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Prof. Valmir F.

Juliano

QUI624
INTRODUO AOS MTODOS ESPECTROANALTICOS - II

Luminescncia Molecular
Trs tipos de mtodos pticos relacionados entre si so conhecidos coletivamente como mtodos de luminescncia molecular: Fluorescncia molecular; fosforescncia e quimiluminescncia. A fluorescncia e a fosforescncia so similares, no tocante ao processo de excitao, que feita por absoro de ftons. Por esse motivo so frequentemente mencionados pelo termo mais genrico fotoluminescncia. A quimiluminescncia est baseada no espectro de emisso de uma espcie excitada que formada no decorrer de uma reao qumica.

Luminescncia Molecular
A medida da intensidade de fotoluminescncia ou quimiluminescncia permite a determinao quantitativa de uma variedade de espcies orgnicas e inorgnicas importantes em concentraes muito baixas (traos). Atualmente, o nmero de mtodos fluorimtricos significativamente maior que o nmero de aplicaes de procedimento de fosforescncia e quimiluminescncia. Um dos aspectos mais atraentes dos mtodos de luminescncia a sua sensibilidade intrnseca, com limites de deteco frequentemente de uma a trs ordens de grandeza menores de a absoro (ppb).

Luminescncia Molecular
Outra vantagem dos mtodos fotoluminescentes a sua extensa faixa de concentrao linear, que, com frequencia, significativamente maior que as encontradas em mtodos de absoro. Devido sua alta sensibilidade , os mtodos de luminescncia quantitativos esto sujeitos a efeitos de interferncia srios das matrizes das amostras. Por essa razo, normalmente, as medies de luminescncia esto associadas com tcnicas de separao da cromatografia e da eletroforese. Geralmente os mtodos de luminescncia apresentam uma aplicao menos ampla. Muito mais espcies absorvem radiao UV/Vis do que emitem.

Luminescncia Molecular
Teoria da fluorescncia e fosforescncia Ocorrem em sistemas qumicos gasosos, lquidos e slidos simples, bem como em sistemas complexos. Fluorescncia de ressonncia: lemis = labs. Observada mais
Fluorescncia com deslocamento Stokes: lemis > labs. O
para espcies atmicas que moleculares.
fsico Irlands George Gabriel Stokes, verificou que o fton absorvido perdia energia por inmeras vibraes microscpicas.

A absoro de ftons ocorre instantaneamente (10-14 a 10-15 s). A emisso de fluorescncia ocorre em um tempo significativamente maior (10-9 a 10-7 s, quando e tem valores 103 a 105, e 10-6 a 10-5 s para e bem menores). A emisso de fosforescncia, por sua vez, ocorre em tempos muito maiores (10-4 a 10 s ou mais) em virtude da transio de spin singlete-triplete diferente da transio singlete-singlete da fluorescncia.

Luminescncia Molecular
Teoria da fluorescncia e fosforescncia
a) b) c) Estado fundamental singlete Estado excitado singlete Estado excitado triplete

O estado eletrnico molecular chamado de singlete quando os eltrons esto emparelhados e nenhuma separao de nveis de energia observada sob efeito de um campo magntico. A molcula diamagntica. No estado dublete, o que acontece com um radical livre, o eltron pode ter duas orientaes sob campo magntico, conferindo energias diferentes ao sistema (paramagnetismo). O estado triplete pode ser alcanado se o eltron tornar-se desemparelhado ao ser excitado para um nvel de maior energia. Neste caso tambm ocorre o paramagnetismo.

Luminescncia Molecular
Teoria da fluorescncia e fosforescncia A molcula pode voltar ao seu estado fundamental por uma combinao de vrias etapas mecansticas, denominados de processos de desativao:
Processos radiativos
Fluorescncia. Fosforescncia.
Sempre ocorrem do menor nvel energtico vibracional

Processo no-radiativos Relaxao vibracional (10-12 s)


Converso interna

Colises entre as molculas excitadas e as molculas do solvente eliminam excesso de energia, atingindo o menor nvel vibracional.

Converso externa (extino por coliso)

Processos intermoleculares pelos quais a molcula passa para um estado eletrnico de menor energia sem emisso de radiao.
A desativao de um estado eletrnico excitado envolve a transferncia de energia entre a molcula excitada e o solvente ou outros solutos. Condies que reduzem o nmero de colises (baixa temperatura e alta viscosidade) aumentam a emisso.

