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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS

FACULDADE DE FARMCIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS




ALINE DE OLIVEIRA ROBERTH





Emprego de tcnicas farmacognsticas e eletroanaltica na
identificao de produtos comerciais base de Morinda citrifolia L.
(Noni).










Goinia
2013


ALINE DE OLIVEIRA ROBERTH







Emprego de tcnicas farmacognsticas e eletroanaltica na identificao de
produtos comerciais base de Morinda citrifolia L. (Noni).















Orientador: Prof. Dr. Eric de Souza Gil
Co-orientadora: Profa. Dra. Marize Campos Valadares Bozinis












Goinia
2013
Dissertao apresentada Faculdade de
Farmcia da Universidade Federal de
Gois para obteno do ttulo de Mestre
em Cincias Farmacuticas.































DEDICATRIA

Ao meu esposo, com amor, admirao e gratido por sua compreenso, carinho,
presena e incansvel apoio ao longo do perodo de elaborao deste trabalho.

























AGRADECIMENTOS

Ao orientador e amigo, Prof Dr. Eric Gil, por todo o apoio e dedicao
incondicional, por todos os momentos, bons e ruins, que foram essenciais para meu
crescimento cientfico. Enfim, minha eterna gratido!

Ao meu marido, amigo e companheiro Marcelo Roberth por todo amor,
carinho e principalmente compreenso, por acreditar em mim e estar sempre ao meu
lado. A conquista desta etapa nossa.

A Prof Dra. Maria Teresa pela disponibilidade, ajuda e pela credibilidade em
meu projeto e, principalmente por participar desta banca.

Ao Prof. Dr. Paulo Ghedini pela ateno, receptividade e, principalmente por
participar desta banca.

Aos colegas Fernando Lino e Leandra Almeida pelo conhecimento
compartilhado e colaborao na realizao de alguns experimentos.

Aos meus pais, irmos e toda minha famlia por acreditar e apoiar mais essa
etapa profissional.

Fernanda Bellato, secretria do programa, pela disponibilidade em nos
atender e ajudar a solucionar as formalidades, sempre com muita alegria e gentileza.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.


































Se o dinheiro for a sua esperana de
independncia, voc jamais a ter. A nica
segurana verdadeira consiste numa
reserva de sabedoria, experincia e
competncia. (Henry Ford)

RESUMO

O Noni (Morinda citrifolia L.) uma planta nativa do sudeste da sia e da Austrlia e
cultivada na Polinsia, ndia, Caribe, Amrica do Norte, Central, e do Sul e, seu
consumo seja da fruta in natura, suco e extrato seco, bem como outros produtos
derivados vm crescendo mundialmente. O Noni foi aprovado para comercializao
pela Unio Europia, mas em contrapartida, no ano de 2007, a Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria (ANVISA) proibiu o uso e comercializao do Noni para fins
medicinais, alegando insuficincia nos estudos comprobatrios de seus benefcios.
O consumo popular dos produtos derivados do Noni est associado a uma
miscelnea de benefcios teraputicos que esto intimamente vinculados
abundncia de compostos fenlicos fitoantioxidantes em seus extratos, tais como
flavonides, cidos fenlicos, cumarinas e hidroxiantraquinonas. Neste trabalho,
amostras comerciais base de fruto de Noni (fruto maduro, fruto desidratado, extrato
seco, extrato lquido auriana, extrato lquido comercial, cpsula 1, 2 e 3) adquiridas
no comrcio de Goinia, foram submetidas ensaios de identificao
farmacognstica, anlises cromatogrficas (CCD e CLAE) e voltamtrica (VPD) a fim
de identificar os metablitos secundrios e marcadores majoritrios presentes nos
fruto de Noni, bem como o perfil eletroqumico. Nos ensaios de identificao de
metablitos secundrios, foram detectados cumarinas e flavonides, e nos ensaios
cromatogrficos detectados os marcadores majoritrios, escopoletina e rutina, nas
amostras fruto maduro, fruto desidratado, extrato lquido auriana, cpsula 1 e
cpsula 2. No ensaio voltamtrico de VPD os resultados foram comparados aos
cromatogrficos e apresentaram-se semelhantes na identificao de produtos base
de Noni e na deteco do marcador escopoletina, podendo ser uma tcnica til para
fins de identificao. A amostra fruto maduro foi denominada de amostra autntica,
as amostras fruto desidratado, extrato lquido auriana, cpsula 1 e cpsula 2 foram
amostras comprovadamente obtidas partir de fruto de Noni. Porm, as amostras
extrato seco e extrato lquido comercial no foram amostras produzidas a partir de
fruto de Noni, logo amostras falsificadas. Por fim, este trabalho pde identificar
atravs dos mtodos propostos que 62,5% das amostras foram obtidas a partir de
fruto de Noni e 37,5% foram amostras falsificadas, cabendo uma maior fiscalizao
das autoridades sanitrias quanto a comercializao de produtos fitoterpicos
falsificados, tanto no comrcio popular quanto por distribuidores de insumos
farmacuticos com situao regular.

