Qumica Medicinal I

rnica Montana como Antiinflamatorio y Antimicrobiano

Arteaga Garca F, Enrquez Gutirrez M. G, Garca Ramrez A, Garca Reveles J. L
Laboratorio de Qumica Medicinal I, Qumico Farmacutico Bilogo, Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas, rea de Ciencias de la Salud, Universidad Autnoma de Zacatecas, Campus Siglo XXI

RESUMEN rnica montana, una planta medicinal tradicional, es conocida por sus efectos anti-inflamatorios. Los extractos de esta planta se utilizan para tratar afecciones inflamatorias, como contusiones, esguinces, gingivitis y reumticos. Los metabolitos secundarios de las plantas que median estos efectos antiinflamatorios son lactonas sesquiterpnicas principalmente del tipo pseudoguaianolide tales como helenalina, 11a,13-di-hydrohelenalin y sus derivados de ste. Para la obtencion de estos metabolitos se realizaron metodos de extraccion con disolventes organicos , posteriormente se sometio a destilacion simple culminando con un filtrado al vacio. Cuando se obtuvo el compuesto finalmente se llevo a cabo la mercha fitoquimica por medio de la prueba de Bajlet (reaccin de colorida) donde se comprob la presencia de lactonas. Para culminar y proceder a la parte experimental en murinos, el compuesto obtenido se prepar en gel. Parte de la investigacin fue someter a prueba el extracto de rnica como antibacterial, para el cual se prepar una tintura de esta planta la que se dej reposar durante semanas en etanol. Los resultados fueron favorables en la presentacion del compuesto, en el gel hubo disminucin antiinflamatoria en el murino y en la presentacion de tintura en tres cepas se present inhibicin. Palabras Clave: rnica, antiinflamatorio, sesquiterpenicos, helenalina, lactonas, flavonoides ABSTRAC

OBJETIVOS Convertir el material seleccionado en una forma adecuada mediante la extraccin en un sistema de disolvente adecuado. Demostrar el efecto del extracto total y aceite esencial sobre un proceso inflamatorio en murino. Demostrar el efecto del extracto total en cultivos bacteriolgicos con diferentes cepas como antibacteriano.

INTRODUCCIN

Datos Generales rnica Montana

Nombre populares: rnica Tabaco de Montana, Betonica de Montana, Hierba Santa, Estornudadera, Plaga de Leopardo. Nombre Cientfico: rnica Montana L. Reino: Plantae-Planta. Sub-reino: Tracheobionta-Planta vascular. Superdivisin: Spermatophyta-Planta cansanilla. Divisin: Magnoliphyta-Planta floral. Clase: Magnolipsida-Dicotiledonia.

Subclase: Asteridae. Orden: Asterales. Familia: Asteraceae. Gnero: rnica L-rnica. Especie: rnica Montana L. I. Hbitat: Oriunda de Europa central y meridional, Asia central y Amrica del Norte, encontrndose en zonas soleadas y montaosas (Alpes especialmente), praderas, y tuberas, preferentemente sobre suelos cidos, arenosos y ricos en humus. Actualmente se encuentra como especie protegida en Espaa, Italia y Suiza. II. Caractersticas y Descripcin:

otros monoterpnicos y sesquiterpnicos (entre ellos alfafelandreno, mirceno, humuleno, alfa-candineno y oxido de cariofileno); cido dinmico y sus derivados (cido cafeico, clorognico, cinarina); cumarinas (umbeliferota esscopoletina); poliacetilenos; colina; pigmentos xantfilos, taninos, fitoesteroles, carotenoides. Trazas de alcaloides pirrolizidnicos (tusilagina, isotusilagina), sales de manganeso.

IV.

