Autores: Alfredo Guilln, Carlos Benites, Nora Bravo

Alumno:

Grupo:

2007

MICROBIOLOGIA CLINICA

AUTORES AUTORIDADES Alfredo Guilln Oneeglio Mdico Cirujano Profesor Asociado Facultad de Tecnologa Mdica, Universidad Nacional Federico Villarreal. Jefe de Microbiologa, Laboratorio, Clnica San Borja. Carlos Benites Azabache Tecnlogo Mdico Magster en Microbiologa Profesor Auxiliar Facultad de Tecnologa Mdica, Universidad Nacional Federico Villarreal. Nora Bravo Cruz Biloga Profesor Asociado Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica, Universidad Nacional Federico Villarreal DIRECCION Facultad de Tecnologa Mdica Jr. Rio Chepn s/n, El Agustino Lima Per Telfono 3627578 Pagina Web: www.unfv.edu.pe Lic. Jos Bernala Uchuya Director de la Escuela Profesional de Laboratorio y Anatoma Patolgica Lic. Regina Medina Espinoza Decana Lic. Edix Noriega Secretaria Acadmica Lic. Haydee Chirinos Morante Jefe de Departamento Acadmico

MICROBIOLOGIA CLINICA

REGULACIONES INFORMACION GENERAL

Antes de cada sesin de trabajo se debe leer la gua de prctica y planificar el trabajo cuidadosamente. No empezar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones. La sesin de trabajo se iniciar con las instrucciones del profesor de prcticas. Si la informacin del instructor o del manual no estn claras, realice las preguntas adecuadas. Anote las observaciones cuando las realice. El examen prctico incluir la informacin que el profesor de prcticas le brindar, la del manual y la de sus propias observaciones y conclusiones. Responda y discuta las preguntas de la gua con su profesor de prctica, estas sern consideradas en el examen prctico.

REGLAS DEL LABORATORIO

Debe usar un mandil blanco o chaqueta, limpios cuando este en el laboratorio. Este debe ser lavado por lo menos una vez a la semana utilizando agua caliente y leja. No se permitir el ingreso o la permanencia de alumnos sin mandil o chaqueta. Antes de empezar y despus de trabajar limpie la mesa del laboratorio y cada vez que sea necesario (derrame de material contaminado). Coloque slo el material indispensable sobre las mesas de laboratorio. No colocar bolsas, ni mochilas u otro material que no sea del curso. Nunca utilice la boca para pipetear, el material puede ser txico o infeccioso. Esta PROHIBIDO comer, fumar o aplicarse cosmticos en el laboratorio. Lvese las manos con agua y jabn antes de retirarse del laboratorio. Colocar el material contaminado en envases apropiados y estos deben ser esterilizados al terminar las prcticas, siendo de responsabilidad del grupo correspondiente de acuerdo al cronograma. Algunos de los reactivos y los microorganismos con que se trabajan son peligrosos. Use guantes o mascarillas descartables cuando sea necesario y siga las instrucciones del profesor de prcticas. Reporte todos los accidentes o derrames, incluso los menores, al instructor. Estos reportes no sern tomados en cuenta para la nota pero son importantes para tomar medidas de bioseguridad para todos y evitar la repeticin de los accidentes.

MATERIAL NECESARIO (para todas las prcticas) El alumno debe contar con el siguiente material para el desarrollo de las prcticas:

Gua de prcticas (obligatorio) Desinfectantes: Alcohol 70%, fenol al 5% Jabn lquido y toallas de papel

MICROBIOLOGIA CLINICA Material de escritorio: Marcador de tinta indeleble, lpiz de cera, caja de colores, papel kraft. Material de limpieza: detergente, escobillas. Material de laboratorio: lminas portaobjetos y cubreobjetos, asa de siembra y aguja de cultivo. Equipos: mechero Bunsen, microscopio compuesto, estufa, autoclave, balanza y refrigeradora. Set de colorantes de Gram, agua destilada y suero fisiolgico estril.

