contagem de colnias nas placas de individualizao.

Execuo
Retirar, junto chama, com uma ansa de repicagem, uma poro pequenina de clulas duma colnia isolada duma placa de isolamento ou de individualizao. Depositar essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma lmina. Cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio ptico. Contar, a olho nu, as colnias nas placas de individualizao, e calcular o nmero de clulas na populao da suspenso utilizada.

Figura 13. Suspenso de clulas em lmina para observao microscpica, a partir de colnias isoladas.

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4.1.5. Observao de ascsporos de Saccharomyces cerevisiae em fermento comercial de padeiro (Protocolo desenvolvido por J. Baptista Asceno, 1994, Universidade do Minho):

Material
Fermento fresco Agar cido actico laboratorial ou vinagre de cozinha Hidrxido de potssio (ou potassa custica - KOH) Saquetas de acar (sacarose) para adoar caf Extracto de levedura gua destilada Medidor de pH Caixas de Petri, de preferncia esterilizadas Copo de vidro com vareta de vidro dobrada em L lcool Esptula ou ansa de repicagem Balana Copos de vidro de 100 e 250ml Pipetas de 0,5ml Chama Placa de aquecimento

Preparao do meio de esporulao


Colocar 100ml de gua destilada num copo de vidro. Adicionar cerca de 2,5g de KOH, slido, se a pureza for de cerca de 85%. Adicionar vinagre de cozinha ou cido actico laboratorial, at o pH se situar entre 6 e 7. Adicionar 0,05g de sacarose (na falta de balana com sensibilidade adequada, introduzir a polpa do dedo indicador na sacarose; sacudir com o polegar a sacarose aderente para o meio em preparao. Nota: os dedos devem estar secos). Adicionar 0,2g de extracto de levedura. Adicionar 4g de agar e um volume de gua necessrio para perfazer 200ml. Aquecer at fervura, que pode prolongar-se por 10-15 minutos. Deitar o meio preparado para caixas de Petri, operando junto chama (Fig. 7). Deixar arrefecer at solidificar.

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Inoculao de clulas de Saccharomyces cerevisiae em meio de esporulao (Junto chama) Preparar uma suspenso espessa de fermento fresco: suspender 1g de fermento fresco em 1ml de gua. Deitar, com uma pipeta, 0,2ml da suspenso de clulas para o meio contido numa placa. Espalhar com a vareta de vidro dobrada em L. Deixar temperatura ambiente. Aps pelo menos 1 dia, retirar, junto chama, uma poro de clulas, com uma esptula ou uma ansa de repicagem. Suspender essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma lmina. Cobrir com lamela. Observar ao microscpio ptico.

4.1.6. Crescimento de leveduras em sumo de uva

Material
Sumo de uva Poro de fermento fresco Iogurteira Medidor de pH

Execuo
Encher 6 boies da iogurteira com 100ml de sumo de uva. Numer-los de 1 a 6. Inocular os boies 1, 3 e 5 com um pedao muito pequeno de fermento (Sugesto: utilizar um palito para retirar pedaos pequenos). Colocar os boies 1 e 2 na iogurteira, os 3 e 4 temperatura ambiente, e os 5 e 6 no frigorfico. Construir um quadro avaliando durante 5 dias os seguintes parmetros: a. pH b. Cheiro c. Turvao d. Libertao de gs (CO2 ) Interpretar os resultados. 25

4.2. Eubactrias: as bactrias do iogurte


As bactrias do iogurte medeiam a transformao do leite em iogurte. Utilizam a lactose como fonte de carbono e de energia, levando a cabo uma fermentao lctica, como principal processo gerador de energia. So eubactrias Gram positivas de baixo contedo G+C. Os iogurtes devem conter quantidades aproximadamente iguais de Streptococcus e de Lactobacillus.