Uso tradicional:

Planta aromtica perenne, perteneciente a la familia de las compuestas, caracterizada por presentar una altura entre 20 y 60 cm; tallo erguido, hueco tomentoso, con pocas ramas, en cuya base se ubica una roseta de hojas lanceoladas, extendidas sobre el suelo, simples y derechas, hirsutas por el haz, glabra por el envs. Fig. 1

Las propiedades medicinales del rnica ya fueron conocidas por las primitivas tribus germnicas. Esta planta ha probado ser efectiva en casos de golpes, contusiones y dislocaciones, dolores reumticos, e inflamacin de la piel. Popularmente se usa haciendo una pasta con la raz para curar tumores sin especificar cuales. Tambin la tintura derivada de la flor dcese que ayuda al cncer de hgado, estmago e intestino entre otros. Las flores desecadas se usan medicinalmente como expectorante hemosttico, febrfugo, irritante, sedante, estimulante, tnico y vulnerario (cicatrizante y antisptico). Los rusos usaban sta hierba como colecistoquintico, hipocolesterolmico, estimulante del sistema nervioso central y a nivel genital para detener sangrados, cerrar fornculos e inflamaciones y para fortalecer un corazn dbil. Propiedades medicinales:

Fig. 1

rnica montana

III.

Usos medicinales

Principios Activos: 1) Principales componentes de la flor: Lactosas sesquiterpenicas (0,2 a 0,8%) del grupo del pseudoguayanolido, principalmente de la helenalina y la 11 alfa y 13 dihidrohelenlina y sus esteres (cido actico, isobutrico, 2metilbutanoico, isovalrico, alfa-metacrlico y tglico). Flavonoides (0,4 a 0,6 %) isoquercitina, astragalina, 7-0glucosil-luteolina y otros. 2) Aceite Esencial: Compuesto en un 40 a 50 % de cidos grasos, aproximadamente 9% de n-alkanos y derivados del timol y

Antiinflamatorio. Antibacterial. Analgsico. Incrementa la circulacion sangunea Hemorroides Forunculos

Contra Indicaciones: la planta es muy txica por va interna: se sabe que puede producir alteraciones del sistema nervioso y serios problemas digestivos; tambin se han descrito reacciones alrgicas. Por tanto, solo est recomendado su uso por va externa y siempre con la precaucin de que se emplee en concentraciones diluidas.

Tcnica de Obtencin
Extraccin con disolventes orgnicos: La extraccin es una tcnica de separacin y purificacin para aislar una sustancia de una mezcla slida o lquida en la que se encuentra, mediante el uso de un disolvente. Los disolventes orgnicos

utilizados en extraccin deben tener baja solubilidad en agua, alta capacidad de solvatacin hacia la sustancia que se va a extraer y bajo punto de ebullicin para facilitar su eliminacin posterior. La extraccin slido-lquido, se emplea cuando la sustancia que se desea extraer est contenida en una material slido, junto con otros componentes, los cuales debern ser prcticamente insolubles en el disolvente utilizado. Es muy usada para aislar sustancias naturales de origen vegetal, o bien, de mezclas resinosas obtenidas por sntesis. Se puede emplear un mtodo directo, calentando el slido junto con el disolvente en un matraz y colocando un refrigerante en posicin vertical para que se condense el disolvente que esta hirviendo y no se pierda. (A esta operacin se le llama calentamiento a reflujo), hasta que el producto deseado se encuentre disuelto en dicho solvente). (Tabla 1 y 2)

la respuesta, que tiende a circunscribir la zona de lucha contra el agente agresor. En segundo lugar, la respuesta inflamatoria es inmediata, de urgencia y por tanto, preponderantemente inespecfica, aunque puede favorecer el desarrollo posterior de una respuesta especfica. En tercer lugar, el foco inflamatorio atrae a las clulas inmunes de los tejidos cercanos. Las alteraciones vasculares van a permitir, adems, la llegada desde la sangre de molculas inmunes. Clsicamente la inflamacin se ha considerado integrada por los cuatros signos de Celso: Calor, Rubor, Tumor y Dolor. El calor y rubor se deben a las alteraciones vasculares que determinan una acumulacin sangunea en el foco. El tumor se produce por el edema y acmulo de clulas inmunes, mientras que el dolor es producido por la actuacin de determinados mediadores sobre las terminaciones nerviosas del dolor.

