Universidade Federal de Ouro Preto

Programa de Ps-Graduao Engenharia Ambiental

Mestrado em Engenharia Ambiental



Davi Silva Moreira



DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALITICA POR
CROMATOGRAFIA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA
AVALIAO DA OCORRNCIA DE PERTURBADORES
ENDCRINOS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO DA
REGIO METROPOLITANA DE BELO HORIZONTE.





Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Engenharia Ambiental,
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
dos requisitos necessrios para a obteno do
ttulo: Mestre em Engenharia Ambiental
rea de Concentrao: Saneamento Ambiental


Orientador: Prof. Dr. Srgio Francisco de Aquino

Ouro Preto, MG
2008

ii

Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br


M838D MOREIRA, DAVI SILVA.
Desenvolvimento da metodologia analtica por cromatografia/
espectrometria de massas para avaliao da ocorrncia de pertubadores
endcrinos em mananciais de abastecimento da Regio Metropolitana de
Belo Horizonte [manuscrito] / Davi Silva Moreira. 2008.
123f. : il. color., graf., tabs.

Orientador: Prof. Dr. Srgio Francisco de Aquino.

Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Cincias Exatas e Biolgicas. Ncleo de Pesquisa em Recursos Hdricos
Pr-gua.

1. Belo Horizonte - Abastecimento de gua - Teses. 2. Mananciais
hdricos - Teses. 3. Anlise cromatogrfica - Teses. I. Universidade
Federal de Ouro Preto. II. Ttulo.
iii

iv





























Por falta de reflexo os projetos
fracassam, mas se realizam quando
h muitos conselheiros.

Provrbios 15,22
v
AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus por sempre estar comigo em todos os momentos. Sem Ele no
seria possvel completar esta importante etapa na vida.
Ao professor Srgio por ter acreditado na minha capacidade e ter sido um grande
professor nos ensinamentos de vida acadmica e profissional. Ao professor Robson por
ter apoiado o projeto e ajudado valiosamente com seus conhecimentos.
Aos professores do DEQUI pela dedicao em repassar seus conhecimentos a
todos ns alunos durante a graduao e mestrado.
Aos colegas da UFMG: Jacson, Lucinda e, principalmente, ao Fbio e a Eliane
que ajudaram no projeto sempre que necessrio.
Ao professor Valter por ter confiado no DEQUI-UFOP como parceiro no projeto
PROSAB 5.
Aos amigos do laboratrio Aniel, Danusa, Fernanda e Gustavo pela grande
amizade e o intercmbio de conhecimentos que foram de grande valia para a evoluo
de nossos projetos. A Miriany pela grande ajuda no final do projeto com as anlises
complementares.
Aos amigos Flaviane e Leandro que sempre estiveram comigo nos melhores e
piores momentos de UFOP, que j so seis anos. Obrigado!
A UFOP pela bolsa concedida.
A COPASA pela colaborao na coleta das amostras.
E finalmente, aos meus pais Luiz Henrique e Iolanda e aos meus irmos Saulo e
Ariel que sempre apoiaram e incentivaram mostrando que todo esforo vale a pena.
Muito obrigado!










vi
SUMRIO

Pgina
1. INTRODUO............................................................................................ 1
2. OBJETIVOS................................................................................................. 4
3. REVISO BIBLIOGRFICA................................................................... 5
3.1. O sistema endcrino.................................................................................. 5
3.2. Perturbadores endcrinos......................................................................... 7
3.2.1. Mecanismos de Ao dos Perturbadores Endcrinos............................. 9
3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endcrinos relatados em animais silvestres
e de laboratrio................................................................................................. 11
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endcrinos relatados em humanos............... 13
3.3. Anlise e monitoramento de Perturbadores Endcrinos em guas
Superficiais........................................................................................................ 14
3.3.1. Metodologias para anlise de perturbadores endcrinos....................... 15
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endcrinos em guas superficiais..... 24
3.3.3. Tcnicas de remoo de perturbadores endcrinos................................ 30
3.3.4. Consideraes finais................................................................................ 32
4. MATERIAIS E MTODOS....................................................................... 34
4.1. Desenvolvimento e Otimizao do Mtodo Analtico............................... 34
4.1.1. Amostragem, filtrao e ajuste do pH .................................................... 36
4.1.2. Extrao e concentrao dos analitos..................................................... 36
4.1.3. Secagem e suspenso dos analitos........................................................... 38
4.1.4. Anlise Cromatogrfica........................................................................... 38
4.2. Validao do mtodo analtico.................................................................. 42
4.2.1. Estabilidade............................................................................................. 43
4.2.2. Seletividade.............................................................................................. 44
4.2.3. Curva analtica........................................................................................ 44
4.2.4. Linearidade e Sensibilidade.................................................................... 47
4.2.5. Preciso................................................................................................... 47
4.2.6. Ensaio de supresso................................................................................ 48
4.2.7. Ensaio de recuperao............................................................................ 48
4.2.8. Ensaio de calibrao interlaboratorial................................................... 49
4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endcrinos nos Mananciais da
Regio Metropolitana de Belo Horizonte........................................................ 50
5. RESULTADOS E DISCUSSES............................................................... 58
5.1.Cromatografia Gasosa com Deteco por Ionizao em Chama............. 58
5.2. Cromatografia Lquida com Deteco por Espectrometria de massas -
Desenvolvimento do Mtodo Analtico............................................................. 61
5.3. Validao do Mtodo Analtico para LCMS............................................. 65
5.3.1. Estabilidade............................................................................................. 65
5.3.2. Seletividade.............................................................................................. 66
5.3.3. Curva Analtica....................................................................................... 67
5.2.4. Linearidade e Sensibilidade..................................................................... 69
5.2.5. Preciso................................................................................................... 70
vii
SUMRIO (continuao)

Pgina
5.3.6 Ensaio de Supresso................................................................................. 71
5.3.7 Ensaio de Recuperao............................................................................ 73
5.3.8. Ensaio de calibrao interlaboratorial................................................... 74
5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endcrinos em Mananciais da
Regio Metropolitana de Belo Horizonte......................................................... 76
5.5 Estimativa de valores crticos de toxicidade dos PE estudados................. 94
6. CONCLUSES............................................................................................ 97
7. PERSPECTIVAS......................................................................................... 99
8. REFERNCIAS........................................................................................... 100

























viii
LISTA DE FIGURAS


Pgina
Figura 3.1:
rgos do sistema endcrino....................................................... 5
Figura 3.2:
Funcionamento do hipotlamo..................................................... 6
Figura 3.3: Estruturas qumicas de alguns perturbadores endcrinos
comumente encontrados em guas superficiais........................... 8
Figura 3.4: Disfunes endcrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista;
(c) efeito antagonista.................................................................... 11
Figura 3.5: Diagrama esquemtico para preparao e anlise dos
perturbadores endcrinos............................................................. 16
Figura 3.6: Etapas da extrao por fase slida para isolamento de
compostos de interesse................................................................. 19
Figura 3.7: Exemplo dos dois passos genericamente associados aos
imunoensaios: A) Imobilizao do receptor especfico ao
suporte, seguido de incubao aps a adio da amostra
contendo estrognios e de anticorpos; B) Adio da soluo
adequada ao tipo de deteco pretendida..................................... 22
Figura 4.1:
Diagrama geral para preparao e anlises dos PE. .................... 35
Figura 4.2:
Cartucho SPE C18 500mg Unitech............................................. 37
Figura 4.3: Sistema de extrao em fase slida utilizado para extrao dos
analitos de interesse das amostras ambientais.............................. 38
Figura 4.4: Reao de Silanizao a partir dos analitos a serem
derivatizados (nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o
reagente de derivatizao utilizado (BSTFA).............................. 39
Figura 4.5: Diagrama esquemtico de funcionamento do espectrmetro de
massas on-trap time-of-flight.................................................. 41
Figura 4.6:
Frmula Estrutural da Fenolftalena............................................ 45
Figura 4.7: Localizao dos 3 mananciais estudados na Regio
Metropolitana de Belo Horizonte................................................ 51
Figura 4.8: Contribuio das ETAs no abastecimento da Regio
Metropolitana de Belo Horizonte................................................. 51
Figura 4.9:
Vista area ETA Rio das Velhas.................................................. 53
Figura 4.10: Local de amostragem para gua bruta do manancial Rio das
Velhas.......................................................................................... 53
Figura 4.11:
ETA Vargem das Flores............................................................... 54
Figura 4.12:
Vista area ETA Vargem das Flores............................................ 55
Figura 4.13:
Vista area da ETA Sistema Morro Redondo.............................. 56
Figura 4.14:
ETA Morro Redondo................................................................... 56
Figura 5.1: Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeo de
mistura de padres em diferentes concentraes. ........................ 60
Figura 5.2 Curva de calibrao obtida com a mistura dos padres
analisados...................................................................................... 60



ix
LISTA DE FIGURAS (continuao)


Pgina
Figura 5.3: Cromatograma tpico da anlise dos PE em questo: 1
Fenolftalena, 2 Estradiol, 3 Etinilestradiol, 4 ms
Etinilestradiol, 5 ms Estradiol, 6 Nonilfenol , 7 ms
nonilfenol ) .................................................................................. 63
Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos ons precursores ms
1
e ms
(modos negativo) caractersticos de cada composto.................... 64
Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausncia de picos
para E2, EE2 (Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presena
de interfente no tempo de reteno do NP (Segmento 2 -
6,8minutos - direito).................................................................... 66
Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (gua bruta) com adio de estradiol
e etinilestradiol (100 g.L
-1
, quadro da esquerda) e n-nonilfenol
(200 g.L
-1
, quadro da direita). ................................................... 67
Figura 5.7: Curvas analticas obtidas com solues-padro para os quatro
padres de PE............................................................................... 70
Figura 5.8: Chuva acumulada mensal na RMBH durante o perodo de
monitoramento (fev/07 a jan/08)................................................. 76
Figura 5.9: Box-plot da concentrao dos trs compostos determinados nos
mananciais estudados em todas as campanhas amostrais. gua
Bruta............................................................................................ 78
Figura 5.10: Variao da concentrao de nonilfenol em gua bruta nos
mananciais durante o perodo de fev/07 a jan/08......................... 80
Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas
Nov. 2007 e as diferentes fragmentaes (ms) de seus
ismeros (esquerda). Exemplos de estruturas qumicas de 5 dos
550 Ismeros de nonilfenol existentes (direita)........................... 81
Figura 5.12: Boxplot da concentrao de nonilfenol na gua bruta nos 3
mananciais................................................................................... 82
Figura 5.13: ndice de remoo de NP (gua bruta gua filtrada) durante
as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008................................
83
Figura 5.14: Variao da concentrao de estradiol em gua bruta nos
mananciais durante o perodo de fev/07 a jan/08......................... 84
Figura 5.15: Variao da concentrao de etinilestradiol em gua bruta nos
mananciais durante o perodo de fev/07 a jan/08......................... 86
Figura 5.16: ndice de remoo (gua bruta gua filtrada) de EE2 durante
as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008............................... 87
Figura 5.17: Confirmao da presena de Bisfenol A na gua a partir do
LCMS. Amostra: Rio das Velhas janeiro de 2008....................... 88
Figura 5.18: Anlise quimiomtrica das amostras referentes aos meses de
jun/07 a set/07 com base no PCA................................................ 89
x
LISTA DE FIGURAS (continuao)


Pgina
Figura 5.19: Variao do pH nas amostras de gua bruta dos trs
mananciais durante o perodo de monitoramento........................
91
Figura 5.20: Variao da turbidez nas amostras de gua bruta dos trs
mananciais durante o perodo de monitoramento........................ 91
Figura 5.21: Variao da cor aparente nas amostras de gua bruta durante o
perodo de monitoramento nos 3 mananciais............................... 92
Figura 5.22: Variao da cor verdadeira nas amostras de gua bruta durante
o perodo de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais............................ 92
Figura 5.23: Anlise da Componente principal (PCA) dos seis parmetros
utilizados para o monitoramento dos mananciais escolhidos...... 93






















xi
LISTA DE TABELAS


Pgina
Tabela 3.1: Seminrios, comits e relatrios de avaliao sobre os
Perturbadores Endcrinos............................................................. 9
Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribudos aos perturbadores endcrinos em
animais.......................................................................................... 12
Tabela 3.3: Classificao de alguns perturbadores endcrinos (adaptado de
Mol et al. 2000)............................................................................ 15
Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes.. 19
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de
nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais......... 26-28
Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endcrinos em guas
superficiais.................................................................................... 30
Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoo de perturbadores
endcrinos..................................................................................... 32
Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, frmula molecular, pureza, marca e
nmero CAS dos compostos determinados.................................. 35
Tabela 4.2: Descrio do procedimento de extrao com cartucho Unitech
C18 (500 mg) utilizado nesse trabalho para a extrao
simultnea dos trs compostos de interesse.................................. 37
Tabela 4.3: Condies de anlise dos Perturbadores endcrinos por
cromatrografia gasosa................................................................... 40
Tabela 4.4: Condies de anlise dos PE por cromatrografia lquida
acoplada espectrometria de massas............................................ 42
Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinao de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA Rio das Velhas........................ 54
Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinao de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores.................. 55
Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinao dos Perturbadores
Endcrinos na Regio Metropolitana de Belo Horizonte ETA
Morro Redondo............................................................................. 57
Tabela 5.1: Tempo de reteno, rea obtida em relao concentrao e
limite de deteco dos compostos analisados por cromatografia
gasosa........................................................................................... 59
Tabela 5.2: Frmulas moleculares, tempos de reteno, ons primrios
(ms
1
) e secundrios (ms
2
) caractersticos para cada padro
utilizado........................................................................................ 64
Tabela 5.3: Variao da concentrao dos compostos em relao ao tempo
de preparo das amostras................................................................ 66


xii
LISTA DE TABELAS (continuao)


Pgina
Tabela 5.4: Faixa de trabalho, limite de deteco (LD) e limite de
quantificao (LQ) dos quatro compostos determinados por
LCMS-IT-TOF............................................................................. 68
Tabela 5.5: Coeficiente de correlao (r) obtido para os 4 padres
determinados por LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento... 69
Tabela 5.6: Repetibilidade dos resultados obtidos para solues-padro dos
trs PE expressa por meio do coeficiente de variao (CV)......... 71
Tabela 5.7: Resultados dos testes de supresso realizados com amostras
coletadas na entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008)........... 72
Tabela 5.8: Variao da supresso nas amostras de gua bruta no ms de
janeiro 2008.................................................................................. 73
Tabela 5.9: Valores obtidos pelos ensaios de recuperao de E2, EE2 e NP
em funo da fortificao das amostras coletadas na entrada da
ETA Morro Redondo.................................................................... 74
Tabela 5.10: Resultados obtidos pela calibrao interlaboratorial UFOP-
CIRRA.......................................................................................... 70
Tabela 5.11: Concentrao de nonilfenol (ng.L
-1
) encontrada durante as
campanhas de amostragem........................................................... 79
Tabela 5.12: Concentrao de 17-estradiol (ng .L
-1
) encontrada durante as
campanhas de amostragem........................................................... 84
Tabela 5.13: Concentrao de 17-etinilestradiol (ng.L
-1
) encontrada durante
as campanhas de amostragem...................................................... 86
Tabela 5.14: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (gua
bruta)............................................................................................. 89
Tabela 5.15: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores
(gua bruta)................................................................................... 90
Tabela 5.16: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (gua
bruta)............................................................................................. 90
Tabela 5.17: Exemplos de pertubao endcrina observada em animais do
sexo masculino expostos aos estradiis e nonilfenol durante o
perodo pr-natal. (adaptado Damstra et al.,
2002)............................................................................................. 94



xiii

LISTA DE NOTAES

APEO Alquilfenis Polietoxilados
BPA Bisfenol A
BSTFA N-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
CAS Chemical Abstract Service
CETESB Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
CG Cromatografia Gasosa
CG-FID Cromatrografia Gasosa com deteco por Ionizao em Chama
CGMS Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CSTEE Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment
DAD Detector de Arranjo de Diodo (para cromatografia lquida)
DDE Diclorodifeniltricloroetileno
DDT Dicloro-difenil-tricloro-etano
DES Dietilestilbestrol
DIC Detector de Ionizao em Chama (para cromatografia Gasosa)
E1 Estrona
E2 Estradiol
E3 Estriol
EDC Endocrine Disrupting Chemicals
EE2 Etinilestradiol
EM Espectrometria de Massas
ESI Eletronspray ionization
ETA Estao de tratamento de gua
ETE Estao de tratamento de esgoto
FE Fase estacionria
FM Fase mvel
H
2
SO
4
cido Sulfrico
HCl cido Clordrico
HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
IEH Institute for Ecological Health
IPCS Programa Internacional de Segurana Qumica
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LC Cromatografia Lquida
LCMS Cromatografia Lquida acoplada a Espectrometria de Massas
LCMS-IT-
TOF
Cromatografia Lquida acoplada a Espectrometria de Massas. Deteco por
Ion Trap e Time of Flight
MSTFA N-metil-n-trifluoroacetamida
MTBSTFA N-metil-n-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida
4NP 4-nonilfenol

xiv
LISTA DE NOTAES (continuao)

NP Nonilfenol ou n-nonilfenol
NPEO Nonilfenol Polietoxilado
OCDE Organizao para a Cooperao e Desenvolvimento Econmico
OMS Organizao Mundial da Sade
PCA Anlise de componente principal
PE Perturbadores Endcrinos
POP Poluentes Orgnicos Persistentes
RMBH Regio Metropolitana de Belo Horizonte
SPE Extrao por fase slida
SPME Microextrao em fase slida
STP Substncias Txicas Persistentes
UE Unio Europia
UKEA Agncia de Proteo Ambiental do Reino Unido
USEPA Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos
UV/VIS Detector ultravioleta na regio do visvel
VTG Vitelogenina



















xv
RESUMO

Alguns compostos orgnicos classificados como Perturbadores Endcrinos (PE) so
encontrados em guas superficiais e tm atrado a ateno da comunidade cientfica
devido alterao que eles causam no sistema endcrino da fauna aqutica e ao
potencial risco sade humana. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormnios
(17-estradiol, 17-etinilestradiol) e subprodutos da degradao de surfactantes no-
inicos (n-nonilfenol). Devido a atualidade do tema, h poucos trabalhos nacionais
publicados abordando o monitoramento e a remoo de PE de guas naturais, no
havendo ainda uma legislao que regulamente a emisso de hormnios e nonilfenis
no ambiente ou que estabelea padres de potabilidade para tais compostos. Sendo
assim, essa dissertao teve como objetivo desenvolver metodologia analtica para
quantificao de 17-estradiol (E2), 17-etinilestradiol (EE2) e n-nonilfenol (NP) em
amostras de gua superficial, de forma a permitir o monitoramento de tais PE em trs
mananciais de abastecimento da Regio Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH). A
quantificao dos PE nas amostras ambientais foi feita em equipamento de
cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) aps extrao e
concentrao em cartuchos tipo C18. A recuperao dos PE pelo processo de extrao
em fase slida variou de 90 a 96% ao passo que os limites de deteco do mtodo
foram de 1,4; 0,9 e 4,9 ng.L
-1
para o E2, EE2 e NP, respectivamente. Aps validao do
mtodo analtico, foi feito o monitoramento do afluente e da gua filtrada (em filtro de
areia) de trs estaes de tratamento de gua (Morro Redondo, Vargem das Flores e Rio
das Velhas) da regio Metropolitana de Belo Horizonte. Todos os trs compostos
monitorados foram encontrados em pelo menos uma amostra, sendo que o n-nonilfenol
esteve presente em todas amostras de gua bruta, na faixa de concentrao de 44 a 1.918
ng.L
-1
. Os compostos 17-estradiol e 17-etinilestradiol foram determinados em apenas
15% das amostras, na faixa de concentrao de 2 a 54 ng.L
-1
. As anlises das amostras
coletadas nas ETAs aps o filtro de areia mostraram que as etapas de pr-clorao,
coagulao, sedimentao e filtrao no foram capazes de remover, em sua totalidade,
os PE monitorados.

Palavras-chave: Perturbadores endcrinos; microcontaminantes orgnicos; qualidade
da gua; tratamento de gua; espectrometria de massas.

xvi
ABSTRACT

Some organic molecules classified as endocrine disrupters compounds (EDC) have been
found in surface waters and attracted attention from the scientific community due to
their hability to tamper with the endocrine system of aquatic fauna, hence due to the
potential risk they pose to human health. Among the compunds with endocrine
properties, the hormones (17-estradiol 17- ethinylestradiol) and a by-product of the
degradation of non-ionic surfactants (n-nonylphenol) are of particular importance. There
are a handful of papers on the monitoring of EDC in Brazilian waters and there is no
Brazilian legislation regulating estradiol and nonylphenol in surface or drinking water.
Therefore, this work aimed at developing analytical techniques to quantify 17 -
estradiol (E2), 17 -ethynilestradiol (EE2) and n-nonylphenol (NP) in samples of
surface water from three manancials located in the Belo Horizonte Metropolitan Area,
Minas Gerais, Brazil. The quantification of such EDC was performed by liquid
chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) after the samples being
extracted and concentrated with C18 cartridges. The recovery of EDC by solid phase
extraction varied from 90 to 96% and the limit of detection of the whole analytical
procedure was determined as 1.4; 0.9 and 4.9 ng.L
-1
for E2, EE2 and NP, respectively.
After the method validation it was carried out a one year monitoring of raw and filtered
water (sand filtration) of three water treatment plants (Morro Redondo, Vargem das
Flores and Rio das Velhas) that supply Belo Horizonte Metropolitan Area. The results
showed that the three compounds were found in at least one sample, and that the n-
nonylphenol was present in all water samples analysed, in a concentration range of 44 to
1,918 ng.L
-1
. The estrogens 17-estradiol and 17 -ethinylestradiol were detected in
only 15% of the samples, in a concentration range of 2 to 54 ng/L. The analyses of
samples collected in the WTPs after the sand filter indicates that the pre-chlorination,
coagulation, sedimentation and sand filtration steps were not capable of completely
removing the EDC present in the raw water.

Keywords: Endocrine Disruptors Compounds; organic microcontaminants; Water
Quality; Water Treatment; mass spectrometry
1
1. INTRODUO

A gua hoje reconhecida como um dos bens naturais mais importantes do
planeta. Seus mltiplos usos so indispensveis a um amplo espectro das atividades
humanas. Devido a crescente degradao dos corpos dgua, as preocupaes com o uso
e destino tm mobilizado pessoas de diversas reas acadmicas a pesquisas cientficas
com o intuito de preservar e recuperar esse recurso natural.
A partir da dcada de 70, o interesse da comunidade acadmica e a criao de
rgos de proteo ambiental, como a Agncia de Proteo Ambiental dos Estados
Unidos (USEPA), promoveram um crescimento de pesquisas envolvendo
monitoramento de microcontaminantes orgnicos em diversos setores ambientais. Com
isso, o interesse dos setores pblico e privado por assuntos ambientais resultou em
vrias organizaes governamentais e no-governamentais que hoje debatem,
estabelecem normas e discutem prticas de minimizao e remediao de substncias
qumicas potencialmente poluentes.
Dentre as substncias qumicas potencialmente poluentes, nos ltimos anos,
destacaram-se alguns compostos denominados perturbadores endcrinos (PE), que so
substncias que podem provocar alteraes no sistema endcrino de animais e de
humanos. Os PE constituem uma classe de substncias no definidas pela sua natureza
qumica, mas pelo seu efeito biolgico, que pode causar distrbios no sistema endcrino
mesmo em baixas concentraes. Muitos dos perturbadores endcrinos listados por
algumas organizaes como a USEPA e a Agncia Ambiental do Reino Unido (UKEA),
tambm esto classificados numa srie de grupos de compostos orgnicos
potencialmente txicos, tais como as substncias txicas persistentes (STP), poluentes
orgnicos persistentes (POP), poluentes emergentes, dentre outros. A Unio Europia
tambm elaborou um relatrio contendo uma vasta lista de 118 compostos suspeitos de
interferir no sistema endcrino, tanto de seres humanos como de diferentes espcies
animais (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002).
O interesse no estudo de compostos classificados como PE foi motivado a partir
de observaes sobre a ocorrncia de anormalidades no sistema endcrino e reprodutivo
de animais. Os sintomas observados tm sido atribudos presena de uma grande
variedade de substncias qumicas, mesmo em concentraes-trao, principalmente em
sistemas aquticos naturais (Auger et al. 1995; Routledge et al. 1998). Uma evidncia
dos possveis efeitos dos PE em seres humanos foi obtida a partir da experincia
2
envolvendo mulheres grvidas que tomaram o estrognio sinttico dietilestilbestrol
(DES), prescrito para evitar o aborto espontneo e promover o crescimento do feto, no
perodo entre 1948 a 1971. Muitas das filhas dessas mulheres so hoje estreis e, uma
minoria, tem desenvolvido um tipo raro de cncer vaginal (Damstra et al., 2002).
Homens adultos que foram expostos a estradiol mostram maior incidncia de
anormalidades em seus rgos sexuais, apresentam contagem mdia de espermatozides
diminuda e podem sofrer um risco maior de desenvolver cncer de testculos (Colucci
et al. 2001; Guillette et al. 1996; Legler et al. 2002).
Dentre a vasta quantidade de PE que j foram avaliados pela comunidade
cientfica, destacam-se trs compostos que so comumente avaliados em diversos
trabalhos, que pode ser justificado pelos seguintes fatores:

i) n-nonilfenol ou nonilfenol: um subproduto da degradao dos
alquillfenis polietoxilados (APEO), que so agentes surfactantes de
amplo uso tanto em processos industriais como em produtos de uso
domstico, por exemplo, detergentes (USEPA 2001);
ii) 17-estradiol ou estradiol: um hormnio natural que nas mulheres
responsvel pela sntese de estrognio circulante, sendo por isso
naturalmente e diariamente excretado na urina humana e, assim,
descartado no esgoto domstico (Bila e Dezotti 2003);
iii) 17-etinilestradiol ou etinilestradiol: um dos estrognios sintticos
mais usados como contraceptivos orais, na reposio teraputica na
menopausa ou na preveno do aborto (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli e
Jardim 2007).

