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Taller de identificacin de Levaduras y Dermatofitos

Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON Instituto Nacional de Salud del Nio Universidad Nacional Federico Villarreal

CASO 1 Absceso abdominal

Mujer de 33 aos Dx. Adenocarcinoma colorectal infiltrante
Metstasis hepticas

Amputacin abdominoperineal, fiebre

Meropenem y vancomicina, no responde

TAC, Absceso, drenaje 25 cc. exudado seropurulento Microbiologa

PMN, levaduras y BGN

Adicion al tto. fluconazol 400 mg/da

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CASO 1 Absceso abdominal

Proteus vulgaris y Saccharomyces cerevisiae 7 das de tto., fiebre
2 muestras, S. cerevisiae
Solicitan sensibilidad Cambia fluconazol por anfotericina B liposomal 10 das
Voriconazol oral, 4 semanas CMI (mg/L) anfotericina B (1,0), fluconazol (64), itraconazol y ketoconazol (0,25), 5-fluorcitosina (0,125) y voriconazol (0,5)

CASO 1 Absceso abdominal

1. Cules son las caractersticas microbiolgicas para su identificacin? Levadura ascomiceta, crecimiento rpido Identificacin:
Chromagar Candida, violeta Crece en ASD 2%, no en Micobiotic Morfologa, pseudohifas cortas Fisiologa, sistemas comerciales (API 20C Aux) Formadora de ascosporas

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CASO 1 Absceso abdominal

2. Qu utilidades tiene este hongo? Industria
Pan, vino y cerveza S. boulardii, subespecie, probitico
Tto. disbacteriosis y diarreas asociadas a Clostridium difficile
proteasas que digieren toxinas A y B

CASO 1 Absceso abdominal

3. Puede ser considerado S. cerevisiae un hongo inofensivo? Parte de la microbiota intestinal, boca y TGU Patgeno
Vaginitis recurrentes, inmunocompetentes Atraviesa mucosa intestinal, infecciones invasivas Necrosis y reaccin granulomatosa en tejidos

Crece a 37C y forma pseudohifas

deleccin del gen SSD1
Codifica protena que afecta procesos celulares y crecimiento a altas temperaturas

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CASO 1 Absceso abdominal

4. En qu tipo de infecciones est involucrado S. cerevisiae? Vaginitis recurrente, unmunocompetentes Infecciones invasivas Fungemias, mecanismos
Traslocacin a travs de barrera intestinal Colonizacin masiva en enfermos crticos Inoculacin venosa (manipulacin y contaminacin de CVC)
Reconstitucin de liofilizados de S. boulardii

CASO 1 Absceso abdominal

5. Fue adecuado el tratamiento emprico prescrito? Qu sensibilidad tiene S. cerevisiae a los antifngicos? Cul es el tratamiento de eleccin? Tto. inicial inadecuado
Sensibilidad disminuida a azoles, excepto voriconazol intrnsecamente resistentes a caspofungina
Sobreexpresin de protena Sbep del aparato de Golgi, codificada por gen GAL1
Regula mecanismos de transporte de componentes hacia pared fngica

Anfotericina B, 5-fluorcitosina y voriconazol, excelentes

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Mtodos de identificacin de levaduras

Lic. Roberto E. Rojas Len Instituto Nacional de Salud del Nio rerojasle@yahoo.com

Identificacin Fenotpica de Levaduras

Mtodos Clsicos Mtodos Comerciales Mtodos Automatizados

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Mtodo Convencional

09/10/2005

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09/10/2005

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IDENTIFICANDO LEVADURAS

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CHROM Agar: excelente alternativa Coinfeccin

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Easy Steps Diagram

Agares Cromognicos. Costo efectividad

$ 800 $ 1 X PLACA

$ 1000

$ 2 X PLACA

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Test de la ureasa
Evala la capacidad de una levadura de sintetizar ureasa, hidrolizando la rea, alcaliniza el medio virndolo de amarillo a rojo

Prueba del Tubo Germinativo

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Tubo Germinativo
Evaginacin polar de una levadura en su transicin de levadura a hifa, cuyo primer septo se ubica aproximadamente a 2 m de la clula madre Condiciones experimentales:
Nutrientes, suero humano, plasma, etc. Concentracin celular, no ms de 105 cl/ml Temperatura de incubacin, 35 C Tiempo de incubacin, 2 hrs.