Palavras-chave: Noni, planta medicinal, controle de qualidade, identificao, mtodo
voltamtrico.







ABSTRACT

Noni (Morinda citrifolia L.) is from Southeast Asia and Australia and grown in
Polynesia, India, the Caribbean, North, Central, and South America, and its
consumption is fresh fruit, juice, dry extract and other products are growing
worldwide. Noni has been approved for marketing by the European Union, but, on
the other hand, in 2007, ANVISA has banned the use and marketing of Noni for
medicinal purposes, claiming insufficiency studies that supports its benefits. The
popular consumption of products derived from Noni is associated with some
therapeutic benefits that are closely linked to the abundance of phenolic compounds
in their fitoantioxidants extracts such as flavonoids, phenolic acids, coumarins and
hidroxiantraquinonas. In this paper, commercial samples of Noni fruit (ripe fruit, dried
fruit, dried extract, auriana liquid extract, commercial liquid extract, capsule 1, 2 and
3) acquired from different market in Goinia, underwent pharmacognostic
identification test, analysis by chromatographic (TLC and HPLC) and voltammetric
(DPV) to identify the secondary metabolites and the majority markers present in Noni
fruit, as well as electrochemical profile. In identification test of secondary metabolites
were detected coumarins and flavonoids, and chromatographic assays detected the
majority markers, scopoletin and rutin, in samples of ripe fruit, dried fruit, auriana
liquid extract, capsule 1 and capsule 2. In voltammetric assay by VPD results were
compared to the chromatogram and shown similar in the identification of products
with Noni and detecting the marker scopoletin, and may be a useful technique for
identification purposes. The sample ripe fruit was called authentic sample, samples
dried fruit, auriana liquid extract, capsule 1 and capsule 2 are samples proven
obtained from the Noni fruit. However, the samples dried extract and commercial
liquid extract are not samples made from Noni fruit, thus fake samples. Finally, this
study could identify by proposed methods that 62,5% of the samples were obtained
from the fruit of Noni and 37,5% of samples were fake, being greater control by
health authorities about sale of fake herbal products, at commercially popular or by
pharmaceutical distributor with regular situation.

Keywords: Noni, herb, quality control, identification, voltammetric method.










LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Empresa multinacional americana da Tahitian

(A), Loja em Oslo (B),


mostrurio de produtos obtidos a partir de extratos de Noni (C e D)...........................3

Figura 2 - Venda do fruto de Noni (A) e produtos derivados (B e C) no Mercado
Central de Goinia........................................................................................................4

Figura 3 - Folhas, flores e fruto do Noni (A), rvore (B) e Sementes (C)....................6

Figura 4 - Extrato de Noni em diversas formas comerciais disponveis no Mercado
Central de Goinia........................................................................................................7

Figura 5 - Estrutura Qumica do Damnacanthal........................................................18

Figura 6 - Estrutura Qumica da Rutina.....................................................................18

Figura 7 - Estrutura Qumica do cido Deacetilasperulosdico.................................19

Figura 8 - Estrutura Qumica da Escopolatina...........................................................19

Figura 9 - Amostra autntica do fruto do Noni (1) e amostras comerciais: (2) fruto
desidratado, (3) extrato seco, (4) extrato lquido auriana, (5) extrato lquido
comercial, (6) cpsula 1, (7) cpsula 2 e (8) cpsula 3..............................................29

Figura 10 - Placa cromatogrfica de CCD na pesquisa de escopoletina nas amostras
de fruto de Noni. Amostras: Escopoletina (Padro), fruto maduro (1), fruto
desidratado (2), extrato seco (3), extrato lquido auriana (4), extrato lquido comercial
(5), cpsula 1 (6), cpsula 2 (7), cpsula 3 (8)...........................................................41