4.2.1. Observao microscpica das bactrias do iogurte

Material
Iogurte magro natural Ansa Lminas Lamelas Microscpio

Execuo
Mergulhar a ansa no iogurte. Fazer um esfregao fino numa lmina limpa. Observar ao microscpio, comeando pela objectiva de menor ampliao. Tentar distinguir os dois tipos de bactrias lcticas.

Notas Pode fazer-se o mesmo com o soro do iogurte, que embora possua muito menos bactrias, no tem tanta gordura. Pode corar-se com uma gota de mercurocromo, que se espalha na altura de fazer o esfregao.

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4.2.2. Preparao de meio de cultura em placas para bactrias do iogurte

Material
Bales de Erlenmeyer de 0,5 l Extracto de levedura Lactose Peptona Agar Panela de presso ou autoclave Caixas de Petri, previamente esterilizadas Chama

Execuo
Verter 100ml de gua para um balo. Adicionar 0,5g de extracto de levedura. Adicionar 0,5g de peptona. Adicionar 0,5g de lactose. Adicionar 1,5g de agar. Autoclavar durante 20 minutos a 120C (1 atmosfera) ou ferver o mesmo tempo em panela de presso. Verter para caixas de Petri, junto chama (Fig. 7), e deixar arrefecer. As placas ficam feitas e prontas a usar quando o meio tiver solidificado. Se possvel, fazer tambm placas de incorporao, como indicado atrs.

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4.2.3. Isolamento de bactrias do iogurte

Material
Iogurte magro natural Ansa Placas com meio slido Parafilme ou pelcula aderente Chama Estufa a 37C, ou iogurteira

Execuo
(Trabalhar junto chama) Abrir o iogurte perto da chama. Esterilizar a ansa chama (deixar ir ao rubro). Deixar arrefecer e mergulhar no soro do iogurte. Fazer um riscado numa placa contendo meio slido. Selar a placa com tiras de parafilme ou pelcula aderente. Colocar na estufa a 37C. Alguns dias depois tentar observar os 2 tipos de colnias: a. Colnias muito transparentes em forma de flor (Lactobacillus) b. Colnias brancas, pequenas e redondas (Streptococcus)

Sugestes Retirar, junto chama, uma poro de clulas dum tipo de colnia isolada, com uma ansa. Depositar essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma lmina. Cobrir com lamela. Observar ao microscpio, tentando identificar os microrganismos. Retirar, com uma ansa junto chama, uma poro de clulas dum tipo de colnia isolada. Fazer uma placa de isolamento. Colocar na estufa a 37C. Fazer para os dois tipos de colnias, com vista a obter-se um crescimento isolado dos dois gneros de microrganismos.

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4.3. Arquebactrias: as halobactrias do bacalhau


As halobactrias so contaminantes habituais do bacalhau seco salgado. Crescem sua superfcie, como manchas avermelhadas, e exalam um cheiro caracterstico a bacalhau podre, mesmo quando o bacalhau est em perfeitas condies de utilizao. Para o isolamento destes organismos, pe-se num meio lquido (como o descrito abaixo, omitindo o agar) uma pequena lasca de bacalhau (preferencialmente, se j estiver com cheiro intenso e manchas) e incuba-se a uma temperatura de 37-50C, durante 1-4 semanas. Uma iogurteira proporciona a temperatura ideal, e um boio de vidro um ptimo recipiente. Quando o meio de cultura ficar com cor vermelha e o cheiro conhecido a bacalhau estragado, pode proceder-se ao isolamento das bactrias em placas. As halobactrias do gnero Halobacterium so cilndricas e tm movimento por flagelos; as do gnero Halococcus so esfricas.

4.3.1. Observao microscpica directa a partir do bacalhau proteolisado

Material
Bacalhau que apresente zonas vermelhas e cheiro intenso. Tubo de ensaio gua destilada Sal Ansa de repicagem Lmina Lamela Microscpio

Execuo
Retirar ou raspar um pedao pequeno de bacalhau duma zona que esteja vermelha. Colocar num tubo de ensaio contendo 1 a 2ml de soluo salina de NaCl (20%) Agitar bem. Mergulhar a ansa na soluo. Colocar uma gota numa lmina limpa. Colocar lamela. Observar ao microscpio, comeando pela objectiva de menor ampliao.

