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Aspectos tcnicos dos exames laboratoriais de rotina

Paulo Csar Ciarlini Doutor em Clnica Veterinria pela Universidade Estadual Paulista Professor Adjunto de Laboratrio Clnico Veterinrio UNESP Araatuba

Contato: Rua Clvis Pestana, 793 CEP: 16050-680 Araatuba, SP Tel.: 018-36361413 e-mail: ciarlini@fmva.unesp.br

14. Aspectos tcnicos dos exames laboratoriais de rotina. 1. HEMOGRAMA 1.1. HEMATCRITO OU VOLUME GLOBULAR

Mtodo: Microcapilar de Strumia. Fundamento O hematcrito ou volume globular (VG) a mensurao da frao do volume sanguneo que ocupada pelos eritrcitos aps centrifugao. O VG est intimamente relacionado com o tamanho e o nmero dos glbulos vermelhos. A determinao do VG por centrifugao permite quantificar tambm o volume dos leuccitos, plaquetas e de plasma. Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo por 24 horas. Materiais e equipamentos Tubo capilar sem anticoagulante. Massa vedante prpria para capilar ou massa de modelar atxica. Centrfuga de micro-hematcrito. Carto de leitura. Procedimento 1. Preencher um tubo capilar at aproximadamente 2/3 com sangue previamente homogeneizado. 2. Limpar o sangue da parte externa com auxlio de papel. 3. Fechar o tubo capilar com massa de modelar do lado oposto ao da entrada do sangue. 4. Colocar o tubo capilar na centrfuga com a parte vedada em contato com a borracha. 5. Centrifugar a 13460 G (13000 rpm) durante cinco minutos. Tratando-se da espcie caprina centrifugar durante 15 minutos e ovina 10 minutos. 6. Fazer a leitura no carto apropriado, igualando o menisco do plasma com a linha superior da rgua (linha 100) e igualar a extremidade inferior da poro eritrocitria com a linha inferior da rgua (linha 0), de modo que o resultado seja o valor da linha

limite entre a parte da capa branca leucocitria e as clulas vermelhas (Fig. 1A), exatamente na parte inferior da camada de eritrcitos oxidada pelos leuccitos (vermelho mais escuro). 7. Expressar o resultado em porcentagem do volume globular ou l/l. 8. Determinar o ndice ictrico (Fig. 1B), notificar a presena de plasma hemolisado de cor vermelha (Fig. 1C), lipmico turvo-esbranquiado (Fig.1 D) e observar a espessura da camada de leuccitos e plaquetas.

Figura 1. Leitura de tubo capilar de micro-hematcrito. (A) volume globular (VG=46%, 0,46 l/l) de um co normal com plasma lmpido; (B) co anmico (VG=31%, 0,31 l/l) com plasma amarelado caracterstico de plasma ictercia; (C) co anmico (VG=27%, 0,27 l/l) com plasma vermelho caracterstico de hemlise; (D) co no anmico (VG=46%, 0,46 l/l) com plasma turvo caracterstico de lipemia. 1.2. CONCENTRAO SANGUNEA DE ERITRCITOS

Mtodo: Contagem manual e direta Fundamento A contagem de eritrcitos obtida aps diluio do sangue com soluo diluidora apropriada para cada espcie e contagem em hemocitmetros. Alguns diluidores, comumente utilizado em laboratrios humanos, contm mercrio (Ex: Hayem) sendo, portanto, inadequados para ruminantes por promover aglutinao eritrocitria. A soluo diluidora de Gower pode ser utilizada em todas as espcies de animais domsticos, exceto para rpteis, peixes e aves.

Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/mL de sangue), sem fibrina e/ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo por 24 horas. Materiais e equipamentos Pipeta de Thoma para hemcias. Mangueira de ltex. Cmara de Neubauer com lamnula de cristal apropriada. Agitador de pipetas de Thoma. Papel absorvente. Registrador de clulas. Microscpio tico com objetiva de 40X. Soluo de Gower: Sulfato de sdio anidro ________ 62,5g cido actico glacial__________ 166,8 ml gua destilada qsp Procedimentos 1. Homogeneizar o sangue. 2. Diluir o sangue na proporo de 1:200 aspirando-o at a marca 0,5 da pipeta de Thoma para eritrcitos (Fig.2A). Se o hematcrito estiver abaixo de 12% (0,12 l/l), dilua o sangue 1:100, aspirando o sangue at a marca 1 da pipeta. __________1000 ml

Figura 2. Principais procedimentos da contagem manual de eritrcitos no sangue. (A) Aspirao do sangue at a marca 0,5 da pipeta de Thoma para eritrcitos; (B) Limpeza da parte externa da pipeta; (C) Aspirao do diluente at a marca 101; (D) Homogeneizao com o agitador de pipetas por 30 segundos; (E) Eliminao das trs primeiras gotas; (F) Preenchimento da cmara de Neubauer.

3. Limpar o sangue da parte externa da pipeta com auxlio de papel absorvente (Fig.2B) e completar com o lquido diluente de Gower at a marca 101 (Fig. 2C). 4. Agitar a pipeta por 30 segundos no agitador automtico (Fig.2D) ou manualmente, durante um minuto, realizando movimentos duplos (horizontal e vertical) semelhante a tocar pandeiro. 5. Desprezar as trs primeiras gotas (Fig.2E) e preencher um dos lados da cmara de Neubauer evitando extravasamento nas fossas (Fig. 2F). 6. Esperar os eritrcitos sedimentarem deixando a cmara em repouso por um minuto. Observar se ocorreu distribuio homognea das clulas na rea de contagem. 7. Utilizando aumento de 400X, quantificar o nmero de clulas dos cinco quadrados da rea central do hemocitmetro (quatro das extremidades e um central), tendo o cuidado de no contar duas vezes as clulas localizadas sobre as linhas dos retculos (Fig.3). Para tal, padronizar a leitura de modo a considerar apenas as clulas internalizadas e as que tocam as linhas superiores e do lado direito de cada retculo. 8. Para obter a concentrao de eritrcitos por microlitro, some o nmero de clulas contadas e multiplique por 10.000 se a diluio foi de 1:200 ou por 5.000 se a diluio foi de 1:100. Multiplicar a concentrao por microlitro por 10.000 para expressar o resultado em nmero de eritrcitos por litro de sangue.

