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MICROBIOLOGIA CLNICA

COCOS GRAM POSITIVOS (CGP) Dentre os cocos Gram positivos sero enfatizados alguns gneros: Staphylococcus, Streptococcus e Enterococcus. Aps avaliao preliminar da caracterstica macroscpica e crescimento da colnia microbiolgica, bem como realizao do esfregao e colorao de Gram confirmando a presena de CGP em microscpio ptico (objetiva 1000X imerso). A identificao e diferenciao dos gneros dos cocos Gram positivos se inicia com a prova da catalase.

PROVA DA CATALASE

Finalidade Verificar a presena da enzima catalase que decompe H2O2 em H2O + O2 e dessa forma, distinguir os gneros Staphylococcus dos gneros Streptococcus e Enterococcus. Procedimento Com ala bacteriolgica, retirar duas ou trs colnias do meio de cultura. Colocar a colnia sobre a lmina de vidro ou de fundo escuro e adicionar uma gota de H2O2. Leitura Observar a formao de bolhas. Interpretao Formao de bolhas indica ser o gnero Staphylococcus. Sem formao de bolhas indica serem os gneros Streptococcus ou Enterococcus. COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE POSITIVA PROVA DA COAGULASE EM TUBO

Finalidade Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada que, reagindo com um fator plasmtico, forma um complexo que atua no fibrinognio do plasma formando a fibrina. Procedimento Colocar 0,5 mL de plasma comercial em tubo de ensaio. Adicionar um alada de colnia diretamente no plasma comercial (plasma de coelho liofilizado). Identificar e incubar por 4 h a 352C em estufa ou banho-maria; caso no haja formao de cogulo, incubar por 24h. Leitura Formao de cogulo observada pela inclinao suave do tubo. Interpretao Formao de cogulo inteira ou parcial identifica o Staphylococcus aureus. No formao de cogulo identifica os Staphylococcus coagulase negativa (SCN).

TESTE DA DNase (Azul de toluidina O)

Finalidade Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o cido nuclico (DNA). Procedimento Fazer um inculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio DNase; Identificar a placa e incubar a 352C por 18 24h. Na placa pode ser inoculada com vrias cepas. Leitura Formao de um halo cor-de-rosa ao redor do crescimento bacteriano. Interpretao Formao de halo cor-de-rosa identifica Staphylococcus aureus. Crescimento bacteriano sem formao de halo cor-de-rosa identifica os Staphylococcus coagulase negativa (SCN). OBS: este teste pode tambm ser usado para identificao dos bacilos Gram negativos no fermentadores de glicose. TESTE FERMENTAO DO MANITOL

Finalidade Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de sdio. Procedimento Semear com auxlio de ala bacteriolgica as colnias (3-4 colnias) na superfcie do gar manitol. Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h. Leitura Formao de superfcie amarela produzida pelas colnias no gar manitol. Interpretao Formao de superfcie amarela pelas colnias identifica Staphylococcus aureus. Meio permanece inalterado na superfcie, identifica Staphylococcus coagulase negativa (SCN). OBS: outras espcies de Staphylococcus, com pouca frequncia, tambm podem produzir cido a partir do manitol, portanto tambm devem ser testados quanto produo de coagulase.

TESTE DE RESISTNCIA- NOVOBIOCINA Finalidade Verificar se o microrganismo resistente novobiocina. Procedimento Semear a colnia em gar Mueller-Hinton, atravs da tcnica de execuo do antibiograma. Com auxlio de pina estril, colocar um disco de novobiocina 5g/mL. Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h. Leitura Formao de halo de inibio, que deve ser medido. Interpretao Formao de halo 16 mm identifica Staphylococcus saprophyticus. TESTE DE RESISTNCIA- POLIMIXINA B Finalidade Verificar se o microrganismo sensvel ou resistente a polimixina B. Procedimento Semear a colnia em gar Mueller-Hinton, atravs da tcnica de execuo do antibiograma. Com auxlio de pina estril, colocar um disco de polimixina B. Identificar a placa e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h. Leitura Formao ou ausncia de halo de inibio. Interpretao Formao de halo, Staphylococcus haemolyticus, S. saprophyticus, S. intermedius e S. hominis. Ausncia de halo, Staphylococcus aureus ou S. epidermidis. OBS: Para espcie Staphylococcus lugdunensis a sensibilidade ou resistncia a polimixina B varivel. TESTE DO PYR (pyrrolidonil arilamidase)

