Vicente Molina Ncher

ESTRUCTURA DEL SEMINARIO:

S1.1. Introduccin a la espectrofotometra ___________________________________________ 1
S1.2. Radiacin electromagntica _____________________________________________________ 1
S1.3. Espectroscopa ultravioleta/visible _____________________________________________ 2
S1.4. Colorimetra ______________________________________________________________________ 5

S1.1. Introduccin a la espectrofotometra

ESPECTROFOTOMETRA
Propiedades: concentraciones, variaciones del entorno (polaridad, pH), variaciones
estructurales, interacciones moleculares, ...
: Medida de propiedades moleculares basada en la interaccin
materiaradiacin electromagntica (espectroscopa)
Materia = MUESTRA

: molculas biolgicas en disolucin acuosa (protenas, cidos nucleicos,
metabolitos, ... etc.)
S1.2. Radiacin electromagntica

Caractersticas de la radiacin electromagntica
Naturaleza ondulatoria y corpuscular
Se caracteriza por:
Su energa, definida a travs de:
Su frecuencia (, en s1), su longitud de onda (, en nm) o su nmero de
onda (, en cm1):

=
=

=

Su intensidad (I) (nmero de fotones)



Energa de una molcula
Depende de la interaccin entre partculas (tomos, ncleos, electrones, ...)
Caracteriza los distintos estados de la molcula
Representacin:
Vicente Molina Ncher





Interaccin materia radiacin electromagntica
Dispersin (difraccin)
Absorcin
La energa de la luz incidente (h n) es igual a la variacin de energa entre dos
estados electrnicos de las molculas de la muestra (DE)
Las molculas que absorben se llaman cromforos



Emisin

S1.3. Espectroscopa ultravioleta/visible

Espectroscopa UV Visible
E0 y E* son estados electrnicos
l = 1701000 nm
Espectro de la radiacin electromagntica:

Vicente Molina Ncher



Ley de Lambert-Beer
I = I0 Ia
I Intensidad emergente
I0 Intensidad incidente
Ia Intensidad absorbida
I = I0 e-2.303
Cl

Coeficiente de extincin (M1cm1)
C Concentracin
l Distancia atravesada por la luz (cm)
Medida de la absorbancia (A)
A= log I0 / I
Ecuacin de Lambert-Beer
A = C l
Relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin
Espectros de Absorcin
Registro de A (o e) a longitudes de onda (l) variables
Dan lugar a bandas anchas caracterizadas por un mximo (lmax)
Cada cromforo presenta su espectro caracterstico



Espectrofotmetro de Absorcin
Esquema general:

Vicente Molina Ncher



Espectrofotmetro de doble haz


Aplicaciones analticas en muestras biolgicas
Caracterizacin de molculas biolgicas:
En protenas
Cromforos:
Grupos peptdicos (~200 nm)
Aminocidos aromticos (250 300 nm)
Grupos prostticos: hemo, centros metlicos, (absorben en la
regin visible). NAD+ / NADH (absorben en la regin ultravioleta)
Aplicaciones: Determinacin de concentraciones, estudios estructurales
(desnaturalizacin, cambios conformacionales), unin de ligandos, reacciones
enzimticas...



Espectros de protenas con grupos prostticos:
Hemoprotenas
Vicente Molina Ncher


D aminocido aminotransferasa. Grupo prosttico:
Vitamina B6
Fosfato de piridoxal (PLP)
Fosfato de piridoxamina (PMP)


D-alanina + PLP piruvato + PMP (Paso I)
a-cetoglutarato + PMP D-glutamato + PLP (Paso II)
D-alanina + a-cetoglutarato piruvato + D-glutamato (Global)

Espectros UV Vis de cidos nucleicos
Cromforos: Bases nitrogenadas



S1.4. Colorimetra

Colorimetra
Determinacin de concentraciones proteicas (colorimetra)
Si se conoce para una l caracterstica
Aplicacin de la ecuacin de LambertBeer
Medir Absorbancia a la longitud de onda caracterstica
Vicente Molina Ncher

Aplicar: C = A / ( x 1 cm)
desconocido
Utilizacin de una recta patrn
A partir de disoluciones de la protena de concentracin conocida
A partir de disoluciones de concentracin conocida de una protena
patrn (albmina de suero bovino, BSA)
Mtodo de Lowry
Incubacin con reactivo de Folin de muestras patrn (BSA 0100 mgr/ml) y muestras
problema
Medida de Absorbancia a 660 nm de todas las muestras
Representacin grfica de los valores del patrn (Absorbancia frente a Concentracin)
Interpolacin de la Concentracin de las muestras problema