Figura 11 - Placa cromatogrfica de CCD na pesquisa de rutina nas amostras de
fruto de Noni. Amostras: Rutina (Padro), fruto maduro (1), fruto desidratado (2),
extrato seco (3), extrato lquido auriana (4), extrato lquido comercial (5), cpsula
1(6), cpsula 2 (7) e cpsula 3 (8)..............................................................................42

Figura 12 - Placa cromatogrfica de CCD na pesquisa de cido
deacetilasperulosdico nas amostras de fruto de Noni. Amostras: Extrato seco (1),
cpsula 1 (2), cpsula 2 (3), cpsula 3 (4), fruto desidratado (5), fruto fresco (6),
extrato lquido auriana (7) e extrato lquido comercial (8)..........................................43

Figura 13 - Cromatograma da fase mvel acetonitrila:metanol:gua acidificada
utilizada na anlise dos padres e amostras, mostrando que no interferiu no
mtodo....................................................................................................................... 43

Figura 14 - A: Cromatograma do padro da escopoletina (Tr = 9,782 min). B:
Cromatograma do padro da rutina (Tr = 12,421 min). C: Espectro de absoro no
UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm para padro da escopoletina. D:
Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 255,9 e 354,8 nm para

padro da rutina. Deteco no UV com comprimento de onda em 350 nm. Outras
condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de material e
mtodos..................................................................................................................... 45

Figura 15 - A: Cromatograma da amostra do fruto maduro com presena dos picos
para os marcadores da escopoletina (Tr = 9,812 min) e da rutina (Tr = 12,513 min).
B: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm
para escopoletina. C: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de
255,9 e 354,8 nm para rutina. Deteco no UV com comprimento de onda em 350
nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de
material e mtodos.....................................................................................................46

Figura 16 - A: Cromatograma da amostra do fruto desidratado com presena dos
picos para os marcadores da escopoletina (Tr = 9,748 min) e da rutina (Tr = 12,427
min). B: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0
nm para escopoletina. C: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de
255,9 e 354,8 nm para rutina. Deteco no UV com comprimento de onda em 350
nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de
material e mtodos.....................................................................................................47

Figura 17 - A: Cromatograma da amostra da cpsula 1 com presena dos picos para
os marcadores da escopoletina (Tr = 9,742 min) e da rutina (Tr = 12,442 min). B:
Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm para
escopoletina. C: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 255,9 e
354,8 nm para rutina. Deteco no UV com comprimento de onda em 350 nm.
Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de material
e mtodos...................................................................................................................48

Figura 18 - A: Cromatograma da amostra da cpsula 2 com presena dos picos para
os marcadores da escopoletina (Tr = 9,743 min) e da rutina (Tr = 12,469 min). B:
Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 231,1 e 344,0 nm para
escopoletina. C: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de 255,9 e
356,0 nm para rutina. Deteco no UV com comprimento de onda em 350 nm.
Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de material
e mtodos...................................................................................................................49

Figura 19 - A: Cromatograma da amostra do extrato lquido auriana com presena
de um nico pico para o marcador escopoletina (Tr = 9,805 min). B: Espectro de
absoro no UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm para escopoletina.
Deteco no UV com comprimento de onda em 350 nm. Outras condies
experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de material e
mtodos......................................................................................................................50

Figura 20 - A: Cromatograma da amostra do extrato seco com presena de dois
picos, prximos aos padres, com Tr = 9,358 e 10,793 min. B: Cromatograma da
amostra do extrato lquido comercial com presena de um pico prximo aos padres
com Tr = 11,589 min. C: Cromatograma da amostra da cpsula 3 com presena de
um pico prximo aos padres com Tr = 9,715 min. Deteco no UV com
comprimento de onda em 350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas
no item 4.3.4 na seo de material e mtodos...........................................................52


Figura 21 Espectro de absoro no UV da amostra cpsula 3 com mximos de
absoro de 231,1 e 327,3 nm para o pico com Tr de 9,715 min. Deteco no UV
com comprimento de onda em 350 nm. Outras condies experimentais esto
detalhadas no item 4.3.4 na seo de material e
mtodos..................................................................................................................... 52

