AO DE LA inversin para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL ESCUELA AGROINDUSTRIAL

INFORME N01 CURSO: Microbiologa.

DOCENTE: Doroty Torres

TEMA: Reglamento para el laboratorio de microbiologa

NOMBRE: Iman Rivas Ronald Nelson

FECHA: 24/09/2013

PIURA 2013

I.

INTRODUCCION

Preparacin en fresco
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y observar: la movilidad, el tamao y la forma de agrupacin de los microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; as como grnulos refrctiles, esporas si teir y cloroplastos dentro de las clulas vivas. Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin por la escasa diferencia entre los ndices de refraccin del medio y de los microorganismos; por otra parte, el movimiento continuo de los microorganismos, as como el causado por las corrientes de fluido, frecuentemente hacen difcil la observacin. Por tanto, su uso, con un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado. Es una tcnica que apenas se utiliza en el diagnostico microbiolgico, porque ofrece muy poca informacin en cuanto a la estructura y composicin de las bacterias. Existen dos tcnicas: Preparacin en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuacin cubrirla con un cubreobjetos. Preparacin en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubrindolo con un portaobjetos (invertido) con una excavacin central (portaobjetos excavado). Hay que sellar la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin. La ventaja de esta ltima tcnica, es que la preparacin no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la bsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamacin de la vagina y la uretra. Si en la preparacin se observan clulas en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo.

Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin. Por tanto, su uso, con un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios pticos que hemos mencionado anteriormente.

Preparaciones fijas
La preparacin consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Esta preparacin debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a travs de ella. El extendido o frote se puede hacer de varias maneras: Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequea gota de agua mediante el asa y distribuyndolo en el portaobjetos. Por impronta, presionando el porta sobre la muestra. Colocando una gota de la muestra fluida en el portaobjetos.

Los extendidos o frotes se dejan secar al are; para asegurar que las clulas queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante la tincin; la preparacin se fija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercrico, procediendo a hacer la tincin

Coloraciones de los microorganismos

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante

simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. Tincin de Gram La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativos (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).

Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las Gram-negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gram-negativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la

pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gram-negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gram-negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gram-negativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carcter de gram-positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms gram-positivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces gram-positivos y otras gram-negativos.

Tincin de esporas (wirtz-conklin) Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters. Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.

Coloracin de capsulas
Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cpsula. Est compuesta de azcares y protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencillsima, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color.

Tincin de Ziehl-Neelsen Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias. Contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de los cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul. Existen ms tipos de coloraciones pero en esta prctica: reconoceremos los dos grandes grupos de bacterias que existen mediante el mtodo de coloracin diferencial, demostraremos la tincin de esporas en contraste con la clula vegetativa, observaremos la situacin de las esporas dentro del cuerpo bacteriano.

II. II.1.

MATERIALES Y METODOS Coloracin de Gram

II.1.1.

Materiales. Cultivo lquidos o solidos de : Escherichia coli Bacillus cereus Proteus vulgaris Staphylococus albus Streptococcus Cristal violeta o violeta de genciana Lugol Alcohol cetona Safranina Asas de siembra Aceite de inmersin Porta objetos desengrasados Pizetas con agua destilada Microscopio

II.1.2

Mtodos

1. Colocar una gota de medio liquido con bacterias sobre el portaobjetos, en caso de tratarse de una muestra solida, colocar previamente una gota de agua destilada esteril sobre el portaobjetos, luego estender la muestra sobre el rea de un cm2. 2. Fijar la muestra al aire o pasndolo rpidamente por encima de la llama del mechero. 3. Despus de la fijacin cubrirla con la solucin fenicada de violeta de genciana o la de Hucker. Por un tiempo de un minuto. 4. Lavar con agua a chorro. 5. Cubrir con lugol y dejar actuar por un minuto. 6. Lavar con agua a chorro 7. Decolorar con alcohol solo, o alcohol acetona hasta que ya no se desprenda mas colorante de la lamina 8. Lavar 9. Contrastar con safranina por 30 segundos 10. Lavar, secar y observarla en el microscopio a inmersin. II.2. Wirtz) II.2.1. Coloracin diferencial de esporas y clulas vegetativas (mtodo de

Materiales Cultivo de bacilos esporulados ejem: bacillus subtilis, bacillus thuringiensis. Reactivos colorantes Verde malaquita (solucin acuosa 5%)

 II.2.2.