Figura 3. Viso em aumento de 50X da rea de contagem de eritrcitos (quadriculados vermelhos) na cmara de Neubauer melhorada. O nmero de eritrcitos contados na rea vermelha deve ser multiplicado pelo valor que corrige o volume total (1/0,02mm3 = 50) e pela correo da utilizada (200 ou 100), ou simplesmente ser multiplicado por 10.000 (diluio 1:200) ou 5.000 (1:100).

1.3. CONCENTRAO DE HEMOGLOBINA Mtodo: Cianohemiglobina. Fundamento Em meio alcalino a forma ferrosa do ferro da hemoglobina transformada por oxidao para forma frrica (metahemoglobina) pelo feriicianeto. Na metahemoglobina se combina posteriormente com cianeto de potssio, gerando um pigmento estvel denominado cianohemiglobina. O teor de hemoglobina no sangue proporcional cor do pigmento de cianeto de hemiglobina formado durante a reao. Esse mtodo determina todos os tipos de hemoglobina exceto a sulfohemoglobina. Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem lipemia, fibrina, cogulos e mantido refrigerado por no mximo 24 horas. Materiais e equipamentos Pipeta de Sahli. Mangueira de ltex. Fotocolormetro ou espectrofotmetro visvel. Lquido de Drabkin*: Bicarbonato de sdio PA.............................................1 g Cianeto de potssio (KCN)..........................................50 mg Ferricianeto de potssio K3Fe(CN)6.............................200 mg gua destilada qsp.......................................................1.000 ml * Soluo txica: evitar misturar com cidos para evitar vapores de cianeto. Conservar hermeticamente fechado em frasco mbar. Procedimentos 1. Homogeneizar a amostra de sangue. 2. Acrescentar 5 ml de soluo de Drabkin em um tubo de ensaio (Fig.4A). 3. Aspirar 20l de sangue utilizando uma pipeta de Shali (Fig.4B). 4. Retirar o sangue da parte externa com auxlio de papel absorvente (Fig.4C). 5. Colocar os 20l de sangue no fundo do tubo, aspirar e desprezar a soluo duas ou mais vezes para a completa retirada do sangue aderido parte interna da pipeta (Fig.4D). 6. Homogeneizar o tubo e esperar 10 minutos (Fig.4E).

7. Ler em espectrofotmetro (540 nm) ou fotocolormetro (filtro verde) previamente zerado com o branco reativo (Fig.4F). Multiplicar o valor de absorbncia da amostra pelo fator do lquido de Drabkin obtido com amostra padro: Hb (g/l) = mdia da absorbncia da amostra x fator da hemoglobina.

Figura 4. Principais procedimentos da dosagem de hemoglobina. (A) Uso de dispensador para transferir o reativo de Drabkin; (B) Aspirao de 20 l de sangue utilizando pipeta de Sahli; (C) limpeza da parte externa da pipeta se Shali; (D) Transferncia do sangue para tubo contendo o reagente; (E) homogeneizao da soluo e (F) Leitura da amostra em espectrofotmetro previamente zerado com o prprio reagente (540 nm). 8. O fator do reagente obtido em triplicada repetindo-se o procedimento 1 a 7, utilizando-se um padro de hemoglobina comercial confivel em vez de sangue. O valor do fator da hemoglobina calculado utilizando-se a frmula: Fator Hb (g/l) = valor hemoglobina do padro mdia da absorbncia padro

1.4. CONCENTRAO SANGUNEA DE LEUCCITOS Mtodo: Contagem manual e direta Fundamento O valor da leucometria global obtido aps diluio do sangue com soluo diluidora apropriada para cada espcie e posterior contagem em hemocitmetros. A

soluo diluidora de Trk pode ser utilizada em todas as espcies de animais domsticos. Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos e mantido refrigerado por no mximo 24 horas. Materiais e equipamentos Pipeta de Thoma para leuccitos. Mangueira de ltex. Cmara de Neubauer Lamnula de cristal para cmara. Agitador de pipetas de Thoma. Papel absorvente. Registrador de clulas. Microscpio com objetiva 10X. Soluo de Trk: Sol. Aquosa de violeta de genciana a 1%........... 1 ml cido actico glacial............................................ 1,5 ml gua destilada qsp .............................................100 ml Procedimentos 1. Homogeneizar a amostra de sangue. 2. Utilizando uma pipeta de Thoma para leuccitos, diluir o sangue na proporo 1:20 aspirando-o at a marca 0,5. Se o paciente for muito leucopnico, dilua o sangue 1:10, aspirando-o at a marca 1 da pipeta (Fig. 5A). 3. Limpar o sangue da parte externa da pipeta com auxlio de um papel absorvente (Fig. 5B) e completar com o lquido diluente de Trk at a marca 11 (Fig. 5C). 4. Agitar a pipeta por 30 segundos no agitador automtico (Fig. 5D) ou manualmente, durante um minuto, realizando movimentos duplos (horizontal e vertical) semelhante a tocar pandeiro.

Figura 5. Principais procedimentos da contagem manual de leuccitos no sangue. (A) Aspirao do sangue at a marca 0,5 da pipeta de Thoma para leuccitos; (B) limpeza da parte externa da pipeta; (C) Aspirao do diluente at a marca 11; (D) Homogeneizao com o agitador de pipetas por 30 segundos; (E) Eliminao das trs primeiras gotas; (F) Preencher um dos lados da cmara de Neubauer.

5. Desprezar as trs primeiras gotas (Fig. 5E) e preencher um dos lados da cmara de Neubauer evitando extravasamento nas fossas (Fig.5F). Observar se ocorreu distribuio homognea das clulas na rea de contagem. 6. Esperar a sedimentao dos leuccitos mantendo a cmara em repouso por um minuto. 7. Utilizando aumento de 100X, quantificar o nmero de leuccitos contidos nos quatro quadrados maiores que contem 16 retculos cada (Fig.6), tendo o cuidado de no contar a mesma clula duas vezes. Para tal padronizar a leitura de modo a considerar apenas as clulas internalizadas e que tocam as linhas superiores e do lado direito de cada retculo. 8. Para obter a concentrao de leuccitos por microlitro, some o nmero de clulas contadas e multiplique por 50 se a diluio foi de 1:200 ou por 25 se a diluio foi de 1:100. Multiplicar a concentrao por microlitro por 100.000 para expressar o resultado em nmero de leuccitos por litro de sangue.

