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SNTESE DE N-ACIL-HIDRAZONAS PLANEJADAS COMO INIBIDORES DA AGREGAO PLAQUETRIA SYNTHESIS OF N-ACYLHIDRAZONES AS PLATELET AGGREGATION INHIBITORS

Lucas dos Reis Ercolin Campus de Araraquara Faculdade de Cincias Farmacuticas Frmacia-Bioqumica
lucasercolin@gmail.com CNPQ Palavras-chave: Aterotrombose, Hidrazona, Inibidores da Agregao Plaquetria. Keywords: Atherothrombosis, Hydrazones, Platelet Aggregation Inhibitors.

RESUMO 1. INTRODUO A aterosclerose uma doena inflamatria crnica caracterizada pelo acmulo de lipdios e componentes fibrosos em artrias, formando ateromas. Isto causa diminuio do calibre ou obstruo dos vasos, causando eventos isqumicos. A aterotrombose tem ntima associao com a aterosclerose, pois a ruptura da placa aterosclertica gera extravasamento do contedo pr-trombtico, levando agregao de plaquetas e gerao de trombos, que podem causar um acidente vascular cerebral, infarto agudo do miocrdio, entre outros. As principais estratgias teraputicas envolvem os antagonistas de trombina, receptor purinrgico P2Y12, integrina IIb3 e inibidores da biossntese de tromboxanos. Porm as terapias atuais so insuficientes para o controle da aterosclerose, tornando-se importante a descoberta de novos agentes antitrombticos. A tcnica de hibridao, que envolve a conjugao de duas molculas bioativas distintas em uma nica molcula, permite obter frmacos que atuam em mais de um alvo teraputico. Assim, utilizando essa tcnica, foi planejada uma estrutura hibrida que possua um grupo doador de xido ntrico e um grupo N-acil-hidrazona, relatado na literatura como detentor de atividades analggicas, antiinflamatrias e antiagregante plaquetria. Assim, em uma mesma molcula, a conjugao do efeito antiagregante do xido ntrico, associado a N-acil-hidrazona, potencializaria o efeito antitrombtico. Inicialmente, atravs de interconverso de grupos funcionais, hidrazidas derivadas do ncleo aminobenzico so obtidas para posterior acoplamento com a funo aldedo dos furoxnos para formao da N-acil-hidrazona pretendida. 2. OBJETIVOS Definir metodologia de sntese das hidrazidas do cido 4-aminobenzico e cido 3-aminobenzico, utilizando como intermedirios o metil 3-aminobenzoato e o metil 4-aminobenzoato. Avaliar diferentes mtodos de extrao das hidrazidas para otimizao dos rendimentos. Sntese de hidrazonas, produtos finais desejados. 3. MATERIAIS E MTODOS 3.1.REAGENTES 6-Formilbenzofuroxano, gua destilada por osmose reversa, acetato de etila, cido 3-aminobenzico, cido 4-aminobenzico, cido clordrico 37%, brometo de potssio, etanol, hidrato de hidrazida 80%, metanol, sulfato de sdio,

3.2.EQUIPAMENTOS Agitador magntico com aquecimento; Aparelho de ponto de fuso capilar Electrothermal; Concentrador Speedvac da Thermo Savant; Espectrofotmetro Brker; modelo Advance DPK300 300 MHz; Espectrofotmetro Shimadzu; Rotaevaporador. 3.3.MTODOS