De acordo com trabalhos nacionais e internacionais, compostos classificados
como PE tm sido detectados em amostras de guas superficiais, principalmente em
funo da atividade antrpica (Alda e Barcel 2001). Pesquisas tambm tm mostrado
que substncias estrognicas so encontradas em rios receptores de esgotos domsticos,
tratados ou in natura. Potencialmente danosos sade, os PE tm se mostrado
resistentes aos processos de tratamento convencionais utilizados nas estaes de
tratamento de esgotos (ETE) e de guas (ETA), sendo a intensidade de remoo dos PE
dependente das condies operacionais impostas no sistema de tratamento. Os poucos
trabalhos existentes sobre o tema indicam que os tratamentos convencionais no
3
conseguem remover completamente tais micropoluentes, havendo relato da presena de
diversos frmacos e de estrognios naturais e sintticos no esgoto domstico e efluentes
de ETEs (Jeannot et al. 2002; Krner et al. 2000).
Em relao aos corpos dgua, outro fator importante que pouco se sabe sobre
o real impacto desses compostos sobre o ambiente aqutico e, principalmente, sobre a
sade humana. No caso do Brasil, a ausncia de ETEs em grande parte dos municpios
brasileiros agrava ainda mais o quadro de possvel contaminao das guas superficiais
por PE.
Tendo em vista a crescente preocupao ambiental dedicada aos perturbadores
endcrinos, principalmente no Brasil, o objetivo deste trabalho desenvolver uma
metodologia analtica que permita a deteco e quantificao de trs PE (NP, E2 e EE2)
em amostras de gua superficiais a partir da tcnica de LCMS. Sero tambm
discutidos, brevemente, resultados sobre anlises dos trs compostos a partir da
cromatografia gasosa com detector por ionizao em chama (CG-FID). Aps o
desenvolvimento da tcnica de anlise, ser feito o monitoramento de trs mananciais
de abastecimento da RMBH: Rio das Velhas e Morro Redondo e Vargem das Flores.
Dessa forma, o primeiro captulo de resultados apresentar o procedimento para
validao da metodologia analtica empregada e discutir os parmetros mais relevantes
para anlise. O segundo captulo de resultados apresentar os dados do monitoramento
de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em trs pontos de captao de gua da regio
metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) e discutir os resultados obtidos. Finalmente,
o captulo de concluses consubstanciar as informaes mais relevantes e destacar a
contribuio da dissertao para o tema pesquisado.











4
2. OBJETIVOS

O objetivo geral do trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analtica para a
deteco e quantificao dos perturbadores endcrinos nonilfenol (NP), estradiol (E2) e
etinilestradiol (EE2) em amostras de gua usando cromatografia acoplada a
espectrometria de massas (LCMS).

Objetivos especficos:
Monitorar, pelo perodo de um ano, a gua de trs mananciais da regio
metropolitana de Belo Horizonte para avaliar a presena de NP, E2 e EE2;
Avaliar, de forma geral, a eficincia das etapas de pr-clorao, coagulao,
sedimentao e filtrao, empregadas nas estaes de tratamento de gua (ETA)
monitoradas, na remoo de NP, E2 e EE2.


5
3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1. O sistema endcrino

D-se o nome de sistema endcrino ao conjunto de rgos que apresentam como
atividade caracterstica a produo de secrees denominadas hormnios, que so
lanados na corrente sangnea e iro atuar em outra parte do organismo, controlando
ou auxiliando o controle de sua funo. Os rgos que tm sua funo controlada e/ou
regulada pelos hormnios so denominados rgos-alvo (Guyton 1988).
Os hormnios influenciam praticamente todas as funes dos demais sistemas
corporais. Freqentemente o sistema endcrino interage com o sistema nervoso,
formando mecanismos reguladores bastante precisos. O sistema nervoso pode fornecer
ao endcrino a informao sobre o meio externo, ao passo que o sistema endcrino
regula a resposta interna do organismo a esta informao. Dessa forma, o sistema
endcrino, juntamente com o sistema nervoso, atua na coordenao e regulao das
funes corporais (Guyton 1988). A Figura 3.1 apresenta os rgos do sistema
endcrino. As propriedas dos rgos do sistema endcrino sero discutidas a seguir.


Figura 3.1 - rgos do sistema endcrino (Fonte: AFH, 2007).

Hipfise ou pituitria: os hormnios produzidos pela hipfise so denominados trficos
por atuarem sobre outras glndulas endcrinas. So responsveis por ativar a secreo
de outros hormnios como os da glndula tireide, glndula adrenal, gnadas e do
crescimento.
6
Hipotlamo: responsvel pelo controle da hipfise atravs de conexes neurais e
substncias semelhantes a hormnios chamados fatores desencadeadores (ou de
liberao), o meio pelo qual o sistema nervoso controla o comportamento sexual via
sistema endcrino. Em mulheres, a glndula-alvo do hormnio gonadotrfico o
ovrio; no homem, so os testculos. O hipotlamo responsvel pelo controle de
inibio ou liberao destes hormnios. Como a hipfise secreta hormnios que
controlam outras glndulas e est subordinada, por sua vez, ao sistema nervoso, pode-se
dizer que o sistema endcrino subordinado ao nervoso e que o hipotlamo o
mediador entre esses dois sistemas A Figura 3.2 apresenta um diagrama de
funcionamento do hipotlamo.

Figura 3.2 - Funcionamento do hipotlamo (Fonte: AFH, 2007).

Tireide: responsvel pela produo de hormnios como triiodotironina (T3) e tiroxina
(T4), que aumentam a velocidade dos processos de oxidao e de liberao de energia
nas clulas do corpo, elevando a taxa metablica e a gerao de calor. A calcitonina,
outro hormnio secretado pela tireide, participa do controle da concentrao sangnea
de clcio, inibindo a remoo do clcio dos ossos e a sada dele para o plasma
sangneo, estimulando sua incorporao pelos ossos.

Paratireides: glndulas responsveis pela secreo do paratormnio, hormnio que
estimula a remoo de clcio da matriz ssea (o qual passa para o plasma sangneo), a
absoro de clcio dos alimentos pelo intestino e a reabsoro de clcio pelos tbulos
renais, aumentando a concentrao de clcio no sangue.

Adrenais ou supra-renais: so duas glndulas localizadas sobre os rins, divididas em
duas partes independentes, medula e crtex.

7
Pncreas: uma glndula mista, ou seja, apresenta determinadas regies endcrinas e
excrinas ao mesmo tempo. As funes endcrinas do pncreas so responsveis por
clulas que secretam dois hormnios: insulina e glucagon.

3.2. Perturbadores endcrinos

O termo Pertubador Endcrino utilizado nesse texto como sinnimo de
disruptores endcrinos, interferentes endcrinos e agentes hormonalmente ativos, que
na literatura internacional corresponde aos endocrine disrupting compounds or
chemicals (EDC). Os termos mais usados so perturbadores endcrinos e disruptores
endcrinos. Muitas definies tm sido propostas para tal classe de compostos,
entretanto, para todas elas existe um ponto em comum: trata-se de uma substncia
qumica que pode interferir no funcionamento natural do sistema endcrino de espcies
animais, incluindo os seres humanos.
Alguns pesquisadores definem um interferente endcrino com base nos seus
efeitos, ou seja, trata-se de uma substncia qumica que, mesmo presente em
concentrao extremamente baixa, capaz de interferir no funcionamento natural do
sistema endcrino, podendo causar cncer, prejudicar os sistemas reprodutivos e causar
outros efeitos adversos (Mozaz et al. 2007; Yang et al. 2006). Em maio de 1997, a
agncia de proteo ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency -
USEPA), definiu um interferente endcrino como agente exgeno que interfere com
sntese, secreo, transporte, ligao, ao ou eliminao de hormnio natural no corpo,
que so responsveis pela manuteno, reproduo, desenvolvimento e/ou
comportamento dos organismos.
O Programa Internacional de Segurana Qumica (IPCS), em conjunto com o
Japo, os EUA, o Canad, a Organizao para a Cooperao e Desenvolvimento
Econmico (OCDE) e a Unio Europia, adotou a seguinte definio para os
perturbadores endcrinos: Um perturbador endcrino uma substncia ou um
composto exgeno que altera uma ou vrias funes do sistema endcrino e tem,
conseqentemente, efeitos adversos sobre a sade num organismo intacto, sua
descendncia, ou (sub) populaes (CEC 1999).
Os PE podem ser produtos naturais, como os fitoestrgenos produzidos por
plantas, e por isso bastante comuns em alimentos de origem vegetal; ou produtos
sintticos, como no caso de solventes clorados, aditivos alimentares, constituintes de
8
produtos de limpeza, agrotxicos, e cosmticos; plulas anticoncepcionais e outros
frmacos. Desta forma, a exposio aos perturbadores endcrinos pode ocorrer a partir
de uma variedade de fontes, de forma voluntria ou no, inclusive por meio da dieta
diria e do consumo de gua potvel (Damstra et al. 2002; Sol et al. 2003; Veras
2006). A Figura 3.3 mostra exemplos de perturbadores endcrinos comumente
presentes no ambiente (Lagan et al. 2004).

Figura 3.3 Estruturas qumicas de alguns perturbadores endcrinos comumente

encontrados em guas superficiais (Lagan et al. 2004).

Embora desde o incio do sculo XX j existissem hipteses prevendo alteraes
no funcionamento do sistema endcrino de algumas espcies animais expostas a
determinadas substncias qumicas txicas, apenas recentemente esta importante
questo tem recebido a devida ateno por parte da comunidade cientfica. Isso pode ser
constatado pelo nmero crescente de publicaes que relatam o aumento da incidncia
de disfunes no sistema endcrino de seres humanos (incluindo a infertilidade
masculina), e mais significativamente, efeitos fisiolgicos adversos observados em
espcies animais para as quais a relao causa/efeito mais evidente (Damstra et al.
2002).
De fato, as evidncias observadas em estudos envolvendo moluscos, crustceos,
peixes, rpteis, pssaros e alguns mamferos tm sugerido que possveis alteraes de
sade humana envolvendo o sistema reprodutivo, tais como o cncer de mama e de
testculo, podem estar relacionadas exposio aos Perturbadores Endcrinos
(Lintelmann et al. 2003). Para esclarecer, desenvolver estratgias e solucionar o
problema dos perturbadores endcrinos, vrias organizaes governamentais e no
governamentais, como, Unio Europia (UE), US-EPA, Damstra et al. 2002, IPCS e a
9
Organizao para a Cooperao e Desenvolvimento Econmico (OCDE), investigaram
o tema perturbadores endcrinos, conforme mostra a Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Seminrios, comits e relatrios de avaliao sobre os Perturbadores
Endcrinos (Bila e Dezotti 2007).

Ano Organizao Objetivos do Estudo
1995 Agncia Ambiental Federal
Alem
Discusso sobre evidncia e impactos dos PE e riscos
potenciais que podem causar em humanos e animais
1995 Agncia Proteo Ambiental
Americana (USEPA)
Seminrios para avaliar os riscos sade e efeitos
ambientais dos PE
1995 Ministrio do Meio Ambiente e
Energia da Dinamarca
Avaliao dos efeitos de substncias estrognicas no
desenvolvimento e nas funes do sistema
reprodutivo masculino
1996 USEPA Seminrio para desenvolvimento de estratgia para
avaliar o risco dos PE no ambiente
1996 USEPA Desenvolvimento de programa de testes e anlises
(screening) para avaliar a ao dos PE
1997 USEPA Relatrio sobre os PE presentes no meio ambiente
1998 USEPA Reviso e discusso das informaes cientficas
disponveis sobre PE
1998 Organizao para a Cooperao
e Desenvolvimento Econmico
(OCDE)
Desenvolvimento de mtodos de ensaio para os PE
1999 Committee on Toxicity,
Ecotoxicity and the Environment
(CSTEE)
Reviso da literatura existente e opinio cientfica nas
evidncias dos PE, em particular, avaliao dos riscos
ecolgicos e diretrizes de ensaios toxicolgicos
1999 Comisso das Comunidades
Europias
Identificao do problema dos PE, suas causas,
conseqncias e definio das medidas adequadas
para dar uma resposta ao problema
2001 Comisso das Comunidades
Europias
Primeiro relatrio sobre o progresso dos trabalhos da
comunidade europia sobre os PE
2002 Comisso das Comunidades
Europias
Programa COMPREHEND: Avaliao das
evidncias dos PE no ambiente aqutico na Europa
2002 OCDE Avaliao dos mtodos de ensaios para as substncias
estrognicas
2002 Organizao Mundial da Sade
(OMS)
Avaliao global do estado da arte da cincia dos PE
2003 Instituto de Sade Ecolgica
(IHE)
Relatrio de avaliao do progresso internacional da
pesquisa dos PE
2004 Comisso das Comunidades
Europias
Segundo relatrio sobre o progresso dos trabalhos
sobre os PE.
3.2.1. Mecanismos de Ao dos Perturbadores Endcrinos

A ao de um determinado hormnio inicia-se atravs da sua ligao a um
receptor especfico, no interior de uma clula. O complexo resultante liga-se a regies
10
especficas do DNA presente no ncleo da clula, o que determina a ao dos genes.
Certos compostos qumicos podem tambm se ligar ao receptor hormonal e,
conseqentemente, mimetizar ou bloquear a ao do prprio hormnio (Ghiselli e
Jardim 2007; Damstra et al. 2002; Soto et al. 1991).
Esta mudana de atividade transmitida por vrias vias metablicas, atravs da
membrana plasmtica, dependendo do tipo de hormnio. Os diferentes processos
fisiolgicos (em cascata e independentes) obtidos so controlados por mecanismos
complexos, que so ativados ou desativados de acordo com os nveis dos hormnios
encontrados no organismo. Embora muitas destas vias metablicas possam ser
influenciadas por estimulaes externas ao organismo, a grande maioria das disfunes
endcrinas observadas atribuda ao funcionamento das gnadas, responsveis pelas
caractersticas sexuais secundrias e pelo desenvolvimento e funcionamento dos rgos
sexuais (Ghiselli e Jardim 2007; OMS 2002).
Um receptor hormonal possui elevada sensibilidade e afinidade por um
hormnio especfico produzido no organismo. Por isso, concentraes extremamente
baixas de um determinado hormnio geram um efeito, produzindo uma resposta natural
(Figura 3.4a). Entretanto, estes receptores hormonais tambm podem se ligar a outros
compostos qumicos, e isso explica o porqu de determinados perturbadores endcrinos
presentes no organismo, mesmo em baixssimas concentraes, serem capazes de gerar
um efeito, provocando conseqentemente uma resposta (Damstra et al., 2002).
A alterao no sistema endcrino ocorre quando o PE interage com os receptores
hormonais modificando a sua resposta natural, e para isso dois processos distintos
podem ser desencadeados. O PE pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma
resposta, atuando ento como um mimetizador, ou seja, imitando a ao de um
determinado hormnio, processo este denominado de efeito agonista (Figura 3.4b). Se o
PE se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ele estar agindo como
um bloqueador, ou seja, estar impedindo a interao entre um hormnio natural e o seu
respectivo receptor. Este processo denominado de efeito antagonista (Figura 3.4c)
(Ghiselli 2006).
Um exemplo de perturbao endcrina o caso do estradiol. Muitos PE
competem com o estradiol, pelos receptores de estrognio. Outros competem com a
dihidrotestosterona (hormnio sexual masculino produzido naturalmente pelo
organismo), pelos receptores de andrognio. Portanto, estes compostos exercem efeitos
de feminizao ou masculinizao sobre o sistema endcrino. Compostos que produzem
11
efeitos de feminizao so conhecidos como estrognicos, enquanto que os que
produzem efeitos de masculinizao so conhecidos como andrognicos. Assim, se um
determinado composto considerado anti-andrognico como a flutamida (frmaco
utilizado no tratamento de cncer de prstata) ele certamente inibir a ao biolgica
dos andrognios, ligando-se e, conseqentemente, inativando os receptores de
andrognios presentes nos tecidos-alvo. J um composto anti-estrognico como o
tamoxifeno (frmaco utilizado no tratamento de cncer de mama) inibe a ao biolgica
dos estrognios ligando-se e, conseqentemente, inativando os receptores de estrognios
presentes nos tecidos-alvo (Joon Kang et al. 2002; Panter et al. 2000).


Figura 3.4 - Disfunes endcrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito
antagonista (Ghiselli, 2006).

3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endcrinos em animais silvestres e de laboratrio

Vrios estudos relacionam a poluio ambiental das guas naturais com
anomalias no sistema reprodutivo e no desenvolvimento de diferentes espcies de
animais. A exposio aos perturbadores endcrinos pode ser responsvel por alteraes
fisiolgicas e histolgicas em animais silvestres e de laboratrio, incluindo alteraes
nos nveis de vitelogenina (VTG) no plasma sangneo, feminizao de peixes machos,
induo ao hermafroditismo, inibio no desenvolvimento das gnadas e declnio na
reproduo. Essas e outras anomalias relatadas em vrias espcies de animais so
apresentadas na Tabela 3.2.


12
Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribudos aos perturbadores endcrinos em animais
(Bila e Dezotti 2007)

Espcie Contaminante Efeitos Referncia
Feminizao de Peixes (Allen et al. 1999)
Declnio da Reproduo (Robinson et al. 2003) Efluente de
ETE
Induo da sntese de VTG
(Allen et al. 1999; Sol et al.
2000; Sol et al. 2003)
Feminizao de Peixes (Krner et al. 2000)
Alterao nas gnadas (Panter et al. 2000)
Hermafroditismo (Hartley et al. 1998)
Incidncia de Testculo-Ovulos nas
gnadas (Joon Kang et al. 2002)
Declnio da Reproduo (Shioda e Wakabayashi 2000)
Mortalidade elevada dos
descendentes (Knorr e Braunbeck 2002)
17-Estradiol



Induo da sntese de VTG (Routledge et al. 1998)
Induo da sntese de VTG (Folmar et al. 2000)
Mortalidade da espcie (Schmid et al. 2002)
17-
etinilestradiol
Declnio da Reproduo (Robinson et al. 2003)
Estrona Induo da sntese de VTG (Routledge et al. 1998)
Declnio da Reproduo
Induo da sntese de VTG
(Jobling e Sumpter 1993;
Routledge et al. 1998) Octilfenol
Nonilfenol
Butilfenol

Mortalidade elevada dos
descendentes
Feminizao de Peixes (Knorr e Braunbeck 2002)
Peixe



















Bisfenol A Declnio da Reproduo (Shioda e Wakabayashi 2000)
Bisfenol A
Anomalia no sistema reprodutivo de
ratos (Markey et al. 2002)
Mamfero
PCB Alta mortalidade de golfinhos (Aguilar e Borrell 1994)
DDE e DDT
Concentraes anormais de
hormnios sexuais no plasma e
anomalias morfolgicas nas gnadas
(Guillette et al. 1996;
Guillette et al. 1999; Milnes
et al. 2002)
Rptil
17-Estradiol
Induo da sntese de VTG no
sangue e alteraes na produo de
ovos de tartaruga (Irwin et al. 2001)
Feminizao de Gaivotas machos (Fry e Toone 1981)
DDT
Anomalia no sistema reprodutivo (Bitman et al. 1968)
Aves
DDE Nascimento prematuro de aves (Damstra et al. 2002)
Anfbio
Efluente de
ETE
Induo sntese de VTG no sangue
e hermafroditismo (Bogi et al. 2003)

Vrios estudos mostram que organismos aquticos respondem com induo da
sntese de VTG exposio a determinadas concentraes de estrognios (Panter et al.
2000; Robinson et al. 2003). No estudo de Routledge et al. 1998, duas espcies de
13
peixes, Oncorhynchus mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a
concentraes de E2 e estrona (E1) ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L
-1
). Os
resultados mostraram que as espcies do sexo masculino so sensveis para E2 e E1 nas
concentraes utilizadas, pois ocorreu aumento na concentrao de VTG no plasma
sanguneo durante o perodo de exposio. Entre as fmeas da espcie Rutilus rutilus
ocorreu diminuio do tamanho do ovo.
De acordo com esses e outros pesquisadores, os resultados confirmaram que os
estrognios identificados em efluentes domsticos esto presentes em quantidades
suficientes para induzir o surgimento de rgos masculinos em peixes fmeas,
conhecido como imposex, ou imposio sexual (Ghiselli 2006). Este fenmeno
irreversvel e provoca a esterilizao das espcies, podendo causar declnio considervel
nas populaes de espcies mais sensveis. Segundo o estudo de Fernandez et al (2002),
os PE encontrados nas guas estudadas (organoestnicos) interferiram na sntese da
testosterona (hormnio masculino), ocorrendo aumento na produo deste pelas fmeas.
Consequentemente, a alterao hormonal faz surgir estruturas sexuais masculinas no
funcionais, mantendo-se, porm, a anatomia interna do organismo (Fernandez et al.
2002; Damstra et al. 2002).
Foram observadas anomalias em embries machos e fmeas de trutas, como por
exemplo, a feminizao dos machos (Krner et al. 2000; Damstra et al. 2002). Vrias
espcies de peixes so usadas como modelo para detectar os efeitos de perturbadores
endcrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo. O estudo de
Legler et al (2002) mostrou que as substncias com atividade estrognica no s so
importantes na fase aquosa, mas tambm podem acumular-se em sedimentos marinhos e
expor os organismos em ambientes aquticos a substncias com atividade estrognica.
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endcrinos em humanos

Uma variedade de substncias qumicas suspeita de causar efeitos adversos na
sade humana, resultando em alteraes no sistema endcrino, incluindo efeitos no
sistema reprodutivo feminino e masculino. Os efeitos dos PE em humanos foram
revisados em alguns estudos como o relatrio Global Assessment of the State-of-the-
Science of Endocrine Disrupters do estudo feito pela International Pannel on
Chemical Safety (IPCS) encomendado pela Organizao Mundial da Sade (Damstra et
al. 2002). Uma das concluses do estudo foi a possvel relao entre alguns PE e
14
alteraes na sade humana, como o cncer de testculo, mama e prstata. A
conseqncia da exposio aos PE foi relacionada ao declnio das taxas de
espermatozides, deformidades dos rgos reprodutivos e disfuno da tireide.
Vrios grupos de pesquisas acreditam que grande parte da populao masculina
sofre com o decrscimo na qualidade do smen nas ltimas dcadas, e que isso parece
estar relacionado presena de estradiis nas guas (Damstra et al., 2002). De 1973 a
1994, analisaram a qualidade do smen de um grupo de homens frteis saudveis,
levando em conta o volume do fluido seminal, a concentrao de esperma e a
mobilidade e morfologia dos espermatozides. Os autores observaram um declnio na
concentrao e mobilidade dos espermas nos homens por um perodo de 20 anos, e esse
decrscimo da qualidade do smen coincide com o aumento na incidncia de anomalias
no sistema reprodutivo masculino, incluindo cncer testicular (Auger et al. 1995).
O desenvolvimento e as funes do sistema reprodutivo feminino dependem do
balano e das concentraes dos hormnios (estrognios, andrgenos e tireoidianos).
Portanto, uma disfuno no sistema endcrino pode resultar em algumas anomalias, tais
como, irregularidades no ciclo menstrual, prejuzos na fertilidade e ovrios policsticos.
No entanto, devido capacidade dos PE em modular ou alterar a intensidade dos
hormnios, resta saber se essas substncias podem realmente afetar as funes do
sistema reprodutivo feminino. Alguns fatos demonstram que isso pode realmente
ocorrer, como o uso de dietilestilbestrol (DES) em mulheres grvidas na dcada de 70.
Uma das conseqncias foram anomalias do sistema reprodutivo feminino (cncer
vaginal, gravidez anormal e reduo na fertilidade) de crianas nascidas a partir de mes
que fizeram uso desse medicamento. Este fato , sem dvida, uma evidncia dos efeitos
exposio aos perturbadores endcrinos (Damstra et al. 2002).
Apesar de alguns pesquisadores no sugerirem uma correlao entre a exposio
aos perturbadores endcrinos e efeitos danosos em humanos, revises como a da OMS
(Damstra et al. 2002) indicam que h claras evidncias experimentais e epidemiolgicas
dessas substncias na disfuno no sistema reprodutivo humano (Ghiselli 2006).

3.3. Anlise e Monitoramento de Perturbadores Endcrinos em guas Superficiais

Uma importante fonte de contaminao de guas superficiais com perturbadores
endcrinos (PE) o lanamento de esgotos domsticos tratados ou in natura. Vrios
estudos mostram que as guas receptoras de efluentes de estaes de tratamento de
15
esgoto domstico (ETEs) foram estrognicas para peixes,

e que a proporo da
intersexualidade nos peixes estava correlacionada com a quantidade dos efluentes
lanados nas guas dos rios estudados (Folmar et al. 2000; Sol et al. 2003; Van den
Belt et al. 2004). Alm das emisses pontuais de efluentes domstico e industrial,
emisses difusas, associadas chuva e ao escoamento que dela resulta, chegam aos
corpos de gua e podem contribuir para o aporte de PE. A poluio difusa pode ocorrer
devido s deposies atmosfricas (poluio industrial e veicular), lixiviao de solo
contaminado (Ex. drenagem de lixes) e ao escoamento de guas pluviais em ambientes
rurais (Ex. pesticidas) e urbanos (Ex. leos, lixo). A Tabela 3.3 mostra as classes de
alguns perturbadores endcrinos e a Figura 3.3 mostra a estrutura qumica de alguns
perturbadores endcrinos comumente encontrados em guas superficiais.

Tabela 3.3: Classificao de alguns perturbadores endcrinos (adaptado de Mol et al.
2000)

Tipo de composto Uso
Pesticidas Agricultura (ex: DDT)
Hormnios naturais e
sintticos
Contraceptivos, agentes de crescimento (ex:
estradiol e etinilestradiol)
Alquilfenis
polietoxilados
(APEOs)
Detergentes, cosmticos, agroqumicos
Alquilfenis Produtos de degradao dos APEOs (ex:
nonilfenol, octilfenol), anti-oxidantes
PCBs / dioxinas Fluidos para refrigerao / subprodutos da
combusto
steres ftalatos Plastificantes
Fitoestrognios Ocorrncia natural em plantas
Bisfenol A Produo de polmeros, degradao de plsticos
(policarbonatos)

3.3.1. Metodologias para anlise de perturbadores endcrinos

Diferentes mtodos analticos tm sido desenvolvidos para a determinao de
perturbadores endcrinos em amostras ambientais (Mol et al. 2000). A metodologia de
anlise ideal deve ser rpida, exata, precisa, de fcil adaptao e consumir a menor
quantidade de insumos possveis (Mozaz et al. 2007). As metodologias utilizadas para a
anlise de perturbadores endcrinos so, em sua maioria, tcnicas cromatogrficas que
podem utilizar equipamentos de cromatografia lquida (Hu et al. 2005; Komori et al.
16
2004) ou de cromatografia gasosa (Wang et al. 2005; Yang et al. 2006). Em ambos os
casos, a quantificao dos perturbadores endcrinos nas concentraes ambientais
normalmente feita com espectrmetros de massa, dada sua elevada especificidade.
Outro mtodo de anlise baseado em tcnicas enzimticas ou bioensaios tambm tm
sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do
mtodo tem favorecido o uso das tcnicas cromatogrficas na anlise de perturbadores
endcrinos (Farr et al. 2007)
Basicamente, a determinao dos PE em amostras aquosas envolve trs etapas:
amostragem, pr-concentrao e anlise. Para a determinao de perturbadores
endcrinos necessrio usar critrios analticos rigorosos para que as vrias etapas,
como amostragem, transporte, estocagem e anlise, tenham o menor erro possvel, tendo
em vista a baixa quantidade dos PE (g.L
-1
a ng.L
-1
) nas amostras ambientais (Liu et al.
2004b). A Figura 3.5 mostra um diagrama simplificado do protocolo de anlise dos PE.