Finalidade O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida tambm por alguns Staphylococcus coagulase negativa (SCN). Procedimento Com auxlio de uma pina, retirar um disco de PYR do frasco e coloc-lo sobre uma lmina ou placa de Petri vazia. Pingar uma gota de gua destilada estril (no utilizar salina, pois torna a reao mais lenta e menos intensa). Realizar um esfregao (de preferncia com palito de madeira) com bactria a ser testada, recmisolada, sobre o disco de PYR umedecido. Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR (A reao ocorre em at um minuto). Interpretao Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha. Os Staphylococcus lugdunensis, S. haemoliticus e S. intermedius so PYR (+). O aparecimento de colorao amarela ou laranjada indica resultado negativo.

PROVA COMPLEMENTAR (ORNITINA) para Staphylococcus lugdunensis e S. haemolyticus. Finalidade Avalia a habilidade enzimtica dos S. lugdunensis e S. haemolyticus em degradar o aminocido ornitina, resultando em uma alcalinizao do meio. Procedimento Com auxlio da ala ou agulha de repique microbiolgica, introduzir com uma picada central no gar ornitina 03 a 04 colnias do Staphylococcus coagulase negativa (SCN) a ser testado. Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h. Leitura Formao de cor amarela ou roxa no tubo contendo ornitina. Interpretao Teste (+): Meio com colorao roxa Teste (-): Meio com colorao amarela

Principais sndromes infecciosas causadas pelos Staphylococcus spp: Pneumonias, bacteremias, infeces de pele e tecidos moles, meningites, infeces relacionadas ao uso de prteses e cateteres venosos. S. aureus: o CGP mais importante entre os Staphylococcus coloniza 20 a 40% dos adultos, sendo encontrados principalmente em narinas anteriores. (possui a enzima coagulase). S. epidermidis: faz parte da microbiota normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores est relacionado com infeces associadas ao uso de cateteres endovenoso, endocardites, entre outras. (menos virulenta do que o S. aureus, (biofilme)). S. saprophyticus: causa infeces urinrias agudas, sobretudo em mulheres jovens, saudveis e sexualmente ativas. (infeco do TGU, cistite, uretrite e pielonefrite). S. haemolyticus: presente na microbiota humana normal da pele. Importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemlise na placa de gar sangue S. hominis: encontrado na pele humana e relacionado bacteremia em pacientes imunodeprimidos. S. lugdunensis: Associado a casos de endocardite. S. capitis: parte da flora normal da pele do couro cabeludo humano, face, pescoo, e das orelhas e tem sido associado com a endocardite de prtese. S. caprae: tem sido associado infeco da circulao sangunea, do trato urinrio, ossos e articulaes.

COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE NEGATIVA A classificao do tipo de hemlise fator primordial para indicar quais as provas de identificao devem ser realizadas a fim de chegar a espcies de cocos Gram positivo, catalase negativa.

TESTE DE SENSIBILIDADE BACITRACINA

Finalidade Diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A) de outras espcies de CGP catalase negativa. Procedimento Com auxlio do swab umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras -hemolticas da placa primria ou reisolamento. Semear as colnias presentes no swab, em gar sangue com movimentos retilneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfcie do AS um disco de bacitracina 10mcg. I identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 352C em estufa por 18-24h. Leitura Formao de halo de inibio. Interpretao A presena de qualquer halo de inibio ao redor do disco interpretada como sensvel a bacitracina e indicando a espcie S. pyogenes. TESTE DE CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen)

Finalidade O teste visa identificao de cepas de Streptococcus agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP que atua sinergicamente com a -hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em gar sangue. Procedimento Semear um inculo na horizontal de S. aureus ATCC 25923 (ou cepa de S. aureus com duplo halo de hemlise) de um ponto a outro da placa de AS (gar sangue). Semear perpendicularmente (90) a colnia de estreptococo -hemoltico a ser testada, sem que haja contato com a estria de S. aureus. Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 352C em estufa por 18-24h.

