PenetapanPotensi Antibiotik

SecaraMikrobiologi
Marlia Singgih Wibowo
School of Pharmacy ITB
Mengapa antibiotik perlu ditentukan
kadar atau potensinya?
Efek penggunaan antimikroba
yang meningkat, sehingga
meningkatkan pula efek resistensi
berbagai mikroba patogen
Mikroba patogen dan virus baru :
HIV, Avian Flu Virus
Efektivitas daya hambat atau daya
bunuh antimikroba sangat
tergantung pada jumlah dan
kekuatan zat aktif nya
Pengertian kadar vs potensi
Kadar jumlah per satuan berat/volume
Potensi ukuran kekuatan /daya hambat
atau daya bunuh zat aktif terhadap
mikroorganisme tertentu
Mengapa harus dengan cara
mikrobiologi?
Respons mikroba terhadap antibiotik
berbeda-beda
Spesifik
Sensitif
Spektrum beberapa antibiotika
Skema analisis
patogen dan metode
analisis yang
digunakan
ELISA untuk analisis antigen
spesifik pada mikroba patogen
Uji senyawa antibiotik untuk
penentuan KHM antibiotik
terhadap mikroba suspect
Estimasi dari potensi antibiotik melalui
perbandingan langsung antara sampel
(antibiotik uji) dengan antibiotik standar
yang telah disahkan penggunaannya,
terkalibrasi dengan baik, dan umum
digunakan sebagai rujukan.
Prinsipuji potensi antibiotikberdasarkan
FarmakopeIndonesia edisi IV 1995
Tujuanuji
Sebagai standar untuk mengatasi
keraguan tentang kemungkinan
hilangnya aktivitas (potensi)
antibiotik terhadap efek daya
hambatnya pada mikroba.
Metode Umum
1. Lempeng (silinder /
kertas cakram)
2. Turbidimetri
(tabung)
Metode LempengSilinder
Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang
tegak lurus pada lapisan agar padat dalam
cawan petri atau lempeng yang berisi biakan
mikroba uji pada jumlah tertentu
Mikroba dihambat pertumbuhannya
Hambatan pertumbuhan biakan mikroba
dalam larutan serba sama antibiotik, dalam
media cair yang dapat menumbuhkan
mikroba dengan cepat bila tidak terdapat
antibiotik
Metode turbidimetri digunakan pada sampel
yang sulit larut dalam air, contoh: Gramisidin
Metode Turbidimetri
Persiapan uji
Mikroorganisme
Bahan
Alat
Cuci bersih sebelum dan sesudah digunakan
Sterilkan dengan pemanasan kering atau uap
air
Peralatan
Selama inkubasi dalam penetapan
pada lempeng dan tabung
Metode lempeng 0,5C
Metode turbidimetri 0,1C
suhu dapat diperoleh dengan sirkulasi
udara dan air.
PengendalianTermostatik
Wadah(1)
Metode Lempeng Silinder:
1. Cawan petri kaca atau plastik ukuran 20 x
100 mm
2. Silinder dari besi tahan karat atau porselen
diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm,
tinggi 10 mm
3. Bersihkan dengan asam nitrat 2 N bila perlu
Metode Turbidimetri:
1. Tabung reaksi kaca/plastik ukuran dan
ketebalan seragam
2. Tabung Spektrofotometer harus steril
dan sesuai
3. Semua residu dihilangkan serta selalu
sterilisasi sebelum dan sesudah
Wadah(2)
Media danLarutanDapar
Media Larutan Dapar
Media 1 pH 6,6
Media 2 pH 6,6
Media 3 pH 7,0
Media 5 pH 7,9
Media 8 pH 5,9
Media 9 pH 7,2
Media 10 pH 7,2
Media 11 pH 8,3
Media 13 pH 5,6
Media 19 pH 6,1
Media 32 pH 6,6
Media 34 pH 7,0
Media 35 pH 7,0
Media 36 pH 7,3
Media 39 pH 7,9
Dapar nomor 1 pH 6,0
Dapar nomor 3 pH 8,0
Dapar nomor 4 pH 4,5
Dapar nomor 10 pH 10,5
Dapar nomor 16 pH 7,0
Cat: untuk pelarut lain
Air murni
Formaldehide encer
Injeksi larutan NaCl
Unit dan
Baku Pembanding
Potensi Antibiotik
Adalah antibiotik dimana potensinya yang
dinyatakan dalam unit atau g aktivitas
antibiotik per mg zat kering telah ditetapkan
secara nasional (BPFI).
g aktivitas dianggap terdiri dari bahan
kimia tunggal
unit merupakan baku pembanding apabila
terdapat lebih dari satu bahan aktif antibiotik
dalam suatu obat antibiotik.