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4.3.2. Meio de cultura em placas para halobactrias

Material
Bacalhau Panela Copos de precipitao Proveta Funil Papel de filtro Sal Medidor de pH NaOH (soda custica) Agar Caixas de Petri Placa de aquecimento

Execuo
Cozer 200g de bacalhau em 0,5l de gua durante 30 min. Filtrar a gua de cozedura atravs de papel de filtro. Verter o lquido para um copo de precipitao. Deixar arrefecer. Por cada 100ml juntar 20g de sal. Retirar o sal em excesso que no se dissolveu. Acertar a pH 7 com NaOH com ajuda do medidor de pH. Adicionar 2g de agar por cada 100ml. Aquecer a soluo at entrar em ebulio. Retirar a espuma em excesso, verter para caixas de Petri (Fig. 7), e deixar arrefecer.

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4.3.3. Isolamento de halobactrias

Material
Bacalhau que apresente zonas vermelhas e cheiro intenso Ansa de repicagem Placas com meio de cultura slido Parafilme ou pelcula aderente Chama Estufa a 40C ou iogurteira

Execuo
Esfregar um pedao de bacalhau duma zona que esteja vermelha numa placa com meio de cultura slido. Selar a placa com tiras de parafilme ou pelcula aderente. Colocar na estufa a 40C, ou na iogurteira. Passados alguns dias, identificar as colnias vermelhas, e fazer placas de isolamento a partir de colnias isoladas. (Podem tambm fazer-se placas de individualizao.) Colocar na estufa a 40C, ou na iogurteira. Passados alguns dias voltar a observar.

Sugestes Retirar uma poro de clulas duma colnia isolada, com uma ansa de repicagem. Depositar essas clulas numa gota de meio lquido, colocada sobre uma lmina. Cobrir com lamela. Observar ao microscpio tentando distinguir os microrganismos. Para o isolamento destes organismos, pr uma pequena lasca de bacalhau (preferencialmente, se j estiver com cheiro intenso e manchas) em meio lquido (como o descrito acima, omitindo o agar) e incubar a uma temperatura de 37-50C, durante 1-4 semanas. Uma iogurteira proporciona a temperatura ideal, e um boio de vidro um ptimo recipiente. Quando o meio de cultura ficar com cor vermelha e o cheiro conhecido, pode retirar-se uma poro de meio de cultura, com uma ansa. Depositar a gota de meio lquido sobre uma lmina. Cobrir com lamela. Observar ao microscpio tentando distinguir os microrganismos.

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4.4. Resistncia de bactrias a antibiticos


As bactrias so sensveis a substncias qumicas, sintetizadas por outras bactrias ou por fungos, que as inibem de se multiplicar, ou produzem mesmo a morte. So os antibiticos de grande importncia no tratamento de infeces, sendo muitas vezes conveniente, antes da aplicao do antibitico, efectuar um antibiograma, isto, um teste de sensibilidade da bactria que produz a infeco a um conjunto de antibiticos. 4.4.1. Meio para antibiogramas

Material
Carne de frango Panela Bales de Erlenmeyer de 0,5l Proveta de 250ml Funil Papel de filtro Medidor de pH NaOH (soda custica) Mel Agar Panela de presso ou autoclave Caixas de Petri Placa de aquecimento

Execuo
Cozer 200g de frango em 0,5 l de gua. Verter o lquido para um balo de Erlenmeyer. Deixar arrefecer ou arrefecer no frigorfico. Filtrar a gua de cozedura, atravs de papel de filtro, para uma proveta. Por cada 100ml juntar 2g de mel. Acertar a pH 7 com NaOH. Adicionar 4g de agar por cada 100ml. Autoclavar durante 20 min a 120C e 1 atmosfera, ou ferver durante o mesmo tempo numa panela de presso. Verter para caixas de Petri junto chama, e deixar arrefecer.