MICROBIOLOGIA CLINICA PRACTICA 1: COPROCULTIVO OBJETIVO

Conocer el procedimiento para es aislamiento e identificacin de las bacterias patgenas que producen enfermedad diarreica aguda. Los agentes etiolgicos bacterianos de las infecciones intestinales agudas en el hombre pueden ser determinados mediante el cultivo de heces o coprocultivo. Dentro de la Familia Enterobacteriaceae se conocen como enteropatgenos a los incluidos dentro de los gneros: Salmonella, Shigella, Escherichia. As mismo dentro de la Familia Vibrionaceae, a algunas especies del gnero Vibrio. MATERIAL POR GRUPO 2 Hisopos de mango largo, estriles 1 Agar TCBS Sacarosa): 1 T Caldo Selenito 5 Agar Triple Sugar Iron Reactivo de oxidasa 5 Medio SIM

INTRODUCCION

1 Tubo Agua Peptonada Alcalina 1 Agar XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato) 1 Agar SS (Salmonella Shigella Agar): 1 Agar tripticasa soya en tubos 15x 125 5 Agar Lisina Iron LIA Desoxicolato de Sodio al 0.5% 5 Agar Citrato de Simmons

1 tubo con Medio de Transporte Cary y Blair (Tiosulfato-Citrato-Bilis-

PROCEDIMIENTO: 1 Da

Obtencin de la muestra de heces por hisopado rectal, en medio de transporte Cary y Blair. Se siembra la muestra en agar XLD agar por agotamiento. Colocar el hisopo en: tubo de APA y tubo de caldo selenito donde se deja el hisopo. Colocar las placas y los tubos en la incubadora a 37C x 24 h. Seleccionar colonias sospechosas de Salmonella o Shigella del medio de XLD, repicarlas en TSI-LIA. h. Sembrar en agar TCBS a partir del caldo peptonado alcalino. Sembrar en agar SS a partir del Caldo selenito. Incubar tubos y placas a 37C x 18-24 h. Seleccionar colonias sospechosas de Vibrio del agar TCBS y Salmonella en agar SS, repicarlas en TSI-LIA. Leer TSI-LIA, repicadas del XLD o el TCBS, sembrar las cepas sospechosas en TSA inclinado para confirmacin serolgica. Incubar a 37C 18-24 h. Incubar a 37C 18-24 h. Leer TSI-LIA, repicadas del medio SS agar, sembrar las cepas sospechosas en TSA inclinado para confirmacin serolgica.

2 Da

3 Da

4 Da

MICROBIOLOGIA CLINICA Realizar las pruebas confirmatorias de Vibrio cholerae Realizar serologa para las diferentes bacterias sospechosas.

MICROBIOLOGIA CLINICA PRACTICA 2: SECRECION DE VIAS RESPIRATORIAS MATERIALES

Placas de agar sangre Placas de agar Mac Conkey Colorantes de Gram Hisopos con punta de algodn Muestra de esputo purulento Jeringa de 3 mL con aguja 23 x 1

Placas de agar manitol salado Placas de agar chocolate Medios de aislamiento y de diferenciacin Bajalenguas Ratn de 15 a 30 g de peso Estuche de diseccin

PROCEDIMIENTO Da 1

Obtener una muestra de secrecin respiratoria de un paciente: esputo, secrecin faringea, secrecin nasofaringea. Inocular los medios de aislamiento. Realizar la coloracin de Gram de las muestras y su observacin Siembra de la muestra de secrecin farngea por el mtodo de la placa vertida

De la muestra de secrecin farngea, colocar el hisopo en 1 mL de TSB y se incuba a 37C por 2 h. Remover el hisopo del caldo, exprimirlo contra las paredes del tubo y colocarlo en un tubo estril. Licuar de 15 a 20 mL del agar base para sangre y mantenerlos en bao Mara a 50C. Agregar 1 mL de sangre desfibrinada de carnero al agar licuado. Del caldo incubado, transferir una asada (asa sacudida, seca) al tubo con el agar sangre. Homogeneizar bien y verter sobre una placa estril. Colocar un disco de cotrimoxazole (SXT) y uno de gentamicina en la placa de agar. Colocar la placa a 37C y en atmsfera de CO2 por 18 a 24 h.

