INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA LABORATORIO DE BIOLOGIA DE PROCARIONTES

Prctica N 9.- Cuantificacin de Bacterifagos.

Equipo 3 y 8: Seccin 2.-

Castro De Aquino Dana Vianey Escobar Gonzlez Roberto Eduardo Franco Roberto Jurez Maldonado Rafael

Fecha: 30 de Octubre de 2013

OBJETIVOS Utilizar la tcnica ms comn y relativamente ms sencilla, para demostrar y cultivar bacterifagos presentes en aguas residuales. Determinar el nmero de placas lticas y calcular el ttulo del bacterifago.

RESULTADOS
Tabla 1.- Nmero de Placas lticas formadas por los fagos y el porcentaje de aislamiento que se obtuvo de estos en la seccin 2.

Equipo 1 2 3 4 5 6 7 8 DISCUSIN

# de placas

Dilucin

UFP/ ml

% de placas

>10000 59 >1000000 86 28 65 43

10-4 10-5 10-6 10-5 10-5 10-5 10-2

> 109 5.9 x 107 >1 x 1013 8.6 x 107 2.8 x 107 6.5 x 107 4.3 x 104

100% 100% 100% 100% 100% 95% 100% 100%

Los bacterifagos son parsitos intracelulares obligados que se multiplican al interior de las bacterias, provocando su lisis. La determinacin de fagos, es observada gracias a la formacin de placas lticas. Cuando se siembra un nmero suficiente de bacterias sobre la superficie de una caja de agar nutritivo, stos forman una capa uniforme despus de algunas horas de incubacin. Si se introducen fagos, stos pueden entrar al ciclo ltico. Al liberarse nuevos fagos, estos infectan a las bacterias vecinas, de tal manera que despus de varios ciclos, pueden verse pequeos aclaramientos o placas sobre la superficie de la capa bacteriana, Dado que el nmero de placas es directamente proporcional al nmero de fagos, este mtodo es de utilidad para la deteccin y cuantificacin de fagos obtenidos en cada uno de los equipos. Existe diferentes ttulos de fago, esto debido a que en un ecosistema bacteriano pueden coexistir tanto bacterias susceptibles a la infeccin como aquellas que no lo son (resistentes). El ttulo de la preparacin viral se calcula contando el nmero de placas que produce una determinada dilucin de la muestra, y haciendo las correcciones necesarias para llegar a la cantidad de virus en la muestra original. Cada partcula infecciosa da origen a una placa de lisis, y se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). El ttulo se expresa como "UFP/ml" o "UFP/g", segn corresponda.

En la determinacin de la presencia de Fagos el porcentaje de aislamiento resulto del 100% casi en todos los equipos, con excepcin del equipo 6, que obtuvo un valor del 95%. La mayor cantidad de placas lticas se observ en los equipos 1 y 3, mientras que en los equipos y 8 se obtuvieron los valores ms bajos, el equipo 5 obtuvo alguna placa ltica, posiblemente por errores humanos al realizar las diluciones o al poner la muestra biolgica en el agar, ya que se encontraba caliente y pudieron haberse quemado, con lo cual se inhibi su crecimiento. Las diluciones en donde se llev a cabo la cuantificacin fueron en su mayora mayor a , aunque el equipo 8 utilizo los resultados arrojados por la dilucin , ya que no obtuvo formacin de placas lticas en ninguna otra dilucin. CONCLUSIN La demostracin de la presencia de bacterifagos de aguas residuales especficos para Escherichia coli logr ser positiva en todos los equipos. CUESTIONARIO 1.- Mencionar que es una placa ltica Este mtodo consiste en infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo del mismo en fase semislida. De esta manera, cuando un virus infecta una clula, su progenie slo puede migrar a las clulas inmediatamente vecinas, y no a las alejadas, ya que el medio semislido limita su movilidad. Coloreando las clulas se observarn zonas no teidas (placas de lisis), correspondientes a las clulas destruidas por la partcula infecciosa inoculada y las nuevas partculas que ella produjo, si la coloracin se realiza con un colorante vital (rojo neutro), que no mata las clulas teidas ni al virus, es posible tomar material de una placa, que contendr la progenie viral correspondiente a un nico virus infectante, constituyendo, por lo tanto, un clon. 2.- Para qu inocul un caldo nutritivo con una suspensin de E. coli adicionada de aguas residuales? La mayora de los parsitos, son especficos en relacin con sus hospederos que parasitan. Algunos virus son especficos de bacterias y se denominan virus bacterianos, bacterifagos o fagos. La mayora de las bacterias son susceptibles a ataque por bacterifagos. En los hbitats donde viven las bacterias podemos encontrar ah a sus bacterifagos especficos, y en caso de E. coli se espera obtener al bacterifago a partir del agua residual. 3. Para conocer el ttulo del fago que tena en el cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo es necesario conocer el nmero de bacterias que coloco en cada caja? No, simplemente contando los pequeos aclaramientos o placas sobre la superficie de la capa bacteriana es como se va obtener el resultado. El nmero de placas ser directamente proporcional a UFP/ ml.

4.- Explique brevemente en que consiste el ciclo ltico y en que el ciclo lisognico de un virus. En el Ciclo ltico el virus penetra a una clula o bacteria y produce copias que acaban liberndose al exterior. Este ciclo puede dividirse en cinco fases: Fase de fijacin: en la cual una protena del virus se une especficamente a una protena, receptora de la membrana plasmtica, del husped que infecta. Fase de penetracin: el virus, una vez fijado a la membrana plasmtica del husped, penetra en su interior. Puede ocurrir que no penetre el virus completo, sino que lo haga solamente su cido nucleico con algunas protenas o bien solo el material gentico. Existen diferentes mecanismos de penetracin: penetracin directa, endocitosis fusin de membranas, y combinacin de los mecanismos anteriores. Fase de biosntesis: una vez que el DNA del bacterifago llega hasta el citoplasma de la clula husped ocurre la biosntesis del cido nucleico y de la protena viral. La sntesis de protenas del husped es detenida por la degradacin del DNA del husped inducida por el virus, las protenas virales que interfieren en la transcripcin o la represin de la traduccin. Durante varios minutos despus de la infeccin no se encuentran fagos completos en la clula husped, solo se detectan componentes dispersos de DNA y protenas. El periodo de multiplicacin viral durante el cual no hay viriones infecciosos completos se denomina periodo de eclipse.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Daz, M. G. 2009.Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgicos: Morfologa y estructura bacteriana. Laboratorio de Diagnstico Clnico. 2 curso, Centro de Formacin Profesional Instituto Villaverde. Ramrez, R. M et. al. 2006. Microbiologa General, 5edicin, Facultad de Qumica, UNAM. Mxico