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4.4.2. Preparao de solues de antibiticos

4.4.2.1. Ampicilina

Material
Medicamento: AMPLIFAR para 250ml de Suspenso oral (50mg de Ampicilina/ml), Tecnifar gua esterilizada Pipetas Execuo Tubos de ensaio (Trabalhar junto chama) Balana de preciso Pesar 2g do medicamento em p. Chama Numerar 4 tubos de ensaio de 1 a 4. Colocar 10ml de gua esterilizada no tubo 1 e 9 ml nos restantes. Colocar os 2g de medicamento no tubo 1 e agitar bem. Utilizar pipetas diferentes nos passos seguintes: Pipetar 1ml do tubo 1 para o tubo 2 e agitar bem. Pipetar 1ml do tubo 2 para o tubo 3 e agitar bem. Pipetar 1ml do tubo 3 para o tubo 4 e agitar bem. No tubo 4 estar uma soluo final com 28Pg/ml de ampicilina.

4.4.2.2. Bacitracina

Material
Medicamento: BACITRACINA zimaia pomada (500U de Bacit./g), 10g, Laboratrio ZIMAIA gua esterilizada Copo de precipitao pequeno Pipeta Vareta Tubo de ensaio Balana de preciso Execuo Chama (Trabalhar junto chama) Pesar 1g do medicamento para o copo de precipitao. Juntar 10ml de gua esterilizada e mexer bem com a vareta. Passar os 10ml para um tubo de ensaio. No tubo estar uma soluo final com 50 U/ml de bacitracina.

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4.4.2.3.Cloramfenicol

Material
Medicamento: CLOROCIL colrio (8mg de cloramfenicol/ml), 5ml, EDOL gua esterilizada Pipetas Tubos de ensaio Chama

Execuo
(Trabalhar junto chama) Encher 2 tubos com 9ml de gua esterilizada. Utilizar pipetas diferentes nos passos seguintes: Pipetar 1ml do medicamento para um tubo (tubo 1) e agitar bem. Pipetar 1ml do tubo 1 para o tubo 2 e agitar bem. No tubo 2 estar uma soluo final com 80Pg/ml de cloramfenicol.

4.4.2.4. Penicilina

Material
Medicamento: Prevecilina forte suspenso injectvel (1.000.000 UI de penicilina/3ml), Grunenthal gua esterilizada Pipetas Execuo Tubos de ensaio (Trabalhar junto chama) Balana de preciso Pesar 0,5g do medicamento em p. Chama Numerar 4 tubos de ensaio de 1 a 4. Colocar 10ml de gua esterilizada no tubo 1 e 9 ml nos restantes. Colocar os 0,5g de medicamento no tubo 1 e agitar bem. Utilizar pipetas diferentes nos passos seguintes: Pipetar 1ml do tubo 1 para o tubo 2 e agitar bem. Pipetar 1ml do tubo 2 para o tubo 3 e agitar bem. Pipetar 1ml do tubo 3 para o tubo 4 e agitar bem. No tubo 4 estar uma soluo final com 50 UI/ml de penicilina

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4.4.2.5. Tetraciclina

Material
Medicamento: Cloridrato de TETRACICLINA cpsulas (500mg de tetraciclina/cpsula) Laboratrio da F. M. do Nascimento gua esterilizada Pipetas Tubos de ensaio Balana de preciso Chama

Execuo
(Trabalhar junto chama) Numerar 3 tubos de ensaio de 1 a 3. Colocar 10ml de gua esterilizada no tubo 1 e 9 ml nos restantes. Colocar uma cpsula do medicamento no tubo 1, esperar que esta se desfaa e agitar bem. Utilizar pipetas diferentes nos passos seguintes: Pipetar 1ml do tubo 1 para o tubo 2 e agitar bem. Pipetar 1ml do tubo 2 para o tubo 3 e agitar bem. No tubo 3 estar uma soluo final com 500Pg/ml de tetraciclina.