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Teoria da fluorescncia e fosforescncia
Processo no-radiativo que ocorre quando h superposio de nveis de energia Estados singlete Processo no-radiativo que ser favorecido se houver superposio dos nveis de energia Estado triplete

Luminescncia Molecular
Efeito da converso interna: Quinina

Tanto a absoro em 250 nm quanto em 350 nm resultam na emisso em 450 nm.


Emisso da luz negra

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Teoria da fluorescncia e fosforescncia
A estrutura molecular, assim como o ambiente qumico, influenciam a ocorrncia ou no da luminescncia de uma molcula. Estes fatores tambm determinam a intensidade de emisso, quando esta ocorre. Rendimento quntico ou eficincia quntica F:
simplesmente a razo do nmero de molculas que luminescem pelo nmero de molculas excitadas. A fluorescena possui uma eficincia quntica prxima da unidade.

Tipos de transio

Estrutura

Dificilmente a fluorescncia resulta de absoro de radiao com l menor que 250 nm, porque tal radiao suficientemente energtica para promover a desativao dos estados excitados por prdissociao ou dissociao. A emisso fica restrita a transies p* p (maior eficincia quntica) e p* n. Ainda que alguns compostos carbonlicos e alguns com estruturas de duplas ligaes altamente conjugadas fluoresam, a fluorescncia mais intensa e mais til encontrada em compostos com grupos aromticos com transies p p* de baixa energia.

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Fluorescena

No apresentam fluorescncia

Apresentam fluorescncia

Luminescncia Molecular

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Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura favorece a fluorescncia

Apresenta fraca fluorescncia F = 0,2

Apresenta forte fluorescncia

F = 1

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Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura favorece a fluorescncia
A rigidez do complexo formado explica porque o complexo de zinco com a 8-hidroxiquinolina apresenta uma fluorescncia muito maior que a 8-hidroxiquinolina.

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Efeito do solvente e temperatura A eficincia quntica diminui com o aumento da temperatura por causa do aumento da frequncia das colises ocasionando converses externas. Um decrscimo na viscosidade causa igual efeito.

A fluorescncia diminuda por solventes contendo tomos pesados ou por solutos contendo tais tomos em suas estruturas. Exemplo: CBr4 e CH3CH2I
Efeitos de pH podem desfavorecer a fluorescncia Apresenta fluorescncia

No apresenta fluorescncia

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Efeito da concentrao na intensidade de fluorescncia A potncia de emisso de fluorescncia F proporcional potncia radiante do feixe de excitao que absorvido. F = K(Po P) Escrevendo a lei de Beer, P / Po = 10-ebc, onde e absortividade molar das molculas fluorescentes F = K(Po - Po 10-ebc) = KPo(1 - 10-ebc) O termo exponencial pode ser expandido e posteriormente simplificado. Considerando A < 0,05, o resultado passa a ser F = 2,303KebcPo. Como eb constante e possvel manter Po tambm constante, o resultado final passa a ser: F = Kc

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Desvios da linearidade Quando a concentrao da espcie emissora grande o suficiente para que a absorbncia seja maior que 0,05, a simplificao do termo exponencial se torna invlida e a linearidade perdida. (absoro primria) Dois outros fatores tambm causam desvios negativos da linearidade: Auto-supresso
Colises entre molculas excitadas provocam a transferncia de energia no-radiativa de um modo semelhante transferncia para molculas do solvente na converso externa.

Absoro secundria (inclui a auto-absoro)


Ocorre quando lemisso coincide com algum labsoro. O resultado a reabsoro da radiao por quaisquer molculas na soluo.

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Fatores que reduzem a intensidade de fluorescncia Supresso dinmica

Tambm chamada de supresso colisional, necessita do contato entre as espcies excitadas e o agente supressor. O mecanismo no muito bem compreendido.
A concentrao do agente supressor deve ser suficientemente alta para que haja uma alta probabilidade de coliso entre as espcies excitada e supressor durante o tempo de vida do estado excitado.
A presena de O2 dissolvido, que paramagntico, geralmente reduz a intensidade da fluorescncia por promover o cruzamento intersistema. Entretanto, tambm pode promover a supresso do estado triplete, reduzindo tambm a fosforescncia. A fluorescncia do sulfato de quinino suprimida por altas concentraes de ons cloreto.

Luminescncia Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescncia Supresso esttica

Neste caso, o supressor forma com o analito fluorforo um complexo chamado de complexo escuro.
supressor

Molcula fluorescente

Complexo nofluorescente

ML

Supresso de longo alcance Neste tipo de supresso a transferncia de energia ocorre com colises entre as molculas. O acoplamento dipolo-dipolo entre o fluorforo excitado e o supressor responsvel pela transferncia.