Figura 3.5 - Diagrama esquemtico para preparao e anlise dos perturbadores
endcrinos

Amostragem, filtrao e ajuste de pH

A primeira etapa da anlise a amostragem, e a qualidade do processo de
amostragem e preparao das anlises um fator determinante para um resultado
correto (Mozaz et al. 2007). Como os PE em amostras de gua podem sofrer degradao
biolgica durante o transporte e estocagem, comum adicionar alguns biocidas, como o
formaldedo ou metanol, bem como manter as amostras em baixa temperatura (4 C) at
17
o procedimento de extrao e concentrao. O tempo mximo recomendado entre a
coleta e a extrao de 48 horas (Fountoulakis et al. 2005; Wang et al. 2005), sendo a
coleta feita em frascos de cor escura uma vez que alguns estrognios, como estradiol,
podem ser foto-degradados (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005).
A quantidade de gua coletada pode variar de acordo com as propriedades
intrnsecas da gua analisada, tipo de composto, mtodo de extrao e aparelho utilizado
para quantificao. Aparelhos com grande sensibilidade, guas com nvel alto de
poluio e alguns mtodos de extrao como a microextrao por fase slida (SPME)
geralmente necessitam de pouca quantidade de amostra (Yang et al 2006). Contudo,
para a maioria dos casos necessria uma quantidade maior de gua, que normalmente
varia de 250 a 1000 mL (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005). Como exemplo,
Lagana et al (2004) fizeram anlise de perturbadores endcrinos em diferentes matrizes,
e o volume de amostra variou de 110 mL para esgoto bruto a 1000 mL para gua de rio.
Aps coletada a amostra, a primeira etapa de preparao consiste na sua
filtrao. A filtrao tem a finalidade de retirar os slidos presentes na gua, evitando
assim o comprometimento (entupimento e queda na taxa de filtrao) da etapa posterior
de concentrao em cartuchos de extrao em fase slida. Embora a maioria das
membranas utilizadas e citadas na literatura seja de acetato de celulose, recomenda-se a
utilizao de membranas de materiais mais inertes (teflon, fibra de vidro, nylon) para
evitar a adsoro de perturbadores durante a etapa de filtrao. As membranas mais
utilizadas na filtrao so de 0,45m feitas de acetato de celulose. Etapas preliminares
de filtrao, como a utilizao de filtros de 8m, podem ser necessrias dependendo da
quantidade de slidos presentes na gua. Isso particularmente importante durante a
amostragem de gua de mananciais superficiais durante perodos chuvosos.
Em seguida feito o ajuste do pH da amostra, que tem como finalidade
aumentar a afinidade dos perturbadores endcrinos, principalmente aqueles de carter
cido como nonilfenol, bisfenol e estrona, pela fase estacionria do cartucho de
extrao, aumentando assim sua extrao da fase aquosa (Raimundo 2007). De fato, Liu
et al (2004b) fizeram um trabalho para avaliar a influncia do pH inicial da amostra na
eficincia de extrao, e os resultados obtidos mostraram que a melhor recuperao
obtida foi quela feita em meio mais cido. medida que o pH era diminudo, o ndice
de recuperao aumentava, chegando a 100% para alguns compostos no pH igual a 3. O
pH escolhido para as amostras pode variar de acordo com a capacidade mxima que o
cartucho de extrao suporta, mas a maioria dos trabalhos de fato utilizam o pH
18
variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (Gibson et al. 2007; Wang et
al. 2005). Os cidos mais utilizados para a correo do pH so o clordrico (HCl) ou o
sulfrico (H
2
SO
4
).

Concentrao e eluio dos compostos de interesse

Os PE so, em sua maioria, compostos orgnicos hidrofbicos encontrados em
baixas quantidades no ambiente, e como a maioria dos equipamentos no consegue
detect-los nas concentraes usualmente encontradas, uma etapa de concentrao
usualmente necessria (Ghiselli e Jardim 2007). Atualmente existe um considervel
interesse no desenvolvimento de novos mtodos seletivos para extrao e isolamento
dos componentes de matrizes ambientais complexas (Kasprzyk-Hordern et al. 2007). A
seletividade da fase estacionria um importante parmetro, uma vez que um dos
principais objetivos seria remover os interferentes e facilitar as anlises posteriores
feitas nos equipamentos de LC-MS e CG-MS (Mozaz et al. 2007). A alternativa mais
utilizada para contornar esses problemas tem sido a extrao em fase slida (Solid
Phase Extration - SPE). A SPE uma tcnica de separao lquido-slido que, do ponto
de vista prtico, pode ser descrita como uma cromatografia lquida, onde se usa uma
pequena coluna aberta, denominada cartucho de extrao, que contm a fase slida (o
correspondente fase estacionria em cromatografia).
No procedimento de extrao a amostra contendo o analito de interesse
colocada no topo do cartucho e aspirada atravs dele pela aplicao de um pequeno
vcuo. Ao passar a amostra pelo cartucho o analito fica retido (adsorvido) na fase
slida, de forma a ser posteriormente eludo com um pequeno volume de solvente, e
essa etapa de eluio permite a determinao do grau de concentrao necessrio para a
anlise uma vez escolhido o volume inicial de amostragem e o volume final de solvente
eludo. Se houver contaminantes que possam interferir na anlise, uma lavagem e/ou
clean-up precede a eluio, com a utilizao de um solvente que tenha afinidade pelo
contaminante e no pelos compostos de interesse. Em muitos casos, onde a amostra no
precisa ser filtrada, a prpria etapa de extrao em fase slida funciona como clean-up
(Lanas 2004a). A Figura 3.6 exemplifica as etapas envolvidas na extrao em fase
slida.
19

Figura 3.6 - Etapas da extrao por fase slida para isolamento de compostos de
interesse (Lanas 2004a)

Atualmente um grande nmero de cartuchos de SPE est disponvel de modo
que possa ser utilizado por uma grande faixa de aplicaes. Um adsorvente genrico
capaz de adsorver uma grande variedade de PE, mas alguns compostos especficos
exigem cartuchos mais seletivos. O mecanismo mais utilizado a interao hidrofbica
e as fases slidas mais reportadas nos trabalhos so as compostas de octadecil (C18) e
slica. A Tabela 3.4 mostra os cartuchos mais utilizados na extrao por fase slida para
os perturbadores endcrinos nonilfenol e estradiis.

Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes

Cartuchos Descrio Fabricante
Oasis HLB Poli(divinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona) Waters
C18 Polimericamente ligado, octadecil (18% C) Vrios
C18/ENV
+
C18 hidroxilado poliestireno-divinilbenzeno IST

Liu et al (2004b) fizeram um estudo a respeito da eficincia de recuperao dos
PE em relao ao tipo de cartucho SPE. A concluso obtida foi que o melhor cartucho
para adsoro de alquilfenis e estrognios o conhecido como Oasis HLB 500mg. O
maior inconveniente na utilizao deste tipo de cartucho o preo, cerca de cinco vezes
superior aos cartuchos de eficincia de recuperao semelhante, como o DSC-18. Dessa
forma, fases estacionrias compostas de octadecil (C18) possuem melhor relao custo-
benefcio.
Uma das grandes desvantagens obtidas na extrao em fase slida a quantidade
de amostra a ser coletada para anlise. Para uma concentrao de 1000 vezes, por
exemplo, necessita-se, em mdia, de 1 litro da amostra, e o tempo de extrao pode ser
bastante demorado, podendo chegar a at 3 horas (Wang et al. 2005). Kuch e
Ballschmiter (2001) e Snyder et al (1999) alcanaram baixos limites de deteco de
20
estradiol natural, etinilestradiol e nonilfenol devido ao grande volume de amostra
utilizado, que chegou a 5 litros com uma pr concentrao de 5000 vezes.
Uma das solues apresentadas seria a microextrao por fase slida (SPME), a
qual possui as mesmas funcionalidades da SPE e reduz consideravelmente a quantidade
de amostra e tempo de extrao para anlise. Yang et al (2006) compararam as
metodologias SPME e SPE e os resultados obtidos mostraram que a SPME bastante
promissora para a anlise de estrognios, anabolizantes e alquilfenis, sendo possvel
utilizar apenas 3mL de amostra para obter fatores de concentrao de 100 vezes.
Recentemente, Wang et al (2008) criaram um mtodo alternativo de extrao utilizando
filtros de cigarro como cartuchos de SPE. Uma vez que os filtros de cigarro so
utilizados para a reteno de parte dos poluentes orgnicos gerados pela fumaa,
avaliou-se a capacidade destes em reter alguns PE como o estradiol. Uma das grandes
vantagens seriam o baixo custo e a facilidade de aplicao. Os resultados obtidos
chegaram a 100% de recuperao do estradiol para amostras do rio monitorado.
A eluio do cartucho, ou seja, a dessoro dos compostos de interesse vai
depender do tipo de composto a ser analisado. Trabalhos publicados utilizam
geralmente metanol, acetato de etila e acetona, puros ou misturados, como agentes de
eluio (Alda e Barcel 2001; Gibson et al. 2007; Lagan et al. 2004; Wang et al.
2005). importante destacar que a eluio normalmente feita com um volume maior
de solvente (5 a 15 ml) para assegurar a completa dessoro dos analitos de interesse.
Desta forma, para se obter um elevado grau de concentrao preciso secar o extrato
orgnico e re-solubilizar o analito em volume adequado de solvente.
Alm de obter o grau de concentrao adequado, a secagem permite ainda
adequar o solvente ao mtodo de anlise tendo em vista que o solvente utilizado na
eluio pode ser incompatvel com o equipamento cromatogrfico. Um exemplo o
diclorometano, que no recomendado para anlises em cromatografia lquida devido a
sua alta volatilidade, mas que foi utilizado (junto com o metanol em soluo 1:1) por
Lagan et al (2004) para a eluio de fitoestrognios, micoestrognios, estrognios e
alquilfenis.
A secagem dos extratos orgnicos normalmente feita em banho-maria
temperatura pouco maior que a ambiente. Alm disso, comum utilizar fluxo de
nitrognio sobre os extratos orgnicos para acelerar o processo de secagem. Conforme
dito anteriormente, a reconstituio do extrato seco feita com o solvente mais
apropriado para anlise cromatogrfica. Para a cromatografia lquida geralmente utiliza-
21
se acetonitrila e metanol como solventes de reconstituio, ao passo que para
cromatografia gasosa comum o uso de solventes mais volteis como acetona e acetato
de etila (Jeannot et al. 2002). Outros mtodos analticos, como a utilizao de kits
enzimticos, exigem a reconstituio em solues tampo de fosfato (Farr et al. 2007).

Anlise Instrumental

Do ponto de vista analtico, os mtodos mais adequados para monitoramento dos
PE em amostras ambientais incluem, genericamente, mtodos biolgicos e mtodos de
separao (Farr et al. 2007). Dentre os mtodos biolgicos destacam-se,
principalmente, os imunoensaios, cujos princpios so a produo de anticorpos e/ou
receptores que se ligam especificamente a substncias que apresentam atividade
estrognica. A Figura 3.7 exemplifica os dois passos genericamente associados aos
imunoensaios. Inicialmente ocorre a imobilizao do receptor especfico a um suporte,
seguido de adio da amostra contendo estrognios e anticorpos, ocorrendo ento um
perodo de incubao, que varia de 1 a 4 horas. Em seguida, por adio de uma soluo
adequada ao tipo de deteco pretendida, procede-se quantificao por medidas de
fluorescncia ou isotpicas (Ex. ELRA: "Enzyme Linked Receptor Assay"; ELISA:
"Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"; RIA: "Radio Immuno Assay") (Mozaz et al.
2007; Nogueira 2003).
Com o intuito de anlise vestigial em amostras ambientais, tm-se desenvolvido
inmeros anticorpos e receptores especficos para os mais diversos tipos de poluentes
qumicos, permitindo a tais mtodos elevada rapidez de screening (Nogueira 2003). As
vantagens dos mtodos biolgicos so: rapidez, seletividade, especificidade e
sensibilidade. Por apresentarem limites de deteco na ordem de ng/L no necessitam,
em alguns casos, de pr-concentrao da amostra. Algumas desvantagens incluem a
necessidade de se fazer anlises individualizadas dos PEs e problemas causados por
alguns interferentes da matriz, podendo levar a resultados superestimados. Farr et al
(2007) observaram que seria necessrio um clean-up da amostra para que no ocorresse
este efeito e concluram tambm que, para anlise de estrognios como o estradiol,
poderia haver interferncia de outros contaminantes como estrona e nonilfenol. Para
contornar esta limitao recorre-se, usualmente, a mtodos cromatogrficos de
separao, que tm se mostrado bastante eficazes e versteis no monitoramento de um
grande grupo de PE.
22

Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A)
Imobilizao do receptor especfico ao suporte, seguido de incubao aps a adio da
amostra contendo estrognios e de anticorpos; B) Adio da soluo adequada ao tipo
de deteco pretendida (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).

Os mtodos cromatogrficos implicam em interaes fisico-qumicas entre os
compostos presentes na amostra e a coluna cromatogrfica, e sua aplicao permite a
anlise qualitativa ou quantitativa de vrios microcontaminantes de interesse ambiental.
A cromatografia permite separar constituintes de uma mistura atravs de sua
distribuio em duas fases: uma estacionria (fixa na coluna cromatogrfica) e outra
mvel. A cromatografia acoplada espectrometria de massas, seja lquida ou gasosa,
apresenta-se como a tcnica analtica mais robusta, abrangente, reprodutvel e sensvel,
para o monitoramento de amostras ambientais. A instrumentao disponvel combina
baixos limites de deteco e reprodutibilidade analtica atravs do monitoramento de
ons pr-selecionados.
A cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (CGMS) tem sido
uma tcnica comumente empregada, apesar de a cromatografia lquida acoplada
espectrometria de massas (LCMS) ter ganhado popularidade. O pr-requisito necessrio
para anlise em cromatografia gasosa que o analito de interesse seja volatilizvel e
termicamente estvel, muito embora a derivatizao possa ser usada em alguns casos
para superar esta limitao. Tradicionalmente, a cromatografia gasosa necessita do
emprego de derivatizao para determinar compostos estrognicos, e os compostos mais
utilizados com tal finalidade so o MSTFA (n-metil-n-trifluoroacetamida), BSTFA (n-
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) e MTBSTFA (n-metil-n-(tert-
butildimetilsilil)trifluoroacetamida). A diferena entre eles se baseia no tipo de reao
que ocorre com o grupo hidroxila dos compostos. Quintana et al (2004) fizeram um
23
estudo comparando os trs compostos e mostrando que o MTBSTFA mais seletivo e o
MSTFA o mais reativo. Apesar da derivatizao ser mais comum quando se usa
cromatografia gasosa, Matsumoto et al (2002) utilizaram o anidrido de
pentafluorpropionil (CDPP) em cromatografia lquida, reduzindo assim os limites de
deteco para os estradiis analisados. As desvantagens do procedimento de
derivatizao esto relacionadas ao maior trabalho laboratorial para preparo das
amostras, ao maior tempo de anlise, e possibilidade de perdas de analito, uma vez
que a baixa eficincia da hidrlise dos conjugados a estrognios livres, via
derivatizao, pode compor erros nos estgios de recuperao, extrao e quantificao.
Tais desvantagens tm dado mais popularidade cromatografia lquida para a
determinao de estrognios (Reis Filho et al. 2006) e outros contaminantes ambientais
pouco volteis.
A cromatografia lquida tem vrias vantagens para anlise de compostos
orgnicos em gua, e uma delas refere-se ao fato de os compostos volteis serem apenas
uma pequena frao de poluentes usualmente presentes em gua e esgotos. De fato, a
maior parte dos perturbadores endcrinos no voltil, tornando a cromatografia lquida
a tcnica mais adequada para sua anlise. Isto especialmente verdade para esgotos, os
quais contm muito material hmico e compostos orgnicos polares, tais como os
carboidratos. Vrios detectores podem ser acoplados cromatografia lquida, tais como
ultravioleta-visvel, arranjo de diodos, fluorescncia e espectrmetro de massas (Alda e
Barcel 2001; Mao et al. 2004; Matsumoto et al. 2002; Raimundo 2007; Sol et al.
2000; Wang et al. 2008).
Os detectores de arranjo de diodos e fluorescncia so menos utilizados como
alternativas devido a sua especificidade, mas so poderosas ferramentas adicionais para
anlise ou confirmao de alguns grupos especficos de PE (Mozaz et al. 2007).
Conforme mencionado anteriormente, a deteco de perturbadores endcrinos por
espectrometria de massas (MS) tem sido a tcnica preferida pela comunidade cientfica
devido sua elevada sensibilidade, reprodutibilidade, abrangncia e robustez. A
instrumentao atualmente disponvel combina a diminuio dos limites de deteco e
excelente reprodutibilidade analtica e elevada seletividade seja no modo de varredura
(modo Full-SCAN), seja atravs do monitoramento de ons selecionado (modo SIM)
(Hu et al. 2005; Liu et al. 2004b).
Segundo Nogueira (2003), a tendncia para um eficiente monitoramento dos PE
em amostras ambientais parece ser a combinao entre mtodos biolgicos, atravs de
24
ensaios de imunoextrao que consistem no isolamento seletivo de classes restritas de
PE de amostras ambientais com a utilizao de "immunosorbents", que seria uma SPE
contendo anticorpos muito especficos na constituio da fase estacionria. Os
compostos de interesses que ficariam retidos na fase estacionria seriam analisados por
cromatografia. Atualmente pouco se desenvolveu neste tipo de tcnica, mas a
expectativa para a criao ainda existe, pois o desenvolvimento de uma metodologia de
alta especifidade onde baseia-se em reaes enzimticas possvel. A principal
vantagem deste mtodo estaria na minimizao de interferentes durante a anlise
cromatogrfica.
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endcrinos em guas superficiais

A Tabela 3.5 resume resultados disponveis na literatura do monitoramento de

trs perturbadores endcrinos encontrados em guas superficiais: um estrognio natural
(17-estradiol ou E2), um estrognio artificial (17-etinilestradiol ou EE2) e um
produto da degradao dos surfactantes alquilfenis etoxilados (nonilfenol ou NP), que
foram escolhidos pelo potencial de risco aos seres vivos e pela freqncia com que
foram reportados em trabalhos nacionais e internacionais.
O 17-estradiol (conhecido tambm como estradiol ou pela sigla E2) um
hormnio natural que nas mulheres responsvel pela sntese de estrognio circulante.
Esses estrognios so naturalmente e diariamente excretados na urina humana e, assim,
descartados no esgoto domstico (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). O 17-
etinilestradiol ou etinilestradiol um dos estrognios sintticos mais usados como
contraceptivos orais (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). Os alquilfenis, por sua vez,
apresentam uma variedade de aplicaes, incluindo detergentes industriais e
domsticos, lubrificantes, emulsificantes, formulaes de pesticidas, de tintas, bem
como produtos de higiene pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos para cabelo e
banho). Nas ETEs e mananciais, os alquilfenis polietoxilatos (APEOs) so
inicialmente biodegradados, derivando em metablitos persistentes e altamente
lipoflicos que incluem os alquilfenis etoxilatos e, finalmente, os alquilfenis, tais
como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP).
Os trabalhos apresentados na Tabela 3.5 mostram que a tcnica de preparo de
amostra usada predominantemente na anlise dos estradiis e do nonilfenol utiliza a
extrao em fase slida, sendo o cartucho Oasis HLB e o octadecilsilano (C18) os mais
25
comuns para tal finalidade. Os resultados compilados mostram ainda que as tcnicas de
cromatografia (tanto gasosa como lquida) acopladas espectrometria de massas so as
mais utilizadas, sendo usada ainda, em menor freqncia, cromatografia acoplada a
detector de arranjo de diodos ou a detector de fluorescncia. Quando a cromatografia
gasosa utilizada percebe-se que a derivatizao por reaes de silanizao preferida
e que os reagentes mais utilizados para tanto so o MTBSTFA, o MSTFA e o BSTFA.
As tcnicas preferidas pelos pesquisadores resultam em limites de deteco na ordem de
0,15 a 2,0 ng.L
-1
para os PE investigados. Valores baixos de limite de deteco
dependero do tipo de equipamento utilizado e volume de amostragem, e todas as
tcnicas de anlise listadas na Tabela 3.5 resultam em limites de deteco semelhantes.
A Tabela 3.5 mostra que para amostras de rios e mananciais o estradiol (E2) e o
nonilfenol (NP) so os compostos frequentemente presentes, sendo o etinilestradiol
(EE2) sempre presente em menor quantidade. Em esgotos domsticos in natura, os
compostos E2 e EE2 foram encontrados com mais freqncia que o NP. Um dos
possveis fatores a maior degradao/adsoro dos alquilfenis ao longo da rede de
coleta. A Tabela 2.5 mostra ainda que apenas o trabalho de Beck et al (2005) investigou
a presena de PE em gua marinha. As amostras foram coletadas em um esturio
prximas da ETE municipal de uma cidade alem com 90.000 habitantes. Os valores
mdios encontrados para EE2 e NP foram de 17,9 e 6,3 ng.L
-1
, respectivamente.
De acordo com a Tabela 3.5, tambm pode ser observado que as maiores
concentraes de PE foram reportadas em trabalhos feitos no continente americano e
asitico, onde se verificou valores mdios acima de 100 ng.L
-1
para NP e E2. Apesar da
grande quantidade de trabalhos europeus relacionados, no foram encontradas grandes
quantidades de estrognios em guas superficiais, e os valores mximos de estradiol e
de etinilestradiol reportados foram de 13,9 ng.L
-1
e 17,9 ng.L
-1
, respectivamente. Dos
trabalhos feitos na Europa salta aos olhos o monitoramento feito por Azevedo et al
(2001) em Portugal, onde se verificou a presena de nonilfenol em concentraes de at
10 mg.L
-1
. Como grande parte dos trabalhos feitos com guas superficiais de cidades
europias no detectou nenhum dos trs PE destacados (NP, E2 e EE2) provvel que
estes se encontravam abaixo do limite de deteco analtico (Jeannot et al, 2004;
Matsumoto et al, 2002). Tais resultados indicam que os PE podem estar presentes no
ambiente em valores na ordem de pg/L, tornando-se necessrio pesquisar novos
mtodos para anlise e extrao bem como tcnicas que permitam avaliar a
estrogenicidade de tais compostos em baixas concentraes.
26
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais.
Concentrao detectada (ng.L
-1
)
Referncia

Localizao
Fonte de
Origem
Tipo de
extrao
Tipo de
deteco
Reagente de
Derivatizao Nonilfenol (NP) Estradiol (E2) Etinilestradiol (EE2)
(Azevedo et al. 2001)
Portugal
Vrios locais
Rio
Oasis HLB CG-MS - (0,01 a 10)x10
6
NA
1
NA
(Beck et al. 2005)
Mar Bltico
(Parte Alem)
gua
Marinha
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - 3,1 a 6,3 < 4,0 2,1 a 17,9
(Bruchet et al. 2004)
Frana Efluente
Domstico SPE C18 CG-MS PFPA <0,1x10
3
10,0 2,5
(Farr et al. 2007)
Espanha
Rio
SPE C18 e
NH2
LC-MS/MS
Kit ELISA - NA 0,5 a 1,1 <1,0
(Ghiselli 2006)
Campinas
(Brasil) Rio
SPE
(Oasis HLB) CG-MS MTBSTFA (1,1 a 1,8)x10
3
(1,8 a 6,0)x10
3
(1,3 a 3,5)x10
3
(Gibson et al.) 2008

Cidade do
Mxico
(Mxico)
Nascente

SPE C18 ou
(Oasis HLB)
CG-MS/MS

BSTFA +
Piridina
1,8 a 8

0,01 a 0,02

0,04 a 0,08

(Hu et al. 2005)
Pequim
(China) Rio SPE C18 LC-MS/MS NA < 0,1 < 0,1
(Jeannot et al. 2002)

Frana e
Canad
Efluente
domstico

SPE C18 ou
(Oasis HLB)

CG-MS/MS
LC-MS/MS

BSTFA (para CG-
MS) < 2,0 < 2,0 < 5,0
(Kolpin et al. 2002)
Estados
Unidos
Efluente
Domstico
Lquido -
Lquido CG-MS
TMS (para
hormnios) (0,8 a 40)x10 9,0 a 93,0 73 a 831
(Komori et al. 2004)
ETEs
(Japo)
Efluente
domstico
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - NA 27 a 220 N.D
2
(Kuch e Ballschmiter
2001)

Alemanha


Rio
SPE
(LiChrolut
EN) CG-MS
Cloreto de
pentafluorbenzoila
(para alquilfenis) 6,7 a 134 0,15 a 3,6 0,10 a 5,1
(Lagan et al. 2004)
Roma
(Itlia) Rio
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - (1,3 a 1,5)x10
3
2,0 a 6,0 N.D

1
NA no analisado,
2
ND no detectado
27
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais (continuao...)
1
NA no analisado
Concentrao detectada (ng.L
-1
)
Referncia

Localizao
Fonte de
Origem
Tipo de
extrao
Tipo de
deteco
Reagente de
Derivatizao Nonilfenol (NP) Estradiol (E2) Etinilestradiol (EE2)
(Liu et al. 2004a)
East Sussex
(Reino Unido)
Sedimento
de Rio
Microondas e
Slica Gel CG-MS BSTFA 2,9 a 7,5 1,3 a 5,5 2,0 a 7,6
(Liu et al. 2004b)

East e West
Sussex
(Reino Unido)
Rio

SPE
(Oasis HLB)

CG-MS

BSTFA

< 0,8

14 a 17

< 0,8

(Matsumoto et al.
2002)
Japo
Rio SPE C18
LC-
Fluorescncia CDPP NA
1
<0,65 <0,65
(Mibu et al. 2004)
Japo
Rio
SPE
(Oasis HLB) LC-MS/MS - (0,10 a 0,25)x10
3
NA NA
(Mol et al. 2000) Holanda
Rio SPE C18 CG-MS MTBSTFA < 4,0 < 300 < 50,0
(Quintana et al.
2004)
Espanha
Rio
SPE
(Oasis HLB) CG-MS/MS MSTFA NA

3,0-13,9 < 5,0
(Raimundo 2007)
Campinas
(Brasil)
Rio
SPE
(Oasis HLB)
LC-DAD
LC-
Fluorescncia - (0,017 a 0,22)x10
3
(0,045 a
1,31)x10
3
(0,106 a 4,3)x10
3

(Snyder et al. 1999)
Estados
Unidos
Rio
SPE
PFA
(fluorpolmero)
LC-
Fluorescncia
Kit ELISA
-
0,16 a 1,17 0,27 a 2,82 0,25 a 0,55
(Sol et al. 2000) Espanha
Rio SPE C18 LC-DAD-MS - (0,02 a 0,64)x10
3
NA NA
(Ternes et al. 1999)
Brasil Efluente
Domstico SPE C18 CG-MS MSTFA NA 21,0 <1,0
(Wang et al. 2005)
Tianjin,
(China)
gua
reutilizada SPE C18 CG-MS MTBSTFA 1,0 a 7,0 1,0 a 4,0 6,9
(Wang et al. 2008)
Tianjin,
China Rio
SPE (Filtro de
cigarro e C18) LC-UV - NA (1,3 a 1,5)x10
3
NA
28
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais (continuao...)