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4.4.3. Preparao do antibiograma 4.4.3.1. Inoculao de clulas de Bacillus cereus IP 5832 em meio para antibiogramas

Material
Medicamento: Bactisubtil (Bacillus cereus IP 5832) cpsulas, Hoechst Marion Roussel gua esterilizada Pipetas Tubo de ensaio Placa com meio slido Copo de vidro com vareta de vidro em L, mergulhada em lcool Chama

Execuo
(Trabalhar junto chama) Colocar uma cpsula do medicamento no tubo de ensaio com 5ml de gua esterilizada, esperar que esta se desfaa e agitar bem. Pipetar 0,1ml da suspenso para o meio contido na placa. Espalhar, com a vareta de vidro previamente esterilizada com lcool, inflamada chama e arrefecida no interior da placa.

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4.4.3.2. Elaborao e colocao dos discos de antibiticos

Material
Papel de filtro Furador Lpis Solues de antibiticos Placa com cultura fresca de Bacillus cereus Pina gua destilada Chama

Nota. Existem no mercado discos embebidos em antibiticos que podem adquirir-se no comrcio de produtos qumicos e colocar-se directamente sobre a placa previamente inoculada.

Execuo
(Trabalhar junto chama) Furar o papel de filtro com o furador. Aproveitar 5 dos discos obtidos, e marcar a lpis cada um com as seguintes letras: A - ampicilina B - bacitracina C - cloramfenicol P penicilina T - tetraciclina Colocar uma gota do antibitico correspondente sobre cada um deles (Fig. 14). Colocar os discos (papelinhos) na placa j inoculada, na ordem A, B, P, C, T, tendo o cuidado de lavar bem a pina com gua destilada entre a colocao de cada papelinho, pois existe a possibilidade de se misturarem os antibiticos. Aps 24 horas, observar e interpretar.

Figura 14. Elaborao de antibiogramas.

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5. Sugestes para a adequao da execuo dos trabalhos


5.1. Ensino Bsico
5.1.1. Leveduras Observar fermento de padeiro vista desarmada, notando e registando a cor e a consistncia. Observar ao microscpio: numa lmina pr uma gota de gua e adicionar, com um palito ou alfinete, um poucochinho do fermento de padeiro (a levedura Saccharomyces), de maneira a que a gua adquira uma leve turvao; cobrir com lamela e seguir as instrues de utilizao do microscpio. Registar as observaes com auxlio de desenhos. Fazer placas de isolamento em meio de mel. Incubar, com a tampa para baixo, temperatura ambiente at haver crescimento (2 a 7 dias, ou mais, conforme a temperatura, respectivamente de 30C a 10C). Observar a forma e cor das colnias, logo que sejam visveis, e seguir o seu crescimento, registando as observaes. Estimular a ateno dos alunos para o tamanho relativo das vrias colnias na mesma placa, e tentar interpretar [em termos de diferenas das leveduras que originaram cada colnia, e da abundncia de nutrientes]. Observar ao microscpio, em gotas de gua separadas, as leveduras retiradas da margem duma colnia e as do centro. Comparar, notando que nas da margem se observam leveduras grandes (leveduras-mes) com outras mais pequeninas agarradas a elas (leveduras-filhas ou gmulas). assim que as leveduras, que so seres vivos, se multiplicam. Preparar massa de po farinha e gua em duas pores, juntando um pouco de fermento a uma das pores. Observar a evoluo da massa e tentar explicar em termos da actividade das leveduras: fabricam gs que torna a massa mais leve. 5.1.2. Bactrias do iogurte Observar um pouco de iogurte ou, simplesmente, uma gota da sua parte lquida, fazendo um esfregao e deixando secar ao ar, ou cobrindo a gota com uma lamela. Procurar bactrias redondas (Streptococcus) e bactrias alongadas (os mais raros Lactobacillus). Pr leite em dois copos (de iogurteira ou outros) e juntar um pouco de iogurte a um deles. Incubar na iogurteira ou deixar temperatura ambiente, e observar no dia seguinte, descrevendo as observaes. Comparar e tentar explicar as diferenas pela multiplicao e actividade das bactrias. Observar ao microscpio um pouco do contedo de cada um dos frascos. Verificar se essa observao apoia a explicao que foi dada. 5.1.3. Halobactrias do bacalhau Observar as manchas vermelhas e as bactrias ao microscpio, numa gota de gua salgada.