Figura 22 Cromatoplaca na anlise de escopoletina raspadas para compor os
EPCs aps eluio em fase mvel composta por diclorometano. Amostras:
Escopoletina (Padro), fruto maduro (1), fruto desidratado (2), extrato seco (3),
extrato lquido auriana (4), extrato lquido comercial (5), cpsula 1 (6), cpsula 2 (7),
cpsula 3 (8).............................................................................................................. 55

Figura 23 - Voltamogramas de Pulso Diferencial obtidos em Tampo Fosfato 0.1 M,
pH 7.0 para eletrodos de pasta de carbono modificados com 250 L das amostras (-
- -) extrato seco; () extrato lquido auriana; (--) fruto maduro; (--) fruto
desidratado; () extrato lquido comercial. Amplitude de Pulso 50 mV, velocidade
de varredura 10 mV s
-1
...............................................................................................55

Figura 24 - Voltamogramas de Pulso Diferencial obtidos em Tampo Fosfato 0.1 M,
pH 7.0 para eletrodos de pasta de carbono modificados com 250 L das amostras
() cpsula 1; (--) cpsula 2; () cpsula 3. Amplitude de Pulso 50 mV, velocidade
de varredura 10 mV s
-1
...............................................................................................57

Figura 25 Voltamogramas de Pulso Diferencial obtidos em Tampo Fosfato 0.1 M,
pH 7.0 para eletrodos de pasta de carbono modificados com manchas raspadas da
cromatoplaca para pesquisa de escopoletina das amostras fruto maduro (FRE), fruto
desidratado (DES), cpsula 1 (CAP1) e cpsula 2 (CAP2) contendo escopoletina, do
padro (PAD) e do branco (SIL) contendo silica+fase mvel. Amplitude de Pulso 50
mV, velocidade de varredura 10 mV s
-1
.....................................................................58















LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Benefcios observados em pessoas que ingeriram suco de fruto de Noni
durante 2 anos de acompanhamento clnico................................................................8

Quadro 2 - Compostos Qumicos isolados das folhas, fruto e raiz do Noni atravs de
tcnicas cromatogrficas............................................................................................14

Quadro 3 Pesquisa qualitativa de flavonides, relacionados ao ncleo
fundamental, nas amostras autntica e comerciais de fruto de Noni.........................38

Quadro 4 - Pesquisa qualitativa de flavonides, relacionados s hidroxilas fenlicas,
nas amostras autntica e comerciais de fruto de Noni...............................................39

Quadro 5 Volumes (L) em que as amostras analisadas reduziram a concentrao
do radical DPPH em 50%, sendo expressos em CE
50
...............................................60