Definisi
Penyiapan Baku
Larutan persediaan: larutkan sejumlah atau
seluruh isi vial baku pembanding antibiotik
seperti pada tabel 1
Simpan dalam lemari pendingin dan gunakan
dalam waktu yang ditentukan
Pada hari penetapan, buat pengenceran dari
larutan persediaan (5), umumnya dengan
perbandingan 1 : 1,25 untuk lempeng
silinder atau lebih kecil pada turbidimetri
Ampisilin : buat enceran larutan baku
pembanding dan larutan uji secara bersamaan
Zink Basitrasin : tiap enceran larutan baku
harus mengandung asam klorida sejumlah
sama dengan larutan uji.
Secara umum pengeringan dilakukan pada
oven hampa udara 5 mmHg, 60C, selama 3
jam.
Ketentuan
Penyiapan Contoh
Buat larutan serta enceran larutan uji
sesuai dengan antibiotik pembanding.
Penetapan hanya membutuhkan 1 tingkat
dosis uji yang sesuai dengan dosis tengah
baku pembanding
Dosis uji (U) = Dosis S
3
Mikroba Uji dan Inokula
Mikroba Uji
Mikroba uji untuk masing-masing antibiotik
tertera pada Tabel 2, pelihara pada agar
miring dan inkubasikan sesuai dengan Tabel 3
Mikroba uji harus merupakan galur murni dan
dipindahkan setiap minggu.
Pada Klebsiella pneumoniae gunakan biakan
tidak berkapsul
Penyiapan Inokula
1. Inokulasikan biakan segar ke 250 ml media agar dalam
tabung Roux, sebarkan secara merata, inkubasikan
pada suhu dan waktu tertentu.
2. Larutkan biakan permukaan ke dalam 50 ml larutan
NaCl 0,9 % steril.
3. Atur perbandingan hingga inokula mempunyai
transmitans 25 % terhadap blangko.
4. Untuk penetapan turbidimetri, optimalkan hubungan
antara dosis dan respon.
5. Pada penetapan lempeng silinder, atur larutan suspensi
hingga menghasilkan batas daerah hambatan yang
memuaskan; yaitu 14 mm-16 mm
Cara Pengujian:
1. Desain penetapan
2. Metode lempeng silinder
3. Metode Turbidimetri
4. Cara perhitungan
DesainPenetapan(1)
Pada penetapan lempeng silinder,
perbandingan pokok dibatasi pada hubungan
pengukuran diameter hambatan antar
lempeng.
Pada penetapan turbidimetri, perbandingan
pokok dibatasi pada hubungan antara
kekeruhan yang diamati pada tiap rak.
Dianjurkan hanya menggunakan satu aras
dosis dengan suatu kurva baku dan
pengenceran larutan minimal 5 atau lebih
Penetapan potensi antibiotik secara
mikrobiologi dipengaruhi oleh variabel intra
dan antar penetapan.
Awali dengan penyiapan larutan baku dan uji
secara terpisah, dan ulangi pada hari yang
berbeda.
Jika hasil yang diperoleh berbeda signifikan,
lakukan satu atau lebih penetapan tambahan
DesainPenetapan(2)
MetodeTurbidimetri
1 ml larutan uji dan larutan baku tiap dosis pada 3 tabung reaksi;
buat triplo dan letakkan acak
Buat 2 tabung kontrol
Tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam tiap tabung
Letakkan tabung dalam tangas air atau inkubator pada suhu (36-
37,5)C; selama 2 jam
Setelah inkubasi tambahkan 0,5 ml larutan formaldehide encer
Ukur transmitans atau serapan pada 530 nm
MetodeTurbidimetri (2)
Pada desain penetapan 5 aras dosis:
1. Buat 20 sediaan uji yang sama dengan S
3
baku
2. Buat juga pengenceran S
3
lain sebagai rujukan uji
pertumbuhan
3. Tambahkan 1 ml larutan uji ke dalam 3 tabung
dan 1 ml pengencer bebas antibiotik ke dalam 6
tabung
4. Tambahkan 9,0 ml inokula
5. Inkubasi
6. Tambahkan 0,5 ml larutan formaldehide encer
7. Hitung transmitan atau serapan pada 530 nm
MetodeLempengSilinder
Pada cawan petri dibuat lapisan dasar yang licin
Tambahkan 4,0 ml lapisan inokula
Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan agar dalam radius 2,8 cm;
pada ketinggian 12 mm
Isi silinder selang seling dengan dosis tengah baku (S
3
); buat triplo
Inkubasikan pada suhu 32-35C selama 16-18 jam
Ukur diameter hambatan yang terbentuk pada agar
Desain pengujian
Dipilih berdasarkan hasil akhir yang diinginkan,
presisi tinggi atau tidak. Desain yang digunakan :
2+2 : yaitu satu baku pembanding dan satu sampel,
masing-masing dengan dua tingkat dosis yang
diperlakukan dalam satu lempeng (cawan) agar
3+3 : yaitu satu baku pembanding dan satu sampel,
masing-masing dengan tiga tingkat dosis yang
diperlakukan dalam satu lempeng (cawan) agar
5+1 : yaitu satu baku pembanding dengan 5 tingkat
dosis dan satu sampel dengan satu tingkat dosis
yang setara dengan dosis menengah (dosis acuan)
baku pembanding.