Figura 6. Viso em aumento de 50X da rea de contagem de leuccitos (quadriculados vermelhos) na cmara de Neubauer melhorada. O nmero leuccitos contados na rea vermelha deve ser multiplicado pelo valor que corrige volume total (1/0,4 mm3 = 2,5) e pela correo da diluio utilizada (20 ou 10), ou simplesmente multiplicado por 50 ou 25.

9. Quando se observam mais de cinco eritrcitos nucleados circulantes no sangue perifrico (rubrcitos e metarrubrcitos) a cada 100 leuccitos, deve-se corrigir o valor dos leuccitos que se encontra falsamente elevado devido presena desses precursores eritrides. Para a correo utiliza-se a seguinte frmula: Valor corrigido = _________nmero de leuccitos totais x 100_________ 100 + nmero de eritrcitos nucleados em 100 leuccitos

1.5. CONTAGEM DIFERENCIAL DOS LEUCCITOS MTODO: Microscopia comum. Amostra: Sangue total preferencialmente sem anticoagulante ou em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo por 24 horas.

Fundamento A contagem diferencial uma avaliao citolgica realizada preferencialmente em esfregao de sangue sem anticoagulante e tingido com corantes panticos. As caractersticas morfo-tintoriais dos elementos figurados do sangue (eritrcitos, leuccitos e plaquetas) so quantificadas e qualificadas quanto s suas formas, tamanho e presena de parasitos. Materiais e equipamentos Tubo capilar sem anticoagulante. Lmina para microscopia. Lmina extensora com extremidades cortadas. Microscpio tico. Corante pantico de Leishman: Eosina-Azul de Metileno (seg. Leishman)....................... 1,5 g Metanol PA...................................................................... 1l Dissolver o corante em banho-maria (37oC) acrescentando aos pouco o metanol com pH previamente corrigido para 6,8. Filtrar em papel rpido (Faixa preta) e deixar maturar em frasco mbar por no mnimo 30 dias antes do primeiro uso. Procedimento 1. Colocar uma gota de sangue sobre uma lmina posicionada horizontalmente entre os dedos polegar e indicador ou apoiar sobre uma mesa (Fig.7A). A limpeza das lminas imprescindvel para a obteno de um bom esfregao. Para tal devem ser lavadas e desengorduras com detergente, mantidas em lcool e antes do uso enxutas com tecido que no solte fibras. 2. Com a outra mo, posicionar uma lmina extensora de vidro frente da gota de sangue, num ngulo de 45 (Fig.7B) e em seguida fazer um ligeiro movimento para trs at o sangue espalhar-se pela extensora (Fig.7C). 3. Com um impulso uniforme e suave para frente, fazer a extensora deslizar at aproximadamente 2/3 da lmina (Fig.7D). Um bom esfregao no toca a lateral da lmina e possui trs segmentos bem definidos: cabea, corpo e cauda. 4. Utilizando um secador ou por agitao, secar o esfregao imediatamente aps a sua confeco.

Fig. 7. Principais procedimentos para confeco do esfregao sanguneo. Posicionamento de uma gota de sangue sem anticoagulante numa extremidade da lmina (A); Posicionamento da lmina extensora frete do sangue (B); Recuo da lmina extensora at a gota para espalhar o sangue (C); Impulso da extensora para frente em ngulo de 30-45o (D). 5. Identificar o esfregao com lpis na borda fosca da lmina ou no centro do esfregao. Espalhe 20 gotas do corante Leishman ou similar sobre o esfregao e espere 3 minutos. 6. Acrescente 20 gotas de gua com pH neutro (7,0), misture com o corante utilizando um basto ou assoprando suavemente. 7. Espere 10-15 minutos, lave em gua corrente antes de secar. Corar sempre uma Lmina e deixar outra de reserva. Os corantes panticos tipo Romanowsky (Leishman, May-Grnwald, Wright etc) so constitudos por eosina e azul de metileno dissolvido em metanol (fixador). Quando maturado e misturado gua, o azul de metileno oxidado libera diversos azures de metileno que formam complexos de eosinato de metileno que tingem a maioria das estruturas celulares. O tempo de fixao e colorao varia com o tipo de corante, maturao e fabricante. Siga as instrues do fornecedor. 8. A leitura da lmina deve ter como base a contagem global de leuccitos (Fig. 8). Utilizando aumento de 1000X, a contagem deve ser feita na zona marginal (predomnio clulas maiores) e interna (predomnio de clulas menores) do corpo do esfregao, sendo trs campos em cada zona. 9. Quantificar todas as alteraes morfolgicas e tintoriais dos eritrcitos e leuccitos, conforme a classificao de Weiss (1984):

Tabela 1. Classificao semiquantitativa das alteraes morfolgicas de eritrcitos e leuccitos, Weiss (1984). Alterao Espcie 1+ 2+ 3+ 4+ Anisocitose Canina Felina Bovina Eqina Canina Felina Bovina Eqina Todas espcies Todas Poiquilocitose Eritrcito alvo Esfercitos Demais alteraes eritrocitrias Toxicidade de neutrfilo em espcies Canina Canina 1-10 Canina Felina Bovina Eqina Canina Bovina 1-2 11-50 3-8 51-150 9-20 >150 >20 3-10 3-5 11-50 6-15 51-200 16-30 >200 >30 1-10 11-50 51-200 >200 7-15 5-8 10-20 1-3 2-7 1-2 2-5 Rara 16-20 9-15 21-30 4-6 8-14 3-8 6-10 Rara 21-29 16-20 31-34 7-10 15-29 9-15 11-20 Rara >30 >20 >40 >10 >30 >15 >20 Rara