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5.1.4. Antibiogramas Fazer, de maneira simplificada, em tempo quente, temperatura ambiente. Chamar a ateno para a especificidade dos antibiticos e para a necessidade de realizar antibiogramas antes de aplicar antibiticos no tratamento de doenas infecciosas.

5.2. Ensino Secundrio


Todos os trabalhos podem realizar-se neste nvel de ensino. Os professores escolhero e adequaro os trabalhos, segundo as necessidades especficas de programa e tempo disponvel.

6. Avaliao comportamental
Um manual, como este, que resultou dum projecto aberto, no est necessariamente terminado. A aplicao mais generalizada dos protocolos sugeridos pode conduzir preparao de exerccios prticos experimentais e de exerccios de inqurito cientfico, a utilizar junto dos alunos que realizaram os trabalhos, para avaliar comportamentalmente em que medida os objectivos foram atingidos. Estes exerccios tero de ser obviamente adequados a cada nvel de aprendizagem. Espera-se que da advenha eventual reformulao de estratgias, e adio de objectivos que se revelarem decorrentes.

Sugesto de tarefas: Avaliar, fundamentadamente, as experincias levadas a cabo. Recordar resultados ou descrever outros relacionados com os assuntos em estudo. Apresentar hipteses alternativas (devidamente formuladas), pedindo aos estudantes para escolher as que so apoiadas pelas observaes. Levar os alunos a formular os conceitos, estimulando-os a darem explicaes simples, distinguindo sempre entre observaes e ideias explicativas. Construir exerccios de inqurito, com base em sequncias experimentais encadeadas, e intervaladas de questes pertinentes. Estimular a resoluo de problemas, que vo surgindo, atravs de planeamentos experimentais simples. Pedir a elaborao de protocolos explicitamente destinados a objectivos especficos, por modificao de protocolos conhecidos.

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6.1. Exemplo de exerccio, a utilizar no ensino secundrio


A orientao conduzida pelo professor. Entre parnteses rectos, esquematizam-se respostas possveis de dar pelos estudantes, que devem discutir-se, possibilitando a continuao do exerccio. 6.1.1. Coexistem, presentemente, trs sistemas de classificao para os seres celulares a um nvel primrio: - classificao prtica reinos dos animais, das plantas, das algas, dos fungos, dos protozorios e das bactrias, correspondentes s disciplinas da biologia, respectivamente, zoologia, botnica, ficologia, micologia, protozoologia e bacteriologia; - classificao estrutural super-reinos dos eucariontes e dos procariontes; - classificao molecular domnios dos eucariontes, das eubactrias e das arquebactrias. 6.1.1.1. Procure informao respeitante aos fundamentos de cada uma destas classificaes. [classificao prtica: anatomia, fisiologia, diferenciao celular; classificao estrutural: complexidade de estrutura celular; classificao molecular: cidos nucleicos (principlamente rRNA) e protenas] 6.1.1.2. Coloque, nos grupos de cada microrganismos estudados neste trabalho.
leveduras bactrias do iogurte halobactrias do bacalhau classif. prtica fungos bactrias bactrias

