RESUMEN

La cromatografa en columna es una tcnica de separacin, generalmente usada para compuestos orgnicos, que tiene el mismo principio que la cromatografa en papel y en capa fina, ya que para la separacin de los componentes de la sustancia, se juega con su polaridad. El proceso consiste en llenar una columna de vidrio o plstico, como lo fue en este caso, con un soporte slido adsorbente que fue la fase estacionaria, almina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase mvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin Se logr separar 15ml de la fase verde correspondiente a clorofilas y 10ml de una fase amarilla clara, correspondiente a carotenos. Se determin que las longitudes de onda mximas experimentales para la clorifila fue de 630nm y entre 415-435nm para los carotenos.

MARCO TEORICO
Cloroplastos Los cloroplastos son los organelos en donde se realiza la fotosntesis. Estn formados por un sistema de membranas interno en donde se encuentran ubicados los sitios en que se realiza cada una de las partes del proceso fotosinttico. Los cloroplastos son plastidios que contienen los pigmentos verdes clorofila a y b, as como carotenoides de color anaranjado y xantofilas amarillas, son caractersticos de los seres fotoauttrofos, que poseen la maquinaria enzimtica para transformar la energa solar en energa qumica, a travs de la fotosntesis Figura 1. Espectro de absorcin ptica de la clorofila como grafico de porcentaje de absorcin versus la longitud de onda. La clorofila a, se muestra en rojo y la clorofila b en azul.

Fuente: bibliografa 1. Clorofilas La clorofila: Es una porfirina, contiene un tomo de magnesio en el centro del anillo de porfirina. Contiene radicales especficos unidos al anillo de porfirina, as como una molcula hidrofbica de un alcohol de cadena larga. La clorofila se asocia con lpidos y
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protenas hidrofbicas de las membranas fotosintticas mediante esta cadena lateral del alcohol. Se localiza en la membrana de los tilacoides dentro de la clula. Existen dos, clorofila a y clorofila b y se distinguen por sus diferentes espectros de absorcin. Clorofila a :Es de color verde porque absorbe con preferencia la luz roja y la azul y transmite la luz verde. Muestra una fuerte absorcin de la luz roja (absorcin mxima a una longitud de onda de 680nm) y de la luz azul (mximo a 430nm). Esta clorofila se encuentra en los procariotas y las bacterias.

Clorofila b: Tiene una absorcin mxima de 660nm en vez de 680 Carotenos y Xantofilas El -caroteno, es el carotenoide ms abundante en la naturaleza y el ms importante para la dieta humana, por lo que da su nombre a todo un grupo de compuestos bioqumicos. El espectro de absorcin del -caroteno muestra dos picos de absorcin entre los 400 nm y 500 nm, correspondiente al azul y verde, por lo que la luz roja-anaranjadaamarilla que refleja le proporciona su color caracterstico. En general, el contenido de carotenos y xantofilas (carotenoides) se cuantifica a 480 nm. Figura 2. Longitudes de ondas de los pigmentos en los cloroplastos.

La cromatografa en columna es el mtodo ms general, utilizado para la separacin, a la vez que para la purificacin, de diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en estado slido o lquido. En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio o plstica, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase mvil. Seguidamente la mezcla orgnica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y as la fase mvil podr ir atravesando el sistema. Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase mvil, poco a poco saldrn de la columna cromatogrfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, sern las primeras en salir de la columna.

RESULTADOS
Tabla 1. Volmenes de muestra recuperados Verde Amarillo 15ml 9ml

Tabla 2.