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Fatores que reduzem a intensidade de fluorescncia Uma vez que a emisso de fluorescncia F diretamente proporcional eficincia quntica Ff, se a supresso depender de um nico supressor, aps alguma manipulao nas equaes do sistema, obtm-se: F0 onde F e Fo so os sinais de fluorescncia na presena e 1 Kq [Sup] ausncia do supressor e Kq a constante de supresso F 200 14.0000
180 160 140 120 12.0000 10.0000 y = 209.9462x + 1.0092 R = 0.9999

F 100
80

Fo/F
0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060

8.0000
6.0000 4.0000 2.0000 0.0000 0.000

60
40 20 0 0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

0.050

0.060

Supresso da fluorescncia do sulfato de quinino por Cl-.

[Cl-]

[Cl-]

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Instrumentos para medir fluorescncia e fosforescncia Os componentes dos instrumentos para medir a fotoluminescncia so similares queles encontrados nos fotmetros e espectrofotmetros UV/Vis. A fonte de radiao necessita ser mais intensa que aquelas utilizadas na absoro molecular. A maioria dos equipamentos emprega a tica de duplo feixe para compensar flutuaes na potncia da fonte. A fluorescncia emitida pela amostra se propaga em todas as direes, mas o ngulo reto em relao ao feixe incidente mais conveniente para evitar perdas por espalhamento na soluo e, principalmente, nas paredes da cubeta.

F = Kc

Luminescncia Molecular

Luminescncia Molecular

Para refletir e responder: Seria possvel realizar uma medida de fluorescncia em um espectrofotmetro convencional aps alguma pequena modificao?

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Aplicaes Os mtodos de fluorescncia e fosforescncia so intrinsecamente aplicveis a faixas de concentraes mais baixas que as medidas espectrofotomtricas baseadas em absorbncias e esto entre as tcnicas analticas mais sensveis facilmente disponveis.

Essa sensibilidade elevada vem do fato que F aumenta se a potncia da fonte Po aumentar, ou ento, pelo fato do sinal poder ser amplificado posteriormente. A absorbncia, por estar relacionada com Po/P, no se altera com o aumento de Po, pois o aumento deste causa um aumento proporcional em P.
Em contraste a alta sensibilidade, os mtodos fotoluminescentes so menos precisos e exatos que os mtodos espectrofotomtricos por um fator de 2 a 5.

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Aplicaes Muitos ons de metais de transio so paramagnticos, o que favorece o cruzamento intersistema ao estado triplete, desfavorecendo a fluorescncia, embora a fosforescncia possa ser observada. Os complexos dos metais de transio possuem muitos nveis de energia pouco espaados, favorecendo a desativao por converso interna e no por fluorescncia. Complexos de metais que no so de transio, geralmente incolores e que formam complexos tambm incolores, so menos suscetveis a esses processos de desativao. Estes no poderiam ser determinados por absoro molecular no visvel. Assim a fluorimetria complementar absoro molecular.

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Aplicaes Reagentes fluorimtricos

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Aplicaes

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Quimiluminescncia A aplicao da quimiluminescncia qumica analtica relativamente recente. O nmero de reaes qumicas que produz quimiluminescncia pequeno, limitando assim o mtodo. A quimiluminescncia produzida quando uma reao qumica fornece uma espcie excitada eletronicamente que emite luz quando retorna ao estado fundamental. A bioluminescncia a quimiluminescncia que ocorre em sistemas biolgicos. Os exemplos mais conhecido so os vaga-lumes e as guas-vivas. A instrumentao para medidas de quimiluminescncia notavelmente simples. necessrio um sistema fechado com apenas um tubo fotomultiplicador.

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Quimiluminescncia A utilizao do luminol para deteco de sangue em uma cena de crime baseia-se a reao do luminol com H2O2 em meio alcalino catalisada pelo ferro presente hemoglobina. Dentro de certos limites, a intensidade de quimiluminescncia do luminol diretamente proporcional concentrao do oxidante, do catalisador ou do luminol. Os mtodos de quimiluminescncia em geral so altamente sensveis porque nveis baixos de luz podem ser detectados na ausncia de rudo. No h atenuao da radiao em monocromadores ou filtros. Com isso limites de deteco na faixa de partes por bilho (ppb) ou partes por trilho (ppt) podem ser alcanados.