uma

das

classificaes,

os

classif. estrutural eucariontes procariontes procariontes

classif. molecular eucariontes eubactrias arquebactrias

6.1.2. Encheram-se com leite seis boies de iogurte e inoculou-se uma colher de ch de iogurte em cada um de trs deles. Rolharam-se bem e incubaram-se os seis numa iogurteira, at ao dia seguinte. 6.1.2.1. Registaram-se as observaes seguintes: nos trs boies onde se inoculou iogurte, o leite coalhou, tendo-se produzido iogurte fresco, ao passo que nos outros trs o leite manteve-se lquido. Formule uma hiptese explicativa. [As bactrias do iogurte multiplicam-se no leite e transformam-no em iogurte] 6.1.2.2. O que necessrio fazer para fornecer novo apoio experimental a esta hiptese? [Observar ao microscpio amostras de todos os boies] 6.1.2.3. Quais os resultados esperados? [Bactrias em forma de esferas e em forma de cilindros nos boies com iogurte, e nenhumas bactrias nos outros]

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6.1.2.4. Estes resultados apoiariam ou refutariam a hiptese anterior? [Apoiariam] 6.1.2.5. Imaginemos que apareceu coalhado o leite contido num boio, noinoculado com iogurte, e deixado durante uma semana aberto, temperatura ambiente. Formulem uma hiptese para esta observao. [Houve contaminao com bactrias do iogurte] 6.1.2.6. Planeiem uma experincia que teste esta hiptese. [Observar a textura do leite coalhado, apreciar o cheiro e tambm fazer uma observao ao microscpio] 6.1.2.7. superfcie do leite havia uma mancha rugosa. Ao microscpio no se encontraram bactrias mas leveduras. A hiptese foi apoiada ou refutada? [Refutada] 6.1.2.8. Formulem outra hiptese que seja apoiada por todas as observaes (antigas e novas) respeitantes a este problema. [H contaminao com leveduras e a actividade delas coalha o leite] 6.1.2.9. O leite coalhado, contaminado com leveduras, poder ser consumido na alimentao? Porqu? [No, porque no sabemos de que leveduras se trata, nem as transformaes que produziram no leite] 6.1.2.10. Deixou-se que crescesse, durante mais uns dias, a tal colnia de leveduras contaminantes, e usou-se um pouco para inocular dois boies de leite fresco. Deixou-se um deles temperatura ambiente, desta vez tapado, e colocou-se o outro na iogurteira, durante trs dias. Que resultados esperamos? [Que aparea crescimento nos dois boies] 6.1.2.11. Somente no leite, que ficou temperatura ambiente, se encontrou formao de pelcula de leveduras, que foi apoiada por observao microscpica. No boio, que tinha sido deixado na iogurteira, no surgiram leveduras. Discuta estes resultados. [A temperatura da iogurteira alta demais para o crescimento daquelas leveduras] 6.1.2.12. Como poderemos testar esta hiptese? [Repetir esta ltima experincia, com um meio de cultura mais apropriado para leveduras, como suma de uva, pondo, desta vez tambm no frigorfico, um boio de sumo inoculado com leveduras, e boies de sumo mas sem leveduras s outras temperaturas: ambiente e iogurteira] 6.1.2.13. Qual o papel do sumo sem leveduras?[Controlo da experincia] 6.1.2.14. Que resultados so de esperar? [Que s haja crescimento de leveduras no boio onde elas foram inoculadas, e que ficou temperatura ambiente]

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6.1.2.15. Se forem esses os resultados, que generalizao podemos fazer, relativamente ao crescimento das leveduras em funo da temperatura? [A temperatura da iogurteira alta demais para o crescimento das leveduras e a temperatura do frigorfico baixa demais] 6.1.2.16. Como se comportaro as bactrias do iogurte s mesmas temperaturas. [Devem crescer bem na iogurteira, crescer menos tempertatura ambiente e no crescer no frigorfico] 6.1.2.17. Planeiem uma experincia que teste essas previses. [Boies de iogurte com leite, inoculados ou no com um pouco de iogurte, e deixados temperatura ambiente, na iogurteira, e no frigorfico] 6.1.2.18. Acham que as bactrias do iogurte resistiriam temperatura de 100C durante 5 minutos? [No] 6.1.2.19. Mas conhecem-se bactrias que tm formas de resistncia esporos resistentes a esse tratamento. Que importncia prtica tem o conhecimento destas formas de resistncia? [Na esterilizao de alimentos, como o leite, e na esterilizao de instrumentos cirrgicos] 6.1.2.20. Que informao retiraram deste exerccio, relativamente ao processamento de alimentos e sua conservao, para se manterem livres de micrbios? [Bem cozinhados e conservados no frigorfico]