Fig. 01: Esquema da sntese das hidrazonas desejadas O planejamento da sntese, indicado na Figura 01, props-se a formao de steres metlicos (2a e 2b) a partir dos respectivos cidos aminobenzicos (1a e 2a) em metanol, e cido clordrico como catalisador. As hidrazidas (3a e 3b) foram formadas pela reao entre os steres (2a e 2b) com hidrato de hidrazina (80%). O produtos finais foram formados pela acoplagem das hidrazidas (3a e 3b) com o 6-formilbenzofuroxano, utilizando como catalizador cido actico glacial. O procedimento para a sntese dos aminobenzoatos de metila (2a e 2b) envolve adicionar em um balo de fundo redondo de 125 mL, 2 g do cido aminobenzico (1a ou 2b) a ser esterificado usando 60 mL de metanol e duas gotas de cido clordrico 37% como catalizador. A reao mantida sob agitao magntica por 10 horas em temperatura ambiente. O isolamento foi realizado por evaporao do metanol presso reduzida. Para sntese das aminobenzohidrazidas (3a e 3b) foi utilizado um balo de 50 mL, em que se adicionou 0,55 g do aminobenzoato de metila (2a ou 2b) com 4 mL de hidrato de hidrazina 80%. A reao mantida em aquecimento controlado a 50 C sob refluxo e agitao magntica constante por 12 horas a abrigo da luz. Aps o fim do tempo de reao, o aquecimento deve ser desligado. O isolamento foi realizado por extrao com acetato de etila ou utilizando do concentrador speedvac, permitindo avaliar as diferenas entre metodologias de isolamento. As hidrazonas (4a e 4b) foram obtidas em um balo de fundo redondo de 50 mL. Foram adicionados 8 mL de etanol, 0,18 g de 6-formilbenzofuroxano e duas gotas de cido actico glacial como catalizador, mantendo o contedo do balo sob agitao magntica constante. Aps 5 minutos adiciona-se 0,15 g da aminobenzohidrazida (3a ou 3b). A reao mantida sob agitao magntica constante, temperatura ambiente e protegida da luz por 15 horas. Aps o tempo de reao, feita a extrao reduzindo o volume sob presso reduzida e posteriormente a reao resfriada para precipitao do produto. O precipitado filtrado e lavado com gua fria e depois etanol frio. O monitoramento de todas as reaes foi feitas em Cromatografia de Camada Delgada (CCD), utilizando como fase mvel 70% acetato de etila e 30% hexano. A caracterizao dos produtos foi realizada pela CCD, ponto de fuso, espectrofotometria de absoro no infravermelho, ressonncia magntica nuclear de prtons e carbono-13 (RMN-H1 e C13) 4. RESULTADOS E DISCUSSES Os aminobenzoatos de metila (2a e 2b) foram obtidos como slidos amorfos de colorao levemente amarelada. O rendimento para ambos foi de 99%. A caracterizao estrutural representada a seguir: 3-Aminobenzoato de metila (2a): Pf.: 173 C, Rf= 0,71; Espectrofotometria de absoro no infravermelho: cm) 3414,00 (-NH2 aromtica), 2956,87 (aromtico), 1635,64 (C=O) e 756,10 (aromtico 1,3-dissubistitudo); RMN-H1 (300 MHz DMSOd6): (ppm) 7,23 (H2), 7,25 (H4), 7,39 (H5), 7,70 (H6) e 4,90 (H7). 4-Aminobenzoato de metila (2b): Pf.: 186 C, Rf= 0,6; Espectrofotometria de absoro no infravermelho: cm) 3363,86 (-NH2 aromtica), 2958,80 (aromtico), 1600,92 (C=O), 771,53 (aromtico 1,4-dissubistitudo); RMN-H1 (300 MHz DMSOd6): (ppm) 6,59 (H2 e H6), 6,52 (H3 e H5), 3,32 (H7) e 5,86 (H8) As hidrazidas (3a e 3b) foram obtidas por dois mtodos: Extrao por acetato de etila ou pelo concentrador speedvac. Em ambos os casos, o contedo do balo deve ter seu pH corrigido para 7 com cido clordrico 20%. A extrao por acetato de etila deve ser feita com pequenas pores de 20 mL. Porm so necessrias vrias extraes para se obter um bom rendimento (40-60%). O acetato e etila removido por rotaevaporao, obtendo um slido amorfo amarelado para ambas. Na extrao por concentrador speedvac, a mistura adicionada em tubos falcon e concentrada por 8 horas seguidas. O slido formado deve ser retirado do tubo Falcon, e pulverizado.