septo

Tubo Germinativo

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Morfologa de levaduras: Tcnica de Dalmau

Agar harina de maiz con tween 80
Agar arroz

Incubacion de 48-96 hrs, a temperatura ambiente

Dr. Patricio Godoy

Inoculacin del Agar Harina de Maz con Tween 80

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blastosporas

pseudohifas

hifas

clamidosporas

artrosporas

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Candida albicans: blastosporas, pseudohifas, hifas y clamidosporas

Produccin de clamidosporas por C. albicans

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Yeast Name: Asexual State: Other names given to this strain:

Trichosporon asahii

Geotrichum infestans, Mycoderma infestans, Proteomyces infestans, Sporotrichum infestans, Trichosporon cutaneum var. infestans, Trichosporon cutaneum var. peneaus, Trichosporon figueirae, Trichosporon infestans, Trichosporon loboi

CBS Number: NCYC Number: Other Collection Equivalent: Cell type: Growth Medium Growth Conditions: Incubation temperature: Optics: Other information:

CBS2479 NCYC2677 IGC3469, JCM2466, UAMH7654 Cells Yeast Nitrogen Base + 25 mM-D-glucose ~ 20 h, to A640 = 0.06. 25 oC DIC

Trichosporon asahii CBS 2479

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Yeast Name: Asexual State:

Trichosporon asahii

Other names given to this strain:

Geotrichum infestans, Mycoderma infestans, Proteomyces infestans, Sporotrichum infestans, Trichosporon cutaneum var. infestans, Trichosporon cutaneum var. peneaus, Trichosporon figueirae, Trichosporon infestans, Trichosporon loboi

CBS Number: NCYC Number: Other Collection Equivalent: Cell type: Growth Medium

CBS5286

JCM2943 Filaments Potato glucose agar

Growth Conditions:
Incubation temperature: Optics: Other information:

16 days
20 oC Bright field

Candida lusitaniae

Clavispora lusitaniae

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Caracteres bioqumicos de levaduras

o Permite diferenciacin a nivel de especie. o Caractersticas metablicas inherentes a cada espcie de levadura.

Asimilacin de carbohidratos (Auxanograma)

o Capacidad de las levaduras de asimilar carbohidratos como nica fuente de carbono

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Fermentacin de carbohidratos (Zimograma)

Capacidad de la levadura de utilizar determinado carbohidrato para la produccin de energa en baja tensin de O2 con produccin de etanol y CO2 6 azcares (dextrosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, galactosa). Visualizacin de formacin de CO2 en tubos de Durham invertidos.

Dr. Patricio Godoy

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S. cerevisiae. Ascas conteniendo ascosporas

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Saccharomyces cerevisiae
Ascas con ascosporas

Saccharomyces cereviciae ASCA MOSTRANDO EN SU INTERIOR 2 ASCOSPORAS Coloracin ZN

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C. albicans vs. C. dubliniensis

Caldo Sabouraud hipertnico
Cal. desarrolla; Cdub. no desarrolla

Desarrollo a 45C
Cal. desarrolla; Cdub. no desarrolla

Agar cscara semilla de girasol

Cal: colonias lisas sin produccin de clamidosporas Cdub: colonias rugosas con formacin de clamidosporas

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Agar cscara semilla de girasol

Indian Journal of Medical Microbiology, (2005) 23 (3):182-185

CASO 2
1. Por las caractersticas microbiolgicas descritas en el caso, podra identificar la especie de levadura? Podra, al menos, descartar algunas especies? Candida spp., crecimiento rpido (24 h)
Crecimiento lento, mas de 72 h
Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Geotrichum, Galactomyces

Se descarta por macroscopa

Rhodotorula

Se descarta por examen microscpico

Cryptococcus.

Probables por macroscopa y examen microcpico

Trichosporon, Galactomyces y Geotrichum.