Policromasia

Hipocromia

Basofilia suave

Toxicidade de neutrfilo

Felina Eqina

<10% dos neutrfilos com corpsculos de Dhle

Basofilia moderada e/ou citoplasma levemente vacuolizado com corpsculos de Dhle 10 a 30% dos neutrfilos com corpsculos de Dhle

Basofilia e/ou citoplasma fortemente vacuolizado com corpsculos de Dhle >30% dos neutrfilos com corpsculo de Dhle

Critrio similar a 3+ com membranas nucleares imperceptveis

Obs: Nestas duas espcies comum a presena de Dhle sem outros sinais de toxicidade

Figura 8. Esfregao sanguneo corado, especificando o nmero de leuccitos que devem ser contados de acordo com a leucometria e o traado que deve ser realizado para contagem diferencial dos leuccitos. 3. DETERMINAO DA PROTENA PLASMTICA TOTAL

MTODO: Refratometria. Fundamento A refrao da luz diretamente proporcional presena de protena total do plasma (albumina + globulinas). Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo 24 horas.

Materiais e equipamentos
Tubo capilar sem anticoagulante. gua destilada. Refratmetro clnico. Papel absorvente liso. Massa vedante. Centrfuga de micro-hematcrito.

Procedimento 1. Homogeneizar a amostra do sangue. 2. Preencher um tubo capilar at aproximadamente 2/3 com sangue. 3. Limpar o sangue da parte externa com auxlio de papel. 4. Fechar o tubo capilar com massa de modelar do lado oposto ao da entrada do sangue. 5. Colocar o tubo capilar na centrfuga com a parte vedada em contato com a borracha. 6. Centrifugar a 13.460 G (13.000 rpm) durante cinco minutos.

Figura 9. Leitura da protena plasmtica total por refratometria. (A) Escala do refratmetro zerado na marca W com gua destilada; (B) Separao do plasma acima da camada branca de leuccitos e plaquetas de amostra sangunea centrifugada em capilar; (C) Preenchimento da rea espelhada do refratmetro com o plasma; (D) Leitura da concentrao de protena na escala da esquerda (7,2 mg/dl). 7. Zerar o refratmetro com gua destilada (Fig.9A). 8. Quebrar o tubo capilar logo acima da camada de leuccitos e plaquetas (Fig.9B). 9. Limpar o refratmetro com papel absorvente e depois transferir o plasma para o mesmo (Fig.9C). 10. Expor o refratmetro contra a luz para realizar a leitura em mg/dl, identificando o limite entre a zona branca e azul (Fig.9D). Expressar o valor de protena em g/l multiplicando o valor mg/dl por 10.

4. DETERMINAO DO FIBRINOGNIO PLASMTICO MTODO: Indireto por precipitao por calor. Fundamento Aps prvia precipitao por calor, o fibrinognio pode ser separado das demais protenas por centrifugao. Diferentemente das demais protenas plasmticas, o fibrinognio se precipita a 56o C. Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo por 24 horas. Materiais e equipamentos Tubos capilares sem anticoagulante. gua destilada. Refratmetro. Papel absorvente liso. Massa vedante. Centrfuga de micro-hematcrito. Procedimento 1. Repita em duplicata (tubo A e B) os procedimentos de 1 a 6 descrito para realizao do hematcrito (item 3). 2. Coloque o tubo A em banho-maria por 5 minutos a 56o C e mantenha o tubo B em temperatura ambiente. 3. Centrifugar o tubo A 13.460 G (13.000 rpm) durante dois minutos. 4. Observar a camada branca dos dois tubos. O tubo B ter uma camada branca maior do que o tubo A devido ao fibrinognio precipitado a 56oC ser incorporado aos leuccitos e plaquetas aps centrifugao (Fig.10). 5. Quebrar os tubos A e B logo acima da camada branca e transfira o plasma para um refratmetro previamente zerado com gua destilada. 6. Realizar a leitura da protena total de ambos os tubos, subtraindo o valor do tubo A pelo do tubo B para obter a concentrao de fibrinognio em g/dl e expresse em g/l multiplicando o resultado por 10.

Figura 10. Sangue ps-centrifugao (A) e sangue centrifugado aps incubao a 56oC (B). O aumento da camada branca do tubo B proporcional concentrao do fibrinognio (F) plasmtico precipitado. A concentrao de fibrinognio plasmtico resulta da subtrao da protena plasmtica total do tubo A (PPT A) pela PPT do tubo B (PPT B). Neste exemplo a relao PPT:F foi menor do que 10, indicando ser uma hiperfibrinogenemia de origem inflamatria.

5. CONTAGEM DE RETICULCITOS MTODO: Colorao supravital. Fundamento Os eritrcitos jovens possuem resqucios de RNA que se tingem com corantes supravitais como o azul cresil brilhante e o novo azul de metileno, permitindo visualizar por microscopia formas reticulares intraeritrocitrias tpicas dos reticulcitos. O aumento do nmero de reticulcitos circulantes reflete o grau de atividade eritropotica. Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo 24 horas. Materiais e equipamentos Tubo de ensaio. Pipeta automtica (100 l). Lmina de microscopia. Microscopio tico com objetiva de 100X.

Corante supravital: Novo azul de metileno (NAM) 0,5%: NAM.............................................................. 0,5g Formalina...................................................... 1 ml Soluo aquosa NaCl 0,85% q.s.p.............100 ml Azul de cresil brilhante 1%: Azul de cresil brilhante..........1g Citrato de sdio P.A ..............0,4g Soluo fisiolgica q.s.p .......100 ml. Procedimentos 1. Homogeneizar o sangue do frasco. 2. Em um tubo de ensaio pipetar 50 l de sangue e 50 l de novo azul de metileno ou azul cresil brilhante. 3. Homogeneizar com a prpria pipeta e aguardar 10 - 20 minutos (tempo depende do tempo de maturao do corante). 4. Homogeneizar novamente por ressuspenso. 5. Confeccionar duas lminas conforme item 1.5. 6. Contar 500 clulas e quantificar a porcentagem de eritrcitos reticulados e pontilhados. Desconsiderar as formas pontilhadas em felinos. 6. PESQUISA DE HEMATOZORIOS

MTODO: Exame direto em hemoconcentrado. Fundamento Pesquisa dos gneros Anaplasma, Babesia, Filaria, Haemobartonella, Erlichia, Trypanosoma, Hepatozoon e Eperitrozoon so mais eficientes em hemoconcentrados obtidos por centrifugao do sangue quando comparado a pesquisa em esfregaos sanguneos. Eritrcitos parasitados e infectados comumente apresentam alteraes morfolgicas que dificultam a sua sedimentao de modo que concentram-se na parte superior da massa eritride ou ficam misturados aos leuccitos (capa leucocitria avermelhada).

Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos e mantido refrigerado por no mximo 24 horas. Materiais e equipamentos Tubo Wintrobe. Centrfuga comum. Agulha inox de 15 cm. Seringa 5 ml. Lmina de microscopia. Corante Leishman. Procedimentos 1. Homogeneizar o sangue. 2. Com auxlio de uma agulha e seringa preencher o tubo de Wintrobe at a marca 100. 3. Centrifugar o tubo a 2.750 G ( 3.500 rpm) por 10 minutos. 4. Com o auxlio da seringa e agulha descartar o plasma e retirar a camada de leuccitos. 5. Realizar esfregao e corar com Leishman, conforme descrito no item 1.5. 7. DETERMINAO DA CONCENTRAO SANGUNEA DE PLAQUETAS

Mtodo: Contagem manual e direta Fundamento A contagem de plaquetas obtida aps diluio do sangue obtido com EDTA com soluo diluidora apropriada para cada espcie e posterior contagem em hemocitmetros. A soluo diluidora de Brecher pode ser utilizada em todas as espcies de animais domsticos. As plaquetas nucleadas (trombcitos) das aves, rpteis e peixes podem ser quantificadas utilizando-se o lquido diluidor de eritrcitos. Neste caso h necessidade de treino e experincia citolgica para diferenciar os trombcitos que so um pouco menores e arredondados que os eritrcitos. Amostra: Sangue total em frasco plstico ou de vidro siliconizado contendo EDTA-K (1,8 mg/ml de sangue), sem fibrina e/ou cogulos, mantido refrigerado por no mximo 24 horas. A puno deve ser nica, sem garroteamento excessivo do vaso e sem formao de bolha dentro da seringa.

Materiais e equipamentos Pipeta de Thoma para eritrcitos. Mangueira de ltex. Cmara de Neubauer espelhada. Lamnula de cristal para cmara. Agitador de pipeta de Thoma. Papel absorvente. Registrador de clulas. Microscpio com objetiva 40X. Soluo de Brecher: Oxalato de amnio PA.......................... 1 g gua destilada qsp.............................. 100 ml Procedimentos 1. Homogeneizar a amostra de sangue. 2. Aspire a soluo de Brecher at a marca 1 pipeta de Thoma para eritrcitos (Fig. 11A) e em seguida elimine o contedo assoprando.

Figura 11. Principais procedimentos da contagem manual de plaquetas no sangue. (A) Lavagem da parte capilar da pipeta de Thoma de eritrcitos aspirando e desprezando o diluente; (B) Aspirao do sangue trombocitopnico at a marca 1; (C) Limpeza da parte externa da pipeta; (D) Aspirao do diluente at a marca 101. (E) Homogeneizao por um minuto com agitador de pipetas; (F) Preenchimento de um dos lados da cmara de Neubauer. 3. Aspire o sangue at a marca 0,5, se o paciente for muito trombocitopnico, dilua menos o sangue (1:100), aspirando-o at a marca 1 (Fig. 11B).

4. Retirar o sangue da parte externa da pipeta com auxlio de um papel (Fig. 11C) e completar com o lquido diluente de Brecher at a marca 101 (Fig. 11D). 5. Agitar a pipeta por pelo menos um minuto no agitador automtico (Fig. 11E) ou manualmente, durante dois minutos, realizando movimentos duplos (horizontal e vertical) semelhante a tocar pandeiro. 6. Desprezar as trs primeiras gotas e preencher um dos lados da cmara de Neubauer (Fig. 11F) evitando extravasamento nas fossas. 7. Dentro de uma cmara mida esperar em repouso por 15 minutos. Observar se ocorreu distribuio homognea das clulas na rea de contagem. 8. Utilizando aumento de 400X, contar as plaquetas em toda rea da cmara (nove quadrados), tendo o cuidado de no contar a mesma clula duas vezes (Fig.12). Para tal padronizar a leitura de modo a considerar apenas as plaquetas internalizadas e que tocam as linhas superiores e as do lado direito de cada retculo. 9. Para obter a concentrao de plaqueta por microlitro, some o nmero de clulas contadas em toda rea da cmara e multiplicar o valor por 222,22 se a diluio foi de 1:200 ou por 111,11 se a diluio foi de 1:100. Multiplicar o valor por microlitro por 100.000 para expressar o resultado em nmero de plaquetas por litro de sangue.

Figura 12. Viso em aumento de 50X da rea de contagem de plaquetas (quadriculados vermelhos) em cmara de Neubauer melhorada. O nmero leuccitos contados na rea vermelha deve ser multiplicado pelo valor que corrige volume total (1/0,9 mm3 = 1,11) e pela correo da diluio utilizada (200 ou 100), ou simplesmente multiplicado por 222,22 ou 111,11.