LISTA DE ABREVIAES E SIGLAS

AA% - Porcentagem de Atividade Antioxidante

Abs Absorbncia

AINES Antiinflamatrio no-esteroidal

ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

AVC Acidente Vascular Cerebral

CE
50
Concentrao Eficiente

CI
50
Concentrao Inibitria

CB Receptores Canabinides

CCD Cromatografia de Camada Delgada

CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

CG Cromatografia Gasosa

DRGE Doena do Refluxo Gastroesofgico

DPPH 2,2-difenil-1-picrilidrazila

E
pa
Potencial de Pico Andico

E
pc
Potencial de Pico Catdico

EAG Equivalentes de cido Glico

FT Fenis Totais

Fr Fator de Reteno

HDL Lipoprotena de Alta Densidade
i.e. isto

I
pa
Corrente de Pico Andico

I
pc
Corrente de Pico Catdico

IL-4 Interleucina 4

IFN- - Interferon


INCA Instituto Nacional do Cncer

LDL Lipoprotena de Baixa Densidade

PA Para Anlise

p56
lck
Tirosina Quinase

RE Resoluo Especfica

RLs Radicais Livres

RSV Rat Sarcoma Virus

SR Soluo Reagente

Tr Tempo de Reteno

UV Ultra-Violeta

VC Voltametria Cclica

VPD Voltametria de Pulso Diferencial

VOQ Voltametria de Onda Quadrada

V velocidade de varredura

V

- raiz quadrada da velocidade de varredura
















SUMRIO

1. INTRODUO ........................................................................................................ 1
2. FUNDAMENTAO TERICA .............................................................................. 6
2.1 Noni ...................................................................................................................... 6
2.2 Aspectos Farmacolgicos .................................................................................... 7
2.2.1 Modulador do Sistema Imunolgico ................................................................... 9
2.2.2 Cncer ................................................................................................................ 9
2.2.3 Efeito Antidislipidmico..................................................................................... 11
2.2.4 Doenas Gastrointestinais ................................................................................ 11
2.2.5 Isquemia Cerebral ............................................................................................ 13
2.3 Aspectos Qumicos ............................................................................................. 14
2.4 Controle de Qualidade de Produtos Naturais ...................................................... 20
2.4.1 Mtodos Convencionais ................................................................................... 21
2.4.1.1 Mtodos Cromatogrficos ............................................................................. 21
2.4.1.2 Mtodos Colorimtricos ................................................................................. 22
2.4.1.2.1 Mtodos para Avaliao da Capacidade Antioxidante ............................... 23
2.4.2 Mtodos Eletroanalticos .................................................................................. 24
2.4.3 Outros Mtodos Instrumentais Aplicveis ....................................................... 25
2.4.4 Eletroanlise em Produtos Naturais ................................................................ 25
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 28
3.1 Objetivos Gerais .................................................................................................. 28
3.2 Objetivos Especficos .......................................................................................... 28
4. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 29
4.1 Amostras ............................................................................................................. 29
4.2 Padres e Reagente ........................................................................................... 30
4.3 Preparo das Amostras e Mtodos ....................................................................... 30
4.3.1 Identificao Morfolgica do Fruto ................................................................... 30
4.3.2 Ensaios de Identificao ................................................................................... 30
4.3.3 Cromatografia em Camada Delgada ................................................................ 32
4.3.4 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.......................................................... 33
4.3.5 Voltametria de Pulso Diferencial em estado slido ......................................... 34
4.3.6 Atividade Antioxidante ...................................................................................... 35
5. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 37

5.1 Identificao Morfolgica do Fruto ...................................................................... 37
5.2 Ensaios de Identificao...................................................................................... 37
5.3 Cromatografia em Camada Delgada ................................................................... 41
5.4 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia............................................................. 43
5.5 Voltametria de Pulso Diferencial em estado slido ............................................. 54
5.6 Avaliao Espectrofotomtrica da Atividade Antioxidante ................................... 59
6. CONCLUSES ..................................................................................................... 62
7. REFERNCIAS ..................................................................................................... 64
8. ANEXO.................................................................................................................. 76
























1

1. INTRODUO

As clulas so expostas diariamente a fatores extrnsecos, i.e., agentes
poluidores, radiaes ionizantes, tabagismo, estresse do dia-a-dia, maus hbitos
alimentares e intrnsecos, i.e., respirao mitocondrial, os quais em conjunto
desencadeiam um processo de stress oxidativo, ameaando o equilbrio fisiolgico
(CHEVION et al., 2000). Esse equilbrio vincula-se intimamente ao balano oxidativo,
que alcanado atravs de uma srie de reaes de oxirreduo, fundamentais
para a sobrevivncia das clulas. Por sua vez, o equilbrio das reaes redox,
interdependentes cintica e termodinamicamente, quando perturbado se manifesta
pela produo excessiva de radicais livres (BAE et al, 1999; LARSON, 1997).
Os radicais livres (RLs) so espcies produzidas durante os processos
metablicos, que embora desempenhem funes importantes, i.e., produo de
energia, fagocitose, regulao do crescimento, sinalizao intercelular, sntese e
substncias biolgicas, mediadores para transferncia de eltrons nas reaes
bioqumicas, podem, em virtude da sua alta instabilidade, provocar danos ao DNA,
protenas, organelas citoplasmticas, provocando alteraes estruturais e funcionais
das clulas, desencadeando assim, diversas patologias, a exemplo do cncer,
envelhecimento precoce, doenas cardiovasculares, degenerativas e neurolgicas,
entre outras (BAE et al., 1999; HALLIWELL; GUTTERIDGE; CROSS, 1992; SHAMI;
MOREIRA, 2004).
O balano oxidativo assegurado fisiologicamente por um sofisticado sistema
antioxidante capaz de converter os RLs em formas mais estveis. Este sistema de
defesa antioxidante composto por elementos biomacromoleculares, capazes de
inibir ou retardar a produo de RLs, tais como enzimas, i.e., superxido dismutase,
catalases, peroxidases; bem como biomolculas redutoras de baixo peso molecular,
i.e., vitamina A, C e E; glutationa entre outras biomolculas redutoras (ALVES et al.,
2010).
Apesar deste sofisticado sistema antioxidante, a capacidade endgena de
combate aos RLs limitada, devido aos supramencionados fatores extrnsecos.
Assim, os RLs acumulam-se no organismo, desencadeando vrios processos
degenerativos, entre os quais, o desenvolvimento de tumores malignos (ALVES et
al., 2010; RIVERA et al., 2012). Um tumor maligno ou cncer um dos processos
2