O p deve ser colocado novamente nos tubos e mantido por mais 4 horas. formado um slido amorfo higroscpico branco. Haver a presena de cloreto de sdio do slido. A caracterizao estrutural das hidrazidas representada a seguir: 3-Aminobenzohidrazida (3a): Pf.: 170 C, Rf = 0,73, Espectrofotometria de absoro no infravermelho: cm) 2956,87 (aromtico), 1635,64 (-CONH-), 1388,75 (-NH2 aromtica), 756,10 (Aromtico 1,3-dissubistitudo); RMN-H1 (300 MHz DMSOd6): (ppm) 6,74 (H2), 6,76 (H4), 7,08 (H5), 7,10 (H6), 7,17 (H7), 5,34 (H8), 7,16 (H9). 4-Aminobenzohidrazida (3b): Pf.: 180 C, Rf= 0,74, Espectrofotometria de absoro no infravermelho: cm) 3363,86 (-NH2 aromtica), 2958,80 (aromtico), 1600,92 (-CONH-), 771,53 (Aromtico 1,4-dissubistitudo). As hidrazonas (4a e 4b), com propriedade liberadora de xido ntrico e com a subunidade N-acil-hidraznica, foram obtidas sem maiores dificuldades, se apresentando como um slido amorfo amarelado. No acompanhamento pela cromatografia de camada delgada, s foi observada a formao de um produto, demonstrando que a reao, nas propores descritas, tem preferncia para uma das aminas. As anlises de espectrofotometria de absoro no infravermelho, RMN-H1 e RMN-C13 demonstram que em ambos produtos a preferncia em relao amina hidrazidica. A caracterizao estrutural dos produtos finais representada a seguir Produto final meta (4a): Pf.: 203,5 C, Rf.: 0,73, Espectrofotometria de absoro no infravermelho: cm) 3363,86 (-NH2 aromtica), 1616,35 (N=C, imina conjugada), 1689,64 (C=O), 1400,32 (Grupo Ntro), RMN-H1 (300 MHz DMSOd6): (ppm) 7,62 (H2), 7,34 (H4), 7,60 (H5), 7,61 (H6), 10,04 (H8), 8,77 (H9), 8,03 (H11), 7,34 (H14), 8,00 (H15), 6,39 (H16), RMN-C13 (300 MHz DMSOd6): (ppm) 134, 45 (C1), 112,13 (C2), 147,71 (C3), 120,64 (C4), 130,78 (C5), 130,64 (C6), 171,70 (C7), 159,56 (C9), 140,57 (C10), 130,52 (C11), 126,59 (C12), 134,98 (C13), 130,43 (C14) e 130,18 (C15). Produto final para (4b): Pf.: 224 C, Rf= 0,71, Espectrofotometria de absoro no infravermelho: cm) 3414,00 (-NH2 aromtica), 1616,35 (N=C, imina conjugada), 1689,64 (C=O), 1419,61 (Grupo Nitro). RMN-H1 (300 MHz DMSOd6): 6,54 (H2 e H6), 7,62 (H3 e H5), 6,25 (H8), 8,77 (H9), 7,37 (H11), 7,59 (H14), 7,39 (H15), 10,03 (H16), RMN-C13 (300 MHz DMSOd6): 124,13 (C1), 112,23 (C2 e C6), 130,80 (C3 e C5), 147,34 (C4), 182,84 (C7), 159,86 (C9), 168,21 (C10), 120,82 (C11), 118,08 (C12), 135,25 (C13), 130,79 (C14), 120,82 (C15). 5. CONCLUSES A sntese dos steres, intermedirios da sntese das hidrazidas, foi obtida de modo rpido e eficiente, uma vez que teve 99% de rendimento. Suas caracterizaes demonstrou a adio de um carbono metlico e a formao de um grupo ster (RMN-H1: Em meta = 4,90 ppm e em para = 3,32 ppm, ambos singletos), comprovando sua formao. A hidrazida meta pode ter a sua formao confirmada pela ressonncia magntica nuclear de prtons, em meta = 5,34 ppm, correspondente a amina terminal da hidrazida e em = 7,17 ppm, correspondente ao grupo amida. O mtodo de extrao com acetato de etila de fcil execuo, uma vez que no necessita de equipamentos especiais para realizar o procedimento. Porm de baixo rendimento e demanda grandes quantidades de solvente e muito tempo para se obter pequenas quantidades. A extrao usando do concentrador speedvac , comparada extrao, muito eficiente, visto que obtem rendimentos prximos a 99% e demanda um curto tempo para se obter o slido. Entretanto o slido formado muito higroscpico, dificultando a anlise por mtodos que sofrem a interferncia por gua.

A sntese das hidrazonas demonstrou que, independente da hidrazida usada (obtida por extrao com acetato de etila ou por retirada do solvente pelo concentrador Speedvac), que h uma preferncia pela amina hidrazdica, conforme pode ser observado nos RMN-H1 e RMN-C13 (diversos novos sinais, que caracterizam os tomos do 6-formilbenzofuroxano, sendo o principal o sinal do C9/H9, em meta: 8,77:159,56 ppm e em para 8,77:159,86 ppm). A estequiometria usada na reao est diretamente relacionada com a formao do produto desejado. O aumento na quantidade de aldedo pode levar reao da amina aromtica, formando subprodutos indesejados. 6. BIBLIOGRAFIA ABBAS A. K. et al., Patologia: Bases Patolgicas das Doenas. Rio de Janeiro: Elsevier, 2010, p.495-539 BARREIRO, E. J., FRAGA, C. A. M., Qumica Medicinal As bases moleculares da ao dos frmacos. Porto Alegre: Editora Artmed, 2001 p. 189-206. LIMA et al., Synthesis and anti-platelet activity of novel arysulfonate-acylhydrazone derivatives, designed as antithrombotic candidates. European Journal of Medicinal Chemestry, v.43, i.2, Amsterdam, Elsevier, 2008, p. 348-356. ROLLAS S., KKGZEL S. G., Biological Activities of Hydrazone Derivatives, Molecules, Basel: Molecules Editorial Office, 2007, p. 1910-1939 ROSS R., Atherosclerosis An inflammatory disease. The New England Journal of Medicine Waltham: Massachusetts Medical Society, 1999, p. 115-126 ZAFAR M. U. et al., A novel anti-ischemic nitric oxide donor (LA419) reduces thrombogenesis in healthy human subjects, Journal of Thrombosis and Haemostasis, London: Internacional Society on Thrombosis & Haemostasis, 2007, p. 1195-1200