8. TEMPO DE COAGULAO. Mtodo: Lee-White Fundamento: O fator XII (Hageman) da coagulao ativado quando em contato com a parede de vidro do tubo de ensaio. Amostra: Sangue total sem anticoagulante obtido por puno nica e sem garroteamento excessivo. Materiais e equipamentos Agulha estreis 25 x 7 mm. Seringa plstica 5 ml. Banho-maria a 37 oC. Cronmetro. Tubos de ensaio de vidro 10 x 100 mm. Procedimentos 1. Numerar os tubos de ensaio (1, 2 e 3) e lev-los ao banho-maria a 37oC para praquecimento. 2. Utilizando seringa plstica e agulha estril, coletar 3ml de sangue do animal. 3. Remover a agulha da seringa e transferir imediatamente 1ml do sangue para cada um dos 3 tubos e deix-los no banho-maria. 4. Inverter o tubo 1 com movimento suave (ngulo de 45o) a cada 30 segundos de intervalo, retornando o tubo para o banho-maria at o surgimento do cogulo. 5. Depois de coagulado o tubo 1, repetir o procedimento do item 4 com o tubo 2 e posteriormente com o tubo 3. 6. O tempo de coagulao sangnea (em segundos) determinado entre o momento em que o sangue entrou na seringa at o instante da coagulao no tubo 3. 9. URINLISE TIPO I Amostra: Urina protegida da luz mantida no mximo por duas horas sob refrigerao entre 4 e 8 C. Na identificao da amostra deve constar o tipo de colheita (mico, cistocentese ou cateterismo vesical) e os medicamentos utilizados pelo paciente nas ltimas 48 horas.

Materiais e equipamentos Tubo de ensaio ou frasco. Tubo de ensaio de fundo cnico (10-15ml). Fita reagente. Papel absorvente. Refratmetro clnico. Centrfuga convencional para tubos 15 ml. Lmina microscopia. Lamnula (25x25mm). Pipeta automtica. Microscpio com objetiva de 10X e 40X. 9.1. Exame fsico Procedimento 1. Em um tubo de ensaio de vidro coloque 5 ml de urina. 2. Imediatamente aps abrir o frasco contendo a urina, classifique o odor em uma das categorias: - Sui generis (normal da espcie). - Ptrido (degradao protica oriunda de inflamao ou necrose tecidual). - Adocidado (presena de corpos cetnicos). - Amoniacal (presena de infeco por bactrias produtoras de urease). - Medicamentoso (presena de metablicos de medicamentos excretados por via urinria). 3. Coloque a urina em tubo de ensaio e contra um fundo branco (fig.13 A) classifique a sua colorao em uma das categorias: - Amarelo-citrino (normal). - Amarelo-palha (poliria). - Amarelo-escuro (oligria). - Amarelo-ouro (presena de bilirrubina). - Vermelho-vivo (presena de pigmentos medicamentosos e de alimentos, hematria ou hemoglobinria recente). - Marrom-enegrecido (hematria-hemoglobinria antinga). - Verde-azulado (presena de bactrias, pigmentos medicamentosos e de alimentos). - Esbranquiado (Piria ou critalria intensa). 4. Contra um papel branco contendo texto avalie o aspecto (Fig.13 A). Se for possvel ler o texto classifique o aspecto da urina como lmpido, caso contrrio, como turvo. O aspecto da urina da maioria dos animais normais lmpido, com exceo dos eqdeos,

nos quais geralmente turvo devido ao grande nmero de cristais de carbonato de clcio e muco (o muco ocorre principalmente nas fmeas). 5. Coloque uma gota de urina em um refratmetro previamente calibrado com gua destilada. Com o aparelho posicionado contra a luz (Fig. 13B), leia a escala da direita para quantificar a densidade urinria. 9.2. Exame qumico Procedimento 1. Utilize uma tira reagente para urinlise recm retirada do frasco e feche-o imediatamente para evitar a absoro de umidade nas zonas reativas. 2. Mergulhe rapidamente a tira reagente na urina contida em um tubo de ensaio, garantindo que todas as zonas de teste estejam umedecidas (Fig. 13C). Este procedimento no deve demorar mais que uns poucos segundos. Em caso de pequeno volume, a urina pode ser colocada diretamente sobre as zonas de teste com auxlio de uma pipeta.

Figura 13. Principais procedimentos da urinlise tipo I. Avaliao da cor e aspecto da urina contra um fundo branco com texto (A) - o tubo da esquerda representa uma urina normal amarelo-citrino com aspecto lmpido que permite a visualizao das letras do texto, enquanto que o da direita representa uma urina anormal com cor mbar e turva. Uso de refratmetro para determinao da densidade urinria (B). A fita teste para o exame bioqumico submergida (C) e retirada (D) sem permitir contato da rea reativa com a parede do tubo. Utilizao de papel absorvente (E) para evitar que o excesso de urina numa rea reativa contamine outra zona de reao. Leitura das reaes utilizandose a escala contida no frasco (F). 3. Ao retirar a fita, encoste sua lateral na parede do tubo de ensaio, para eliminar o excesso de urina (Fig.13C). Mantenha a fita posicionada na horizontal e retire o

excesso de urina com papel absorvente (Fig. 13D) para evitar transferncia de lquido de uma zona reativa para outra. 4. A leitura dever ser realizada entre 1 e 2 minutos, conforme a recomendao do fabricante. Cada reao deve ser comparada com a escala de cor contida no frasco (Fig.13E). A fim de se evitar a interferncia na leitura das cores de reao, amostras com hematria devem ser previamente centrifugadas e apenas o seu sobrenadante deve ser submetido ao exame qumico. 9.3. Exame do sedimento Procedimento 1. Colocar 5 ml da amostra de urina em um tubo de ensaio de fundo cnico e centrifuglo em baixa rotao (1500 rpm) por 5 minutos. 2. Desprezar o sobrenadante at a marca 0,5 e em seguida ressuspender o sedimento utilizando uma pipeta automtica. 3. Colocar 1 gota (20 l) do sedimento em uma lmina de microscopia limpa e cobr-la com uma lamnula. 4. Examinar o sedimento no microscpio, primeiro com a objetiva de 10x para uma visualizao de toda rea e em seguida com a de 40x para identificar as estruturas presentes, observando em torno de 30 campos. 5. Fazer uma mdia dos achados e anotar os resultados em unidades por campo para os diferentes tipos de clulas (leuccitos, eritrcitos, clulas renais, da pelve renal, de transio, vaginal e prepucial) e cilindros (hialino, hemtico, leucocitrio, misto, granuloso, creo ou gorduroso). 6. Quantifique em cruzes (1+, 2+ e 3+) a presena de espermatozides, bactrias, cristais e outros achados. 10. BIOQUMICA SRICA. Os procedimentos bioqumicos variam com o tipo de equipamento, a metodologia e as orientaes tcnicas do fabricante dos reagentes. Independentemente das caractersticas do sistema bioqumico, todos os laboratrios devem buscar minimizar seus erros analticos realizando rigoroso controle de qualidade interno para avaliar sua impreciso e controle externo para avaliar a inexatido de seus resultados. Segundo a Sociedade Brasileira de Patologia Clnica, 70% dos erros laboratoriais so pranalticos, 10% analticos e 20% ps-analticos.