Llegada de molculas y clulas inmunes al foco inflamatorio

Desde el punto de vista cronolgico, los mediadores de la inflamacin van a producir bsicamente dos efectos. En una primera fase inicial, alteraciones vasculares que facilitan el trasvase de molculas desde la sangre al foco inflamatorio, as como la produccin de edema. En una segunda fase, ms tarda, las propias alteraciones vasculares, as como la liberacin en el foco de factores quimiotcticos, determinan la llegada de clulas inmunes procedentes de la sangre y de los tejidos circundantes.
Tabla 1. Disolventes de extraccin comnmente utilizados

Tabla 2. Disolventes de extraccin ms densos que el agua

Modelos inflamatorios en murinos

La inflamacin es un proceso tisular constituido por una serie de fenmenos moleculares, celulares y vasculares de finalidad defensiva frente a agresiones fsicas, qumicas o biolgicas. Los aspectos bsicos que se destacan en el proceso inflamatorio son en primer lugar, la focalizacin de

El proceso de extravasacin leucocitaria, un paso crucial de la respuesta inflamatoria, implica la migracin de los leucocitos desde la corriente sangunea hasta los tejidos diana donde ejercen su funcin efectora. La extravasacin de los leucocitos est orquestada por la accin conjunta de receptores de adhesin celular y factores quimiotcticos, e implica cambios morfolgicos drsticos tanto en leucocitos como en clulas endoteliales. De este modo, constituye un proceso activo para ambos tipos celulares que promueve la rpida y eficiente llegada de los leucocitos a los focos inflamatorios sin comprometer la integridad de la barrera endotelial.

Regulacin de la respuesta inflamatoria

Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenmeno inflamatorio se encuentra estrechamente regulado, evitando, as una respuesta exagerada o perjudicial. Algunos de los mediadores que producen activacin, al variar su

concentracin o actuar sobre distintos receptores, van a producir inhibicin, consiguiendo, de esta forma, un equilibrio o modulacin de la respuesta inflamatoria. Los siguientes factores intervienen en esta regulacin: Histamina. Actuando sobre receptores H2, induce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de mediadores, inhibe la actividad del neutrfilo, inhibe la quimiotaxis y activa las clulas T supresoras. PGE. Produce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de mediadores y sobre los linfocitos una inhibicin de la proliferacin y diferenciacin. Agonistas autonmicos. El mastocito y basfilo parecen presentar receptores y -adrenrgicos y colinrgicos que sugieren que la liberacin de mediadores podra estar sometida a una regulacin autonmica. La activacin del receptor -adrenrgico produce una inhibicin, mientras que la activacin la -adrenrgico y -colinrgico inducen la estimulacin. Heparina. Inhibe la coagulacin y la activacin de los factores del complemento. Eosinfilo. Esta clula, atrada por el ECF-A, acude al foco inflamatorio donde libera una serie de enzimas que degradan determinados mediadores potenciadores de la inflamacin. La histaminasa acta sobre la histamina, la arilsulfatasa sobre los leucotrienos y la fosfolipasa sobre el PAF.

el frmaco bloquee una enzima o sustrato no presente en las clulas eucariotas humanas o suficientemente distintas. La mayora de los actan inhibiendo procesos metablicos vitales para las bacterias, relacionados con la sntesis de la pared, las protenas y los cidos nucleicos, o determinan la desestructuracin de las membranas lipdicas que las separan del entorno. Las cepas que se sometieron a prueba fueron: Staphylococcus epidermidis es una especie bacteriana del gnero Staphylococcus, consistente en cocos Gram-positivos arreglados en grupos. Es catalasa-positiva, termonucleasa-negativo aunque a veces varia, coagulasa-negativa; y se presenta frecuentemente en la piel de humanos y de animales y en membranas mucosas. Salmonella es un gnero de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi) ni esporas. Son bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa. No tienen metabolismo fermentativo. Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia 'koli/), tambin conocida por la abreviacin de su nombre, E. coli, es quizs el organismo procariota ms estudiado por el ser humano. Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Klebsiella pneumoniae es la especie de mayor relevancia clnica dentro del gnero bacteriano Klebsiella, compuesto por bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae, que desempean un importante papel como causa de las enfermedades infecciosas oportunistas.

Reparacin
Cuando las causas de la agresin han desaparecido o han sido eliminadas por la propia respuesta inflamatoria, se inician los procesos de reparacin. Estos procesos integran la llegada a la zona de fibroblastos que van a proliferar y sintetizar colgeno, proliferacin de clulas epiteliales y proliferacin de vasos dentro de la herida.