6.1.3 Experimentaram-se os antibiticos penicilina, cloramfenicol e ciclo-heximida, separadamente, no crescimento de culturas de leveduras, de bactrias do iogurte e halobactrias do bacalhau. Os resultados foram os seguintes:
Leveduras Bactrias do iogurte Halobactrias do bacalhau Penicilina cresceram no cresceram cresceram cloramfenicol cresceram mal no cresceram cresceram ciclo-heximida no cresceram cresceram cresceram

6.1.3.1. Discuta os resultados luz dos alvos conhecidos para esses antibiticos: A penicilina inibe a sntese da parede das eubactrias, o cloramfenicol inibe a sntese proteica das eubactrias e das organelas dos eucariontes (mitocndrias e cloroplastos), e a ciclo-heximida inibe a sntese proteica dos eucariontes (citoplsmica). [Os resultados esto de acordo com o esperado; a inibio das mitocndrias das leveduras ainda permitiu algum crescimento com fermentao, uma vez que a respirao estaria bloqueada] 6.1.3.2. Qual dos sistemas classificativos, indicados em 1. apoiado pela aco dos antibiticos? [O molecular]

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6.1.3.3. Como se justifica a manuteno, presentemente, doutras classificaes? [Comodidade relativamente s disciplinas da biologia, estrutura das clulas, e importncia relativa que se d a certas caractersticas mais facilmente detectadas] 6.1.3.4. Esperaria produo de iogurte se se adicionasse penicilina ou cloramfenicol ao leite? [No] 6.1.3.5. E se se adicionassem esses antibiticos ao bacalhau seco salgado, ver-nos-amos livres das halobactrias? [No] 6.1.3.6. Que reaco seria de esperar das clulas animais (incluindo as humanas), em tratamentos com penicilina, contra infeces bacterianas? [Nenhuma, se no houver alergia] 6.1.3.7. E de tratamentos com cloramfenicol? [inibio da sntese proteica mitocondrial] 6.1.3.8. Em que caso se justificaria o tratamento com cloramfenicol? [Se a bactria infecciosa fosse resistente a todos os outros antibiticos que se conhece no terem efeitos secundrios]

7. Publicaes relacionadas para possvel consulta


A. Madeira Lopes e lvaro Fonseca. 1996. Biologia Microbiana. 183 pginas. Edio da Universidade Aberta, n94. A. Madeira Lopes, lvaro Fonseca, Joo Almeida, Alexandra Veiga, M. Conceio Loureiro Dias, Ana Vieira. 1997. Durao: 55 minutos. Videogramas de Biologia Microbiana. Edio da Universidade Aberta. lvaro Fonseca e Amndio Madeira Lopes. 2003. Biodiversidade, Captulo 1, pags. 331. In Nelson Lima e Manuel Mota (editores), Biotecnologia, 505 pag, Editora Lidel. John Postgate. 2002. Os micrbios e o homem (verso portuguesa de Margarida Guerreiro, reviso cientfica de A. Madeira Lopes), 372 pginas. Editora Replicao. Jos Batista Asceno. 1994. Elaborao de protocolos experimentais para o ensino de Cincias da Vida, utilizando fermento de padeiro, 129 pginas. Dissertao de Mestrado. Universidade do Minho, Braga. Wanda F. Canas Ferreira e Joo Carlos F. de Sousa (editores). 1998. Microbiologia, volume I, 342 pginas, Editora Lidel.

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