Leitura Visualizar a imagem de uma seta ou meia-lua no AS. Interpretao A formao de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na interseco do crescimento das duas bactrias indica que o teste positivo e indica a espcie de Streptococcus agalactiae. Se no houver formao de seta ou meia-lua, o teste negativo e a cepa no pertence ao grupo B de Lancefield. TESTE DE PYR (pyrrolidonil arilamidase)

Finalidade O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo Streptococcus pyogenes, mas no pelos demais estreptococos -hemolticos. Colnias -hemolticas de Enterococcus spp. podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste teste. Procedimento Com auxlio de uma pina, retirar um disco de PYR do frasco e coloc-lo sobre uma lmina ou placa de Petri vazia. Pingar uma gota de gua destilada estril (no utilizar salina, pois torna a reao mais lenta e menos intensa). Realizar um esfregao (de preferncia com palito de madeira) com bactria a ser testada, recmisolada, sobre o disco de PYR umedecido. Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reao ocorre em at um minuto. Interpretao Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha. Os Streptococcus pyogenes e os Enterococcus spp. so PYR positivo. O aparecimento de colorao amarela ou laranjada indica resultado negativo. TESTE GAR BILE-ESCULINA

Finalidade Diferencia os Enterococcus spp. de outros Streptococcus spp., tendo como princpio a hidrlise da esculetina presente no meio de cultura bile-esculina pela bactria; formando esculetina e dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presente no meio bile-esculina tornando-o enegrecido.

Procedimento Semear com auxlio de ala bacteriolgica as colnias (3-4 colnias) do gar sangue na superfcie do gar Bile-esculina. Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h. Interpretao Presena de cor enegrecida na superfcie do meio bile-esculina, identifica Enterococcus spp. Meio permanece inalterado na superfcie do meio bile-esculina, identifica outros Streptococcus spp. TESTE DE CRESCIMENTO EM NaCl 6,5% Finalidade Determinar a capacidade do microrganismo de crescer em altas concentraes de sal. Procedimento Com auxlio de ala inocular 03 a 04 colnias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador). Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 24h. Interpretao A turvao ou mudana de cor (no caso adio indicador) indica crescimento de Enterococcus spp. PROVA DA OPTOQUINA

Finalidade Frmaco utilizado para indicar se o Streptococcus -hemoltico um pneumococo. A optoquina uma droga solvel em gua que se difunde rapidamente em meio de cultura slido. Procedimento Com auxlio do swab umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras alfa-hemolticas da placa primria ou reisolamento. Semear as colnias presentes no swab, em gar sangue com movimentos retilneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfcie do AS um disco de optoquina 5g. Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 352C em estufa por 18-24h. Interpretao Presena de halo de inibio 14 mm = Sensvel a optoquina Streptococcus pneumoniae. O pneumococo pode apresentar halos < 14 mm, como os Streptococcus do grupo viridans. Deve-se ento ser realizado o teste de bile solubilidade. TESTE DE BILE-SOLUBILIDADE (desoxicolato de sdio 2%) Finalidade Capacidade do desoxicolato de sdio (sal biliar) de lisar seletivamente o Streptococcus pneumoniae em fase logartmica do crescimento. Este sal ativa as enzimas autolticas (autolisinas) produzidas pelo pneumococo, acelerando a reao ltica natural da bactria.

Procedimento Preparar uma suspenso bacteriana densa a partir da cultura recente. Utilizar 02 tubos de ensaio transparentes, para o teste: Tubo controle C e Tubo teste T. Adicionar soluo de desoxicolato de sdio 2% ao tubo T e soluo salina a 0,85% ao tubo C. Os volumes em cada tubo devem ser iguais 0,5ml (500L). Adicionar a cada tubo o mesmo volume da suspenso bacteriana. Homogeneizar e incubar a 352C em estufa microbiolgica. Fazer a leitura imediatamente, aps 1h e at 2h de incubao. Interpretao Reao Positiva = TuboT lmpido ou turvao visivelmente menor que o Tubo C, confirma a espcie Streptococcus pneumoniae. Reao Negativa = Tubo T com turvao igual ao tubo C. TESTE SULFAMETOXAZOL+TRIMETOPRIM (STX) Finalidade Verificar se os estreptococos no pertencem ao grupo A, B ou D de Lancefield. Procedimento Com auxlio do swab umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras beta-hemolticas da placa primria ou reisolamento. Semear as colnias presentes no swab, em gar sangue com movimentos retilneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfcie do AS um disco de STX. Identificar e incubar em jarra de vela, a 352C por 18-24h. Interpretao Ausncia de halo (Resistente): Streptococcus pyogenes; S. agalactiae e Enterococcus spp. Presena de halo (Sensvel): Streptococcus no A, B ou D. TESTE DA HIDRLISE DO HIPURATO

