LABORATOR O !E M CROB OLO"#A L C$ E%!A ME&!#A !E CAMPOLLO TCNICAS DE AISLAMIENTO BACTERIANO Y RECUENTO BACTERIANO 1.

Introduccin Para demostrar la 'resencia de una bacteria 'at(gena y lograr su com'leta identi)icaci(n es necesario en 'rimer lugar obtener una muestra del 'aciente* del rea o medio contaminado$ +in embargo en 'ocos casos se obtendr culti,os bacterianos 'uros* ya -ue regularmente las bacterias e.isten en 'oblaciones mi.tas$ Es necesario* entonces* obtener un culti,o 'uro$ +e trata de se'arar una es'ecie bacteriana de todas las dems -ue com'arten su /bitat 'ara 'oder estudiar sus caracter0sticas culturales* mor)ol(gicas y )isiol(gicas con lo cual lograr una adecuada identi)icaci(n$ 1no de los mtodos ms im'ortantes 'ara la identi)icaci(n de microorganismos es obser,ar su crecimiento en sustancias alimenticias arti)iciales 're'aradas en el laboratorio$ El Medio de Culti,o es el material alimenticio en el -ue crecen los microorganismos$ Al crecimiento de los microorganismos se le denomina Culti,o$ En distintos laboratorios de Microbiolog0a se /a 're'arado ms de 2*333 medios de culti,o di)erentes$ Para -ue las bacterias cre4can adecuadamente en un medio de culti,o arti)icial debe reunirse ,arias condiciones 'ro'icias* entre ellas5 tem'eratura* /umedad* 'resi(n de o.0geno y '6$ 1n medio de culti,o debe contener los nutrientes y )actores de crecimiento necesarios y debe estar e.ento de microorganismos contaminantes en todas sus )ormas$ 2. Obj ti!o"# 7ue el estudiante5 a$ b$ c$ $. A%c&nc En esta 'rctica el estudiante lograr una idea com'leta de las ,enta8as -ue a'ortan el mane8o de los di)erentes ti'os de medios de culti,o* dentro del traba8o rutinario 'ara el aislamiento* 'uri)icaci(n e identi)icaci(n de las bacterias$ E.'li-ue el 'rinci'io en el -ue se basa el aislamiento* identi)icaci(n y crecimiento de las bacterias* en di)erentes caldos y medios de culti,o$ !esarrolle /abilidad en el mane8o de los di)erentes caldos y medios de culti,o$ Enumere las ,enta8as -ue a'orta el uso de cada uno de ellos y su utilidad diagn(stica$