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Quimiluminescncia

luminol

on 3-aminoftalato

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Vantagens (em comparao absoro molecular) Muito mais sensvel. Alcana facilmente limites de deteco de ppb. A quimiluminescncia pode fornecer limites de deteco da ordem de ppt. Mais seletiva. O fato de absorver um determinado l e emitir em outro, diminui em muito a probabilidade de existir na mesma soluo outra espcie que faa o mesmo. Serve para a determinao de metais que no so de transio que, em geral, so incolores e tendem a formar quelatos tambm incolores e que no poderiam ser determinados por absoro molecular na regio do visvel.

Luminescncia Molecular
Desvantagens (em comparao absoro molecular) Limitada a um nmero muito menor de sistemas que incorporam caractersticas estruturais e ambientais que provocam uma desacelerao dos processos de relaxao ou desativao no-radiativos. Apesar disso, existem mais de 200 substncias que podem ser analisadas por esta tcnica. Espcies orgnicas e bioqumicas produtos alimentcios, frmacos, produtos naturais e amostras clnicas: Enzimas e coenzimas, esterides, vitaminas, etc. Pior exatido e preciso por um fator de 2 a 5. Custo maior do equipamento. Ao contrrio da absoro molecular, no se aplica a determinao de complexos de metais de transio.

Luminescncia Molecular

Para refletir e responder: Seria possvel analisar um analito orgnico aromtico com anis condensados em uma mistura de compostos orgnicos atravs da espectrometria de luminescncia molecular? Em caso positivo, quais seriam as limitaes da anlise?

Luminescncia Molecular
Exerccio:
Os volumes de uma soluo padro contendo 1,10 ppm de Zn2+, mostrados na tabela, foram pipetados para frascos separados, cada um contendo 5,00 mL de uma soluo de concentrao desconhecida de zinco. Cada uma foi extrada com 3 alquotas de 5mL de CCl4 contendo excesso de 8hidroxiquinolina. Os extratos foram ento diludos a 25,00 mL e a fluorescncia foi medida com um fluormetro. a) Construa a curva de trabalho. b) Determine a equao linear. c) Calcule o desvio padro da inclinao, do intercepto e da regresso. d) Determine a concentrao de zinco na amostra com o respectivo desvio padro s2 s
Volume da soluo padro de Zn2+, mL 0,00 4,00 8,00 12,00 Leitura do fluormetro

( xi x)( y y) ( x x)
i 2

sm

( x x)
2 i

2 i

( x x)
2 i

b y mx
6,12 11,16 15,68 20,64

sb sr
2

x N x x

sr

( y y)

N 2

m 2 ( x x) 2

s sx r m

1 ( y y)2 2 N m ( xi x) 2

Luminescncia Molecular
Exerccio - resposta:
25 Leitura do fluormetro

a) Curva de trabalho em volume de padro adicionado. b) Equao linear.


Volume da soluo padro de Zn2+, mL 0,00 4,00 8,00 12,00 Leitura do fluormetro
20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 Volume de soluo padro de Zn2+, mL 12 14 y = 1.202x + 6.188 R = 0.9996

6,12 11,16 15,68 20,64

c) Desvios-padro Regresso: sr = 0,154402 Inclinao: sm = 0,01726 Intercepto: sb = 0,12918 d) Desvio padro da leitura: sx = 0,17251 sc = 0,17251 x 1,10 / 5 = 0,038 ppm [Zn2+] = (6,188/1,202) x 1,10 / 5 = 1,13 ppm

Luminescncia Molecular
Exerccio - resposta:
a) Curva de trabalho em concentrao de padro adicionado. b) Equao linear.
25

[Zn2+], ppm 0,00 0,176 0,352 0,528

6,12 11,16 15,68 20,64

Leitura do fluormetro

Leitura do fluormetro

20 15 10

y = 27.318x + 6.188 R = 0.9996

5
0 0 0.1 0.2 0.3 [Zn2+], ppm 0.4 0.5 0.6

c) Desvios-padro Regresso: sr = 0,154402 Inclinao: sm = 0,39233 Intercepto: sb = 0,12918 d) Desvio padro da leitura: sx = 0,00759 sc = 0,00759 x 25 / 5 = 0,038 ppm [Zn2+] = (6,188/27,31) x 25 / 5 = 1,13 ppm

Luminescncia Molecular
Exerccio: Compare a luminescncia molecular com a absoro molecular no UV/Vis. Porque o aumento da potncia da fonte luminosa no aumenta a sensibilidade de deteco na absoro molecular, mas aumenta a emisso?

A = log (P0/P) F = K (P0 P) F = K(Po - Po 10-ebc) F = KPo(1 - 10-ebc) 2,303KebcP0

Fim da Luminescncia Molecular. O que ser que vem a seguir?