Clara de huevo como mecanismo de inflamacin en murinos

La albmina es una solucin viscosa (coloidal), que rodea a la yema y se encuentra contenida entre las membranas del cascarn. Sus constituyentes son 88% agua, 11% protenas, 1% carbohidratos y 0.5% minerales. Bsicamente se trata de una solucin de protenas globulares que contienen fibras de ovomucina (existen ms de treinta protenas diferentes). Son ricas en aminocidos esenciales. Esta tres glicoprotenas suma ms del 80% del total de protenas en la clara de huevo.

MATERIALES Y MTODOS Mtodo de extraccin con cloroformo: Se extrajeron 25g (aproximadamente), de ptalos de las flores frescas rnica montana amarilla, se colocaron en morteros con 225 ml de cloroformo (distribuida en los morteros) y se realiz un

rnica como antibacterial

Los antibiticos actan inhibiendo diversos procesos metablicos que son esenciales para la supervivencia de los microorganismos. La especificidad de accin depende de que

macerado de estos durante 15 min. Despus se agreg 100 ml de alcohol etlico 95 caliente (se deja reposar). Se filtra el lquido con un embudo de cristal y una gasa, para quitar el exceso de los ptalos y se descarta sta materia extra. El lquido se dej reposar 10 min. Para realizar la separacin de la fase oleosa, se tomaron 20 ml del lquido de la maceracin y se colocaron en un embudo de separacin para aadirle 10 ml de acetato de plomo (Pb (CH3COO)) al 4% como agente precipitante. (Fig. 2) Obteniendo 3 fases de esta extraccin. Las fases obtenidas se sometidas a esta prueba fitoqumica y fueron evaluadas para ver en cul de las tres fases se encontraba la mayor cantidad de lactonas sesquiterpenicas. De la fase extrada con acetato de plomo (fase 1) se somete a reflujo para una mayor separacin gracias a los residuos del solvente orgnico (cloroformo), durante 1 hora a 350C aproximadamente, utilizando una plancha de calentamiento (Fig. 3). Posteriormente se lleva a destilacin simple durante 30 minutos aproximadamente entre las temperaturas 57 y 69 C, para terminar de descartar el cloroformo y residuos de etanol y a su vez ayudar aislar mayormente el extracto. (Fig. 4) El extracto concentrado con aspecto oleoso se filtro al vaco con uso de un embudo bushner, para as obtener un polvo compacto fino con un peso total de 570 mg, como extracto final. (Figs. 5 y 6)

Fig. 4 Equipo de destilacin simple en posicin.

Fig. 5 Filtrado al vaco

Fig. 6 Polvo obtenido del filtrado

Marcha Fitoquimica: Reaccin colorida, prueba de Bajlet, utilizando dos soluciones que se mezclan en iguales volmenes antes de usarse. Para la solucin A: 100mg de cido pcrico en 10 ml de etanol; solucin B, 1 g en 10 ml de agua. (Fig.7) Para la prueba se pusieron alcuotas de 1 ml de las muestras sometidas (extractos y tintura) para dar positivo si: se obtena una coloracin anaranjada o roja, que para la mayora de las muestras sometidas dio positivo. (Fig. 8)

Fig.2

Mtodo de extraccin con cloroformo

Fig. 7 Solucin A y Solucin B respectivamente

Fig .3 Equipo en posicin de reflujo

Fig. 10 Preparado de rnica en gel Fig 8. De izquiera a derecha: blanco, positivo fase 1, positivo extracto final (polvo), positivo tintura

Tintura: Siendo una solucin alcohlica que se logra con una concentracin muy alta del principio activo de la planta, es precisamente por ser soluble en alcohol. Se elabor a partir de dejar macerar 10g de ptalos secos y triturada de rnica montana amarilla en 100 ml de etanol de 96. ste se deja en reposo durante 2 semanas como mnimo para su posterior uso, que de preferencia se utiliza diluido. (Fig.9)