Desain Pengujian 3+3
Larutan baku pembanding : sejumlah tertentu
baku pembanding dilarutkan dalam pelarut
yang sesuai sedemikian sehingga diperoleh
larutan induk yg setara dgn 1000 IU/mL.
Pengenceran dibuat sehingga diperoleh
larutan baku dosis rendah, dosis menengah
dan dosis tinggi dengan pebandingan yang
relatif sama, misalnya 1:2, 2:3 atau 3:4
Larutan uji : ditimbang sejumlah
tertentu sampel, dilarutkan dalam
pelarut yang sesuai sehingga diperoleh
larutan sampel induk yg setara dengan
1000 IU/mL.
Pengenceran dilakukan dengan dosis
yang kira-kira sama dengan larutan
baku pembanding.
Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam
selinder atau serapkan pada kertas cakram
sebanyak 100 L di atas media agar yang
telah diinokulasikan mikroba uji.
Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada
35-37 C selama 18-24 jam.
Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang
terbentuk diukur garis tengahnya.
Dosis baku
Dosis sampel
Desain pengujian 5+1
Larutan baku pembanding yang dibuat
sama dengan desain 3+3, hanya dibuat
pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5
dengan tingkat perbandingan 1,25.
Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya
10 IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL,
S1=6,4 IU/mL, S4=12,5 IU/mL dan
S5=15,6 IU/mL
Larutan uji/sampel dibuat larutan induk dan
pengenceran yang sama dengan larutan baku
pembanding.
Larutan S3 (pembanding dosis tengah)
selanjutnya selalu ditempatkan pada setiap
media agar yg digunakan, dan ke dalam
selinder pencadang atau kertas cakram yg
digunakan dimasukkan 100 L larutan
pembanding lainnya (S1, S2, S4, S5) dan
larutan uji (U) , masing-masing triplo.
Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam
selinder atau serapkan pada kertas cakram
sebanyak 100 L di atas media agar yang
telah diinokulasikan mikroba uji.
Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada
35-37 C selama 18-24 jam.
Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang
terbentuk diukur garis tengahnya.
Pola letak uji pada desain (5+1)
Dosis S3
Dosis lainnya
S3
S1
S3
S2
S3
S4
S3
S5
S3
U
Cara Perhitungan
Desain pengujian (3+3)
Cara perhitungan dengan desain 3+3
terdapat pada Farmakope Indonesia
edisi III, tahun 1979
Analisis meliputi : analisis variansi,
perhitungan potensi dan batas
keyakinan potensi hasil penetapan
Desain pengujian (5+1)
Sebelum menghitung potensi ,
dilakukan terlebih dahulu koreksi garis
tengah rata-rata diameter daerah
hambat dosis larutan baku S1, S2, S4
dan S5
Cara :
Hitung diameter rata-rata S3 di semua
cawan (Y
3T
)
Hitung diameter rata-rata S3 pada
masing-masing cawan larutan baku
S1,2,4 dan 5 (Y
31
, Y
32
, Y
34
dan Y
35
)
Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y
1
, Y
2
, Y
4
dan Y
5
)
Maka diameter koreksi masing-masing
larutan baku adalah :
S1 (a) = Y
1
+ (Y
3T
Y
31
)
S2 (b) = Y
2
+ (Y
3T
Y
32
)
S3 (c) = Y
3T
S4 (d) = Y
4
+ (Y
3T
Y
34
)
S5 (e) = Y
5
+ (Y
3T
Y
35
)
Untuk kurva baku, dihitung diameter
dosis terendah dan tertinggi yaitu :
YT =
(3e + 2d + c a )
5
YR =
(3a + 2b + c e )
5
YR = diameter hambat
dosis terendah
YT = diameter hambat
dosis tertinggi
Selanjutnya dibuat kurva baku pada
kertas semilog :
Sumbu X : log dosis
Sumbu Y : diameter hambat
Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR)
sampai S5 (YT)
Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji,
dilakukan koreksi diameter larutan sampel U:
Y
U
koreksi = Y
S
+ (Y
U
Y
3U
)
Y
3U
= diameter rata-rata S
3
pada pengujian
larutan U
Y
U
= diameter rata-rata U pada cawan
larutan U
Y
S
= Hasil interpolasi S
3
pada kurva baku
Cara Perhitunganpotensi sampel
Perhitungan Potensi sampel
Potensi sediaan uji ditentukan dengan
menginterpolasi Y
U
pada sumbu Y ke garis
kurva baku dan tarik garis ke sumbu X
(diperoleh X
U
)
Dosis U = X
U
/S3 x dosis S3
Potensi U = dosis U x faktor pengenceran
Cara Perhitungan(1)
Potensi antibiotik dihitung dengan
menggunakan metode garis lurus
transformasi log dengan penyesuaian
kuadrat terkecil dan uji linearitas.
Apabila dilakukan lebih dari satu penetapan
potensi dari bahan uji yang sama; maka
dapat dirata-ratakan.
Diameter daerahhambat
Pencadang