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'. Ant c d nt " El agar es un elemento muy em'leado 'ara la 're'araci(n de medios de culti,o$ +e obtiene de un alga ro8a denominada "racilaria$ 7u0micamente* es una me4cla com'le8a de sales de 'olisacridos* la mayor0a de ellos galact(sidos$ Las grandes molculas -ue lo constituyen determinan sus caracter0sticas coloidales y es'esantes* -ue lo /an /ec/o casi insustituible$ Adems de 'olisacridos* el Agar contiene numerosos cationes asociados* tales como sodio* 'otasio* calcio* magnesio y algunos otros$ La "elatina es otro agente solidi)icante 'ero se em'lea muc/o menos ya -ue bastantes bacterias 'roducen en4imas ca'aces de licuarlo$ La mayor0a de las bacterias 'at(genas re-uieren nutrientes com'le8os similares en com'osici(n a los l0-uidos orgnicos del cuer'o /umano$ Por eso* la base de muc/os medios de culti,o es agar con una in)usi(n de e.tractos de carne y Pe'tona a los -ue se a9ade otros ingredientes$ En los di)erentes medios de culti,o se encuentran numerosos materiales de enri-uecimiento como /idratos de carbono* suero* sangre com'leta* bilis* etc$ Los /idratos de Carbono se adicionan 'or dos moti,os )undamentales5 incrementar el ,alor nutriti,o del medio y detectar reacciones de )ermentaci(n de los microorganismos -ue ayuden a identi)icarlos$ El suero y la sangre com'leta se a9aden 'ara 'romo,er el crecimiento de los microorganismos menos resistentes y:o ms e.igentes$ Tambin se a9aden colorantes -ue act;an como indicadores 'ara detectar* 'or e8em'lo* la )ormaci(n de cido o como in/ibidores del crecimiento de algunas bacterias <el Ro8o =enol se usa como indicador ya -ue es ro8o a '6 bsico y amarillo a '6 alcalino>$ 1tili4ando di,ersas tcnicas y medios de culti,o es'eciales es 'osible contar el n;mero de microorganismos 'resentes en un determinado lugar o en un medio como el agua o el aire$ Este recuento es de suma im'ortancia* ya -ue en muc/os casos* bacterias 'at(genas 'ueden estar 'resentes y llegar /asta el organismo /umano y 'ro,ocarle en)ermedad$ 1na )uente muy im'ortante de bacterias 'at(genas 'uede ser el agua$ Aun-ue en las ciudades utili4amos agua 'otable1* en algunos casos el agua 'uede llegar contaminada a las casas$ &ormalmente no se busca bacterias como +almonella o +/igella* 'ues a'arecen en escasa cantidad y su su'er,i,encia en este medio es )a,orable$ +e utili4a mtodos ms seguros 'ara establecer la calidad /iginica de las aguas* basndose en la in,estigaci(n de bacterias coli)ormes como indicadores de contaminaci(n )ecal$ El agua -ue contenga bacterias de ese gru'o se considera 'otencialmente 'eligrosa* 'ues en cual-uier momento 'uede llegar a trans'ortar bacterias 'at(genas* 'ro,enientes de 'ortadores sanos* indi,iduos en)ermos o animales$ El agua contiene bacterias cuyas necesidades nutriti,as y de tem'eratura ('tima de desarrollo son ,ariables$ En un anlisis ordinario de agua se inicia sembrando en medio s(lido un ,olumen conocido de la muestra de agua 'ara determinar el n;mero de bacterias mes()ilas ,iables* ya -ue las
1 Potable +igni)ica -ue es a'ta 'ara la alimentaci(n y uso domstico5 no deber contener sustancias o cuer'os e.tra9os de origen biol(gico* orgnico* inorgnico o radiacti,o en cantidades tales -ue la /agan 'eligrosa 'ara la salud$

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coli)ormes estn incluidas en este gru'o$ +e incuba durante un tiem'o y a determinadas tem'eraturas y se cuenta el n;mero de colonias -ue se obtienen$ El medio utili4ado es agar nutriti,o$ El l0mite ace'table es el siguiente5 Bacterias mesfilas viables en agar, durante 24 hrs. a 37C: No ms de 500 UFC/ml. +i en una muestra de agua se obtiene un ,alor su'erior a @33 1=C:ml es necesario continuar el anlisis 'ara con)irmar la 'resencia de coli)ormes y tomar medidas dirigidas a la correcta 'otabili4aci(n del agua$ La muestra 'ara anlisis bacteriol(gico debe e)ectuarse con el mayor cuidado$ +e deben utili4ar )rascos esterili4ados y con en,oltura e.terna$ La ca'acidad debe ser de 233 a 2@3 cc$ !ebe transcurrir el menor tiem'o entre la e.tracci(n y la llegada al laboratorio* y -ue durante ese tiem'o se mantenga entre A y 13 BC$ !e lo contrario se 'roducen modi)icaciones cualitati,as y cuantitati,as de la microbiota$ Toma de muestra de un gri)o en una ca9er0a de agua corriente5 1$ +e elige un gri)o -ue este conectado directamente con una ca9er0a de distribuci(n* es decir* -ue el ramal del gri)o no este comunicado con tan-ues domiciliarios* )iltros* ablandadores u otros arte)actos similares$ Tam'oco con,iene e.traer muestras de gri)os colocados en 'untos muertos de la ca9er0a$ Estas 'recauciones no se tienen en cuenta cuando se desea conocer la calidad del agua -ue suministra un determinado gri)o* en lugar de la -ue conduce la ca9er0a 'rinci'al$ 2$ +e -uitan del gri)o los dis'ositi,os destinados a e,itar sal'icado$ Luego se lim'ia la boca del gri)o con un algod(n embebido en alco/ol /asta -ue salga lim'io y cuidando de eliminar la suciedad -ue a ,eces se acumula en la 'arte interna del ori)icio$ ?$ +e esterili4a el gri)o calentndolo durante un 'ar de minutos con un /iso'o embebido en alco/ol$ A$ !es'us se de8a salir agua en )orma abundante durante 2 o ? minutos$ @$ +e reduce el )lu8o de agua en )orma tal -ue el c/orro no 'rodu4ca sal'icaduras y se llene el en,ase$ 6$ +e identi)ica el en,ase con la )ec/a* /ora y lugar de muestreo$ (. M&t ri&% " ) E*ui+o 1$ Mec/ero de Bunsen$ 2$ ncubadora a ?C DC ?$ Ca8as de 'etri* con crecimiento bacteriano$ 2$ Ca8as de 'etri con medios de culti,o estril$ <TCB+* ++* Mac ConEey> ?$ Enlenmeyer con agar nutriti,o a C3B C A$ Ca8as de 'etri estriles @$ Tubos con caldo enri-uecedor Tri'ticasa soya$ 6$ Tubos con F ml de agua estril 'ara reali4ar diluciones$ C$ Tubos con muestras desconocidas$ G$ En,ases estriles <'ara tomar muestras de agua> F$ Pa'el mayordomo$ 13$ Asas en aro$ 11$ Tubos con agua destilada estril$ 12$ Tubos con arena y desin)ectante$ 1?$ Marcador 'ermanente 'ara ,idrio$ 1A$ Lentes de 'rotecci(n$ 1@$ "uantes de lte.$ 16$ 6iso'os estriles$ 1C$ BeacEers con cloro$ 1G$ Bolsas 'ara descarte de basura$