Safranina (solucin acuosa 0.5%) Pinzas de madera Asas de siembra Portaobjetos desengrasados Aceite de cedro Microscopio Pizetas con agua destilada Mtodos

1. Hacer la extensin bacteriana y fijar al calor 2. Aadir verde de malaquita 3. Calentar sin hervir hasta el desprendimiento de vapores (no debe secarse el colorante) 4. lavar 5. agregar medio ml de safranina por un minuto 6. lavar 7. secar y observar. II.3. Coloracin de Zhiel Neelsen (para grmenes acido alcohol resistente) Materiales cultivo de grmenes, ejm. Mycobacterium reactivos colorantes colorante de Zhiel alcohol acido. Azul de metileno o acido pcrico.

II.3.1.

II.3.2.

Mtodos

1. Preparar el frotis 2. Cubrir ntegramente con el colorante de Zhiel 3. Calentar a la llama del mechero hasta el desprendimiento de vapores, tres veces consecutiva, sin llegar a la ebullicin. 4. Lavar intensamente a chorro 5. Decolorar con alcohol acido 6. Colorear con azul de metileno o acido pcrico. 7. Lavar, secar y observar en el microscopio.

Estos son algunos materiales usados en la prctica. Reactivos cultivo de estreptococcus

Cultivo de bacterias

cultivos de bacterias

III.

RESULTADOS

Coloracin de Gram En este se utiliz el cultivo de streptococcus y se observ los cocos en forma de cadenas y de color azul as como se puede ver en la siguiente figura:

En cambio en la eschericha coli se observa de color rosado o rojo

Coloracin diferencial de esporas y clulas vegetativas (mtodo de Wirtz) En esta muestra de cultivo se observan las celulas que tienen las forman de bastones y son de color rojo y ademas observamos celulas de color verde.

Coloracin de Zhiel Neelsen (para grmenes acido alcohol resistente) se observa que unas celulas se colorean (color rojo) y otras se ven transparentes lo cual se puede decir que no tiene color ademas se observan como pequeas gotas de agua.

IV.

DISCUSIONES

Segn el manual moderno Santaf de Bogota puede mostrar dos tipos de coloraciones de Zhiel Neelsen el clsico y el modificado, los cuales tienen diferencias al realizarlos los pasos son diferentes pero tambin son diferentes a los pasos llevados en nuestra practica adems en lugar de usar el reactivo de Zhiel utilizan como principal reactivo el reactivo (fuchina fenicada) y adems en las clsica no se usa el aceite de inmersin y en nuestro caso se uso o cual estamos combinando los casos por que se llevan los mismos pasos excepto el ultimo que se le hecho aceite de inmersin.

V. CONCLUSIONES En la coloracin de Gram se observ clulas de color azul lo cual quiere decir que los estreptococcus son clulas Gram-positivas. Mientras que en el caso de la eschericha coli se observa de color rojo lo cual quiere decir que estamos frente a clulas de tipo Gram-negativas. En la muestra de coloracin de esporas se las clulas que se observan de color rojo son las clulas vegetativas mientras que las clulas que se observan de color verde son esporas. En la coloracin de Zhiel Neelsen las clulas que se observan de color rojo son clulas acido alcohol resistentes mientras que las clulas que se ven transparentes son clulas no acido alcohol resistente.

VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Manual de microbiologa general de la UNAM:Velsquez, M. O.; Vierna, G. L. y Luna, M. B.: Manejo y cuidado de los microorganismos. Pp.25-32

MOSSEL D. QUEVEDO F. Control microbiolgica de los alimentos. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de Farmacia y Bioqumica. Lima-Per. 1967.

NEVOT A. Control Bacteriolgica Prctica de los Alimentos de Origen Animal. Editorial. Flammarion. Paris. 1342. MANRIQUE V. VAILENAS R. Manual de Laboratorio de Microbiologia General. Universidad Agraria La Molina. Lima Per. 1980. Pag. 01-20p. http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm http://bioquimica.wordpress.com/2007/08/07/microbiologia-coloraciones/