Longitud de onda mxima de absorcin de las muestras obtenida por

espectroscopia UV-Vis Color Absorcin mxima Longitud de onda [A] Verde 2.767 0.355 Amarillo 2.792 [nm] 295 630 305

Tabla 3. Datos tericos de longitud de onda a la mxima absorbancia correspondientes a cada pigmento. Compuesto Color Longitud de
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onda

la Longitud

de

onda

mxima absorbancia [nm] Clorofila a Clorofila b Carotenos Xantofilas Verde intenso Verde Amarillo claro Amarillo anaranjado 680 640 400-500 480

experimental -630 305 --

DISCUSION
La cromatografa en columna es una tcnica de separacin, generalmente usada para compuestos orgnicos, que tiene el mismo principio que la cromatografa en papel y en capa fina, ya que para la separacin de los componentes de la sustancia, se juega con su polaridad. El proceso consiste en llenar una columna de vidrio o plstico, como lo fue en este caso, con un soporte slido adsorbente que fue la fase estacionaria, almina (Al2O3)). Se analiz los componentes de los cloroplastos. Los cloroplastos le dan ese color caracterstico a las plantas verdes. Para ello se pesaron 15g de hojas de durazno, se macero con 10m de metanol y se dej reposar, luego se agreg 6ml de hexano y se separ el extracto. Luego se separ el extracto en un ampolla de decantacin y se lav con una solucin de NaCl para eliminar los residuos de disolvente. Se descart la fase polar y a la fase no polar se le agrego se deposit en un beacker. Se prepar la columna cromatogrfica colocando un algodn en la parte inferior de la columna sobre la llave de paso y luego se rellen la columna con almina, se agreg una solucin de tolueno-acetona 9:1. Se esper hasta que se mojara toda la fase estacionaria, se coloc el extracto. Se utiliz una fase mvil de hexano debido a que
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este es de baja polaridad al igual que el extracto, con esto se consigui separar una fase amarilla, correspondiente a los carotenos. Luego de un tiempo, haba quedado una fase verde en la parte superior de la columna. Para extraerla se agreg metanol que es un disolvente ms polar que el hexano y se logr separa 15ml de pigmentos verdes, los cuales corresponden a la clorofila. Para saber que compuesto representaba cada color, se realiz un barrido para determinar la longitud de onda a la mxima absorcin, para cada color. Se obtuvieron las grficas 1 y 2 (ver anexo). Para el barrido de color amarillo, se obtuvo un pico muy claro y definido, el cual se tom como representativo de carotenosy ocurre a 305nm. Por otra parte el barrido para el compuesto verde, el barrido marco varios picos. Al comparar la figura 2 con la figura 4, se encuentra una similitud. La figura 3, es el barrido obtenido en el laboratorio y el pico 11 da una longitud de onda de 630, es similar a la longitud de onda mxima teorica, segn la figura 1, entre 600 y 700nm aproximadamente, por lo que se tom como vlida la separacin de clorofila b En el caso de los volmenes obtenidos, no se tomaron como representativos ya que no se utiliz la misma fase mvil. Ya que el hexano no logro hacer descender el verde en la columna, por lo que se le agrego un disolvente ms polar, metanol, hasta que este descendiera. Por esta razn el volumen de verde o clorofila a, fue de 15ml y 9ml para los carotenos.

CONCLUSIONES

1. La cromatografa en columna es un mtodo sencillo de identificacin y separacin de los compuestos de los cloroplastos.

2. De la maceracin de hojas verdes de durazno, se logr separar clorofila b, verde, y carotenos que fue la solucin amarilla clara. 3. la longitud de onda mxima experimental para la clorofila b fue de 630nm y 305 para los carotenos.

4. Al realizar una separacin en columna se debe verificar las polaridades de la fase mvil como el de la muestra en estudio.

BIBLIOGRAFA

1. Atkins, William. Loretta Ones

Principios de Qumica: Los Caminos Del

Descubrimiento Editorial Medica Panamericana. Pg. 124.

2. Descripcion de compuestos de los cloroplastos. Consultado el 22/4/2013. Disponible en

http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080103100126AAFeyK m 3. Isoprenos/Terpeno. Consultado el 22/4/2013. Disponible en:

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e20/20b.htm

ANEXOS
Fotografas de prctica 1. Decantacin del extracto

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2. Columna al inicio, agregando la fase mvil

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3. Columna a media separacin

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4. Separaciones obtenidas

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Fotografa de resultado del anlisis espectrofotomtrico

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Figura 1. Verde

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Figura 2. Amarillo

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