10.1. Controle interno dos erros pr-analticos provvel que a porcentagem de erros pr-analticos seja ainda maior na Medicina Veterinria uma vez que as amostras freqentemente so colhidas, acondicionadas e encaminhadas por terceiros e no pelo prprio laboratrio. Para minimizar os erros pr-analticos o laboratrio deve orientar seus clientes quanto aos cuidados com a colheita das amostras. Para anlises bioqumicas, o jejum habitual de 8 horas, sendo de 12 a 16 horas para triglicrides. O jejum acima de 24 horas promove elevao na concentrao de triglicrides por estmulo fisiolgico mobilizando os lpides que podem afetar vrias anlises (Ex: ALT, AST, GGT, FA etc). A restrio medicamentosa fundamental, uma vez que muitas drogas e seus derivados podem causar falsas elevaes e diminuies dos resultados bioqumicos. O uso imprprio de alguns anticoagulantes, a lipemia e hemlise so causas importantes de erros pr-analticos em laboratrios clnicos de rotina. O tempo e a temperatura de conservao inadequada so fontes de erros que mais freqentemente afetam laboratrios de pesquisa que armazenam por longo perodo suas amostras. 10.2. Controle interno das anlises bioqumicas

1. Conferir o bom estado de manuteno das amostras, dos reagentes, pipetas e do analisador bioqumico. 2. Realize a calibrao do sistema bioqumico utilizando um calibrador comercial confivel. 3. Repetir 20 vezes a anlise bioqumica de uma amostra controle nvel I (normal) e II (patolgico) em um sistema previamente calibrado. 4. Utilizando a planilha eletrnica Excel, calcule o valor mdio e desvios-padro dos 20 valores obtidos do soro controle e crie um grfico de Levey-Jenning a partir um, dois e trs desvios-padro positivos e negativos em relao mdia (Fig.14). 6. Durante o processamento das amostras de rotina, realize uma nova anlise dos soros controles e compare o resultado com os da curva de Levey-Jenning (Fig.15).

Figura 14. Grfico de Levey-Jenning, feito em planilha Excel, para o controle interno de alanina aminotransferase (ALT). Linhas horizontais verde, amarela e vermelha, respectivamente, representam um, dois e trs desvios-padro para mais e para menos do valor mdio (linha azul).

7. Se ocorrer a transgresso de uma das regras de Westgard (13s, 22s, 41s ou 10X) adotadas no controle de qualidade do laboratrio (Fig.15), deve-se realizar as medidas corretivas necessrias para controlar a fonte do erro antes de repetir as anlises da rotina.

Figura 15. Grfico de Levey-Jenning para controle interno da qualidade da determinao srica de alanina aminotransferase (ALT) expressando diferentes transgresses s regras de Westgard, de acordo com o valor de um nico soro controle (pontos pretos). Sistema analtico sob controle apresenta valores que oscilam acima e abaixo da linha mdia (azul), sempre entre os limites das linhas amarelas (dois desvios padro). Um nico valor do controle superior a dois desvios-padro (12s, dia 3) indica alerta, porm no implica na rejeio dos resultados da rotina. Valor superior a trs desvios-padro

(13s, dia 7) indica erro aleatrio. Dois valores consecutivamente superiores a dois desvios-padro acima ou abaixo da mdia (22s, dias 11 e 12) indicam erro sistemtico. Quatro valores de controle consecutivos acima de um desvio-padro abaixo ou acima da mdia (41s, dias 15 a 18) indicam erro sistemtico. Valores de controle 10 vezes consecutivos sempre acima ou abaixo da mdia, independente do grau de variao (10X, dias 19 a 28) indicam erro sistemtico.

11. PESQUISA DE GORDURA NAS FEZES. Mtodo: Qumico-microscpico

Fundamento: A gordura neutra presente nas fezes tinge-se em laranja-vermelho na presena de Sudam II ou III, enquanto que os cidos graxos apenas so evidenciados aps acidificao e aquecimento da amostra fecal. A estimativa da quantidade de gordura nas fezes feita por comparao com amostra fecal controle obtida de um animal sadio submetido mesma alimentao do paciente. Amostra: Fezes frescas ou mantidas refrigeradas por at 24 horas. Materiais e equipamentos cido Actico Glacial. Bico de Bunsen. Basto de vidro. Lminas e lamnulas para microscopia desengorduradas. Microscpio ptico com objetiva de 10X. Corante: Sudam II ou III (soluo alcolica saturada) Sudam II ou III .............................................................1 g lcool a 70% + Acetona (partes iguais) q.s.p...................100 ml. Procedimento 1. Misturar uma pequena poro de fezes frescas (equivalente a um gro de arroz) com soluo salina sobre a lmina. 2. 3. 4. Colocar duas gotas de Sudam II ou III e misturar bem com um basto de vidro. Cobrir com a lamnula. Examinar ao microscpio com aumento 100x e 400x; se houver a presena de gordura neutra nas fezes, estas se apresentaro como glbulos corados em alaranjado e vermelho (Fig.16A). 5. Repetir o processo (passos 1, 2 e 3) adicionando previamente cido actico s fezes.

6. 7.

Aquea levemente a lmina com auxlio de um bico de Bunsen. Examinar ao microscpio com aumento 100x e 400x. A reao forte com Sudam (vermelho) indica presena de gordura na forma de cidos graxos.