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CASO 2
2. Qu pruebas microbiolgicas se emplean para confirmar la especie de un aislado clnico de levaduras productoras de artroconidias? Para distinguir entre las tres especies de artroconidiales (Trichosporon, Galactomyces y Geotrichum) se necesita
estudio morfolgico pruebas bioqumicas tcnicas complementaria

Sistemas comerciales y produccin de ureasa

CASO 2
3. Si la enferma no hubiera fallecido, qu tratamiento antifngico hubiera recomendado? Anfotericina B lipdica a dosis mximas
5 mg/kg/da, por expertos

Trichosporon spp., in vitro resistentes a anfotericina B

Voriconazol o combinacin de antifngicos

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CASO 2
4. La cepa fue identificada como Trichosporon inkin das despus. Existe alguna particularidad sobre el perfil de sensibilidad de las especies de Trichosporon que deba conocerse? T. asahii, es realmente resistente in vitro a la anfotericina B.

Datos de 31 cepas clnicas probadas en el Servicio de Micologa del Centro Nacional de Microbiologa del Instituto de Salud Carlos III.

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CASO 2
5. Qu sabe de las endocarditis por Trichosporon? Son similares a las descritas por otras especies de levaduras Las publicaciones en su mayora reportadas como T. beigelii (?) Periodo de implantacin y sintomatologa, variable
2 meses hasta 7 aos

Tto. en la mayora de pacientes

recambio valvular y anfotericina B
Mortalidad superior al 80%

Por ello
diagnosticar precozmente las infecciones fngicas invasoras Identificacin a nivel de especies

DERMATOFITOSIS y su Diagnstico Micolgico

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CASO 3 Tinea barbae profunda

CASO 3
1. Cul parece el diagnstico en este caso? Tinea barbae de tipo inflamatorio o tinea barbae profunda
pequeos abscesos foliculares en la zona de la barba y el bigote, en la cara y cuello, acompaados o no de inflamacin local veterinarios, agricultores, ganaderos y personal de laboratorio

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CASO 3
2. Cul sera la etiologa ms probable? Dermatofitos zooflicos Trichophyton mentagrophytes, T. verrucosum, T. interdigitale y Microsporum canis

CASO 3
3. Qu metodologa seguiremos para establecer el diagnstico microbiolgico? Toma de muestra, pelos afectados KOH 20%, hifas y artroconidias Cultivo, ASD 2% y A. Micobiotic, T Amb.
Macroscopa Microscopa

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CASO 3
4. Qu tratamiento est indicado en este paciente? Griseofulvina, ketoconazol, itraconazol o terbinafina Terbinafina (250 mg/da durante 4 semanas)

TIAS - TOPOGRAFIA

Pedis Manuum Corporis Imbricata Cruris Barbae Capitis Fvica Unguium

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Tia faciei
Regin no barbada de la cara Trichophyton tonsurans, T. rubrum y Microsporum canis

International Journal of Dermatology,2004, 43:437 440

Tia corporis del gladiador

J Am Acad Dermatol 2000;43:1039-41

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Especies de Dermatofitosis en Humanos segn Habitat

Antropoflico Zooflico
E. floccosum M. audouinii T.rubrum T. schoenleinii T. tonsurans M. canis M. gallinae M. nanum T. mentagrophytes T. verrucosum T. equinum

Geoflico
M. gypseum M. fulvum M. nanum T. ajelloi T. terrestre

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Patogenia

Journal of Infection; 48:175-180, 2004

J Am Acad Dermatol 2000;43:641-8

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J. Am Acad Dermatol 2003;49:193-7

J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

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J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

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J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

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J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

J Am Acad Dermatol 2004;50:748-52

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Revista Instituto de Salud del Nio, 2(2):73-75; 2002

Revista Instituto de Salud del Nio, 2(2):73-75; 2002

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Revista Instituto de Salud del Nio, 2(2):73-75; 2002

Aislamiento e Identificacin de Dermatofitos

Toma de Muestra

Examen directo

Aislamiento Primario

Identificacin

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TOMA DE MUESTRA

Tcnica de Mackenzie

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TOMA DE MUESTRA

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EXAMEN DIRECTO

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Artefactos
fungus mosaico
Depositos de colesterol Semejan hifas tabicadas
angulosas

Artefactos
Glbulos de mielina

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IMPRONTA COLOREADA CON COLORANTE DE KANE

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Agar Dermatophyte Test Medium

DTM

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Microsporum canis

Microsporum canis
Morfologa macroscpica Las colonias son granulosas a vellosas con borde plumoso, blancas a color cuero y caractersticamente tienen una coloracin amarillo limn o amarillo anaranjado en la periferia que suele difundir hacia el medio

Morfologa microscpica Presenta macroconidias multicelulares con paredes rugosas, fusiformes con extremo terminal algunas veces curvo, poca o ninguna produccin de microconidias.