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,. -roc di.i nto# -ARTE I. Inocu%&cin d % C&%do d Enri*u c dor Traba8ar todo el 'rocedimiento )rente a la llama del Mec/ero Bunsen a$ Tomar el tubo de muestra desconocida* desta'arlo con cuidado y )lamear la boca del mismo$ b$ ntroducir un /iso'o estril* dentro del tubo de muestra desconocida y HcargarloI<'ermitir -ue se sature>$con la muestra$* escurrir le,emente al retirarlo$ c$ !esta'ar con cuidado el tubo con caldo enri-uecedor y )lamear la boca del mismo$ d$ ntroducir este mismo /iso'o dentro del tubo con caldo enri-uecedor$ e$ Agitar el /iso'o sua,e y lentamente dentro del tubo y 'resionarlo contra las 'aredes internas del tubo$ )$ +acar con cuidado el /iso'o y descartar$ g$ =lamee inmediatamente la boca del tubo con caldo enri-uecedor y colocar la ta'a de rosca* sin atornillar o sellar$ /$ ncubar a ?Co C 'or trmino de AG /oras$ -ARTE II. Inocu%&cin d %&" c&j&" con . dio "%ido o &/&r. Traba8ar todo el 'rocedimiento )rente a la llama del Mec/ero Bunsen a$ Tra4ar una l0nea di,isoria en el centro de las ca8as de medio s(lido e identi)icar cada lado$ b$ !e un lado sembrar <utili4ando el asa en anillo y no un /iso'o> una ce'a conocida y del otro lado sembrar el material del tubo con la muestra desconocida$ c$ !is'ersar la muestra estriando sobre la mitad corres'ondiente de la ca8a$ d$ ncubar a ?CB C 'or trmino de AG /oras$ -ARTE III. R cu nto d b&ct ri&" n .u "tr& d &/u& d c0orro. Traba8ar todo el 'rocedimiento )rente a la llama del Mec/ero Bunsen a$ denti)icar los tubos con F ml de agua destilada como 1513* 15133 y 151333$ b$ Agitar el )rasco 13 a 1@ segundos* 'ara asegurar la distribuci(n uni)orme de las bacterias del l0-uido$ c$ !esta'ar el )rasco y )lamearlo$ d$ 1tili4ando una 'i'eta esterili4ada* tomar 1 ml de muestra$ e$ Jerter la al0cuota en la ca8a de 'etri utili4ando la tcnica as'tica$ )$ Agregar as'ticamente el agar nutriti,o )undido y en)riado a menos de @3B C <-ue no -ueme el dorso de la mano> y rotar la ca8a 'ara -ue la muestra -uede distribuida /omogneamente$ g$ Re'etir los 'asos &1 b ) c y agregar la al0cuota en el tubo 1513$ +e agita esta as'irando y e.'eliendo el l0-uido de la 'i'eta re'etidas ,eces$ /$ 1tili4ando la 'i'eta* tomar 1 ml del l0-uido diluido y ,erter en otra ca8a de 'etri$ i$ Tomar 1 ml de l0-uido del tubo 1513 y ,erter en el tubo 15133$ Con la tcnica correcta ,erter 1 ml de contenido del tubo 15133 en ca8a de 'etri y agregarle agar$ 8$ Tomar 1 ml del contenido del tubo 15133 y ,erter en el 151333$ Con la tcnica correcta ,erter 1 ml de contenido del tubo 151333 en ca8a de 'etri y agregarle agar$ E$ !e8ar re'osar las ca8as /asta -ue el agar se endure4ca* in,ertir las ca8as e incubar de ?2K?@B C durante 2A /oras$
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-ARTE I2. L ctur& d %o" . dio" ) c&%do. a$ Al cum'lir el tiem'o de incubaci(n* reali4ar las lecturas$ b$ Com'letar la siguiente tabla ME! O !E C1LT JO Caldo Tri'ticasa +oya TCB+ ++ Mac ConEey A+PECTO !EL ME! O &o$ !E COLO& A+ COLOR !E LA+ COLO& A+