Induccin de inflamacin en murinos: Tomando 2 ml de una solucin al 1% de albmina, se indujo a inflamacin en ambas piernas del ratn, para as determinar el dimetro de la lesin y determinar valores sin ningn tipo de intervencin antiinflamatoria; se llev a cabo a diferentes tiempos y con el uso de un vernier se obtuvieron los valores reportados en la Tabla 3. Para la segunda induccin de inflamacin, se procedi con el mismo volumen de albmina al 1%, pero con la diferencia de aplicar el preparado de rnica en gel y avaluar de esta manera su funcin antiinflamatoria, los datos obtenidos se reporta en la Tabla 4. As para finalmente contrastar la inflamacin sin y con el efecto antiinflamatorio de rnica en gel. Evaluacin del poder antibacterial de rnica tintura : Con la ayuda que se brind en el rea de microbiologa; se evalu cuatro diferentes bacterias que se han reportado la funcin antibactericida del rnica. Las cepas utilizadas fueron: Salmonella typhi, Escherichia coli, Staphylococcus

epidermidis, Klebsiella pneumoniae. La proliferacin se

Fig. 9 Tintura, forma de almacenamiento en frasco mbar para prevenir posible descomposicin.

llev a cabo en agar mtodos estndar, tubo en posicin pico de flauta, se incub 24 horas a 37C. Posteriormente se inocula en placas diferentes, con una anterior divisin en cuatro, en agar Mueller-Hinton, en cada divisin se coloc

Elaboracin del gel de rnica: Teniendo en cuenta el orden de adicin de los ingredientes para su preparacin se elaboro en un vaso de precipitado de 250 ml, aadiendo el principio activo, carbopol, trietanolamina, alcohol etlico y principalmente, glicerina, siendo este ingrediente el esencial para que el compuesto activo extrado se pueda incorporar en la mezcla para el gel. (Fig. 10)

un disco impregnado con la tintura a las diferentes concentraciones: concentrado, 1:10, 1:100 y 1:100. Se incub 24 horas a 37 y se realizaron las lecturas necesarias. ( Tabla 5) DISCUSIN Y RESULTADOS Del filtrado obtenido, se prepar un gel para ser aplicado en la rata una vez inducida la inflamacin, los valores obtenidos fueron los siguientes: (Tablas 3 y 4) Tabla 3. Referencia para determinar el porciento final de inflamacin SIN gel de rnica (Control) Tiempo (min) 5 10 15 20 Inflamacin (cm) 1.5 1.8 1.6 1.5 Porciento de inflamacin 83.33 % 100.0 % 88.88 % 83.33 %

25

1.5

83.33 %

respectivas cajas de petri con las bacterias utilizadas. (Tabla 5)

Bacteria inhibida

Tabla 4. Resultados de desinflamacin en porciento CON gel de rnica Tiempo (min) 0 10 25 30 Inflamacin (cm) 1.6 1.6 1.4 1.3 Porciento de inflamacin 88.88 % 88.88 % 77.77 % 72.22 %

Salmonel la typhi

Escherich ia coli

Dilucin sometida Concentra da 1:10 1:100 1:100

Staphylococ cus epidermidis

Klebsiella pneumoni ae

1 mm 1 mm 2 mm

1 mm

Grafico comparativo que muestra el notable efecto de rnica montana en gel con respecto a la inflamacin inducida sin tratar. (Grfico 1)

OBSERVACIONES CONCLUSIN

Porciento de inflamacin y desinflamacion tras el uso de rnica montana en gel

105 100
% de inflamacin

Actividad farmacolgica. Las preparaciones de las flores de rnica presentaron actividad analgsica e inmunomoduladora. Estas en preparaciones el tratamiento han de mostrado actividad

Inflamacin SIN Inflamacin CON

95 90 85 80 75 70 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo (min)

enfermedades inflamatorias postraumticas, siendo su accin antiiflamatoria (helenlina), analgsica, antiagregante plaquetaria (helenalina y la 11alfa, 13dihidrohelenalina), antihistamnica (extracto acuoso, in vitro), antieczematosa y antibacteriana. Actividad antibacteriana: Por su aplicacin en forma de compresas, enjuagues o gargarismos. Son importantes las pruebas microbianas que se realizaron para la tintura, marcha fitoquimica y la dosis correcta pro

Para la determinacin de rnica como antibacterial, se midi el halo de inhibicin para las diferentes diluciones y bable para su uso.