Concentrao detectada (ng.L
-1
)
Referncia

Localizao
Fonte de
Origem
Tipo de
extrao
Tipo de
deteco
Reagente de
Derivatizao Nonilfenol (NP) Estradiol (E2) Etinilestradiol (EE2)
(Yang et al. 2006)
Guangdong,
(China) Rio SPME CG-MS MSTFA (4,0 a 5,3) 10
3
98 a 102 NA
1
(Zhang et al. 2008)
Reino Unido
Rio
SPE
(Oasis HLB) CG-MS No Informado NA 11,8 NA

1
NA no analisado
29
A Tabela 3.5 mostra que grande parte das amostras aquticas analisadas indicou
a presena de PE em concentraes que variaram de 1,8 a 10000 ng.L
-1
para o NP e de
0,01 a 6000 ng.L
-1
para o E2 e 0,04 a 3.500 ng.L
-1
para EE2. Apesar de a Tabela 3.5 s
ter apresentado trs PE, salienta-se que muitos dos trabalhos relatados detectaram ainda
a presena de outros PE, tais como bisfenol A e estrona (Lagan et al. 2004; Raimundo
2007; Wang et al. 2005). Trabalhos brasileiros como de Ghiselli (2006) e Raimundo
(2007) detectaram tambm em guas brasileiras o estrognio natural progesterona, o
estrognio sinttico levonorgestrel e os xenoestrognios dietilftalato, dibutilftalato e
octilfenol. Compostos considerados PE, mas que enquadram em outras classes como
pesticidas e HPAs, tambm foram analisados e detectados por Ghiselli (2006) e
Raimundo (2007).
A Portaria 518/2004 do Ministrio da Sade no determina os valores mximos
permitidos das substncias analisadas em gua de abastecimento. Outros rgos
mundiais como a Agncia Ambiental Americana (USEPA) e a Organizao Mundial da
Sade (OMS) tambm no apresentam valores mximos permitidos devido falta de
comprovao concreta dos limites txicos dos PE. A Tabela 3.5 mostra que so poucos
os trabalhos realizados em guas brasileiras. Os resultados apresentados por Ghiselli
(2006) e Raimundo (2007) indicaram uma quantidade de estradiol e etinilestradiol
superior quela normalmente encontrada em guas estrangeiras. Clculos de
concentraes mdias encontradas em trabalhos internacionais apresentaram valores de
34 ng.L
-1
para E2 e 5,5 ng.L
-1
para EE2 enquanto que trabalhos brasileiros, feitos na
bacia do rio Atibaia em Campinas-SP (Ghiselli, 2006), chegaram a concentraes
mximas de 6,0 x 10
3
ng.L
-1
para E2 e 3,5 x 10
3
ng.L
-1
para EE2.
No h muitos resultados publicados de monitoramento de estradiol,
etinilestradiol e nonilfenol em guas superficiais. Alm disso, os artigos disponveis
relatam o monitoramento destes PEs em diferentes tipos de corpo dgua localizados
em diferentes pases, o que torna a comparao de resultados difcil e limitada. A
quantidade existente de um PE no ambiente depende de vrios fatores. Locais onde h
uma forte presena da agricultura e pecuria possuem tendncia de conterem pesticidas
e hormnios, enquanto que esgotos domsticos possuem uma maior probabilidade de
conter alquilfenis. A Tabela 3.6, adaptada de Raimundo (2007), resume os possveis
perturbadores endcrinos presentes de acordo com a fonte de poluio.

30
Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endcrinos em guas superficiais.
(adaptada de Raimundo 2007).

Fontes Tipos de
fontes
Perturbadores endcrinos presentes
Efluente
industrial
Pontual Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,
ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena, pesticidas,
bifenilas policloradas (PCB), hidrocarbonetos
policclicos aromticos (HPA), retardantes de chama,
pesticidas, dioxinas
Esgoto domstico Pontual Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,
ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena.
Deflvio pecurio Difusa Hormnios naturais e sintticos, antibiticos,
frmacos veterinrios
Natural Difusa HPA, estrognios naturais e fitoestrognios

3.3.3. Tcnicas de remoo de perturbadores endcrinos

Em virtude da presena de NP, E2 e EE2 em potenciais mananciais de

abastecimento de gua, faz-se necessrio avaliar a eficincia de tcnicas de tratamento
de gua na remoo de tais compostos. Salienta-se que pouco se sabe sobre a eficincia
das operaes unitrias e processos qumicos usualmente usados no tratamento
convencional de gua na remoo de tais compostos.
Recentes estudos mostram que os processos oxidativos, tais como, ozonizao e
os processos oxidativos avanados (POAs) so tecnologias promissoras na remoo
desses micropoluentes no tratamento de gua potvel ou de outros sistemas aquosos.
Outros tratamentos tambm foram investigados na remoo de PE em sistemas
aquosos, como, filtrao em carvo ativado, processos com membranas de
nanofiltrao e osmose reversa, clorao, dentre outros (Deborde et al. 2004; Veras
2006; Wang et al. 2005).
A ozonizao tem sido considerada uma tecnologia promissora na remoo de
estrognios naturais e sintticos tanto de gua para abastecimento quanto de efluentes.
Wang et al (2005) avaliaram o ndice de remoo dos compostos E2, EE2 e NP, que
chegou a 53% na etapa de ozonizao para o E2, 71% para o EE2 e de apenas 21% para
o NP. A estao avaliada recebia o efluente domstico tratado em sistema de lodos
ativados, sendo o tratamento tercirio feito com coagulao-floculao utilizando o
cloreto de polialumnio (PAC) como coagulante (dose de 15 mg.L
-1
) seguido de
filtrao com membranas de 0,2 m e, finalmente, tratamento por ozonizao com
dosagem de 5 a 6 mg.L
-1
de O
3
. Os valores de PE residuais (aps a ozonizao) foram
31
de 0,7 ng.L
-1
para E2, 0,8 ng.L
-1
para EE2 e 1,8 ng.L
-1
para NP. Infelizmente maiores
informaes a respeito do tratamento (Ex. tempo de contato, temperatura...) no so
informados no artigo.
Outros estudos em escala laboratorial (Alum et al. 2004; Huber et al. 2003)
indicaram que os estrognios so rapidamente oxidados com baixas doses de oznio (1,5
mg.L
-1
e tempo de contato de 10 minutos) que so usadas em estaes de tratamento de
gua potvel, alcanando altas remoes (> 97%). Contudo, como no caso anterior,
apesar da atividade estrognica ter diminudo consideravelmente, uma estrogenicidade
residual permaneceu, provavelmente, devido aos subprodutos de oxidao e a no
remoo completa.
Rudder et al. (2004) estudaram um sistema de filtro biolgico em conjunto com o
xido de mangans (MnO
2
) para oxidao dos PE em esgoto domstico, e obtiveram
eficincias de 81,7% na remoo de EE2. O MnO
2
oxidou os micropoluentes em
molculas menores, que junto com o Mn
2+
foram degradados biologicamente, sendo o
mangans reoxidado (Mn
4+
) re-depositado no reator MnO
2
.
Os processos oxidativos avanados (POAs) tambm so bons candidatos para a
remoo de PE em guas e efluentes. A reviso da literatura mostra que os seguintes
processos j foram investigados para a degradao de perturbadores endcrinos em
ambientes aquticos: O
3
/H
2
O
2
, H
2
O
2
/UV, Fenton, TiO
2
/UV. A fotocatlise com TiO
2

tem sido bastante estudada na degradao de estrognios (17-estradiol, estrona) e
outros PE, alcanando boas remoes dos poluentes (Bila e Dezotti 2007; Veras 2006).
A Agncia Ambiental Americana (USEPA 2001) realizou um estudo para
avaliar quais processos no tratamento de gua podem ser usados para remoo de
alguns PE. O relatrio conclui que a melhor tecnologia disponvel no tratamento de
gua para remoo de pesticidas, ftalatos, alquilfenis, alquilfenis etoxilados e PCB
o processo de filtrao em CAG (Carvo Ativado Granular). O carvo ativado em p
(CAP) comumente usado no tratamento de gua potvel para remoo de
micropoluentes. Alguns autores investigaram o uso de processos de filtrao com
carvo ativado na remoo dos PE, tais como, E2, bisfenol A e EE2, e os resultados
mostraram que so alcanadas remoes maiores que 99% de eficincia em com
concentraes iniciais do poluente de aproximadamente 100 ng.L
-1
, onde foi utilizado
concentraes de 5 a 50mg.L
-1
de carvo ativado em p (Fuerhacker et al. 2001; Yoon
et al. 2003). Veras (2006) estudou a capacidade de remoo do estradiol por Carvp
32
ativado em p (CAP) e a remoo chegou a 100% com o carvo ativado a partir de osso
bovino com uma concentrao de carvo de 20 mg.L
-1
.
Outra tecnologia que pode ser usada na remoo de PE so os processos de
membrana. De fato, a aplicao de processos com membranas de nanofiltrao (NF),
ultrafiltrao (UF) e osmose reversa (OR) em plantas de tratamento de gua tem
aumentado de forma significativa (Mierzwa et al. 2005; Van der Bruggen e
Vandecasteele 2003). H poucos trabalhos publicados sobre a remoo de PE por
processos de membranas, mas o trabalho de Mierzwa et al (2005) relataram eficincia de
remoo acima de 90% para EE2 e NP usando membranas de ultrafiltrao.
A Tabela 3.7 resume os dados disponveis na literatura relacionados s
eficincias de remoo de E2, EE2 e NP por diferentes tcnicas de tratamento de gua.

Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoo de perturbadores endcrinos.

Tecnologia PE estudados Remoo Referncia
Ozonizao

E2, EE2, NP
1
53% (E2)
71% (EE2)
21% (NP)
Wang et al (2005)
Ozonizao E2, EE2 > 97% Alum et al (2004)
Adsoro por carvo
Ativado em p
E2 > 95% Veras et al (2006)
Separao com utilizao de
Membranas
EE2, NP > 90% Mierzwa et al (2005)
Filtro biolgico com MnO
2
EE2 81,7% (Rudder et al. 2004)
1
E2 estradiol; EE2 etinilestradiol; NP - nonilfenol.

Percebe-se que h pouqussimos trabalhos publicados sobre tecnologias de

remoo de perturbadores endcrinos em guas destinadas ao abastecimento pblico.
Nesse sentido cabe destacar que pesquisas financiadas pelo Programa Nacional de
Saneamento Bsico (PROSAB) tm sido conduzidas por algumas instituies brasileiras
(UFMG-UFOP, USP) para avaliar a ocorrncia de perturbadores endcrinos em
mananciais superficiais bem como a eficincia de diferentes tecnologias de tratamento
na remoo de tais compostos.

3.3.4. Consideraes finais

Este captulo revisou as metodologias utilizadas para anlise dos PE em amostras

ambientais e compilou os valores de monitoramento de estradiol, etinilestradiol e
33
nonilfenol, apresentados em artigos nacionais e internacionais. Alm disso, a reviso
apresentou dados de experimentos que objetivaram avaliar diferentes tecnologias na
remoo de tais poluentes.
De modo geral, os procedimentos analticos empregados nos trabalhos, em sua
maioria usando tcnicas cromatogrficas acopladas a espectrmetros de massa,
mostraram-se efetivos para a identificao e quantificao de PE presentes nas amostras
ambientais. O tipo de anlise a ser escolhida (GC-MS ou LC-MS) vai depender
basicamente do tipo de amostra e disponibilidade de equipamento, sendo recomendado o
uso de kits de bioensaios nos casos em que tais equipamentos no so disponveis. Em
relao ao procedimento de extrao, os cartuchos SPE Oasis HLB e octadecil (C18) so
os mais utilizados para a anlise quantitativa da maioria dos PE e, como ambos
apresentam ndices de recuperao semelhantes, o cartucho C18 torna-se uma opo
com melhor relao de custo-benefcio.
A reviso mostra que os hormnios sexuais (naturais e sintticos) e os
alquilfenis estiveram presentes na maioria das amostras de gua superficial analisadas,
e em concentraes que variaram de 1,8 a 5.300 ng.L
-1
para o nonilfenol; de 0,01 a 6.000
ng.L
-1
para o estradiol natural; e de 0,04 a 3.500 ng.L
-1
para o etinilestradiol. Os
trabalhos apresentados mostram que a eficincia de remoo dos PE varia muito com a
condio operacional e tecnologia utilizada; e que na maioria dos casos o tratamento
com ozonizao, ultrafitrao e adsoro em carvo ativado reduziu significativamente a
concentrao dos PE estudados.
Percebe-se que h pouqussimos trabalhos nacionais sobre o tema perturbadores
endcrinos, tanto no que diz respeito ao monitoramento da ocorrncia de PE em
mananciais superficiais, quanto ao estudo das tecnologias de remoo dos PE de guas
superficiais. A necessidade de estudo sobre os valores mximos permitidos de certos PE
no relacionados na Portaria MS 518/2004 tambm importante, uma vez que certos
PE, como o estradiol, possuem a capacidade de alterar funes endcrinas em humanos
e no possuem regulamentao de seu teor em gua.
34
4. MATERIAIS E MTODOS

Para que se pudesse desenvolver um procedimento analtico capaz de identificar
e quantificar os possveis PE em amostras ambientais, o trabalho experimental foi
dividido em trs etapas. Na primeira etapa do trabalho foi adaptado, a partir da literatura
pertinente, um procedimento para a determinao do nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol, utilizando SPE-LCMS-IT-TOF. A segunda etapa consistiu na validao
do mtodo empregado, e na terceira etapa foram analisadas amostras de gua superficial
de trs mananciais da RMBH em doze campanhas amostrais.
A escolha de E2, EE2 e NP como micropoluentes a serem monitorados, alm de
sua importncia ambiental, tambm devido ao fato de outros pesquisadores no mbito
do PROSAB, Edital 5, estarem realizando pesquisas com estes micropoluentes em
outros estados brasileiros. Dessa forma, os resultados obtidos podero ser comparados
com outros pesquisadores da rede.

4.1. Desenvolvimento e Otimizao do Mtodo Analtico

Inicialmente foi adaptado, dois procedimentos para a separao e quantificao
dos trs compostos escolhidos empregando CG-FID (apenas anlises de teste) e LCMS-
IT-TOF (otimizao e validao), depois disso, foram avaliados mtodos de extrao
dos analitos da amostra baseados em SPE. Devido s baixas concentraes dos
compostos de interesse encontrados em ambientes aquticos naturais, foram adotados
procedimentos para reduzir contaminaes originadas durante as etapas de amostragem,
preservao e pr-tratamento.
Desta forma, foram empregados procedimentos fundamentados no uso de
tcnicas com baixo ndice de contaminao em todas as etapas envolvidas na realizao
deste trabalho. Todos os materiais e vidrarias foram primeiramente lavados com gua
corrente, detergente. Em seguida, foram lavados em triplicata com uma soluo de
Extran 2,5% e enxaguados exaustivamente com gua destilada. Aps a lavagem com
Extran, as vidrarias foram imersas em uma soluo de HNO
3
2,5% por um perodo de 24
horas e, finalmente, submetidos limpeza final com gua deionizada. Durante todo o
processo de limpeza, a vidraria foi colocada em bandejas limpas. Alm disso, o
manuseio e as etapas de preparo de amostra, incluindo filtrao, extrao e concentrao
dos analitos, foram realizados em sala para amostras de gua. A Tabela 4.1 traz
35
informaes sobre os trs padres analticos utilizados nesse trabalho, enquanto que a
Figura 4.1 apresenta um procedimento geral de preparao e anlises dos PE
monitorados neste trabalho. Os nmeros apresentados no fluxograma da Figura 4.1,
sero utilizados para melhor identificao dos procedimentos descritos posteriormente
neste captulo.

Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, frmula molecular, pureza, marca e nmero CAS dos
compostos determinados.

Composto Frmula
Molecular
Massa
Molar
(g/mol)
CAS
1
Marca Pureza Nome IUPAC
2
Estrognio Natural
17-estradiol C
18
H
24
O
2
272,1776 50-28-2 Sigma-
Aldrich
97% estra-1,3,5(10)-
trieno-3,17-diol
Estrognio Sinttico
17-
etinilestradiol
C
20
H
24
O
2
296,1776 57-63-6 Sigma-
Aldrich
98% 19-norpregna-
1,3,5(10)-trien-
20-ino-3,17-
diol
Xenoestrognio
Nonilfenol
mistura tcnica
C
15
H
24
O 220,1827 84852-15-
13
Pestanal 94% n-nonilfenol
4 - Nonilfenol C
15
H
24
O 220,1827 104-40-5 Riedel-de
Han
99.9% 4-n-nonilfenol
1
CAS: Chemical Abstract Service,
2
IUPAC: International Union of Pure and Applied
Chemistry



Figura 4.1 - Diagrama geral para preparao e anlises dos PE.
36
O acetato de etila utilizado no preparo das amostras foi de grau CG (Sigma-
Aldrich), enquanto que o metanol utilizado na separao cromatogrfica e no preparo de
amostras foi de grau HPLC (JT Baker). A gua utilizada como fase mvel em todas as
anlises foi deionizada em sistema de gua ultra pura TKA com resistividade igual a
0,058 S.

4.1.1. Amostragem, filtrao e ajuste do pH (etapas 1 a 3)

Utilizando um frasco de vidro escuro, coletou-se 1 litro de gua dos mananciais
escolhidos na entrada das respectivas estaes de tratamento de gua (ETA). Adicionou-
se em cada frasco, in loco, 5mL de metanol para evitar o crescimento de microrganismos
e efetuou-se o transporte para os laboratrios do DESA-UFMG, onde as extraes foram
realizadas. O tempo limite de preservao foi de 48 horas.
Aps a amostra ser coletada, foi feito a filtrao (2) cuja funo consistiu em
reter partculas suspensas presentes na amostra bruta, permitindo assim que a extrao
por fase slida fosse feita sem problemas de entupimento dos cartuchos. Foram
utilizadas membranas de fibra de vidro (de 1,2 m) em srie com membranas de acetato
de celulose (de 0,45 m). Aps a filtrao, o pH da amostra foi ajustado para o valor 3,0
com gotas de uma soluo de cido sulfrico (50% v/v) (Wang et al. 2005).

4.1.2. Extrao e concentrao dos analitos (etapas 4 e5)

A etapa de extrao foi feita com o objetivo de concentrar os compostos de
interesse (analitos) bem como separ-los das espcies que poderiam interferir na anlise.
A remoo de compostos orgnicos da fase aquosa foi feita por SPE, adaptando-
se a metodologia descrita por Wang et al (2005). Vale salientar que a metodologia
utilizada bastante parecida com outros trabalhos (Ghiselli 2006; Raimundo 2007;
Wang et al. 2008; Wang et al. 2005), ou seja, pequenas modificaes foram feitas para
adequar a extrao aos compostos analisados e ao equipamento utilizado na
quantificao dos mesmos (Tabela 4.2). Na parte de validao do mtodo analtico, foi
verificada a eficincia da etapa de extrao a fim de se obter os resultados relacionados
extrao simultnea dos trs compostos analisados.
A extrao em fase slida utiliza uma coluna contendo um sorvente apropriado
para reter o analito que ento eludo com um solvente especfico. A SPE envolve
37
basicamente quatro etapas: condicionamento do cartucho (uso de solvente adequado para
disponibilizar os stios ativos e para ajustar as foras dos solventes de eluio com o
solvente da amostra); extrao dos analitos da amostra; lavagem do cartucho para
eliminar possveis interferentes; eluio dos analitos de interesse para posterior anlise
(Lanas, 2004a). Nesse trabalho foram utilizados cartuchos C18 (UNITECH) contendo
500 mg de fase slida (Figura 4.2), que o cartucho adequado para adsorver compostos
de interesse em meio aquoso. A Tabela 4.2 descreve os principais detalhes do mtodo.


Figura 4.2 Cartucho SPE C18 500mg Unitech

Tabela 4.2: Descrio do procedimento de extrao com cartucho Unitech C18 (500
mg) utilizado nesse trabalho para a extrao simultnea dos trs compostos de interesse.

Etapa Descrio
Filtrao de 5,0 mL de acetato de etila
Filtrao de 5,0 mL de metanol
Condicionamento
Filtrao de 5,0 mL de gua deionizada
Extrao Filtrao de 1,0 L de amostra em pH=3,0 (vazo aproximada: 5mL .
min
-1
)
Secagem Aplicao de vcuo por 20 minutos
Eluio Filtrao de duas alquotas de 5 mL de acetato de etila (vazo
aproximada: 1,0 mL . min
-1
)

A extrao foi realizada utilizando-se uma bomba de vcuo (Fanem) por meio da
fixao dos cartuchos em um sistema de manifold com capacidade para 16 estraes
simultneas (Figura 3.3). Para a etapa de eluio, tubos de ensaio de vidro (16,0 x 1,5
cm) foram utilizados para armazenar o acetato de etila eludo, conforme a tabela 4.2.

38

Figura 4.3 Sistema de extrao em fase slida utilizado para extrao dos analitos de
interesse das amostras ambientais.

4.1.3. Secagem e suspenso dos analitos (etapas 6,7 e 10)

Os eluatos (~10 ml) coletados nos tubos de ensaio foram ento levados
completa secura com auxlio de nitrognio comercial. Durante o processo de secagem, o
volume era recomposto lavando as paredes do tubo de ensaio para evitar perdas de
analito at que todo o extrato se concentrasse apenas no fundo do tubo. O extrato seco
foi ento avolumado para 1,0mL pela adio acetato de etila (etapa 7) ou metanol (etapa
10), e o extrato concentrado foi ento transferido para vials cromatrogrficos (1,5mL)
que ficaram conservados em freezer (-20C) at o momento da anlise cromatogrfica
por um perodo mximo de 15 dias.

4.1.4. Anlise Cromatogrfica (etapas 8,9 e 11)

Anlise por cromatografia gasosa (8 e 9)

A re-suspenso do extrato seco em acetato de etila (etapa 7) foi feita para
determinar os PE por cromatografia gasosa com deteco por ionizao em chama.
Conforme visto na reviso da literatura, as anlises de E2, EE2 e NP por cromatrografia
gasosa necessitam da etapa de derivatizao. Este procedimento consiste em transformar
um composto em um derivado, cujas caractersticas de volatilizao e interao com a
fase estacionria da coluna utilizada permitam a anlise do composto em questo. No
39
caso dos PE analisados, a etapa de derivatizao utilizada ainda para aumentar a
seletividade e a sensibilidade da anlise, pois os compostos formados aps a
derivatizao no so degradados a altas temperaturas. Nesse caso, o derivado obtido
ser de polaridade menor e volatilidade maior, o que possibilita sua anlise por
cromatografia gasosa.
A reao utilizada para derivatizar os PE foi a de silanizao, que consiste em
substituir o hidrognio da hidroxila (-OH) pelo grupo trimetil-silil (-Si(CH
3
)
3
)
diminuindo assim a polaridade desses compostos e aumentando sua volatilidade. A
Figura 4.4 apresenta uma reao geral de silanizao e os compostos utilizados nessa
etapa.

Figura 4.4 Reao de Silanizao a partir dos analitos a serem derivatizados
(nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o reagente de derivatizao utilizado (BSTFA)

O procedimento para derivatizao dos compostos a serem analisados por CG-
FID consistiu nas seguintes etapas:
A partir do extrato re-suspendido com acetato de etila (1,0 mL grau CG,
Sigma-Aldrich) (etapa 7), transferiu-se 50L da soluo para outro vial no qual
foi novamente secado com nitrognio.
No extrato seco, foi adicionado 50L de BSTFA (sigma-aldrich).
O vial foi fechado e colocado sob uma temperatura constante de 75C durante 45
minutos.
O extrato derivatizado foi levado para anlise no CG-FID Varian CP 3380 no
qual foi analisado de acordo com as condies apresentadas na Tabela 4.3.
40
Tabela 4.3: Condies de anlise dos PE por cromatrografia gasosa

Aparelho Varian CP 3380
Coluna BPX-5 (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano)
Caractersticas
*Comprimento: 25m
*Dimetro interno: 0,15 mm
*Espessura do filme: 0,25 m
Gases utilizados N
2
(make-up), Ar Sinttico (comburente) e
H
2
(gs de arraste e combustvel)
Vazes dos
Gases
N
2
: 30mL/min
Ar Sinttico: 300mL/min
H
2
: 30mL/min
Fase Mvel: 30mL/min
Injeo 2 L, splitless total
Temperatura do
injetor
280C
Temperatura do
detector
300C

Programao de
temperatura
*50C por 1min;
*50 a 120C a 20C/min;
*120 a 280C a 10C/min estabilizando a
280C por 11minutos.
Tempo total: 32minutos




Anlise por cromatografia lquida com espectrometria de massas (etapa 11)

Diferentemente da cromatrografia gasosa, os perturbadores endcrinos a serem
analisados no necessitam de ser derivatizados para anlise por cromatografia lquida.
Portanto, aps a secagem do extrato de SPE, foi feito a suspenso com 1 mL de metanol
(grau HPLC, J.T. Baker). As anlises por cromatografia lquida foram realizadas em um
equipamento da Shimadzu, modelo LCMS-IT-TOF (Cromatografia Lquida acoplado a
espectrmetro de massas, detector do tipo ion-trap - time-of-flight), e configurado de
acordo com a Tabela 4.4. Os solventes utilizados como fase mvel foram degaseificados
pelo sistema DGU-20A
3
(Shimadzu).
O LCMS-IT-TOF um equipamento hbrido ideal para identificao de
compostos orgnicos no-volteis. Acoplando ionizao a presso atmosfrica com as
tecnologias de Ion Trap (IT) e Tempo de vo (TOF), o LCMS-IT-TOF permite obter alta
exatido de massa e alta resoluo (10.000 a 1000 m/z) em todos os modos MS.
Disponibiliza a capacidade de MSn (MS/MS, MS/MS/MS, MS/MS/MS/MS.) utilizando
o mtodo de ion-trap e tambm a capacidade de realizar medies de massa de alta
resoluo e alta preciso utilizando o mtodo TOF, propiciando uma grande seletividade
41
e especificidade dos ons. Pode ser utilizado para obter uma larga variedade de
informaes analticas que so importantes para anlise estrutural (shimadzu). A Figura
4.5 mostra o diagrama de funcionamento do espectrmetro de massas de acordo com a
metodologia utilizada.