Inocule por va intraperitoneal 0.5 mL de la suspensin de esputo a un ratn, a las 24 horas si este no ha muerto se proceder a sacrificarlo. Sembrar una placa de agar sangre y una placa de agar chocolate con la muestra de esputo, colocar un disco de gentamicina en la placa de agar sangre y un disco de bacitracina en la placa de agar chocolate. Incubar en atmsfera de CO2 a 35C. Observar y anotar la morfologa de las colonias, hacer la coloracin de Gram y observar los tipos de hemlisis. Identificar los aislamientos de acuerdo a los procedimientos aprendidos en el curso. Diferenciar flora normal de flora patgena Realice la diseccin del ratn, en el examen post morten es posible recuperar gran cantidad de neumococos de la cavidad peritoneal, realice extendidos. Separe el corazn y crtelo en

Da 2

MICROBIOLOGIA CLINICA dos, utilcelo para preparar extendidos y sembrar placas de Agar sangre. Coloree las lminas con coloracin de Gram y observe. Realice una coloracin con tinta china para observar la cpsula del neumococo.

MICROBIOLOGIA CLINICA PRACTICA 3: HEMOCULTIVO MATERIALES

Frascos de hemocultivo Tintura de Yodo Material para extraccin de sangre Medios de aislamiento y de diferenciacin

Jeringas descartables de 10 mL Alcohol yodado Algodn Solucin de yodo povidona

OBTENCION DE LA MUESTRA Da 1

Reunir todo lo necesario: jeringa, aguja, torniquete, gasas, alcohol 70, algodn, esparadrapo, contenedor resistente a punturas, y medio de cultivo. El nmero de la aguja depender del sitio de donde se tomar la muestra y del tamao de la vena. Escoger un brazo y aplicar una ligadura. Se escoge usualmente la vena ms prominente. Seleccionar el sitio de entrada en la vena. Si el rea visible de la vena es extenso (varios centmetros de longitud), el lugar de entrada debe ser la porcin ms gruesa de la vena. Si el rea visible es pequea (menos de dos centmetros), el lugar de entrada debe ser justo por debajo del rea visible. Limpiar cualquier rea sucia, desinfectar la piel en el sitio de insercin con un algodn con alcohol 70%. Frotar el rea escogida. Dejar secar. Si se palpa nuevamente la vena, volver a desinfectar el rea. Se debe limpiar la zona varias veces. Luego que el desinfectante haya secado, introducir la aguja en la vena con el bisel de la aguja hacia arriba. Mantener fijada la vena. La aguja debe mantenerse paralela y por encima de la vena, apuntando en la misma direccin del flujo sanguneo hacia el corazn. La aguja es mantenida en esta posicin de modo que se penetre la vena desde arriba y no del costado. Una vez que se ha penetrado en la vena, sacar la sangre aspirando con el mbolo lenta y sostenidamente. Luego de obtener la cantidad deseada de sangre, soltar la ligadura y colocar un pedazo de algodn sobre el sitio de insercin, manteniendo en su lugar la aguja. Retirar la aguja y presionar el algodn en el lugar hasta que la herida haya cerrado. Colocar un esparadrapo y mantener el brazo levantado por unos pocos minutos. Si el frasco de hemocultivo contiene un diafragma, esterilizar con povidona-yodo o alcohol 70% e inocular el medio. Hacer un movimiento de remolino con el frasco varias veces. Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las punturas. No volver a introducir la aguja en su estuche. Limpiar el diafragma del frasco de hemocultivo. Etiquetar el frasco apropiadamente con la identificacin del paciente, fecha, hora y lugar. Incubar el medio de cultivo a 37C. Realizar la coloracin de Gram de los cultivo positivos Identificar los aislamientos de acuerdo a los procedimientos aprendidos en el curso. Realice esquemas y dibujos de sus observaciones.