Figura 16. Presena de gordura neutra (gotculas vermelhas) em fezes coradas com Sudam II (A). Presena de amido (seta preta) e fibra parcialmente digerida (seta branca) em fezes coradas com lugol (B). Imagens com aumento 100X. 12. PESQUISA DE AMIDO E FIBRAS NAS FEZES. Mtodo: Qumico-microscpico Fundamento: O amido nas fezes tinge-se de preto na presena de iodo. As fibras no digeridas so facilmente evidenciadas na presena de soluo iodada de lugol. A quantidade de amido presente nas fezes do paciente comparada com amostra fecal de um animal sadio submetido mesma alimentao do paciente. Para melhor anlise da presena de amido e fibras musculares nas fezes, deve-se oferecer ao animal, nas refeies que antecederem o exame, uma dieta caseira contendo arroz e carne. Amostra: Fezes frescas ou mantidas refrigeradas por at 24 horas. Materiais e equipamentos Basto de vidro. Lminas e lamnulas para microscopia limpas e desengorduradas. Microscpio ptico com objetiva de 10X. Soluo forte de lugol:

Iodo .............................................. 1g Iodureto de potssio .....................2g gua destilada q.s.p......................50 ml Procedimento

1. Misturar uma pequena poro de fezes frescas (equivalente a um gro de arroz) com soluo salina sobre a lmina. 2. Colocar duas gotas de lugol e misturar bem com um basto de vidro. 3. Cobrir com a lamnula. 4. Examinar ao microscpio com aumento 100x e 400x. O amido nas fezes se apresentar como glbulos corados em preto e as fibras no digeridas apresentamse na forma de cilindro amarelado com aresta e estrias bem visveis (Fig.16B).

13. PESQUISA DE TRIPSINA FECAL. Mtodo: Filme radiogrfico. Fundamento: A emulso protica que reveste o filme radiogrfico digerida pela tripsina fecal em meio alcalino. Amostra: Fezes frescas ou mantidas refrigeradas por at 24 horas. Materiais e equipamentos Banho-maria a 37 oC. Tiras (15 cm x 0,8 cm) de filme de raio-x usadas (parte preta). Tubos de ensaio de 100 x 10 mm. Soluo aquosa de bicarbonato de sdio 5%. Procedimento 1. Em um tubo A misturar uma parte de fezes frescas ( 1 ml) de um animal sadio com nove partes de soluo de bicarbonato de sdio 5%. Repetir o procedimento em um tubo C utilizando fezes do paciente suspeito de insuficincia pancretica. Em um tubo B controle adicione apenas soluo de bicarbonato (Fig.17A). 2. Colocar uma fita de raio-x em cada um dos tubos e incuba-los por duas horas em temperatura ambiente (Fig.14B) ou por uma hora a 37 C em banho-maria (Fig.17C).

3. Lavar as fitas em gua corrente. Na presena de tripsina fecal a emulso protica do filme radiogrfico desaparecer (Fig.17D, fita A). Nos casos de insuficincia pancretica (Fig.17D, fita C) e no tubo controle (Fig.17D, fita B) o filme se manter inalterado. Eventualmente, se ocorrer digesto da fita do tubo controle (B), o teste dever ser repetido com outro lote de filme radiogrfico.

Figura 17. Principais procedimentos para a pesquisa de tripsina fecal. As fezes de um animal sadio controle (A, tubo A) e do paciente (A, tubo C) so diludas em soluo de bicarbonato na proporo de (1:9) e incubada com fitas radiogrficas na temperatura ambiente (B) ou em banho-maria (C). Fezes de normais contendo tripsina fecal digerem o filme radiogrfico (D, fita A), enquanto que em amostras fecais de pacientes com insuficincia pancretica (D, fita C) ou na ausncia de fezes (D, fita B) a emulso protica no digerida, permanecendo o filme inalterado. 15. IDENTIFICAO DE FLUDOS RICOS EM PROTENA Mtodo: Rivalta Fundamento: As protenas das efuses em soluo cida, quando em grande quantidade, se precipitam e geram uma reao esbranquiada visvel. Amostra: Efuses colhidas dentro de 2 horas, com ou sem anticoagulante. Materiais e equipamentos cido actico glacial gua destilada Pipeta 100 l Proveta graduada 100 ml

Procedimento 1. Colocar na proveta 100 ml de gua destilada e trs gotas de cido actico glacial. 2. Homogeneizar. 3. Com auxlio de uma pipeta, colocar uma gota da efuso bem prxima da superfcie da soluo acidificada, com o devido cuidado para que esta no escorra pela parede da proveta (Fig.18A). 4. Se a gota, ao cair na soluo, formar um rastro esbranquiado, semelhante a fumaa de cigarro, o resultado da prova positivo (Fig.18A, ver seta). 5. Para facilitar a visualizao da reao Rivalta positiva, coloque um fundo escuro fosco atrs da proveta.

Figura 18. Provas de precipitao para determinao de protenas em fluidos biolgicos. Na prova de Rivalta, a amostra dispensada bem prxima da superfcie (A). Efuso rica em protena (exsudato) ao se depositar no fundo (A) forma um rastro esbranquiado semelhante fumaa de cigarro (seta). Na prova de Pandy (B) o lquor rico em globulinas causa turvao (+) caracterstica que no ocorre em amostra negativa (-) pobre em globulinas. 16. PESQUISA DE GLOBULINA NO LQUOR Mtodo: Pandy Fundamento: Em soluo cida as globulinas do lquor, quando em grande quantidade, se precipitam e turvam o fenol utilizado como acidificante. Amostra: Lquor colhido dentro de 2 horas, com ou sem anticoagulante.

Materiais e equipamentos Tubos de ensaio 10 x 100 mm. Pipeta de 1000 l. Reativo de Pandy: cido fnico cristalizado ................................................................... 10 g gua destilada q.s.p......................................................................... 100 ml Procedimento 1. Colocar 1 ml de reativo de Pandy em dois tubos de ensaios. 2. Acrescentar uma gota do lquor em apenas um tubo e agitar. 3. Comparar o aspecto com o tubo controle. 4. A reao considera positiva (excesso de globulina) se o tubo que contm o lquor apresentar turvao em relao ao tubo controle (Fig.18B). 16. REFERNCIAS COLES, E.H. Patologia clnica veterinria. 3ed. So Paulo, SP: Ed: Manole, 1984.

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