Figura 4.5 Diagrama esquemtico de funcionamento do espectrmetro de massas on-
trap time-of-flight (fonte: Shimadzu, 2007)

No desenvolvimento da anlise cromatogrfica foi avaliada a deteco dos
compostos usando como fase mvel (FM) acetonitrila/gua e metanol/gua. Para isso
foram estudados trs parmetros: FM, vazo da FM e tipo de eluio (isocrtica ou
gradiente). A vazo da fase mvel escolhida foi 0,2 mL min
-1
com a utilizao dos
solventes metanol/gua definida a partir da anlise dos picos dos compostos obtidos com
vazes que variaram entre 0,1 e 0,3 mL min
-1
. O mtodo de eluio por gradiente obteve
melhores resultados cromatogrficos. O volume de injeo foi mantido em 5 L durante
todas as anlises. Uma vez que a concentrao da amostra foi multiplicada por um fator
de 1000 vezes, grande quantidade e variedade de compostos orgnicos estiveram
presente no extrato, o que resultou em uma amostra de elevada complexidade. Devido a
isso, foi utilizada uma pr-coluna apenas, uma vez que a separao dos compostos no
ocorreria em colunas convencionais (colunas maiores). Para as anlises foram utilizadas
pr-colunas Phenomenex C18 (4,0 mm x 2,0 mm). A freqncia de troca ocorreu a cada
100 anlises aproximadamente, devido a durabilidade menor das pr-colunas. Maiores
informaes da anlise so apresentados na Tabela 4.4.

42
Tabela 4.4: Condies de anlise dos PE por cromatrografia lquida acoplada
espectrometria de massas

Aparelho Shimadzu LCMS-IT-TOF
Mdulos CBM-20A (Controlador de Sistema)
DGU-20A3 (Degaseificador)
LC-20AD (Propulso de Solventes)
SIL-20 (Injetor Automtico)
IT-TOF (Espectrmetro de massas)
Pr-Coluna Phenomenex C18 (ODS) (4,0 mm x 2,0 mm)
Vazo da Fase Mvel 0,2 mL . min
-1
(metanol e gua)
Gradiente de concentrao
(gua e metanol)
*Variao de 30 a 85% de metanol em 5 minutos;
*Estabilizao a 85% de metanol por 3 minutos;
*Aumento para 100% de metanol e estabilizao
por 8 minutos;
*Reduo para 0% de metanol e estabilizao por
2 minutos;
*Aumento para 30% de metanol e estabilizao
por 5 minutos.
Tempo total de anlise: 23 minutos.
Volume de injeo da amostra 5l (injeo automtica)
Gases Utilizados Argnio (gs de coliso)
Nitrognio (gs de nebulizao). Presso: 100kPA
Temperatura do CDL
1
200C
Voltagem do detector 1,65 kV
Interface Eletronspray ionization (ESI) - modo negativo
Intervalo de varredura m/z 100 a 350
ons monitorados

Nonilfenol: m/z = 219,17
Estradiol: m/z = 271,17
Etinilestradiol: m/z = 295,17
Tempo de acumulao de ons Nonilfenol: 30 milisegundos
Estradiol: 100 milisegundos
Etinilestradiol: 100 milisegundos

1
CDL: Curved Dessolvation Line(Kaihara et al. 2002; Schug e McNair 2003)

4.2. Validao do Mtodo Analtico (apenas para LCMS)

A validao deve garantir, atravs de estudos experimentais, que o mtodo
atenda as exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos
43
resultados (Lanas 2004b). Embora no existam ainda sistemas de validao que
assegurem a confiabilidade dos procedimentos analticos que vem sendo empregados na
determinao de PE em amostras ambientais, procurou-se seguir os critrios e
recomendaes de alguns rgos nacionais de avaliao da qualidade de laboratrios de
anlise, como o Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial -
INMETRO e a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - ANVISA, bem como
sugestes de especialistas da rea.
Aps a utilizao de duas tcnicas analticas para determinao de PE (que ser
discutido no prximo captulo) em amostras ambientais, escolheu-se apenas a
metodologia baseada em anlises por LCMS. Essa opo foi fundamentada nos dados do
limite de deteco e especificidade, onde a cromatografia lquida obteve melhores
resultados. A ausncia do requisito volatilidade tambm foi de grande importncia para a
escolha do mtodo, uma vez que no seria necessrio a derivatizao dos compostos E2
e EE2, pois so facilmente degradados a temperaturas elevadas. Como apenas um
mtodo seria escolhido para o monitoramento dos PE, sendo que a tcnica LCMS obteve
melhores resultados, no foi necessrio a validao da tcnica CG-FID.
Portanto, os critrios adotados neste trabalho tiveram como principais referncias
os seguintes documentos: Orientaes sobre Validao de Mtodos de Ensaios
Qumicos, do INMETRO; Resoluo n 899 de 29/05/03, da ANVISA; os artigos
cientficos publicados por Vilagrassa et al (2007) e Abreu et al (2008); e ainda o livro
Validao de Mtodos Cromatogrficos de Anlise, de Lanas (2004b).
A validao do mtodo proposto para esse trabalho consistiu primeiramente da
verificao da calibrao do cromatgrafo, baseada em parmetros definidos pela
Shimadzu. Outros parmetros como estabilidade das amostras e solues-padro,
seletividade, linearidade, intervalos da curva analtica, limite de deteco, limite de
quantificao e eficincia da extrao em fase slida foram avaliados baseados nos
documentos da ANVISA e do INMETRO descritos anteriormente.

4.2.1. Estabilidade

A estabilidade das amostras e padres foi verificada em termos de temperatura e
tempo. Nesse trabalho foi construda uma curva analtica com novos padres a cada
anlise e os extratos eludos das amostras foram analisados em um perodo mximo de
44
15 dias. Alm disso, todos os padres e amostras foram conservados em freezer a -20C
e protegidos da luz, envoltos em papel alumnio.
A estabilidade dos padres foi analisada com cinco solues contendo os trs
compostos de interesse em concentraes de 5 a 400 g.L
-1
em trs momentos
diferentes: logo que o padro foi preparado; depois de 1 ms de preparo; 24 horas aps
ter sido analisado, porm tendo ficado a temperatura e luz ambiente. A estabilidade das
amostras foi avaliada atravs da anlise do extrato da amostra do Rio das Velhas na
primeira campanha amostral em trs momentos: imediatamente aps ter preparado o
extrato; aps 1 e 6 meses que o extrato foi preparado e mantido sob as condies de
preservao (freezer a -18C).

4.2.2. Seletividade

A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da
medio pelo detector selecionado, sem causar um sinal visvel no teste de
especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do
efeito tambm pode depender da sua concentrao (INMETRO 2007).
A seletividade do mtodo cromatogrfico foi determinada por meio da avaliao
da pureza dos picos cromatogrficos obtidos, tanto para os padres como para os
compostos presentes nas amostras, comparando-se os espectros de massas obtidos para
os padres empregados na calibrao do LC/MS com amostras que continham os
compostos. A avaliao foi feita por meio dos ons primrios (ms
1
) e secundrios (ms
2
)
obtidos para cada composto, portanto uma maneira segura de diferenciar o composto
analisado de um interferente presente na matriz (IMMETRO 2007; Ribani et al. 2004).

4.2.3. Curva analtica

A quantificao dos compostos de interesse nas amostras ambientais foi obtida
por padronizao externa e interna. A padronizao externa foi utilizada para a
quantificao de NP, enquanto que para E2 e EE2 foi utilizado esse mtodo apenas
durante os meses de fevereiro a junho de 2007. A determinao por padronizao interna
foi utilizada a partir do ms de julho/2007 para E2 e EE2 com o objetivo de minimizar
os interferentes da matriz para o efeito supressivo.

45
O mtodo de padronizao externa compara a rea da substncia a ser
quantificada na amostra com as reas obtidas com solues de concentraes conhecidas
preparadas a partir de um padro. Preparam- se solues da substncia a ser quantificada
em diversas concentraes; obtm-se o cromatograma correspondente a cada uma delas
e, em um grfico, relacionam-se as reas obtidas com as concentraes. Utilizando este
grfico ou a equao da curva resultante, pode-se calcular a concentrao desta
substncia na amostra a partir da rea da substncia obtida no cromatograma resultante
de uma injeo separada (Ribani et al. 2004).
O mtodo de padronizao interna consiste na preparao das solues padro de
concentraes conhecidas da substncia de interesse, s quais se adiciona a mesma
quantidade conhecida de um composto chamado padro interno. Aps anlise dessas
solues, constri-se um grfico, relacionando a razo de reas (rea da substncia/ rea
do padro interno que tem concentrao constante) com a concentrao (variada) da
substncia. A amostra tambm analisada aps a adio da mesma quantidade
conhecida do padro interno. Atravs da razo de reas obtidas no cromatograma tem-se
a concentrao da substncia na amostra. Idealmente, a substncia usada como padro
interno deve ser similar substncia a ser quantificada, ter tempo de reteno prximo a
esta substncia, no reagir com a substncia ou outro componente da matriz, no fazer
parte da amostra (Ribani et al. 2004).
Usualmente, para adequar-se aos critrios de um padro interno ideal, so
escolhidos os compostos deuterados dos analitos de interesse. Devido dificuldade de
obteno e o alto custo de aquisio, essa opo tornou-se invivel para o
desenvolvimento do mtodo. Como soluo, foi proposto o uso da fenolftalena (Figura
4.6). A fenolftalena possui estrutura semelhante, em alguns aspectos, aos perturbadores
endcrinos estudados. Alm disso, a fenolftalena estvel, altamente sensvel ao
mtodo e no foi detectada nas amostras coletadas.
O
O
OH
HO

Figura 4.6 Frmula estrutural da Fenolftalena

46
Durante as anlises de LCMS, o padro interno obteve um comportamento
semelhante aos estrognios para o efeito supressivo (ser discutido posteriormente), o
que tornou possvel o seu uso durante o monitoramento dos estrognios em gua. Para o
NP no foi detectado efeito supressivo, portanto no foi necessrio o uso de um padro
interno.
As solues padro foram preparadas a partir de uma soluo mais concentrada
(1000 mg.L
-1
) obtida pela pesagem do padro (soluo estoque) e as solues de
trabalho foram preparadas por diluio direta da soluo estoque. Todas as solues
foram preparadas em metanol (grau HPLC, J.T. Baker). A fenolftalena foi adicionada
aps todo o processo de preparao das amostras a uma concentrao de 50 g.L
-1
em
todos os vials. Um branco tambm foi feito injetando-se 5 L de metanol.
Por fim, foram tambm determinados os limites de deteco (LD) e quantificao
(LQ) do mtodo. O limite de deteco representa a menor quantidade do composto de
interesse que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada como um valor
exato. J o limite de quantificao corresponde menor quantidade do composto de
interesse que pode ser quantificada com exatido, utilizando-se um determinado
procedimento experimental (Lanas, 2004b). Ambos os limites podem ser determinados
de 3 maneiras diferentes: empregando-se o mtodo visual, o mtodo da relao sinal-
rudo e o mtodo baseado nos parmetros da curva analtica. Dentre os mtodos
apresentados, o que apresentou resultados mais satisfatrios foi o baseado nos
parmetros da relao sinal/rudo.
Para determinar o LD e LQ atravs da relao sinal-rudo, feita a comparao
entre a medio dos sinais de amostras em baixas concentraes conhecidas do
composto de interesse na matriz e um branco destas amostras. Assim, estabelecida uma
concentrao mnima na qual a substncia pode ser facilmente detectada. A relao
sinal-rudo geralmente aceitas para LD e LQ so de 3:1 e 10:1 repectivamente como so
expressos pelas equaes 1 e 2:(Ribani et al. 2004)

LQ: N/R > 10 (1)
LD: N/R > 3 (2)

onde: N a intensidade do sinal obtido pelo composto com uma concentrao
conhecida. R o rudo gerado pelo mesmo composto quando no est presente (branco).

Segundo Ribani et al (2004), o mtodo mais utilizado para a determinao dos
LD e LQ o da relao sinal-rudo para tcnicas analticas em geral. Assim sendo, o
47
melhor caminho para resolver o problema de clculo destes limites foi utilizar o mtodo
descritos nas equaes 1 e 2. Neste trabalho ambos os limites de deteco e
quantificao foram determinados e calculados usando os softwares LCMS Solutions,
Microsoft Excel e Microcal Origin.

4.2.4. Linearidade e Sensibilidade

A faixa linear de trabalho de um mtodo de ensaio o intervalo entre os nveis
inferior e superior de concentrao do analito no qual foi demonstrado ser possvel a
determinao com a preciso, exatido e linearidade exigidas, sob as condies
especificadas para o ensaio. A faixa linear definida como a faixa de concentraes na
qual a sensibilidade pode ser considerada constante. A faixa linear normalmente
expressa nas mesmas unidades do resultado obtido pelo mtodo analtico (Lanas
2004b).
Nesse trabalho, a linearidade foi obtida por padronizao externa, e de acordo
com a resoluo do INMETRO um valor de coeficiente de correlao (r) maior que 0,90
aceitvel. A sensibilidade foi expressa pelo coeficiente de inclinao da curva de
calibrao e avaliando simultaneamente o intervalo onde ocorre uma variao linear
entre a concentrao do analito e a rea obtida.

4.2.5. Preciso

A repetitividade geralmente dependente da concentrao do analito e, deste
modo, deve ser determinada para um diferente nmero de concentraes. O coeficiente
de variao (CV%) pode ser mais til neste caso, pois foi normalizado com base na
concentrao e deste modo ele praticamente constante ao longo da faixa de interesse,
contanto que esta no seja muito grande (INMETRO 2007). O Coeficiente de Variao
calculado de acordo com a equao 3:

CV = DP/CMD x 100 (3)

Onde:
DP = desvio padro;
CMD = concentrao mdia determinada

48
A preciso foi avaliada em termos de repetibilidade atravs do clculo da
estimativa do DP e do CV para um nmero de sete repeties para duas concentraes
diferentes, onde so aceitos CV de at 20 % (INMETRO 2003).

4.2.6 Ensaio de Supresso

Uma varivel acrescentada para avaliar a resposta de espectrmetros de massas
o teste de supresso. O teste de supresso utilizado para determinar se a presena de
interferentes na amostra alteram a rea cromatogrfica dos compostos de interesse. Isso
pode resultar em uma diminuio da intensidade dos ons dos compostos de interesse na
amostra real fazendo com que seja necessria a correo dos dados para uma melhor
exatido dos resultados (Villagrasa et al. 2007).
O ensaio de supresso, feito em triplicata, consistiu na adio de uma
concentrao de 20g.L
-
de, E2 e EE2, e de 50 g.L
-
de ambos, NP e fenolftalena na
amostra real aps ela ter sido submetida a todo o processo de preparao (entre o item 10
e 11 da Figura 3.1). Se no houver efeito supressivo, a diferena de rea observada entre
a amostra fortificada com o padro e a amostra original (sem a adio do padro) deve
ser igual a rea obtida pelo padro de mesma concentrao. Sendo assim, a porcentagem
de supresso calculada pela equao 4.

Fator de Supresso (%) = (1 [(A
f
A
m
) / A
t
]) x 100 (4)
Onde:
A
f
= rea do composto de interesse na amostra fortificada aps todo o processo de
extrao e eluio (no vial);
A
m
= rea da amostra sem a fortificao (branco)
A
t
= rea terica em relao quantidade de padro adicionado a amostra. Calculado
pela curva de calibrao.

4.2.7. Ensaio de recuperao

Os ensaios de recuperao foram utilizados para averiguao da preciso e
exatido do mtodo. O ensaio de recuperao constitui-se no mtodo mais utilizado para
validao de processos analticos (Lanas 2004b).
49
A recuperao est relacionada com a exatido, pois reflete a quantidade de
determinado analito, recuperado no processo, em relao quantidade real presente na
amostra. A exatido expressa como erro sistemtico percentual, inerente ao processo.
O erro sistemtico ocorre pela perda da substncia devido baixa recuperao da
extrao, medidas volumtricas imprecisas ou substncias interferentes na amostra.
Segundo o INMETRO, o ndice de recuperao calculado da seguinte forma
(equao 5):

Recuperao (%) = [(C
1
- C
2
) / C
3
] x 100 (5)

onde:
C
1
= concentrao determinada na amostra fortificada;
C
2
= concentrao determinada na amostra no fortificada;
C
3
= concentrao adicionada.

Neste trabalho, os ensaios de recuperao foram avaliados usando 9

determinaes, cada qual usando 3 nveis de concentraes, com triplicatas em cada
nvel. As concentraes preparadas foram de 20, 100 e 200 ng.L
-1
para E2 e EE2 e 300
ng.L
-1
para NP.
A faixa escolhida para os estrognios coincide com a faixa de trabalho utilizada
(prximo ao LD, concentrao mdia e mxima da curva de calibrao). Isso foi
possvel devido a ausncia de tais compostos nas amostras. Diferentemente para o NP,
onde no foi possvel a determinao a baixas concentraes (20 e 150 ng.L
-1
), pois o
alquilfenol esteve presente sempre em valores acima de 200 ng.L
-1
durante os testes de
recuperao, impossibilitando a determinao do ndice de recuperao com valores
abaixo de 300 ng.L
-1
.
As amostras utilizadas para o ensaio foram coletadas na entrada da ETA Morro
Redondo totalizando 12 amostras, j que necessrio observar as concentraes dos PE
na, amostra, anteriores adio. Os intervalos aceitveis de recuperao para anlise de
compostos em concentraes-trao esto entre 70 e 120 %, segundo Wang et al, (2005).

4.2.8. Ensaio de calibrao interlaboratorial

A calibrao interlaboratorial possui o objetivo de avaliar a preciso das anlises
feitas por laboratrios ou metodologias diferentes. Consiste em uma importante etapa de
validao, uma vez que cada laboratrio busca a verificao do desempenho dos seus
50
mtodos em relao aos dados de validao obtidos por meio de comparao
interlaboratorial (Immetro, 2007).
Com objetivo de avaliar a confiabilidade dos resultados obtidos para a
metodologia LCMS-IT-TOF, em parceria com o Centro Internacional de Referncia e
Reuso da gua (CIRRA Butant, SP), foram feitas anlises dos 3 compostos por duas
metodologias diferentes:
- Anlise por Espectrometria de Massas DEQUI-UFOP.
- Anlise por Imunoensaio (kit ELISA) CIRRA-USP.
A intercalibrao foi feita em duas etapas. A primeira etapa consistiu em uma
anlise de amostra que foi preparada na UFMG (rio das Velhas fevereiro/2008) e
enviada para os dois laboratrios. A segunda etapa foi a anlise dos padres com
concentraes pr-estabelecidas, de modo que cada padro preparado em seu respectivo
laboratrio foi enviado ao outro e analisado. Esta etapa consistia na verificao da curva
de calibrao de ambos, pois em teoria, a concentrao dos padres deveria ser igual nos
dois procedimentos.
Para a anlise por LCMS foram enviados, pelo CIRRA-USP, apenas os padres
de EE2 devido incompatibilidade, com as colunas cromatogrficas, do padro de NP
utilizado no kit ELISA. Para anlise por kit ELISA foram enviados, pelo DEQUI-UFOP,
todos os padres (4NP, NP mix, E2 e EE2) em meio aquoso.

4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endcrinos nos Mananciais da Regio
Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH)

Por meio da tcnica de cromatografia lquida acoplada espectrometria de
massas (LCMS), foram avaliadas a qualidade de guas destinadas ao abastecimento
pblico na Regio Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) no que diz respeito aos
trs PE j mencionados: nonilfenol, estradiol e etinilestradiol.
Foram realizadas doze campanhas amostrais a fim de se obter dados referentes s
variaes sazonais da concentrao dos trs PE avaliados em trs distintos corpos
dgua. Assim, as coletas foram feitas ao longo de um ano hidrolgico completo,
contemplando perodos de elevada pluviosidade e de estiagem. As campanhas amostrais
foram mensais (de 02/2007 a 01/2008) e a coleta das amostras de gua feitas de forma
pontual.
51
Um levantamento feito pelo DESA-UFMG em conjunto com a COPASA-MG
avaliou as condies de proteo sanitria dos mananciais da RMBH. Foram escolhidos
dois mananciais que apresentaram condies crticas de preservao, sendo um deles
ltico (Rio das Velhas) e outro lntico (Vargem das Flores), e um manancial mais
protegido (Morro Redondo). As Figuras 4.7 e 4.8 apresentam a localizao dos
mananciais e a contribuio dos mesmos para o abastecimento pblico na RMBH.



Figura 4.7 Localizao dos 3 mananciais estudados na Regio Metropolitana de Belo
Horizonte (COPASA, 2006)


Figura 4.8 Contribuio das ETAs no abastecimento da Regio Metropolitana de Belo
Horizonte (COPASA, 2006)

52
Alm de monitorar a qualidade da gua dos mananciais Rio das Velhas, Vargem
das Flores e Morro Redondo no que se refere presena de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol, a dissertao tambm buscou avaliar, ainda que de forma preliminar, a
ocorrncia dos PE estudados na gua parcialmente tratada (antes da etapa de
desinfeco). Para tanto, a partir de Junho de 2007, amostras foram coletadas no s na
entrada das ETAs dos trs mananciais avaliados, mas tambm aps a etapa de filtrao,
podendo assim, avaliar a eficincia do tratamento clssico (exceto desinfeco) na
remoo de E2, EE2 e NP. A eficincia de remoo foi calculada conforme a equao 6:

Eficincia de Remoo (%) = 100 (C
Ab
- C
At
)/C
Ab
(6)
onde:
C
At
= concentrao determinada na gua aps o processo de filtrao;
C
Ab
= concentrao determinada na gua bruta;

As amostras foram coletadas com o auxlio de um frasco previamente
ambientado com a prpria gua a ser coletada, ou diretamente em frascos de vidro mbar
de 1 litro de capacidade tambm ambientados. Em cada ponto de amostragem foram
coletados cerca de 3L de amostra. Em cada recipiente de amostragem foram adicionados
5mL de metanol para fins de inibio microbiana, e em seguida os frascos foram
fechados e colocados em caixa trmica com gelo para seu transporte. Durante todo o
perodo de amostragem foram utilizadas luvas de ltex e todas as amostras foram
preservadas a 4 C, em refrigerador, at a extrao dos compostos de interesse, o que foi
feito em at 48 horas da coleta.
Anterior ao processo de extrao das amostras de gua bruta, medidas de pH,
turbidez, cor verdadeira (fev/07 jan/08) e cor aparente (set/07 jan/08) foram feitas
para uma possvel correlao destes parmetros com as concentraes dos PE presentes
na amostra a partir de anlises estatsticas dos dados (Sousa et al. 2006). As anlises
fsico qumicas foram feitas baseadas na metodologia descrita no livro Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, considerado livro de referncia
para anlises em gua e efluentes (Eaton et al. 2005).
As extraes e eluies das amostras foram feitas em laboratrios devidamente
equipados para anlise de gua localizados no Departamento de Engenharia Sanitria e
Ambiental da UFMG (DESA-UFMG) por pessoas previamente treinadas para tal
funo. No laboratrio, alquotas da gua coletada foram preparadas para a extrao em
duplicata. As amostras foram previamente filtradas a vcuo em sistema tipo manifold
53
utilizando membranas de acetato de celulose com 0,45 m de porosidade e 47 mm de
dimetro, para remover slidos em suspenso presentes na matriz (ver Figura 4.1).

ETA Rio das Velhas (coordenadas 20 00 23.84 S e 43 49 36.42 O)

A ETA-Rio das Velhas trata em mdia 24.300 m
3
/h de gua, sendo responsvel
por cerca de 43% do abastecimento da RMBH (Figura 4.7). A qualidade da gua desse
manancial prejudicada em funo do aporte de esgotos domstico e industrial (tratados
ou in natura) por cidades e indstrias localizadas montante da ETA (Sabar, Raposos,
Santa Luzia, Lagoa Santa, etc.), bem como por atividades agrcola e pecuria
desenvolvidas em sua bacia. O tratamento utilizado na ETA do tipo convencional com
coagulao/floculao, decantao, filtrao, e etapas de pr- e ps-clorao. A Figura
4.9 mostra uma vista area da ETA-Rio das Velhas indicando os pontos de coleta. A
Figura 4.10 mostra o local de amostragem da gua bruta ao passo que a Tabela 4.5
resume as campanhas amostrais realizadas no local.



Figura 4.9 Vista area da ETA Rio das Velhas



Figura 4.10 Local de amostragem para gua bruta do manancial Rio das Velhas

54
Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinao de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol na ETA Rio das Velhas.

Tipo de Amostra Cdigo das Amostras Ms
007RV e 008RV Fevereiro/07
013RV e 014RV Maro/07
019RV e 020RV Abril/07
029RV e 030RV Maio/07
040RVB e 041RVB Junho/07
050RVB e 051 RVB Julho/07
064RVB e 065RVB Agosto/07
084RVB e 085RVB Setembro/07
098RVB e 099RVB Outubro/07
118RVB e 119RVB Novembro/07
130RVB e 131RVB Dezembro/07





Entrada da ETA
(antes da pr-
clorao)
142RVB e 143RVB Janeiro/08
042RVE e 043RVE Junho/07
056RVE e 057RVE Julho/07
066RVE e 067RVE Agosto/07
086RVE e 087RVE Setembro/07
096RVE e 097RVE Outubro/07
116RVE e 117RVE Novembro/07




Efluente do filtro
132RVE e 133RVE Dezembro/07


ETA Vargem das Flores (coordenadas 19 55 13.18 S e 44 10 15.22 O)

A ETA-Vargem das Flores trata em mdia 3.600 m
3
/h de gua e responsvel
por cerca de 10% do abastecimento da RMBH (Figura 4.7). A captao superficial, que
feita em barragem, apresenta histrico de estratificao e florao de cianobactrias
(Jardim et al. 2000; Jardim e Viana 2003). O tratamento utilizado na ETA do tipo
filtrao direta descendente com coagulao/floculao e filtrao, e etapas de pr- e
ps-clorao. As Figuras 4.11 e 4.12 mostram a localizao da ETA Vargem das Flores.
A Tabela 4.6 apresenta as campanhas amostrais realizadas no local.

Figura 4.11 ETA Vargem das Flores

55



Figura 4.12 Vista area ETA Vargem das Flores

Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinao de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores.