degenerativos de maior repercusso devido a baixa possibilidade de cura e sua alta
taxa de mortalidade. Segundo dados do Instituto Nacional do Cncer (INCA), entre
2001 e 2010, o nmero de bitos entre homens e mulheres foi de 787.920 e
672.157, respectivamente; e as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam a
ocorrncia de aproximadamente 518.510 novos casos de cncer (BRASIL, 2012).
Deste modo, o consumo de fontes exgenas de antioxidantes so essenciais
para o combate ao excesso de radicais livres, garantindo assim a homeostase do
balano oxidativo fisiolgico e a preveno de danos degenerativos da gravidade do
cncer. Assim, a busca por novos produtos que visem prevenir ou combater o
cncer cada dia mais presente nos laboratrios de pesquisas, principalmente os de
origem natural (RAMALHO; JORGE, 2006). Ressalta-se que vrios frmacos de
origem natural j fazem parte do arsenal teraputico para o tratamento do cncer, a
exemplo da vincristina, vimblatina, taxol. Outrossim, a busca por novos produtos
naturais no se limita ao tratamento, mas est voltada tambm para o campo da
preveno. Tal fato, se justifica pela abundncia de metablitos secundrios
biologicamente ativos, com ao antioxidante (ALMEIDA et. al., 2005; RIVERA et.
al., 2012).
Neste contexto, inserem-se os produtos naturais obtidos a partir do extrato da
Morinda citrifolia L., conhecida popularmente como Noni. Trata-se de uma planta
nativa do sudeste da sia e da Austrlia e cultivada na Polinsia, ndia, Caribe,
Amrica do Norte, Central, e do Sul (DIXON; MCMILLEN; ETKIN, 1999; ROSS,
2001). O consumo seja da fruta in natura, suco ou extrato seco, bem como outros
produtos derivados, vem crescendo mundialmente (ROGERS et al., 2010). Outra
evidncia que ilustra a grande repercusso e importncia de produtos a base de
Noni, so os produtos da marca americana Tahitian

, e a disseminao de suas
lojas pelo mundo (Figura 1).




3


Figura 1 - Empresa multinacional americana da Tahitian

(A), Loja em Oslo (B), mostrurio de


produtos obtidos a partir de extratos de Noni (C e D).

O Noni foi aprovado pela Unio Europia como um ingrediente alimentar para
ser comercializado como bebida de fruta pasteurizada e, desde essa aprovao,
diferentes fontes de Noni tm sido aprovadas para venda na comunidade europia,
por serem substncias equivalentes. Mais de 40 produtos contendo noni j esto
recebendo concesses para comercilizao (EUROPEAN COMMISSION, 2003;
EUROPEAN COMMISSION, 2010). Em contrapartida, no ano de 2007, a Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) proibiu o uso e comercializao do Noni
para fins medicinais, alegando insuficincia nos estudos comprobatrios de seus
benefcios (BRASIL, 2007). Porm, o consumo teraputico de Noni e seus produtos
derivados em medicina popular tem sido crescente e o comrcio indiscriminado
uma realidade bastante difundida em vrias cidades brasileiras, incluindo Goinia-
GO (Figura 2).
4


Figura 2 - Venda do fruto de Noni (A) e produtos derivados (B e C) no Mercado Central de Goinia.