Finalidade Esse teste visa habilidade de um organismo para hidrolisar o hipurato. Procedimento Coloque 0,4 ml de gua destilada ou desionizada estril num tubo pequeno (13x100mm) e adicione um disco de hipurato. Incube o tubo em banho-maria ou numa incubadora entre 35 e 37C, durante 2 h. Aps a incubao, adicione 0,2ml (5 gotas) de reagente ninidrina a cada tubo e agite suavemente. Volte a incubar o tubo durante 10 a 15 minutos e leia a reao. Interpretao Uma reao positiva caracterizada pela formao de uma cor prpura-azulada na soluo e indica a presena do Streptococcus agalactiae. Uma reao negativa caracterizada pela ausncia de uma alterao de cor na soluo.

TESTE DE MANITOL, SORBITOL E ARABINOSE. Finalidade Determinar se o Enterococcus spp. em estudo capaz de consumir os aucares manitol, sorbitol e arabinose, sendo detectado pela produo de cido. Procedimento Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias por picada central nos tubos de meio de cultura manitol, sorbitol e arabinose. Identificar e incubar o tubo a 352C em estufa por 24h. Leitura Consumo do manitol/sorbitol/arabinose. Cor rosa intenso dos tubos: Reao Positiva. Cor rosa claro dos tubos: Reao Negativa.

TESTE DA ARGININA

Finalidade Determinar se o Enterococcus spp em estudo capaz de hidrolisar o aminocido arginina. Procedimento Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias, depositando o inculo na parede do tubo, abaixo do leo mineral. Incubar o tubo a 352C em estufa por 24h. Leitura Hidrlise da arginina Cor prpura do meio mais acentuado que tubo controle: utilizao do aminocido. Cor do meio igual ou mais amarelada que tubo controle: no utilizao do aminocido. MOTILIDADE DO MICRORGANISMO

Finalidade Determinar a capacidade de movimentao do Enterococcus spp em estudo, distinguindo deste modo, a espcie do microrganismo em questo. Procedimento Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias por picada central nos tubo de meio de cultura do teste de motilidade. Identificar e incubar o tubo a 352C em estufa por 24 horas. Leitura Crescimento alm da picada, motilidade POSITIVA. Crescimento somente na picada, motilidade NEGATIVA. PIGMENTO DA COLNIA BACTERIANA Finalidade A identificao da colorao da colnia tem como finalidade auxiliar na diferenciao das espcies de Enterococcus spp. Procedimento Com auxlio de swab estril branco passar o mesmo nas colnias e verificar as cores. Leitura As colnias dos Enterococcus podem apresentar colorao branca ou amarela.

Principais sndromes infecciosas causadas pelos Streptococcus e Enterococcus spp: -Hemolticos GRUPO A: Streptococcus pyogenes pode causar faringites, impetigo, erisipela, endocardites, meningites, artrites, infeces respiratrias. Cepas produtoras de toxinas podem causar a febre escarlatina e choque txico. -Hemolticos GRUPO B: Streptococcus agalactiae, pode causar infeces graves em neonatologia, como meningite e sepse. Em adultos com neoplasias, imunodeficincias e diabetes mellitus podem predispor infeces como endocardite, bacteremia, infeces de pele e tecidos moles, pneumonia e osteomielites. -Hemolticos GRUPO D: S. bovis, associado a infeces humanas e animais; S. equinus: predominantemente em cavalos, raro agente causador de bacteremia e endocardite no homem; Streptococcus pneumoniae: meningite, otite mdia aguda, artrite sptica, peritonite e derrame pleural e principal agente causador de pneumonia bacteriana comunitria, causa meningite bacteriana em adultos; (principal fator de virulncia: cpsula de polissacardeos). Streptococcus do grupo viridans: S. sanguis, S. oralis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans e S. salivarius so -hemolticos e no hemolticos e fazem parte da microbiota normal da cavidade oral, trato gastrointestinal e trato genital. Entretanto podem estar associados endocardite subaguda, especialmente em portadores de prteses valvulares. Enterococcus spp: so causadores de endocardite, infeces no trato urinrio (ITU), infeces da corrente sangunea, e de stio cirrgico e intra-abdominal. Mas tambm infrequentemente podem causar pneumonias e meningites em pacientes debilitados; bem como empiema em portadores de doena heptica. Possuem resistncia s penicilinas, cefalosporinas e vancomicina; as espcies mais importantes so E. faecalis e E. faecium.