Tipo de Amostra Cdigo das Amostras Ms
009VF e 010VF Fevereiro/07
015VF e 016VF Maro/07
021VF e 022VF Abril/07
031VF e 032VF Maio/07
036VFB e 037VFB Junho/07
052VFB e 053VFB Julho/07
076VFB e 077VFB Agosto/07
092VFB e 093VFB Setembro/07
106VFB e 107VFB Outubro/07
108VFB e 109VFB Novembro/07
122VFB e 123VFB Dezembro/07




Entrada da ETA
(antes da pr-
clorao)
136VFB e 137VFB Janeiro/08
038VFE e 039VFE Junho/07
058VFE e 059VFE Julho/07
082VFE e 083VFE Agosto/07
094VFE e 095VFE Setembro/07
104VFE e 105VFE Outubro/07
110VFE e 111VFE Novembro/07
124VFE e 125VFE Dezembro/07




Efluente do filtro
134VFE e 135VFE Janeiro/08

ETA Morro Redondo (coordenadas 19 57 42.41 S e 43 56 31.05 O)

A ETA-Morro Redondo trata em mdia 2.500 m
3
/h de gua, sendo responsvel
por cerca de 5% do abastecimento da RMBH (Figura 4.7). O Sistema Morro Redondo
56
um conjunto de trs mananciais localizados em reas de preservao (Cerqueira et al.
2000). As Figuras 4.13 e 4.14 mostram uma vista area da ETA-Morro Redondo



Figura 4.13 Vista area da ETA Sistema Morro Redondo




Figura 4.14 ETA Morro Redondo

A captao da gua bruta da ETA Morro Redondo feita nos mananciais de
Fechos, Mutuca e Cercadinho e o tratamento utilizado do tipo convencional com
coagulao/floculao, decantao, filtrao, e etapas de pr- e ps-clorao. A Tabela
4.7 apresenta as campanhas amostrais realizadas no local.
A partir das amostras coletadas dos trs locais, os dados obtidos em relao s
concentraes dos PE em estudo foram compilados e analisados atravs de grficos
estattiscos onde foram avaliados em conjunto com os parmetros fsico-qumicos.
As anlises quimiomtricas foram feitas utilizando o mtode de PCA (anlise de
componente principal). Com este mtodo possvel observar uma possvel correlao,
caso exista, entre as concentraes dos PE aos parmetros fsico-qumicos utilizados
durante o monitoramento (pH, cor aparente e turbidez). O software utilizado foi o
Minitab 14.
57
Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinao dos Perturbadores Endcrinos na
Regio Metropolitana de Belo Horizonte ETA Morro Redondo

Tipo de Amostra Cdigo das Amostras Ms
011MR e 012MR Fevereiro/07
017MR e 018MR Maro/07
023MR e 024MR Abril/07
027MR e 028MR Maio/07
044MRB e 045MRB Junho/07
049MRB e 050MRB Julho/07
068MRB e 069MRB Agosto/07
088MRB e 089MRB Setembro/07
102MRB e 103MRB Outubro/07
112MRB e 113MRB Novembro/07
128MRB e 129MRB Dezembro/07




Entrada da ETA
(antes da pr-
clorao)
140MRB e 141MRB Janeiro/08
046MRE e 047MRE Junho/07
054MRE e 055MRE Julho/07
074MRE e 075MRE Agosto/07
090MRE e 091MRE Setembro/07
100MRE e 101MRE Outubro/07
114MRE e 115MRE Novembro/07
126MRE e 127MRE Dezembro/07




Efluente do filtro
138MRE e 139MRE Janeiro/08


58
5. RESULTADOS E DISCUSSES

Este captulo est estruturado em 4 partes de forma a apresentar os resultados de
acordo com as etapas descritas a seguir:

Criao de um mtodo analtico para CG-FID (testes preliminares) 1 parte. Neste
tpico ser mostrado apenas procedimentos iniciais de anlise dos PE por cromatografia
gasosa com detector de ionizao em chama. Durante os testes foram usados padres
sintticos e apenas quatro amostras de gua bruta e, devido aos resultados obtidos, no
foi desenvolvido um processo de validao para o mesmo.

Criao de um mtodo analtico para LCMS (completo) 3 partes. As anlises
utilizando a tcnica de cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas
obtiveram resultados satisfatrios e, portanto, foi desenvolvido todo o processo
necessrio para a utilizao do mtodo como padro para o monitoramento dos PE em
mananciais da RMBH. Os processos de desenvolvimento e validao do mtodo
analtico consistiram desde a etapa de pr-concentrao dos analitos a anlise
instrumental por LCMS-IT-TOF totalizando 3 partes: Desenvolvimento, validao e
monitoramento dos PE.

5.1. Cromatografia Gasosa com Deteco por Ionizao em Chama (testes).

A cromatografia gasosa com deteco por ionizao em chama (CG-FID) no
uma tcnica comum para determinao de PE, e da anlise da Tabela 3.5 percebe-se que
no foi mencionado nenhuma anlise utilizando esta tcnica. O desenvolvimento de
metodologia de anlise dos PE por CG-FID foi motivada pelo fato de tal equipamento
ser mais disponvel nos laboratrios de Universidades e Companhias de Saneamento. O
desenvolvimento da metodologia para anlise no CG-FID foi feito baseando-se nos
mtodos utilizados para CG-MS. Valores como a variao de temperatura, coluna
utilizada e temperatura do injetor foram feitas com base na tcnica de Wang et al (2005)
(Tabela 4.3). A tcnica para a derivatizao dos compostos foi adaptada a partir de Liu
et al. (2004b), conforme descrito no item 4.1.4. A reao obteve um rendimento de
100% para a formao dos 3 compostos derivatizados, uma vez que o BSTFA estava em
excesso e considerado altamente reativo (Zhang et al. 2006).
59
Para uma melhor separao dos picos, os padres de anlise foram preparados
em acetato de etila. Como este teste foi feito em maro de 2007 e o padro nonilfenol
mistura tcnica (n-nonilfenol) foi utilizado apenas no ltimo perodo de anlise
(Outubro/2007 a Janeiro/2008), apenas os padres 4-nonilfenol (4NP), estradiol (E2) e
etinilestradiol (EE2) foram utilizados no desenvolvimento do mtodo.
Os padres de E2, EE2 e 4NP foram preparados em cinco concentraes
diferentes (Tabela 5.1) na faixa de 50 a 185. mgL
-1
a partir da soluo estoque
(1000mg.L
-1
).

Tabela 5.1: Tempo de reteno, rea obtida em relao concentrao e limite de
deteco dos compostos analisados por cromatografia gasosa.

Padres Concentrao
(ppm)
TR (min) reas Limite de deteco do
Equipamento
184,93 12,455 3691088
123,28 12,438 2078226
92,46 12,432 1435391
84,06 12,411 1238373

4-Nonilfenol
(4NP)
52,84 12,415 685394


28,21mg.L
-1

166,67 19,251 1308655
111,07 19,232 711236
83,33 19,225 448051
75,73 19,208 350391

17-Estradiol
(E2)
47,66 19,209 58367


41,87 mg.L
-1


17-Etinilestradiol
(EE2)
166,67
111,07
83,33
75,73
19,813
19,796
19,794
19,777
360243
214430
130077
112679

36,62 mg.L
-1


A Figura 5.1 mostra que no houve grande variao no tempo de reteno dos
compostos analisados (desvio padro de 0,015 min para EE2 e 0,018 min para 4NP e
E2), e a Figura 5.2 mostra que as curvas de calibrao obtidas tiveram uma boa
correlao linear. Portanto, para a faixa de concentrao analisada, h possibilidade
determinar por CG-FID a concentrao dos PE estudados.
A partir dos limites de deteco obtidos para cada composto, de acordo com a
Tabela 5.1 e a Figura 5.2, pode-se concluir que a senbilidade do 4-NP foi melhor, pois
ele resultou em maior coeficiente angular. O sinal obtido com o 4-NP foi o de maior
intensidade de resposta frente tcnica utilizada.

60

Figura 5.1 Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeo de mistura de
padres em diferentes concentraes.


Figura 5.2 Curva de calibrao obtida com a mistura dos padres analisados.

Considerando que se pode obter, durante a tcnica de extrao em fase slida, um
fator de concentrao de 1000 vezes, os valores mnimos de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol que poderiam ser quantificados por CG-FID seriam de 28g.L
-1
, 41 g.L
-1

e 36 g.L
-1
respectivamente.
Apesar de o CG-FID resultar em relativamente baixos valores de deteco,
trabalhos internacionais como de Wang et al (2005) e Yang et al. (2006) quantificaram o
4-NP, o etinilestradiol e o estradiol em amostras de gua superficiais com concentraes
mximas de 50ng. L
-1
, inviabilizando assim o uso de GCFID para monitoramento
ambiental de guas superficiais. Contudo, a tcnica de extrao em C-18 seguida de
derivatizao e anlise por CG-FID, desde que validada, poderia ser utilizada no
monitoramento de estradiol, etinilestradiol e 4-nonilfenol presentes em amostras de
esgotos sanitrios, ou em experimentos de tratamento de gua em escala de bancada ou
piloto em que a gua fortificada com os padres resultando em concentraes mais
elevadas desses PE.
61
Quatro amostras teste do rio das Velhas foram utilizadas para verificao da
presena dos PE nas concentraes estabelecidas pelo mtodo. Uma amostra preliminar
(Rio das Velhas fev./2007) foi analisada por CG-FID, no sendo detectado nenhum dos
trs compostos de interesse nos limites obtidos pela a metodologia. Os resultados no
puderam ser diretamente comparados com anlises por LCMS devido ausncia do
equipamento no perodo que os ensaios foram feitos por CG-FID (fevereiro /2007).
Contudo, como ser visto posteriormente, o composto nonilfenol esteve presente de
forma consistente em todos os mananciais pesquisados, e provavelmente estava presente
na amostra analisada por CG-FID.
De acordo com os resultados obtidos em relao ao limite de deteco para a
tcnica utilizada, no foram feitos testes para validao e recuperao, pois a
metodologia no poderia ser utilizada para o monitoramento dos PE nos mananciais
escolhidos.

5.2. Cromatografia Lquida com Deteco por Espectrometria de massas -
Desenvolvimento do Mtodo Analtico

O mtodo analtico envolveu a extrao, concentrao dos analitos da amostra e a
sua determinao por LCMS-IT-TOF. H vrios mtodos descritos na literatura (Tabela
3.5), porm ainda no h nenhum mtodo padro para a determinao desses compostos
em matrizes aquticas. O que se encontra nos artigos dessa rea so procedimentos de
extrao e determinao aplicados a vrias classes de compostos, como os estrognios
(Lagan et al 2004) ou os fenis (Liu et al 2004a), por exemplo. Portanto, essa primeira
etapa do trabalho consistiu no desenvolvimento de um mtodo analtico compatvel com
os equipamentos utilizados, de forma a permitir a determinao simultnea de estradiol,
etinilestradiol e nonilfenol em guas superficiais.
Inicialmente foi estudada a melhor separao cromatogrfica para os trs analitos
(E2, EE2 e 4NP) usando eluio isocrtica com fase mvel composta por
acetonitrila/gua e metanol/gua, ambas com 75% de metanol ou acetonitrila e 25%
gua. A vazo de 0,2 mL.min
-1
foi escolhida devido a melhor resoluo dos picos
obtidos em comparao s vazes de 0,1 e 0,3 mL.min
-1
. Para o estudo de eluio por
gradientes de fase mvel foram utilizados apenas os solventes metanol/gua j que
acetonitrila/gua obteve um baixo sinal de resposta.
62
A separao cromatogrfica dos compostos no importante quando a deteco
feita por espectrometria de massas, na qual cada composto produz um espectro
caracterstico (Ribani et al 2004). Tendo em vista essa caracterstica, foi utilizada apenas
uma pr-coluna (phenomenex C18) para a cromatografia devido complexidade das
amostras que foram preparadas. Apesar do tamanho reduzido (4,0mm), a pr-coluna
obteve os parmetros necessrios (nmero de pratos tericos, capacidade) para o seu uso
como coluna principal. Considerando que ocorreu uma concentrao no fator de 1000
para os analitos presentes na amostra, a separao por cromatografia apenas seria
bastante difcil, pois a grande quantidade de compostos orgnicos presentes no seriam
separados por colunas maiores resultado em sobreposio de picos e resultados
duvidosos. Em contrapartida, alm do tempo de reteno, a deteco por LCMS foi com
base no espectro caracterstico obtido para cada substncia, o que torna altamente
especfico o resultado obtido, uma vez que o aparelho trabalha com espectros de alta
resoluo (10000ppm).
A utilizao do gradiente de concentrao descrito na Tabela 4.4 mostrou-se
eficaz para a anlise dos trs compostos de interesse. Mesmo com um tempo total de
anlise de 23 minutos, a utilizao deste gradiente de concentrao justificvel por se
tratar de substncias qumicas pertencentes a classes de compostos que possuem
diferentes propriedades qumicas. Esse gradiente foi adequado deteco no s dos trs
compostos, mas tambm para que ocorresse o condicionamento da coluna para a
prxima anlise resultando em uma limpeza adequada da coluna e minimizao de
contaminao cruzada.
Com a utilizao do gradiente descrito na Tabela 4.4, a anlise ocorreu em dois
segmentos. No primeiro segmento (inicial: 30% metanol, 70% gua Final: 85%
metanol, 15% gua) era feito o monitoramento dos ons da fenolftalena (padro
interno), E2 e EE2 no perodo de zero a 5,5 minutos. No segundo segmento (inicial: 85%
metanol, 15% gua Final: 100% metanol, 0% gua) era feito o monitoramento apenas
do on nonilfenol no perodo de 5,6 a 12 minutos. Essa separao favoreceu a obteno
de picos de maior intensidade, uma vez que seria monitorado o E2 e EE2 no primeiro
segmento e apenas o NP no segundo. No foi possvel a criao de 3 segmentos devido a
eluio conjunta de E2 e EE2 no tempo de reteno de aproximadamente 4,8 minutos. A
Figura 5.3 mostra um cromatograma tpico da anlise dos PE em questo e seus
respectivos fragmentos.

63

Figura 5.3: Cromatograma tpico da anlise dos PE em questo: 1 Fenolftalena, 2
Estradiol, 3 Etinilestradiol, 4 ms Etinilestradiol, 5 ms Estradiol, 6 Nonilfenol , 7
ms nonilfenol ). Condies de anlise de acordo com a Tabela 4.4.

A anlise quantitativa dos trs compostos foi realizada com os cromatogramas
obtidos pelo por LCMS-IT-TOF no modo negativo onde foi utilizado a ionizao por
eletronspray (ESI) e o gs nitrognio como nebulizador e Argnio como gs de coliso.
Parmetros como a temperatura do CDL, voltagem do detector e presso do gs de
nitrognio (100 kPA) no foram alterados, sendo utilizados os parmetros recomendados
pela Shimadzu.
A sensibilidade do aparelho pode ser tambm relacionada com o tempo de
acumulao dos ons. Devido alta sensibilidade do NP, o tempo de acumulao de ons
foi reduzido para 30 milisegundos enquanto que para o E2 e EE2 manteve-se o tempo de
acumulao de 100 milisegundos (Tabela 4.4).
A Tabela 5.2 apresenta as frmulas moleculares, tempos de reteno, ons
primrios (ms
1
) e secundrios (ms
2
) que so caractersticos de cada composto. A Figura
5.4 apresenta os cromatogramas com o ms
1
e ms caractersticos de cada composto.
O LC-MS no possui uma biblioteca de espectros caractersticos para cada
composto, pois no possui uma energia de ionizao fixa para a quebra das molculas
(70eV), como em aparelhos CG-MS. Sendo assim, os ons caractersticos apresentados
na Tabela 5.2 foram obtidos por meio de anlises dos padres no aparelho LCMS-IT-
TOF sob as condies descritas na Tabela 4.4. Observando-se a Figura 5.4, percebe-se
que os ons secundrios possuem uma intensidade relativamente menor em relao aos
ons primrios, de forma que eles s podem ser detectados se estiverem presentes em
concentraes mais elevadas. De fato, anlises de padres mostraram que os fragmentos
gerados pelos compostos de interesse s puderam ser detectados em concentraes
acima de 30g.L
-1
, de acordo com o procedimento adotado.
64
Tabela 5.2 - Frmulas moleculares, tempos de reteno, ons primrios (ms
1
) e
secundrios (ms
2
) caractersticos para cada padro utilizado.

Composto Frmula
Molecular
Tempo de
Reteno
(min)
on Primrio
(ms
1
)
m/z (negativo)
ons Secundrios (ms
2
)
m/z (negativo)
4-nonilfenol C
15
H
24
O 7,12 219.17 106.04 (C
7
H
7
O)

n-nonilfenol

C
15
H
24
O

6,65

219.17
147.07 (C
10
H
12
O)
119.04 (C
8
H
8
O)
106.04 (C
7
H
7
O)
Estradiol C
18
H
24
O
2
4,85 271.17 183.08 (C
13
H
12
O)
145.06 (C
10
H
10
O)
Etinilestradiol C
20
H
24
O
2
4,95 295.17 185.10 (C
13
H
12
O)
267.14 (C
18
H
20
O
2
)


Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos ons precursores ms
1
e ms (modos negativo)
caractersticos de cada composto.

No decorrer do trabalho, anterior as anlises de validao e monitoramento, foi
trocado o 4-nonilfenol (4-NP) por nonilfenol mistura tcnica (n-nonilfenol ou NP), uma
vez que a amostra ambiental continha outros ismeros de nonilfenol alm do 4-NP. A
troca dos padres foi feita no sentido de permitir a confirmao do tipo de nonilfenol
presente nas amostras, uma vez que o tempo de reteno dos ismeros de nonilfenol e a
65
intensidade do sinal observado no modo ms
1
eram semelhantes. Dessa forma a distino
entre os padres foi baseada nos fragmentos de nonilfenol obtidos no modo ms
2
. O 4-NP
basicamente produzia apenas um tipo de fragmento (m/z = 106.04) enquanto que o NP
mistura tcnica produzia dois fragmentos de grande intensidade e bastante frequentes
nas amostras analisadas (m/z = 119.06 e 147.04). Esse resultado indicou que as amostras
analisadas continham, alm do 4-NP, outros ismeros de nonilfenol, o que tambm foi
observado por outros pesquisadores (Guenther et al. 2005).
As condies de preparo dos cartuchos de SPE e da pr-coluna foram avaliadas
usando a metodologia descrita nas Tabelas 4.2 e 4.4. As pr-colunas foram trocadas
quatro vezes devido a sua vida til ser menor em relao s colunas tradicionais, que so
a cada 120 anlises aproximadamente, ou em caso de uma separao ineficiente dos
compostos. As quatro pr-colunas utilizadas mantiveram-se adequadas ao uso durante
todo o perodo de trabalho. A verificao era feita com os padres em estudo onde era
avaliado o tempo de reteno e a intensidade dos ons obtidos.

5.3. Validao do Mtodo Analtico paraLCMS

5.3.1. Estabilidade

De acordo com as anlises para a verificao da estabilidade nos padres e
amostra em diferentes momentos, constatou-se que houve conformidade do sistema
cromatogrfico, ou seja, no ocorreu grande variao no tempo de reteno e nos
resultados obtidos para a concentrao das amostras. A Tabela 5.3 apresenta a variao
da concentrao dos compostos presentes na amostra Rio das Velhas (fevereiro e
dezembro de 2007). A estabilidade foi avaliada com a anlise da amostra imediatamente
eluda e aps um e seis meses de conservao (mantido em a -20
o
C sob ausncia de
luz). As amostras foram analisadas de acordo com o procedimento descrito na Tabela
4.4, sendo que quantificao dos compostos E2 e EE2 foi feita por padro externo (Rio
das Velhas Fev/07) e interno (Rio das Velhas Dezembro/07). O NP foi quanticado
apenas por padronizao externa.



66
Tabela 5.3 Variao da concentrao dos compostos em relao ao tempo de preparo
das amostras.

Rio das Velhas Fevereiro/2007 Rio das Velhas Dezembro/2007
Amostra Anlise Imediata
(ng.L
-1
)
Aps 1 ms
(ng.L
-1
)
Anlise Imediata (ng/L) Aps 6 meses
(ng.L
-1
)
NP
44,3 43,8
649,0
632,0
E2
11,8 12,1 0 0
EE2
3,0 3,0 0 0

5.3.2. Seletividade

A seletividade do mtodo cromatogrfico empregado tambm foi verificada
injetando-se os brancos de laboratrio obtidos, e observando se havia ou no picos na
regio do tempo de reteno dos compostos de interesse, conforme descrito por Lanas
(2004b). A pureza dos picos cromatogrficos obtidos para os compostos identificados
nas amostras tambm foi avaliada, por meio da comparao dos respectivos espectros de
massas com aqueles obtidos para os padres.
De acordo com a Figura 5.5, no branco (metanol HPLC) observa-se a ausncia de
picos nos tempos de reteno de E2 e EE2 enquanto que um pico de baixa intensidade
aparece na regio do NP, que mostra a presena de interferentes durante a anlise. Como
pode ser observado na Figura 5.5, o interferente no apresenta os fragmentos
caractersticos (ms
2
) do NP (Tabela 5.2), confirmando que o pico apresentado no
matanol no se trata do alquilfenol em questo. Devido a presena do interferente, a
anlise de NP s deve ser feita com a confirmao de seus ons secundrios, pois a
presena de apenas um pico com m/z = 219,17 no suficiente para a caracterizao do
mesmo.

Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausncia de picos para E2, EE2
(Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presena de interfente no tempo de reteno do
NP (Segmento 2 - 6,8minutos - direito).
67
A Figura 5.6 apresenta uma amostra coletada na entrada da ETA Morro Redondo
qual foi adicionada os padres de E2, EE2 e NP nas concentraes de 100g.L
-1
para
os estrognios e 200g.L
-1
para o alquilfenol. De acordo com os picos obtidos para os
compostos (ms
1
e ms
2
), o mtodo cromatogrfico seletivo para a maioria dos
compostos, tanto na determinao dos ons primrios quanto secundrios, pois a
presena dos espectros relativos dos PE utilizados confirmada na Figura 5.6. A
determinao empregando o detector de massas ion trap time of flight (IT-TOF),
possibilita a identificao no cromatograma, do pico referente ao analito de interesse, o
que feito pelo espectro de massas caracterstico de cada composto, uma vez que a
mquina obtm espectros de altssima resoluo. A comparao pode ser feita pelo
cromatograma dos picos obtidos nos cromatogramas da amostra de Morro Redondo
(Figura 5.6), gua bruta, onde foi adicionado 200 g.L
-1
do NP e 100 g.L
-1
de E2 e
EE2, comprovando, portanto, a capacidade de anlise dos PE nos analitos na matriz.



Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (gua bruta) com adio de estradiol e
etinilestradiol (100 g.L
-1
, quadro da esquerda) e n-nonilfenol (200 g.L
-1
, quadro da
direita).

5.3.3. Curva Analtica

Neste trabalho, a padronizao externa (NP, E2 e EE2) e interna (E2 e EE2)
foram empregadas para a quantificao dos compostos de interesse nas amostras de gua
superficial. As solues de trabalho foram preparadas em metanol a partir da diluio de
uma soluo concentrada contendo os trs padres (1,0 mg.L
-1
). Por sua vez, tal soluo
foi preparada a partir de uma soluo estoque de 1000 mg.L
-1
para cada composto.
Para a curva analtica utilizando a padronizao interna, foi adicionada
fenolftalena a uma concentrao de 50 g.L
-1
nos padres e na amostra (aps todo o
68
processo de preparao). A fenolftalina pde ser usada como padro interno devido a
sua estrutura qumica ser semelhante a dos estrognios E2 e EE2, a alta sensibilidade de
anlise (tanto no modo negativo quanto positivo) e a sua ausncia nas amostras
localizadas na RMBH. Sendo assim, foi possvel obter a concentrao de E2 e EE2 a
partir da razo entre a rea dos estrognios com a rea da fenolftalena. Para a curva
analtica utilizando a padronizao interna e externa, foram consideradas apenas as reas
dos picos dos ons primrios, pois os espectros ms
2
dos PE no apresentaram linearidade
durante a anlise.
Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) para cada um dos trs
padres foram determinados pelo mtodo baseado na relao sinal-rudo, no qual os
resultados so apresentados na Tabela 5.4.

Tabela 5.4 Faixa de trabalho, limite de deteco (LD) e limite de quantificao (LQ)
dos quatro compostos determinados por LCMS-IT-TOF.

Composto Faixa de trabalho
a
(mg . L
-1
)

LD
b
(ng . L
-1
)

LQ
b
(ng . L
-1
)
4-nonilfenol
c
0,030 a 0,400

4,9 16,4
n-nonilfenol
d
0,030 a 0,400 6,5 21,8
17-Estradiol
d
0,005 a 0,200 1,4 4,7
17-Etinilestradiol
d
0,005 a 0,200 0,9 3,0
a
Empregando-se solues-padro dos compostos em metanol
c
Utilizando padronizao externa
b
Considerando-se um fator de concentrao de 1000 vezes
d
Utilizando padronizao externa e interna

Vale salientar que o LD para um composto utilizando a deteco por IT-TOF
varivel. A sensibilidade da anlise pode ser determinada de acordo com o tempo de
acumulao de on no detector de on-trap, ou seja, podendo ser aumentada ou
diminuda a partir da escolha. De acordo com a metodologia utilizada (Tabela 4.4)
observa-se que a acumulao dos ons obtidos pelo NP cerca de trs vezes menor
(30milisegundos) devido elevada intensidade obtida pelo on gerado. Essa diminuio
foi feita para que se construsse uma curva de calibrao com maior intervalo de
concentrao, pois se fosse utilizado para o NP o mesmo tempo de acumulao do E2 e
EE2 (100milisegundos) a faixa de linearidade do NP seria menor, de 5 a 200 g.L
-1
.
Com a diminuio do tempo de acumulao, obteve-se uma linearidade de 30 a 400
g.L
-1
, e como as amostras analisadas se enquadram nesta faixa de concentrao, esse
procedimento foi preferido. Apesar da possibilidade de melhora do LD com o aumento
do tempo de acumulao de ons, existe um valor limite, pois os compostos E2 e EE2
69
sofrem um aumento no rudo de seus cromatogramas caso utilize um tempo de
acumulao acima de 100 milisegundos. Dessa forma, esse seria o melhor valor obtido
para a determinao dos 2 padres, uma vez que possuem valores aceitveis para LD e
um nvel baixo de rudo.
O limite de quantificao dos trs PE analisados pelo mtodo proposto pode ser
considerado satisfatrio uma vez que inferior ao limite de quantificao encontrado no
trabalho de Raimundo (2007) e semelhante a alguns trabalhos internacionais (Kolpin et
al. 2002; Lagan et al. 2004; Yang et al. 2006). Sendo assim, a metodologia aqui
desenvolvida possibilita o monitoramento de estradiol, etinilestradiol e nonilfenol nas
concentraes em que so usualmente reportados na literatura nacional e internacional
(Bruchet et al. 2004; Wang et al. 2005).