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Microsporum gypseum

Microsporum gypseum
Morfologa macroscpica Produce colonias granulosas de color canela y consistencia yesosa. Morfologa microscpica Las macroconidias son multicelulares con paredes rugosas; los extremos terminales son redondeados. Las microconidias pueden haberlas, en forma aislada o en pequeos racimos.

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Trichophyton mentagrophytes

Trichophyton mentagrophytes
Morfologa macroscpica Desarrolla colonias vellosas o granulosas, con produccin de un pigmento rojizo particularmente escaso preferentemente cuando crece sobre AHM.
Morfologa microscpica Microconidias esfricas, a menudo producidas en racimos. Generalmente con poco produccin de macroconidias, multicelulares, de paredes lisas con forma de cigarro y una insercin estrecha evidente en la base. Tambin puede verse produccin de hifas en espiral.

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Trichophyton rubrum
a, e. Ramificacin con macroconidia b, c, f. Ramificacin con microconidia g. Macroconidia d, i. macroconidia convertida en cadena de clamidosporas h. Conidias rtricas
Hoog, G.S. de 2000, Atlas of clinical fungi, ed.2

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Trichophyton rubrum
Morfologa Macroscpica Colonias generalmente vellosas; abundante pigmento rojo-vino que difunde en el medio.

Morfologa Microscpica Presenta microconidias pequeas, en forma de lgrima, a menudo ubicados lateralmente a lo largo de las hifas. Escaso nmero de macroconidias, multinucleares, de paredes lisas en forma de lpiz y adheridos directamente a las hifas.

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Trichophyton tonsurans

a. b. c. d. e.

Microconidia joven Microconidia madura con macroconidias dispersas y clulas infladas Microconidia Macroconidia Clulas semejantes a clamidosporas
Hoog, G.S. de 2000, Atlas of clinical fungi, ed. 2

Trichophyton tonsurans
Morfologa macroscpica La colonia al inicio por lo general es plana, algo polvorienta, talo amarillento con mas o menos un rojo caoba descolorido. Desarrollando en los bordes una zona agamuzada la cual vara de un blanco crema a un grisceo o beige pardo algunas veces con tinte rosado. En el envs de la colonia se produce un pigmento que puede difundir hacia el medio de color oscuro a marrn rojizo.

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Trichophyton tonsurans
Morfologa microscpica Las microconidias son el rasgo mas caracterstico. Ellas usualmente son abundantes y largas o de tamao variable, en forma de lgrima o palo de golf que parten de hifas engrosadas. Las microconidias tienden individualmente a tener la forma de baln o en clavas. Las formas de baln agrupadas ocasionalmente pueden ser vistas en T. rubrum y T. mentagrophytes. Las macroconidias son de pared un poco gruesa, usualmente de forma menos perfecta que T. mentagrophytes y romos que T. rubrum.

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Epidermophyton floccosum

Epidermophyton floccosum
Morfologa macroscpica Las colonias son algodonosas (flocosas), inicialmente blancas, tomando una coloracin caqui verdosa con el tiempo. Morfologa microscpica Las macroconidias son grandes, en forma de palo de golf, multicelulares, de pared lisa y ubicados en forma aisladas o en racimos de dos o tres. No hay formacin de microconidias.

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Epidermophyton floccosum

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Epidermophyton floccosum

CASO 4

Figura 5. Corte histopatolgico teido con PAS, x200.

Figura 6. Preparacin montada en azul lactofenol del cultivo obtenido a partir del ndulo cutneo, x400

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CASO 4
1. De qu micosis se trata? dermatofitosis generalizada con ndulos subcutneos

CASO 4
1. Cul es el agente etiolgico de esta micosis y dnde debe haber estado radicada la infeccin primaria? El agente causal fue Trichophyton rubrum Foco inicial debe
planta de los pies
uas de los pies
uas de las manos

Onicomicosis subungueal distal y proximal en manos y pies

infeccin por dermatofitos
T. rubrum

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CASO 4
1. Con qu supone Ud. que fue tratado este caso y qu tratamiento empleara actualmente? En la actualidad, Terbinafina a razn de 250 mg/da durante varios meses (indicacin mdica).

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