PROCESAMIENTO

MICROBIOLOGIA CLINICA DISCUTA LOS SIGUIENTES TEMAS CON SU PROFESOR DE PRACTICA 1. Que mtodos automatizados existen para hemocultivos 2. Que son las sustancias removedoras de antibiticos 3. Que condiciones especiales tiene los hemocultivos que se utilizan en el diagnstico de neumonas en nios. 4. Por que es importante una adecuada asepsia de la piel en la obtencin de la muestra 5. Como se realiza un hemocultivo para grmenes anaerobios 6. Como se realiza un hemocultivo para un paciente con SIDA con sospecha de infeccin por Mycobacterium avium 7. En que agentes bacterianos aislados de hemocultivo se deben tener las mximas precauciones de bioseguridad y cuales serian. 8. Cual es el tiempo de observacin que deben tener los frascos de hemocultivos inoculados.

MICROBIOLOGIA CLINICA PRCTICA 4: UROCULTIVO OBJETIVO Conocer los procedimientos para el diagnstico bacteriolgico de las infecciones del tracto urinario. CEPAS

Bacillus subtilis Frascos estriles Agar sangre Medio de Mueller Hinton Agar Cled o Brolacin Tubos 13 x 100 Hisopos con punta de algodn Pinzas

Muestras de orina Asa de cultivo calibrada 1 L Agar Mac Conkey Agar tripticasa soya Agar sangre Placas Petri estriles Discos de papel filtro estriles de 6 mm Discos de antibiticos

MATERIALES

PROCEDIMIENTO

Obtener una muestra de orina en un envase estril. Sembrar en agar sangre, agar Cled, agar sangre y agar Mac Conkey utilizando el asa calibrada. Realizar un recuento de colonias utilizando el mtodo de la placa vertida. Determinar la presencia de sustancias antibacterianas residuales. Hacer una suspensin de Bacillus subtilis a una concentracin similar a la escala de Mc Farland 0,5. Sumergir un hisopo en la suspensin y sembrar una placa de agar Mueller Hinton en tres direcciones. Sumergir un disco de papel estril en la orina del paciente y luego aplicarla en la superficie de la placa inoculada. Incubar a 37C por 24 horas. Medir el halo de inhibicin si se produce. Hacer un sedimento de orina y observarlo buscando: clulas epiteliales, leucocitos, cilindros, cristales, hemates y bacterias. Identificar los aislamientos de acuerdo a los procedimientos aprendidos en el curso e informar. Realizar un antibiograma usando discos de antibiograma apropiados para una infeccin urinaria.

DISCUTA LOS SIGUIENTES TEMAS CON SU PROFESOR DE PRCTICA: 1. Como se realiza una adecuada obtencin de muestra? 2. Que son los cilindros, como se producen y que tipos hay?

MICROBIOLOGIA CLINICA 3. A que se denomina leucocituria y cuales son sus causas? 4. Que importancia tiene la observacin de cristales? 5. Que otras pruebas se utilizan para demostrar la presencia de infeccin urinaria? 6. Que indica la presencia de bacterias en una muestra obtenida para un examen completo de orina y en otra muestra obtenida para urocultivo. 7. Cuales son los antibiticos utilizados para tratar la infeccin urinaria.

MICROBIOLOGIA CLINICA PRACTICA 5: CULTIVO DE SECRECION VAGINAL OBJETIVO Conocer los procedimientos para el diagnstico de las infecciones vaginales. MATERIALES

Agar sangre humana Agar Mac Conkey Agar Saboraoud dextrosa Secrecin vaginal en medio de transporte Extensin en lmina portaobjetos. Algodn Cinta para medir pH

Agar chocolate Agar manitol salado Agar chocolate Secrecin vaginal en suero fisiolgico Alcohol KOH al 10% Medios de aislamiento y de diferenciacin

PROCEDIMIENTO Da 1

Realizar un examen directo de la muestra en suero fisiolgico; buscar la presencia de:

Clulas epiteliales Leucocitos Hemates. Hongos en forma de levaduras Trichomonas vaginalis. Flora de Doderlein Clulas clave Clue cells Bacterias y hongos agar sangre humana agar Mac Conkey agar manitol salado Agar chocolate Agar Saboraoud dextrosa

Hacer la coloracin de Gram en la lmina, buscar la presencia:

Cultivar la muestra en:

Colocar en jarra de acuerdo a la placa sembrada Identificar los aislamientos de acuerdo a los procedimientos aprendidos en el curso.

ANOTE SUS RESULTADOS