5.3.4. Linearidade e Sensibilidade

Dentro das faixas lineares descritas na Tabela 5.3, o mtodo analtico
empregando LCMS-IT-TOF atendeu as exigncias do INMETRO em relao
linearidade em 100 % dos casos, pois o coeficiente de correlao (r) foi superior a 0,90
(Tabela 5.5). Durante a criao das curvas analticas, foram utilizados sete padres de
diferentes concentraes que se encontravam na faixa descrita na Tabela 5.4.

Tabela 5.5 Coeficiente de correlao (r) obtido para os 4 padres determinados por
LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento.

Valores obtidos dos coeficientes de correlao (r) Compostos
Fev - Mai Jun - Jul Ago - Set Out-Jan
4-nonilfenol 0,998 0,994 0,993 0,991
Nonilfenol Mistura N.A.

N.A. N.A.

0,997
17-Estradiol 0,998 0,999 0,999 0,992
17-Etinilestradiol 0,998 0,999 0,993 0,995
N.A: No Avaliado

A sensibilidade foi expressa pelo coeficiente angular da curva analtica, e a
Figura 5.7 apresenta as tendncias observadas. Utilizando a metodologia descrita na
Tabela 4.4, pode-se concluir que a sensibilidade foi maior para os nonilfenos. Pela
Figura 5.7, pode-se observar que a sensibilidade foi semelhante entre os nonilfenis, e,
com uma sensibilidade menor, para os estrognios. Essa relao era esperada devido
semelhana nas estruturas moleculares dos grupos (NP e 4NP; E2 e EE2 Figura 3.3).
70
Apesar do tempo de acumulao de ons do NP ser menor em relao aos estrognios, a
sensibilidade deste composto mantm-se elevada mostrando a eficincia da tcnica para
a anlise de tal composto.

0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
0 50 100 150 200 250 300
Concentrao (g/L)

r
e
a
Nonilfenol Mistura Tcnica
Estradiol
Etinilestradiol
4-Nonilfenol

Figura 5.7: Curvas analticas obtidas com solues-padro dos quatro padres de PE.

5.3.5. Preciso

A preciso instrumental (do mtodo cromatogrfico empregado) foi determinada
em condies de repetibilidade, isto , os resultados foram obtidos utilizando-se vrias
injees em uma mesma amostra, no mesmo laboratrio, com o mesmo equipamento e
mesmo operador, e em um curto intervalo de tempo (determinao feita em um nico
dia), atravs da injeo automtica em sete replicatas de duas solues-padro. A Tabela
5.6 fornece os coeficientes de variao calculados para as reas obtidos aps sucessivas
injees do padro.
De acordo com a Tabela 5.6, os coeficientes de variao foram inferiores a 20 %
para todos os compostos, apresentando-se prximos a 5 % para o estradiol e
etinilestradiol e de 12% para o nonilfenol. Esses valores foram considerados suficientes
para a anlise em solues padro, pois geralmente o valor mximo de CV definido de
acordo com o procedimento empregado, a concentrao na amostra, o tipo de matriz e a
finalidade do mtodo.
71
Tabela 5.6 Repetibilidade dos resultados obtidos para solues-padro dos trs PE
expressa por meio do coeficiente de variao (CV).

Coeficiente de Variao CV (%) Composto
E2 e EE2(20 g . L
-1
)
NP (50 g . L
-1
)
E2 e EE2(130 g . L
-1
)
NP (300 g . L
-1
)
E2
6,5 8,4
EE2
13,3 10,6
NP
3,3 4,5

O INMETRO no recomenda valores de CV superiores a 20 % (INMETRO,
2003), e como no h uma legislao especfica para a determinao desses PE em guas
superficiais, os limites admitidos para CV podem variar dependendo se a validao
feita com padres ou com amostras ambientais (gua superficial). No caso de validao
com amostras ambientais os limites de CV podem ser menos rigorosos (acima de 20%),
uma vez que a anlise feita em uma matriz mais complexa (Raimundo, 2007).

5.2.6 Ensaio de Supresso

Trabalhos como de Snyder (2007), Vilagrassa et al (2007) e Lagana et al (2004)
evidenciam a ocorrncia de efeito supressivo em anlises de amostras ambientais, devido
a grande quantidade de compostos orgnicos presentes. Para verificar uma possvel
variao na intensidade dos cromatogramas dos PE em questo foi estabelecido um
procedimento para a verificao do efeito supressivo em amostras reais. Portanto, para
analisar o efeito de supresso em amostras ambientais, triplicatas de amostras de gua
bruta coletadas na ETA Morro Redondo (fev. 2008), foram fortificadas (spikes) com 20
g.L
-1
de E2 e EE2 e com 50 g.L
-
de NP e fenolftalena (padro interno) aps as
amostras terem sido submetidas a todo o processo de preparao (extrao e eluio). O
resultado obtido foi ento subtrado da intensidade obtida com a anlise da amostra
original (antes da adio dos padres). A Tabela 5.7 apresenta os resultados obtidos para
o teste de supresso.
Os resultados mostraram que o E2 a substncia que mais sofre supresso nas
amostras enquanto que no NP no ocorre supresso. Isso ocorre devido a grande
quantidade de NP presente nas amostras analisadas, pois o efeito supressivo ocorre
geralmente em compostos de menor concentrao, como o E2 e o EE2.

72
Tabela 5.7 Resultados dos testes de supresso realizados com amostras coletadas na
entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008).

Substncia E2
1
EE2
2
NP
3
Fenolftalena
rea mdia obtida pelo spike
a
2579879 39655940 11787781 21315526
rea terica
b
2842807 42105894 11563345 22864172
Supresso (%)
c
9,25 5,82 -1,94 6,77
1- Estradiol; 2 Etinilestradiol; 3 Nonilfenol
a
Valor subtrado da amostra sem adio.
b
Calculada atravs da equao obtida com a padronizao externa.
c
Calculado a partir da equao 4, item 4.2.6.

A utilizao da fenolftalena como padro interno pode ser usada para a correo
das reas de E2 e EE2, uma vez que a supresso dos estrognios e da fenolftalena foram
bastante semelhantes. De acordo com Ribani et al (2004), o mtodo de padronizao
interna extremamente til, especialmente pelo fato de que ela independe de pequenas
mudanas em variveis experimentais.
A padronizao interna muito utilizada para a quantificao dos compostos por
cromatografia lquida e gasosa (Gibson et al. 2007; Wang et al. 2005; Yang et al. 2006;
Zhang et al. 2006). Geralmente, compostos deuterados so utilizados para comparar seu
comportamento em relao aos no-deuterados, uma vez que possuem a mesma estrutura
e praticamente no esto nas amostras (Snyder 2007). Mas a dificuldade de importao e
o alto custo desses compostos dificultam a utilizao destes para tal fim em instituies
brasileiras. A utilizao da fenolftalena apresenta bons resultados obtendo uma boa
relao custo/benefcio sendo uma grande aliada na confiabilidade dos resultados
adquiridos.
Devido a estes fatores e a grande quantidade de NP nas amostras, no foi
observado seu efeito supressivo, uma vez que no houve diminuio da rea de seus
picos na amostra. Portanto, a curva de calibrao de nonilfenol no poder ser
determinada em funo do padro interno, pois a fenolftalena sofre o processo de
supresso e a sua utilizao pode comprometer os resultados. Pelos resultados obtidos,
os clculos de concentrao com base na fenoltalina como padro interno foram feitos
apenas com E2 e EE2. Em todas amostras que foram adicionadas fenolftalena como
padro interno foram observadas variaes de intensidade, confirmando o efeito
supressivo.
A Tabela 5.8 apresenta a variao do efeito supressivo da fenolftalena
encontrado em algumas amostras de gua bruta. Os resultados mostram que a variao
73
da intensidade da fenolftalena no constante, pois a supresso varia em todas as
amostras, uma vez que a sazonalidade e o tipo poluio despejada nos mananciais
influenciam a caracterstica da matriz.

Tabela 5.8 Variao da supresso nas amostras de gua bruta no ms de janeiro 2008

Amostra Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Obtido Terico
a
Obtido Terico Obtido Terico rea do
cromatograma
de Fenolftalena
41832358

44009401

27196706

41649946

41349854

41649946

Supresso
c
(%) 5,0 34,7 0,7
a
Calculado a partir da rea mdia obtida na curva analtica com padres em metanol

c
Calculado a partir da equao 4, item 4.2.6.

De acordo com a tabela 5.8, quanto maior a quantidade de matria orgnica
presente na gua, maior o efeito supressivo, pois o reservatrio de Vargem das Flores o
que recebe maior quantidade de esgoto domstico, conforme percebido pelo elevado
grau de eutrofizao (Jardim e Viana 2003).

5.3.7 Ensaio de Recuperao

A eficincia da extrao em fase slida foi avaliada por meio de teste de
recuperao dos compostos estudados. Para o clculo da porcentagem de recuperao
em amostras ambeintais, foram preparadas triplicatas de amostras de gua bruta
provenientes da ETA Morro Redondo (fev. 2008) devidamente enriquecidas com 20,
100 e 200 ng L
-1
para E2 e EE2 e com 300 ng.L
-1
para NP. Neste experimento, a
extrao em fase slida foi feita seguida da eluio dos compostos em duas alquotas de
cinco mililitros de acetato de etila, conforme recomendado por Wang et al (2005) e
detalhado no Captulo 4.
Na Tabela 5.9 so apresentados os resultados obtidos para o teste de recuperao
em funo da adio de E2, EE2 e NP. A recuperao dos compostos foi calculada por
partir da equao presente no item 4.2.7. Observa-se que a porcentagem de recuperao
dos compostos variou em funo da concentrao adicionada (80 a 110%), obtendo uma
recuperao mdia de 96% para E2, 90% para EE2 e 96% para o NP. Este resultado
satisfatrio considerando-se que estas substncias pertencem a diferentes classes de
compostos e os valores obtidos encontram-se dentro do intervalo de recuperao
74
reportado na literatura, que seria de 70 a 120% (Wang et al 2005). Devido grande
quantidade de NP presente na amostra bruta, no foi possvel avaliar a recuperao do
NP a baixas concentraes, uma vez que em baixas adies, somadas a grande
quantidade de NP (acima de 100 ng.L
-1
, em mdia) e a complexidade presente na
amostra bruta, pode ocorrer uma grande oscilao de valores, acarretando em resultados
contraditrios. Para corrigir este problema, a recuperao poderia ser feita com amostras
sem a presena do NP, como a gua deionizada. Entretanto, os resultados obtidos por
este tipo de experimento podem gerar resultados equivocados, pois a ausncia de
interferentes na amostra acarretaria em uma melhor eficincia de recuperao
apresentando um comportamento diferente em relao a amostras reais.

Tabela 5.9 Valores obtidos pelos ensaios de recuperao de E2, EE2 e NP em funo
da fortificao das amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo.

E2 (ng.L
-1
) EE2 (ng.L
-1
) NP (ng.L
-1
)
C.Esp. C. Obs. % Rec. C.Esp. C. Obs. % Rec. C.Esp. C. Obs. % Rec.
20 21,29 106,45 20 21,75 108,75
100 83,15 83,15 100 79,77 79,77
200 197,72 98,86 200 165,61 82,80

300


288


96


Considerando que em amostras ambientais espera-se que encontre os PE
prximos s concentraes utilizadas para fazer o teste de recuperao, a eficincia da
extrao em fase slida foi considerada satisfatria (Tabela 3.4). Essa variao na
eficincia de extrao para os diferentes compostos se deve ao fato de se tratar de
substncias qumicas muito diferentes e que sofrem interaes distintas com o meio
adsorvente.

5.3.8. Ensaio de calibrao interlaboratorial

A avaliao da preciso do mtodo de anlise foi feita comparando os resultados
obtidos pelas metodologias de imunoensaio (kit ELISA) e LCMS. Os ensaios
consistiram em anlises de amostras identicamente preparadas e de padres dos
respectivos compostos. A Tabela 5.10 apresenta os resultados obtidos para a
intercalibrao feita entre o DEQUI-UFOP e o CIRRA-USP.
De acordo com a Tabela 5.10, pode-se observar que os padres de E2 e EE2
apresentaram resultados semelhantes, enquanto que na amostra real os resultados foram
75
bem diferentes. O NP foi o composto que teve a maior divergncia dos 3 analisados,
sendo que o 4NP foi detectado com uma concentrao cerca de 30 vezes menor para o
mtodo ELISA em relao ao valor obtido por LCMS.
Em relao amostra Rio das Velhas fev/2008 podemos observar que as maiores
divergncias ocorreram em relao ao EE2 e E2. Apesar do valor de EE2 ter sido 10
vezes menor para o mtodo ELISA, vale salientar que o valor obtido por LCMS
encontra-se abaixo do Limite de Quantificao (3,0 g. L
-1
), podendo gerar valores
imprecisos. Quanto ao E2, o fato dele no ter sido detectado por LCMS e ter sido
detectado no kit ELISA pode ser devido ao mtodo ELISA no quantificar somente o
17-Estradiol durante a anlise do estradiol. De acordo com Nogueira (2003) e Farr et
al (2007) o mtodo ELISA pode sofrer interferncia de diversos estrognios como a
estrona, estriol e estradiol sendo que os traos de estrognios podem interferir nas
anlises de NP e vice versa, o que justificaria a concentrao mais elevada de NP na
amostra bruta e menor quantidade nos padres de NP comparados a metodologia do
LCMS. Portanto este fator pode explicar parte da discrepncia dos resultados obtidos.

Tabela 5.10 - Resultados obtidos pela calibrao interlaboratorial entre UFOP e CIRRA.

Resultados das anlises
Laboratriais
Amostras
Concentrao
terica
UFOP (LCMS) CIRRA (ELISA)
Concentrao de NP - 200 g. L
-1
280 g. L
-1

Concentrao de E2 - < LD 8,78 g. L
-1

A
Rio das
Velhas
fev/2008 Concentrao de EE2 - 2,68 g. L
-1
0,28 g. L
-1

A
4-NP (P. Sigma) 200g. L
-1
215 g. L
-1
24,3 g. L
-1

A
NP Mistura tcnica (P. Sigma) 200g. L
-1
165 g. L
-1
5,2 g. L
-1

A
E2 (P. Sigma) 15g. L
-1
15,0 g. L
-1
17,3 g. L
-1

A
EE2 (P. Sigma) 15g. L
-1
17,6 g. L
-1
15,2 g. L
-1

B
EE2 (plula anticoncepcional) 35g. L
-1
33,4 g. L
-1
42 g. L
-1

B
EE2 (plula anticoncepcional) 35g. L
-1
34,5 g. L
-1
42 g. L
-1

A
Preparadas no DESA-UFMG
B
Preparadas no CIRRA

Em relao aos padres puros contendo os PE em questo, o resultado foi
considerado satisfatrio para E2 e EE2, pois as amostras enviadas/recebidas pelo
DEQUI-UFOP e CIRRA-USP tiveram resultados bastante semelhantes, confirmando a
exatido e a preciso do mtodo. Quanto ao 4NP, considerando que o ELISA utiliza
anticorpos e receptores especficos para suas anlises (Nogueira, 2003), possivelmente
76
no pode ser detectado com grande eficincia. Considerando que a metodologia LCMS
analisa todos os ismeros de NP com m/z de 220,19 a dosagem de NP deveria ser mais
exata em relao ao mtodo de imunoensaio.

5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endcrinos em Mananciais da Regio
Metropolitana de Belo Horizonte

Para a determinao dos trs compostos nas matrizes aquticas foram feitas doze
campanhas amostrais nos trs mananciais estudados (Rio das Velhas, Vargem das Flores
e Morro Redondo). O monitoramento pelo perodo de um ano permitiu avaliar uma
possvel correlao entre a influncia da sazonalidade com a concentrao dos PE nos
corpos dgua. A Figura 5.8 apresenta a variao da precipitao de chuva durante o
perodo de amostragem na RMBH.

0
50
100
150
200
250
300
350
feb/07 mar/07 apr/07 may/07 jun/07 jul/07 aug/07 sep/07 oct/07 nov/07 dec/07 jan/08
P
r
e
c
i
p
i
t
a

o

(
m
m
)

Figura 5.8: Chuva acumulada mensal na RMBH durante o perodo de monitoramento

(fev/07 a jan/08). Fonte: Site do INMET (Instituto Nacional de Meteorologia).

A Figura 5.8 confirma o quadro tpico de chuvas na regio sudeste brasileira,
com escassez de chuvas no perodo de maio a setembro e maior pluviosidade no perodo
de novembro a fevereiro. Tais resultados sero utilizados para tentar explicar a variao
sazonal dos PE nos mananciais monitorados.
77
Durante o perodo de amostragem, a partir do ms de junho, foram adicionadas
ao monitoramento amostras de gua oriundas dos tratamentos das respectivas ETAs
(coletadas antes da etapa de desinfeco com cloro), com o objetivo de avaliar, de forma
preliminar, a eficincia de remoo dos compostos estudados pelos processos de pr-
clorao, coagulao/decantao e filtrao. Alm disso, com o intuito de futuras
anlises de outras classes de PE, buscou-se uma avaliao da presena de bisfenol A
nas amostras coletadas no ltimo ms de amostragem (jan/2008), onde foi possvel
confirmar que tal pertubador endcrino importante e bastante prevalente nos
mananciais analisados.
Considerando-se as 72 amostras de gua bruta coletadas, referentes aos trs
locais de coleta e s doze campanhas amostrais, em 100% das amostras foram detectadas
um dos trs perturbadores endcrinos de interesse desse trabalho. Este resultado
bastante similar ao encontrado em estudos realizados pela Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP) que avaliaram a presena de 15 compostos em 5 corpos de gua
na Regio Metropolitana de Campinas encontrando traos de substncias emergentes em
94 % das amostras (Raimundo, 2007). Mais do que isso, estes resultados mostram a
relevncia dos trs compostos classificados como perturbadores endcrinos selecionados
no presente trabalho quanto possibilidade de serem encontrados em guas naturais. Os
trs PE de interesse foram detectadas ao menos uma vez em cada amostra.
Dentre os trs perturbadores endcrinos quantificados, o NP foi encontrado em
maior nmero de vezes (100%) nas 72 amostras analisadas. Os estradiis natural (E2) e
sinttico (EE2) apareceram em 19% das amostras. As concentraes encontradas para
NP, E2 e EE2 so apresentadas na Figura 5.9 onde se observa que as suas concentraes
variaram em at duas ordens de magnitude para NP. Ao contrrio do comportamento
observado para o NP, os estradiis apresentaram baixa prevalncia e estavam presentes
em concentraes bem menores nos mananciais estudados. As concentraes de NP em
gua bruta variaram de 44 a 1918 ng. L
-1
enquanto que para o EE2 foram detectados
valores na faixa de 3,0 a 54,0 ng.L
-1
. Para o E2 as concentraes observadas foram ainda
menores, com valores na faixa de 1,5 a 36,0 ng. L
-1
.
Um dos fatores que poderiam justificar a grande quantidade de NP nas amostras
analisadas seria o aporte de esgoto domstico. Considerando as diversas fontes, o NP
originado principalmente de produtos de limpeza que contm surfactantes, como os
detergentes (USEPA, 2001). Segundo o estudo de Soto et al (1991),o nonilfenol usado
78
como aditivo plastificante na produo de PVC e poliestireno, podendo ainda ser
lixiviado de tubulao feita com esses polmeros.
Em relao ao E2 e EE2, uma menor concentrao de ambos em relao a NP
pode ser devido ao fato deles possurem maior biodegradabilidade, uma vez que o E2
excretado naturalmente por homens e mulheres, principalmente as grvidas (Bila e
Dezotti, 2007).
Os padres de NP, E2 e EE2 assemelham muito aos trabalhos realizados por
Gibson et al (2008), Kolpin et al (2002) e Kuch e Ballschmiter (2001) onde foi
encontrado em maior quantidade o NP seguido por EE2 e E2 respectivamente. Eles
tambm sugerem que os valores obtidos so atribudos principalmente ao esgoto
domstico.
0
500
1000
1500
2000

C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

(
n
g
.

L

-
1
)
Nonilfenol (n=72)

0
10
20
30
40
50
60
C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

(
n
g
.

L

-
1
)
Etinilestradiol (n=14) Estradiol (n=14)

Figura 5.9: Box-plot da concentrao dos trs compostos determinados nos mananciais
estudados em todas as campanhas amostrais. gua Bruta.
79
As concentraes de NP nos mananciais analisados (entrada da ETA e sada do
filtro) e sua variao durante o perodo de fevereiro/2007 a janeiro/2008 so
apresentadas na Tabela 5.11 onde nota-se que tal alquilfenol foi encontrado em quase
todos os pontos amostrais e em todas as campanhas, com exceo na amostra referente
ao ms de junho 2007, na sada do filtro na ETA Vargem das Flores. Maiores
concentraes de tal pertubador endcrino foram determinadas no ms de agosto/07 nos
mananciais de Morro Redondo e Rio das Velhas e em outubro/07 em Vargem das
Flores, contemplando o perodo de seca que pode justificar a elevada concentrao de tal
composto na gua. Uma vez que a amostra de Vargem das Flores foi coletada no incio
do ms de outubro, as chuvas ocorridas neste ms no tiveram influncia na sua alta
concentrao. A Figura 5.10 apresenta a variao do nonilfenol no perodo analisado.

Tabela 5.11 - Concentrao de nonilfenol (ng.L
-1
) encontrada durante as campanhas de
amostragem.

Concentraes (ng. L
-1
)
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo Meses
Bruta gua Filtrada
a
Bruta gua Filtrada Bruta gua Filtrada
Fevereiro 44,4 N.A
b
47,9 N.A 42,8 N.A
Maro 68,2 N.A 63,7 N.A 41,8 N.A
Abril 65,6 N.A 110,2 N.A 40,1 N.A
Maio 161,7 N.A 139,2 N.A 176,6 N.A
Junho 263,1 225,3 260,4 < L.D.
c
318,8 5,7
Julho 294,4 221,3 156,4 128,4 329,2 226,8
Agosto 1045,1 683,1 719,1 41,4 865,7 151,5
Setembro 723,0 397,5 412,2 333,4 747,3 565,4
Outubro 428,1 32,4 1918,2 254,2 554,3 229,4
Novembro 436,0 256,2 447,0 412,4 310,2 265,3
Dezembro 649,0 488,9 543,9 504,1 575,6 577,8
Janeiro 387,5 N.A 513,7 465,0 605,5 472,1
a
Anterior ao processo de clorao, ocorreu apenas pr-clorao.
b
No Analisado
c
Abaixo do Limite de Deteco (6,5 ng.L
-1
)

80
0
500
1000
1500
2000
2500
fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

(
n
g
.
L
-

)
Rio Das Velhas
Vargem Das Flores
Morro Redondo

Figura 5.10: Variao da concentrao de nonilfenol em gua bruta nos mananciais

durante o perodo de fev/07 a jan/08

De acordo com a Figura 5.10 pode-se observar uma concentrao relativamente
baixa de NP no primeiro semestre de 2007. Apesar dos resultados aparentemente
contraditrios nenhum equvoco foi observado durante as anlises, uma vez que as
curvas de calibrao feitas durante este perodo obtiveram excelentes correlaes
lineares, mostrando que os resultados eram confiveis.
A Figura 5.11 (esquerda) apresenta um cromatograma tpico de amostra coletada
no Rio das Velhas (nov. 2007) onde so evidenciadas a ausncia do 4-NP (ausncia do
on m/z = 106.04) e a presena de vrios outros ismeros de nonilfenol, caracterizados
pelos picos m/z = 147 (mais caracterstico), m/z = 175,11 e m/z = 119,04. A Figura
tambm apresenta algumas das 550 estruturas possveis de NP existentes (direita)
(Guenther et al. 2005).


81

Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas Nov. 2007 e
as diferentes fragmentaes (ms) de seus ismeros (esquerda). Exemplos de estruturas
qumicas de 5 dos 550 Ismeros de nonilfenol existentes (direita). Fonte: Guenther et al,
2005.

As concentraes encontradas para o NP so at de nove vezes maiores do que
quelas encontradas em mananciais de Campinas onde Raimundo (2007) utilizou a
tcnica de Cromatografia Lquida acoplada ao detector Arranjo de Diodo (HPLC-DAD)
para a deteco de nonilfenol (ismeros). Em relao aos trabalhos internacionais
publicados, a concentrao de NP encontrada nos trs mananciais estudados
semelhante aos valores encontrados em Roma (manancial no informado), Itlia (Lagan
et al. 2004) e corresponde a 30% dos valores mdios encontrados em Guangdong
(manancial no informado), China (Yang et al. 2006).
Apesar dos valores encontrados nas guas da Regio Metropolitana de Belo
Horizonte serem relativamente altos em comparao a maioria dos dados de
monitoramento apresentados na Tabela 3.5, vale salientar que o mtodo utilizado neste
trabalho quantificou todos os ismeros de nonilfenol presentes, utilizando o padro de
nonilfenol mistura tcnica, enquanto que alguns trabalhos quanticaram o NP com base
na presena do nonilfenol linear ou 4-NP (Kolpin et al. 2002; Wang et al. 2005). O 4-NP
no foi detectado na maioria das amostras analisadas nesse trabalho, e tal afirmao
82
baseada no monitoramento dos ons secundrios com valores de m/z iguais a 106.04,
especficos para o 4-NP.
A Figura 5.12 apresenta a variao da concentrao de NP ao longo do ano nos
trs locais de amostragem. A maior variabilidade foi verificada no reservatrio de
Vargem das Flores, onde se observou uma variabilidade na concentrao de NP em at 3
ordens de magnitude, enquanto que a menor diferena foi encontrada no Rio das Velhas
onde as concentraes mdias e mediana foram em torno de 250 ng. L
-1
. De Modo
geral, os trs locais apresentaram 75% dos dados com concentraes variando de 40 a
500 ng. L
-1
mostrando que os trs locais apresentam semelhana quanto a quantidade de
nonilfenol.
0
500
1000
1500
2000
Morro Redondo
(n=24)
Vargem das Flores
(n=24)
Rio Das Velhas
(n=24)
C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

(
n
g
.
L
-
1
)

Figura 5.12: Boxplot da concentrao de nonilfenol na gua bruta nos 3 mananciais.

A Figura 5.13 apresenta o ndice de remoo (calculado de acordo com a equao
6, item 4.3) de NP pelas ETAs em questo. Percebe-se que h variabilidade na
eficincia de remoo, o que pode ser explicado em parte pelo fato da coleta ter sido
pontual, ou seja, no foi considerado o tempo de reteo hidrulico entre a pr-clorao
e o processo de filtrao, que situa-se na faixa de 2 a 4 horas (COPASA). Outro fator a
diferena entre os processos de tratamentos das ETAs, como a estao de Vargem das
flores, onde no utiliza o processo de decantao . De acordo com os resultados obtidos,
nota-se que a eficincia de remoo foram variados, com uma mdia de 35%. Todavia,
83
os resultados mostraram que o processo de pr-clorao (1,5 a 2,0mg.L
-1
, 2 a 4 horas de
contato) empregados nas 3 ETAs no foram capazes de renover completamente tal
alquilfenol. Uma das causas poderia ser a competio com contaminantes inorgnicos
(ferro e mangans por exemplo) pela oxidao do cloro. Possivelmente o nonilfenol
restante seja oxidado aps o processo de filtrao, durante a etapa de desinfeco.
Futuros monitoramento aps todo o processo de tratamento so necessrios para uma
melhor averiguao da remoo de nonilfenol no tratamento convencional de gua.