Ressalta-se que embora o consumo popular dos produtos derivados do Noni
seja associado a uma miscelnea de benefcios teraputicos, i.e., problemas renais,
cardiovasculares, diabetes e at desempenho sexual, sua principal indicao volta-
se preveno do cncer (ANEKPANKUL et al., 2007; SOLOMON, 1999; WANG;
SU, 2001). Por sua vez, a preveno est intimamente ligada a manuteno do
balano oxidativo, ou seja, ao combate dos radicais livres. Dentre os benefcios
teraputicos de extratos de Noni associados ao combate aos radicais livres, j bem
estabelecidos pela cincia esto: ao antimutagnica, anti-carcinognica, inibio
da oxidao das protenas de baixa densidade, atividade antiinflamatria,
estimulao do sistema imune, regulao da funo celular e dos nveis de
colesterol (FURUSAWA et al., 2003; HIRAZUMI; FURUSAWA, 1999; HORNICK et
al., 2003; KAMIYA et al., 2004; SALUDES et al., 2002; ZIN et.al., 2006; WANG et al.,
2002; YAMAGUCHI et al., 2002).
Tais benefcios vinculam-se a abundncia de compostos fenlicos
fitoantioxidantes em seus extratos, tais como flavonides, cidos fenlicos,
cumarinas e hidroxiantraquinonas (CHAN-BLANCO et al., 2006; PAWLUS;
KINGHORN, 2007). Destacam-se neste contexto, a escopolatina, uma cumarina tida
como biomarcador comumente encontrada em suas folhas e frutos, e o
damnantacal, uma hidroxiantraquinona extrada da raiz (ANEKPANKUL, et al., 2007;
A B
C
5

IKEDA et al., 2009). Em se tratando de fenis, as cumarinas e antraquinonas
apresentam capacidade de doar prton e eltron exercendo portanto, papel redutor
de radicais livres, importante para preveno do cncer (AOKI; PARENT; ZHANG,
2000; FALTYNEK et al., 1995).





































6

2. FUNDAMENTAO TERICA

2.1 NONI
O Noni uma dicotilednea do reino plantae, diviso das Magnoliophyta,
classe Equisetopsida, subclasse Magnoliidae, superordem Asteranae, ordem das
gentianales, famlia das Rubiaceae, gnero Morinda L., espcie M. citrifolia e nome
cientfico Morinda citrifolia L. (Linnaeus, 1753). uma rvore pequena, medindo de 3
a 10 metros de altura na maturidade, com grandes folhas elpticas; flores
perfumadas, ovides e globulosas com colorao branca e amarela; os frutos esto
dispostos em ns ao longo dos ramos; os caules so finos e raiz pivotante com
outras secundrias. Quanto aos frutos e sementes h muita variao de tamanho,
morfologia, sabor, odor de frutos maduros e nmero de sementes por fruto, pois so
aspectos diretamente relacionados s condies de cultivo. No geral, o fruto
compacto, suculento, de formato ovoide, macio e ftido quando maduro. As semente
so em formato de disco com colorao marrom (Figura 3) (DIXON; MCMILLEN;
ETKIN, 1999; ELKINS, 1998; MCCLATHEY, 2002; MORTON, 1992; SMITH, 1988).

Figura 3 - Folhas, flores e fruto do Noni (A), rvore (B) e Sementes (C)

O Noni tem sua origem no Sudeste Asitico, encontrando-se disperso da ndia
at as Ilhas do Pacfico, Polinsia Francesa, Indonsia, Austrlia, Amrica Central,
Sul e Norte, ndias Ocidentais, Caribe e frica, tendo assim uma distribuio
pantropical. Sua disperso ocorreu atravs de viajantes colonizadores, por animais e
pssaros originrios das Ilhas do Pacfico (MC CLATHEY, 2002; SMITH, 1988).
O Noni uma das fontes tradicionais de medicamentos mais significativas
entre as sociedades das Ilhas do Pacfico, adaptando-se muito bem a diversos
7

ambientes, i.e., solos infrteis, cidos, alcalinos, ambientes muito secos, em
condies salinas, ambientes inundados, expostos ao vento e vulcnicos (NELSON,
2003; SOLOMON, 1999).
A disseminao do Noni pela medicina popular despertou o interesse de vrias
indstrias que desenvolveram produtos a partir dos seus extratos com diversas
finalidades, medicinais e cosmticas. Estes produtos podem ser adquiridos em
diversos centros comerciais espalhados por todo mundo nas mais variadas formas,
i.e., cpsulas, suco, chs, shampoo, condicionador, mscara capilar e facial, creme
sem enxgue, fruto desidratado, polpa, entre outros (Figura 4).

Figura 4 - Extrato de Noni em diversas formas comerciais disponveis no Mercado Central de
Goinia.