c$ Para el agar nutriti,o* contar el n;mero de colonias 'resentes en cada ca8a y multi'licar 'or el )actor de diluci(n <rec0'roco de la diluci(n utili4ada>$ n)ormar seg;n el caso* el resultado como n;mero de microorganismos aerobios mes()ilos 'or ml$ El resultado se in)orma como 1nidades =ormadoras de Colonias 'or mililitro <1=C:ml> ya -ue cada clula bacteriana ,iable* dar lugar al desarrollo de una colonia$ Ej .+%o# a$ Placa 1<muestra sin diluir>5 ?33 colonias b$ Placa 2<diluci(n 1513> ?G colonias . 13 N ?G3 colonias c$ Placa ? <diluci(n 15133> A colonias . 133 N A33 colonia

3. Cuid&do" ) otro" &"+ cto" r % !&nt " d " /urid&d a$ La,arse las manos des'us de reali4ar cual-uier tarea dentro del laboratorio de microbiolog0a$ b$ Todo material em'leado en las 'rcticas microbiol(gicas* se descarta en las bolsas ro8as$ c$ &o de8ar 'or ning;n moti,o* ca8as* tubos o cual-uier otro material contaminado* en lugares -ue no corres'ondan al rea de traba8o$ NIN45N E6UI-O DE -ROTECCI7N SUSTITUYE EL CUIDADO1 ORDEN Y -RECAUCI7N 6UE DEBE TENER CADA ESTUDIANTE AL REALI8AR SU TRABA9O. :. Cu "tion&rio a$ L7u buenas 'rcticas deben obser,arse 'ara la 're'araci(n de medios de culti,oM b$ LCules son las di)erencias entre un medio enri-uecedor* uno de aislamiento y otro de identi)icaci(n* en )unci(n de sus com'onentes c$ LCules son algunos de los errores -ue conducen a resultados e-ui,ocados al reali4ar las lecturas de los medios o caldosM d$ LPor -u es necesario esterili4ar el c/orro o gri)o de donde se tomar la muestraM e$ n,estigue sobre los !i)erentes ti'os de medios e.istentes en el mercado$ )$ Cules son los rangos de tem'eratura 'ara incubaci(n* utili4ados 'ar el aislamiento e identi)icaci(n de bacterias$
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g$ L7ue di)erencia e.iste entre CAL!O y A"ARM /$ L7u sustancias o )actores 'ermiten di)erentes colores de colonias en los medios utili4adosM i$ n,estigue como se llama y describa bre,emente la tcnica ms utili4ada 'ara anlisis bacteriol(gico del agua$ ;. Bib%io/r&<=& d r < r nci& "ini* "$ et al 2336$ Manual de Prcticas de Microbiolog0a "eneral$ !e'artamento de Microbiolog0a* =acultad de Ciencias 7u0micas y =armacia* 1ni,ersidad de +an Carlos de "uatemala$

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