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jun jul ago set out nov dez jan
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c
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e
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(
%
)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo


Figura 5.13: ndice de remoo de NP (gua bruta gua filtrada) durante as
campanhas de junho 2007 a janeiro 2008.

O NP pertence classe dos alquilfenis, e compostos pertencentes a esta classe
so bastante utilizados como surfactantes na fabricao de produtos de limpeza,
plastificantes na preparao de resinas fenlicas, polmeros, agentes de cura e
antioxidantes (USEPA 2001). Em um levantamento da ocupao humana margem do
Rio das Velhas, do sistema Morro Redondo e do reservatrio de Vargem das Flores
foram observados que em locais afastados das respectivas ETAs, ocorre a emisso de
esgotos domsticos (nos trs) e efluentes industriais (Rio das Velhas) onde se destacam
uma fbrica de reciclagem de plstico e indstrias de produtos de limpeza. Portanto,
como as concentraes de NP na ETA Morro Redondo foram bastante semelhantes
encontrada nos outros dois mananciais, percebe-se que a gua proveniente do Ribeiro
Mutuca, Fecho e Cercadinho encontram-se possivelmente em processo de degradao,
uma vez que tm ocorrido ocupaes de residncias prximas a estes locais (ALMG,
84
2008). A presena de tais emisses mostra que a atividade antrpica contribui para as
emisses de NP nas regies estudadas.
O E2 foi detectado em 14 das 72 amostras de gua bruta analisadas nesse
trabalho. A Tabela 5.12 e a Figura 5.14 apresentam as concentraes desse esteride
determinadas nas amostras durante as campanhas.

Tabela 5.12 - Concentrao de 17-estradiol (ng . L
-1
) encontrada durante as campanhas
de amostragem.

Concentraes (ng. L
-1
)
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Meses Bruta gua Filtrada
a
Bruta gua Filtrada Bruta gua Filtrada
Fevereiro 11,8 N.A
b
< L.D. N.A < L.D. N.A
Maro 4,1 N.A < L.D. N.A < L.D. N.A
Abril 36,8 N.A < L.D. N.A < L.D. N.A
Maio < L.D.
c
N.A < L.D. N.A 6,2 N.A
Junho 1,5 < L.D. 21,3 10,0 < L.D. < L.D.
Julho < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Agosto < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Setembro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. 8,5 5,9
Outubro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Novembro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Dezembro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Janeiro < L.D. N.A < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
a
Anterior ao processo de clorao. Apenas pr-clorao.
b
No Analizado
c
Abaixo do Limite de deteco (1,4 ng.L
-1
)

0
10
20
30
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50
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fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
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(
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g
.
L
-

)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.14: Variao da concentrao de estradiol em gua bruta nos mananciais

durante o perodo de fev/07 a jan/08
85
De acordo com a Tabela 5.12 o E2 foi quantificado principalmente no Rio das
Velhas durante o perodo de fevereiro a abril de 2007. As concentraes nos trs locais
variaram entre 1,5 a 36,8 ng.L
-1
, evidenciando a degradao de ambos os corpos de gua
em funo da atividade antrpica (Bila e Dezotti 2007). Na entrada das ETAs de Morro
redondo e Vargem das Flores foi detectadas o E2 apenas uma vez durante os meses de
maio (6 ng.L
-
) e junho (21 ng.L
-1
) respectivamente.
Com o incio das coletas do efluente aps filtrao nas 3 ETAs, o Rio das
Velhas apresentou remoo de 100% enquanto que em Vargem das Flores e Morro
Redondo a remoo mdia foi 52% e 30% respectivamente, evidenciando a ineficincia
de remoo de E2 em algumas amostras (Tabela 5.12). Comparando-se os valores
encontrados entre os perodos de seca e chuva durante o ano (Figura 5.9), observa-se que
a concentrao de E2 parece no sofrer influncia, mas existem poucos dados para uma
concluso mais precisa. Os resultados mostraram que o estrognio esteve presente tanto
em perodos de chuva quanto de seca.
De acordo com a Tabela 3.5, essas concentraes so semelhantes aos trabalhos
internacionais de Liu et al (2004b), Bruchet et al (2004) e Quintana et al (2004). Em
relao a trabalhos nacionais, a concentrao foi menor em relao ao trabalho efetuado
por Raimundo (2007), onde foi encontrado uma concentrao de at 1,3 g . L
-1
nos rios
localizados prximo a regio metropolitana de Campinas.
O EE2 foi detectado em 14 das 72 amostras de gua bruta analisadas nesse
trabalho. A Tabela 5.13 e a Figura 5.15 mostram as concentraes desse esteride
determinadas nas amostras durante as campanhas. As concentraes encontradas nos
mananciais variaram na faixa de 3 a 54 ng .L
-1
, tendo sido detectado com maior
frequncia nos meses de dezembro e junho. Em perodos de estiagem, o EE2 foi
encontrado durante o ms de junho no Rio das Velhas e em Vargem das Flores nas
concentraes de 15,5 e 6,7 ng .L
-1
respectivamente, e no ms de setembro em Morro
Redondo na concentrao de 13 ng .L
-1
.
O EE2 um hormnio sinttico utilizado principalmente em medicamentos
anticoncepcionais. No corpo humano, apenas 15 % da substncia metabolizada
enquanto que o restante eliminado pela urina. Devido a esta caracterstica, o EE2 pode
ser considerado como um indicador de atividade artrpica (Raimundo 2007). Assim,
como o E2, o EE2 encontrado em guas superficiais de pases como China, Estados
Unidos e Reino Unido em concentraes entre 0,3 e 7,6 ng L
-1
(Wang et al, 2005;
Snyder et al, 1999 e Liu et al, 2004a). As concentraes mximas detectadas
86
assemelham-se quelas encontradas em efluentes domsticos dos Estados Unidos
(Kolpin et al, 2002) mostrando mais uma vez a influncia do esgoto domstico. Em
relao ao levantamento feito por Raimundo (2007) as concentraes de EE2
encontradas na RMBH foram de at 80 vezes menores em relao regio
Metropolitana de Campinas, onde foram encontradas concentraes de at 4,4 g . L
-1
.

Tabela 5.13 - Concentrao de 17-etinilestradiol (ng . L
-1
) encontrada durante as
campanhas de amostragem.

Concentraes (ng. L
-1
)
Rio das Velhas Vargem das Flores Morro Redondo
Meses Bruta gua Filtrada
a
Bruta gua Filtrada Bruta gua Filtrada
Fevereiro 3,0

N.A
b
< L.D. N.A < L.D. N.A
Maro < L.D.

N.A 31,6 N.A < L.D. N.A
Abril < L.D.

N.A < L.D. N.A < L.D. N.A
Maio < L.D. N.A < L.D. N.A < L.D.

N.A
Junho 15,5

14,8 6,7

< L.D. < L.D. < L.D.
Julho < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Agosto < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Setembro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. 13,0 7,9
Outubro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Novembro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Dezembro < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D. < L.D.
Janeiro < L.D. N.A 54,0 < L.D. 35,0 22,1
a
Anterior ao processo de clorao. Apenas pr-clorao.
b
No Analizado
c
Abaixo do Limite de deteco (0,9 ng.L
-1
)

0
10
20
30
40
50
60
70
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fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
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n
g
.
L
-

)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.15: Variao da concentrao de etinilestradiol em gua bruta nos mananciais

durante o perodo de fev/07 a jan/08.

87
Com o monitoramento na filtrada da ETA (anterior clorao) a partir do ms de
junho 2007, foi avaliada a eficincia de remoo do EE2 (Figura 5.16). Observa-se que a
ETA Vargem das Flores obteve resultados satisfatrios de remoo, pois no foi
detectado o composto na sada do filtro de areia. Em relao amostra de Rio das
Velhas e Morro Redondo os ndices de remoo foram inferiores variando de 4,5 a 40%
respectivamente. Conforme discutido anteriormente, preciso cautela na interpretao
desses resultados tendo em vista que a coleta das amostras foi feita de forma pontual, e
que possvel haver variaes na concentrao dos PE na gua bruta ao longo do dia.

0
10
20
30
40
50
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70
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90
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jun jul ago set out nov dez jan
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(
%
)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.16: ndice de remoo (gua bruta gua filtrada) de EE2 nas campanhas de
junho 2007 a janeiro 2008.

Um levantamento preliminar em relao presena do bisfenol A nos corpos
dgua foi avaliado no final da campanha de monitoramento, quando o padro de tal
composto foi adquirido. O bisfenol A uma substncia amplamente utilizada nos
processos industriais. A principal aplicao como monmero na produo de
policarbonato e resinas-epxi alm de aditivos de resinas de polister-estireno
insaturadas e retardantes de chama. Compostos persistentes biodegradao, possuem
um tempo de meia-vida em guas superficiais de 1 a 150 dias. A maior contribuio
devida aos processos de produo e manufatura do bisfenol A, despejos de efluentes
industriais sem tratamento adequado, e uma pequena contribuio pode ser atribuda
lixiviao dos produtos finais de consumo como embalagens plsticas (USEPA, 2001).
De acordo com as 12 amostras coletadas durante o perodo de janeiro de 2008,
em 100% dos casos foi confirmada a presena deste PE, inclusive aps o tratamento
(exceto desinfeco) nas ETAs. A Figura 5.17 apresenta a amostra de Rio das Velhas
onde pode ser observada a presena do composto e a estrutura qumica do Bisfenol A.
88


Figura 5.17: Confirmao da presena de Bisfenol A na gua a partir do LCMS.
Amostra: Rio das Velhas - Janeiro de 2008.

Uma anlise estatstica dos dados cromatogrficos referentes s amostras de
jun/07 a set/07 foi feito, para avaliar o perfil das amostras estudadas, utilizando apenas o
mtodo SCAN, onde as anlises so feitas a partir do monitoramento da intensidade
compostos orgnicos presentes com a relao massa/carga de 100,00 a 900,00 m/z nas
amostras estudadas (80000 dados por amostra). Os dados compilados so apresentados
na Figura 5.18 onde foi utilizado o mtodo de Anlise da Componente Principal (PCA),
uma tcnica estatstica poderosa que pode ser utilizada para reduo do nmero de
variveis e para fornecer uma viso estatisticamente privilegiada do conjunto de dados
(Sousa et al. 2006). Com base na Figura 5.18, pode-se observar que as amostras dos
distintos mananciais diferem entre si, pois aparecem de forma separada no grfico PCA1
versus PCA2. Isso ocorre possivelmente devido presena diferenciada nos mananciais
de outros compostos orgnicos (Ex. cidos hmicos e flvicos, compostos orgnicos
sintticos), uma vez que os dados compilados foram feitos a partir do monitoramento
dos ons detectados (50 a 900 m/z) nas amostras estudadas.
A Figura 5.18 mostra ainda que as amostras da entrada e da sada de cada ETA
esto agrupadas, sugerindo que elas tm o mesmo perfil qumico do ponto de vista dos
compostos orgnicos detectados no LC-MS. Tais resultados so preliminares mas
indicam que o perfil qumico da amostra de gua bruta no se difere muito da gua
tratada.
Anlises fsico-qumicas de pH, turbidez e cor foram feitas juntamente com as
anlises de PE para todas as amostras referentes a gua bruta. Os dados obtidos so
apresentados nas Tabelas 5.14, 5.15 e 5.16. O monitoramento de tais parmetros nos
mananciais apresentado nas Figuras 5.19 a 5.22.
89

Figura 5.18: Anlise quimiomtrica das amostras referentes aos meses de jun/07 a
set/07 com base no PCA

Tabela 5.14 Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (gua bruta).

Meses pH Turbidez (uT) Cor Aparente (uH) Cor Verdadeira (uH)
Fevereiro/07 7,8 11,5 106 N.A.
1

Maro/07 8,1 14,3 86 N.A.
Abril/07 7,4 67,5 427 N.A.
Maio/07 7,6 5,7 75 N.A.
Junho/07 7,4 3,6 36 N.A.
Julho/07 6,8 4,3 36 N.A.
Agosto/07 7,8 6,9 57 N.A.
Setembro/07 6,8 5,4 52 5,6
Outubro/07 6,0 13,1 89 13,8
Novembro/07 5,9 217,0 1319 19,1
Dezembro/07 6,3 56,1 241 10,0
Janeiro/08 6,1 93,3 440 13,7
1
N.A.: No analisado








90
Tabela 5.15 Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores (gua bruta).

Meses pH Turbidez (uT) Cor Aparente (uH) Cor Verdadeira (uH)
Fevereiro/07 7,6 4,7 106 N.A.
1

Maro/07 7,8 2,3 44 N.A.
Abril/07 7,2 4,8 86 N.A.
Maio/07 7,9 2,7 34 N.A.
Junho/07 7,1 1,4 164 N.A.
Julho/07 7,3 2,1 30 N.A.
Agosto/07 7,3 3,9 39 N.A.
Setembro/07 7,1 N.A. N.A. N.A.
Outubro/07 6,6 3,3 54 3,1
Novembro/07 7,6 2,0 80 0,3
Dezembro/07 7,2 2,9 16 N.A.
Janeiro/08 6,8 2,1 22 N.A.
1
N.A.: No analisada


Tabela 5.16 Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (gua bruta).

Meses pH Turbidez (uT) Cor Aparente (uC) Cor Verdadeira (uH)
Fevereiro/07 7,4 3,2 26 N.A.
1

Maro/07 7,8 3,6 17 N.A.
Abril/07 7,2 3,9 24 N.A.
Maio/07 7,5 1,9 15 N.A.
Junho/07 7,9 1,3 3,6 N.A.
Julho/07 6,9 0,7 3,5 N.A.
Agosto/07 7,6 0,7 4,0 N.A.
Setembro/07 6,9 0,6 1,7 0,7
Outubro/07 6,4 2,1 12 3,9
Novembro/07 7,6 2,1 1,6 1,6
Dezembro/07 6,6 2,5 9,5 2,0
Janeiro/08 5,8 18,1 85 5,5
1
N.A.: No analisado


91
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fev Mar Abr Mai J un J ul Ago Set Out Nov Dez J an
p
H
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.19: Variao do pH nas amostras de gua bruta dos trs mananciais durante o
perodo de monitoramento.

0
50
100
150
200
250
Fev Mar Abr Mai J un J ul Ago Set Out Nov Dez J an
T
u
r
b
i
d
e
z

(
u
T
)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.20: Variao da turbidez nas amostras de gua bruta dos trs mananciais
durante o perodo de monitoramento.
92
1
10
100
1000
10000
Fev Mar Abr Mai J un J ul Ago Set Out Nov Dez J an
C
o
r

A
p
a
r
e
n
t
e

(
u
H
)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.21: Variao da cor aparente nas amostras de gua bruta durante o perodo de
monitoramento nos 3 mananciais.

0
5
10
15
20
25
Set Out Nov Dez J an
C
o
r

V
e
r
d
a
d
e
i
r
a

(
u
H
)
Rio das Velhas
Vargem das Flores
Morro Redondo

Figura 5.22: Variao da cor verdadeira nas amostras de gua bruta durante o perodo
de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais.

De acordo com a Tabela 5.14 e a Figura 5.19 pode-se observar que o pH
manteve-se na faixa de 6 a 8 durante todo o perodo de amostragem nos 3 mananciais
93
com uma mdia em torno de 7,1. A Tabela 5.15 e a Figura 5.17 mostram que os menores
ndices de turbidez foram encontrados nos locais de Vargem das Flores e Morro
Redondo (exceto janeiro 2008) onde ambos obtiveram uma mdia de 2,4 uT. Conforme
esperado, o Rio das Velhas (ambiente ltico) teve as maiores variaes de turbidez onde
foram encontrados valores de 3,6 uT (junho) a 217 uT (novembro). As mesmas
consideraes podem ser feitas para a cor aparente (Tabela 5.16 e Figura 5.18) que,
como esperado, teve grande correlao com a turbidez. A cor verdadeira, determinada
aps filtrao da amostra (Tabela 5.16 e Figura 5.21), manteve-se abaixo de 6,0 uC para
Morro Redondo e Vargem das Flores, enquanto que o Rio das Velhas obteve o valor
mdio de 12,5 uC chegando a um valor mximo de 20,0 uC durante o ms de novembro.
Este resultado tambm pode ser visto analisando-se a Figura 5.23 que apresenta a
anlise quimiomtrica dos dados de PCA, feita com a compilao dos parmetros
utilizados neste trabalho, com exceo da cor verdadeira, que s foi analisada nos meses
finais da campanha de monitoramento. De acordo com a Figura 5.23 podemos observar
que todos os parmetros so independentes entre si, com exceo da turbidez e cor
aparente, cujos valores da 1 e 2 componentes principais aparecem agrupados no grfico
PCA1 versus PCA2. Conforme discutido anteriormente, este resultado j era esperado.

0,75 0,50 0,25 0,00 -0,25 -0,50
0,50
0,25
0,00
-0,25
-0,50
-0,75
PCA 1
P
C
A

2
Cor Aparente
Estradiol
Etinilestradiol
Nonilfenol
PH
Turbidez
C1
Scatterplot of PCA 2 vs PCA 1

Figura 5.23: Anlise da Componente principal (PCA) dos seis parmetros utilizados
para o monitoramento dos mananciais escolhidos.
94
A baixa correlao entre os PE e os parmetros globais de monitoramento pode
ser explicada por alguns fatores. As amostras coletadas so ajustadas para o pH igual a
3, ou seja, todas so extradas sob uma mesma condio. Em relao turbidez, as
amostras so filtradas com membranas de 0,45m onde so retiradas grande parte das
partculas presentes. A turbidez poderia ter alguma influncia se os PE sofressem
adsoro pelas partculas presentes na gua. Isso no ocorre, pois o ndice de remoo
baixo nas ETAs aps a sedimentao.
Para futuras anlises, parmetros como COT (carbono orgnico total) da amostra
filtrada poderiam ser utilizados para possveis correlaes, uma vez que tal anlise
quantifica compostos orgnicos que se encontram dissolvidos em gua.

5.5. Estimativa de valores crticos de toxicidade dos PE estudados

Um trabalho realizado pela Organizao Mundial da Sade (Damstra et al.
2002), mostra que baixas quantidades de E2, EE2 e NP so capazes de alterar tamanho
da prstata de camundongos. A Tabela 5.17 resume os efeitos causados pelos
perturbadores endcrinos citados neste trabalho.

Tabela 5.17 - Exemplos de pertubao endcrina observada em animais do sexo
masculino expostos aos estradiis e nonilfenol durante o perodo pr-natal. (adaptado
Damstra et al., 2002)

Composto Espcie e perodo
de exposio (dias)
Dose Efeitos
Nonilfenol Rato
(1 a 18)
0,08 a 8
mg/kg/dia
(ingesto oral)
0,8 mg/kg/dia: reduo do
testculo, epiddimo, vescula
seminal e prstata.
8,0 mg/kg/dia: Reduo da
quantidade de espermas.
Camundongo
(13 a 19)
25 a 300
g/camundongo
(subcutneo)
De 25 a 100g aumento do
tamanho da prstata.
Estradiol

Ratos
(uma gerao)
0,003 a 4,12
mg/kg/dia
(ingesto oral)
De 10 a 50 mg.Kg
-1
, reduo
dos testculos e epiddimo,
reduo do nmero de
espermas.
Etinilestradiol Camundongo
(0 a17)
0,002 a 200
g/kg/dia
(ingesto oral)
De 0,02 a 2 g/kg/dia:
diminuio da prstata

95
Considerando, as quantidades limite para os ratos, e com base no trabalho de
Snyder (2007) e nos procedimentos descritos em Baird (2001) e em OMS (2006),
estimaram-se valores de referncia para a toxicidade de estradiol, etinilestradiol e
nonilfenol na gua para consumo humano. Os dados que sero apresentados a seguir so
apenas estimativas e no devem ser utilizados como parmetros de toxicidade, uma vez
que a OMS, a comunidade europia ou os pases desenvolvidos (Ex. Canad, Estados
Unidos, Japo) no estabelecem valores mximos permitidos (VMP) de tais
contaminantes nos seus guias de potabilidade de gua. Os resultados, que possuem
apenas carter informativo, foram calculados da seguinte forma:

a) Considerou-se que a faixa de valores toxicolgicos apresentados na Tabela 5.17
contempla os divergentes dados da literatura. Dessa forma as doses crticas, ou seja,
valores abaixo dos quais no se observam algum efeito adverso (NOAEL non
observed adverse effect level) seriam de 0,08 a 8 mg/kg/d para o NP; de 0,003 a 4,12
mg/kg/d para E2 e de 0,02 a 2 g/kg.d para o EE2;

b) Converteram-se esses valores para uma dose equivalente em humanos, e isso
geralmente feito usando um fator de diviso de 100 (pela extrapolao entre espcies e
para considerar membros frgeis na comunidade como imunodeficientes, crianas e
idosos). Dessa forma as concentraes crticas seriam de 0,8 a 80 g/kg.d para o NP; de
0,03 a 41,2 g/kg.d para o E2 e de 0,2 a 20 ng/kg.d para o EE2;

c) Multiplicaram-se os valores encontrados no passo b) pela massa corprea mdia de
um ser humano (70 kg) e dividiu-se o valor encontrado pelo consumo mdio (por
ingesto) de gua por habitante (2 L/d). Desta forma a faixa de valores considerados
txicos para humanos foram estimados em 28 a 2.800 g/L para o NP; 1 a 1.442 ng.L
-1

para o E2; e 0,7 a 70.000 ng.L
-1
para o EE2.

De acordo com os dados apresentados, os valores de NP (0,044 a 1,9 g/L)
encontrados nas guas da RMBH encontraram-se bem abaixo dos valores supostamente
txicos estimados. Para os estradiis, sabidamente mais estrognicos que o nonilfenol,
os valores encontrados nos mananciais (3 a 54 ng.L
-1
para E2 e 1,5 a 36 ng.L
-1
para EE2)
caem dentro da faixa calculada como supostamente txica para a sade humana.
Contudo preciso salientar que tais compostos foram detectados em poucas amostras e
96
que toda essa anlise est sendo feita com os valores encontrados na gua bruta. Como
visto anteriormente o tratamento convencional remove parcilamente os PE estudados, e
bem provvel que a etapa final de desinfeco (no avaliada nesse estudo) consiga, de
forma efetiva, reduzir a concentrao de NP, E2 e EE2 para valores inferiores queles
considerados txicos. De qualquer forma estudos posteriores so necessrios para avaliar
se a clorao da gua consegue remover perturbadores endcrinos promovendo
simultaneamente reduo na estrogenicidade da gua.

97
6. CONCLUSES

O presente trabalho avaliou a presena de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol
em trs mananciais de abastecimento da regio metropolitana de Belo Horizonte
(RMBH). Este trabalho pode contribuir para o entendimento de uma rea onde dados
deste tipo de levantamento so escassos devido atualidade do tema. A partir da
identificao e monitoraramento de E2, EE2 e NP, considera-se este trabalho pioneiro
em Minas Gerais uma vez que a comunidade cientfica no dispe, at o momento, de
tais informaes.
De modo geral, os procedimentos analticos empregando amostragem, extrao
por SPE e anlise por LCMS se mostraram eficientes na determinao dos trs
compostos de interesse usando um volume de amostra igual a 1 litro. As concentraes
de 17-estradiol e 17-etinilestradiol e nonillfenol, presentes na faixa de nanogramas por
litro, s foram possveis de serem determinadas devido elevada sensibilidade e
seletividade obtida com o detector por espectrometria de massas on-trap - time-of-flight.
Devido aos teores encontrados nas guas, recomenda-se que as anlises sejam feitas por
este tipo de aparelho, pois obteve um limite de deteco aproximadamente mil vezes
menor em relao ao CG-FID, onde tambm foram apresentados excelentes parmetros
de linearidade e separao, mas um alto limite de deteco.
Os parmetros de validao verificados para o procedimento proposto
aumentaram a confiabilidade dos resultados apresentados, uma vez que ainda no se tem
um mtodo oficial para a determinao simultnea desses compostos. Esse procedimento
poder ainda servir como base para se iniciar estudos de monitoramento desses
compostos em diversas matrizes aquticas e, futuramente, adicionar outros compostos
como o bisfenol-A que foi detectado em anlises preliminares nas amostras do ms de
janeiro 2008.
O alquilfenol NP foi o composto que esteve presente em todas amostras em
concentraes elevadas (44 a 1900 ng.L
-1
) quando comparado com a literatura
internacional. Por sua vez, os hormnios E2 e EE2 foram identificados em apenas 15%
das amostras na faixa de concentrao de 3 a 54 ng.L
-1
para o E2 e de 1,5 a 36 ng.L
-1

para o EE2.
Em relao remoo dos compostos aps o processo de pr-clorao,
coagulao, sedimentao e/ou filtrao, utilizado nas ETAs estudadas, observou-se que
tais operaes unitrias no removeram completamente os perturbadores NP, E2 e EE2,
98
indicando que tais compostos no so adsorvidos no lodo formado na etapa de
coagulao.
Neste contexto, pode-se entender que no Brasil certos corpos dgua encontram
em processo de degradao, pois as concentraes dos compostos estudados encontrados
nas guas superficiais da RMBH so semelhantes quelas presentes em efluentes de ETE
de pases da Europa e Estados Unidos, reflexo da deficincia de ETEs em grande parte
dos municpios do pas.











99
7. PERSPECTIVAS

Para trabalhos futuros, sugere-se um estudo mais abrangente da presena de NP,
E2 e EE2 em outros corpos dgua, como guas subterrneas, por exemplo, uma vez que
muitos municpios utilizam essa fonte para abastecimento pblico. Tambm seria
interessante um estudo que avaliasse a eficincia das estaes de tratamento de gua e
esgoto com relao remoo destes compostos, bem como a aplicao de mtodos de
tratamento complementares que promovam a degradao completa desses
contaminantes.
A avaliao da capacidade de biodegradao das substncias nas guas naturais
brasileiras e a formao de derivados mais ou menos txicos que os compostos originais
tambm poderiam ser melhores estudadas futuramente. E finalmente, devido a presena
de E2, EE2 e NP nas amostras durante o monitoramento, sugere-se um levantamento de
outros possveis compostos, preferencialmente fenis, devido a presena de nonilfenol e
bisfenol A. Um novo levantamento preliminar poderia ser feito utilizando mtodos de
varredura mais amplos (m/z de 100 a 5000 por exemplo) nos dois modos de deteco
por espectrometria de massas (positivo e negativo).













100
8. REFERNCIAS

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