Neste contexto, os beneficos farmacolgicos do Noni, para o tratamento e
preveno de vrias doenas, dentre elas cncer, isquemia cerebral, doenas
gastrointestinais, cardiovasculares, imunolgicas, diabetes, doenas metablicas
esto sendo elucidados por diversos pesquisadores de todo o mundo (CHAN-
BLANCO et. al., 2006; POTTERAT; HAMBURGER, 2007).

2.2 ASPECTOS FARMACOLGICOS
Os benefcios farmacolgicos foram descritos no livro Noni O Fruto Tropical
de 101 Aplicaes Medicinais aps 2 anos de experincias clnicas realizadas com
dez mil pacientes, em que cerca de 78% se beneficiaram de alguma forma em 23
diferentes enfermidades, como apresentado no Quadro 1 (SOLOMON, 1999).

8

Quadro 1 - Benefcios observados em pessoas que utilizaram suco do fruto de Noni durante 2 anos
de acompanhamento clnico.

Afeco/Condio
Nmero de
Pessoas que
ingeriram o Noni
Percentual das
pessoas que
relataram melhora
Alergia 948 84%
Alerta e Agilidade Mental 2.983 72%
Artrite 719 81%
Cancro 889 65%
Depresso 807 77%
Desenvolvimento de Massa
Muscular
816 71%
Desordens Digestivas 1.593 89%
Diabetes Tipo 1 e 2 2.773 84%
Dificuldades de Concentrao 2.983 72%
Dores em geral 4.231 88%
Enfermidades Cardacas 1.123 80%
Stress 4.113 72%
Falta de Energia 8.327 92%
Funes Renais 2.372 67%
Hipertenso Arterial 938 85%
Infarto 1.019 57%
Problemas Respiratrios 2.727 78%
Obesidade 2.841 75%
Rejuvenescimento 148 78%
Sentimento de Bem-estar 4.561 80%
Vida Sexual 1.608 87%
Tabagismo 452 58%
Transtornos do Sono 1.231 73%
Fonte: SOLOMON, 1999.

Alm disto, vrias publicaes cientficas tem mostrado a utilizao do Noni
para diversas patologias, e os resultados positivos fomentaram o consumo deste
9

fruto, no apenas na sia, como tambm nos Estados Unidos, Japo, Europa,
Brasil, entre outros (ELKINS, 1998; SOLOMON, 1999).

2.2.1 MODULADOR DO SISTEMA IMUNOLGICO
O sistema imunolgico composto por diferentes clulas com funes
determinadas, sendo responsveis pela defesa do organismo atravs do combate a
microrganismos invasores, retirada de clulas mortas, renovao de determinadas
estruturas, rejeio de enxertos e memria imunolgica, e ativo na remoo de
clulas alteradas que necessitam serem destrudas, por dar origem a tumores. Esse
sistema deve funcionar sinergicamente, a fim de prevenir desordem imunolgica que
resultar em patologias, a exemplo do cncer, lpus, artrite reumatoide entre outras
(MOSER; LEO; OBERDAN, 2010).
Em estudos realizados por Hirazumi et al. (1996) e Hirazumi e Furusawa (1999)
utilizando precipitado rico em polissacardeo de noni em camundongos com cncer
de pulmo constataram que o noni apresentou atividade antitumoral por ativar o
sistema imunomodulador.
Estudo realizado pela Tahitian Noni International Research Center nos Estados
Unidos mostraram os efeitos do Noni na ativao do sistema imune, in vivo e in vitro,
por apresentar atividade sob os receptores canabinides, justificando assim sua
atividade imunomodulatria. Para o estudo foi utilizado suco de fruto concentrado de
noni e o Tahitian Noni Juice

(PALU et al., 2008).


O Noni em concentraes de 1 e 5 mg/mL inibiu os receptores canabinides
CB
1
em 14 e 10%, respectivamente, e mostrou estimulao dos receptores
canabinides CB
2
em 54 e 160%, respectivamente. Camundongos tratados com
suco do noni tiveram uma supresso na produo de interleucina-4 (IL-4) quando
comparado aos tratados com gua, alm de aumentar a produo de interferon
(IFN-). Neste estudo, foi demonstrado que o suco concentrado do fruto do Noni
sugestivo de modular o sistema imune por ser um potente ativador de CB
2
e inibidor
de CB
1
, alm de suprimir a IL-4 e aumentar a produo de INF- (PALU et al., 2008).

2.2.2 CNCER
O cncer o nome dado a um conjunto de mais de 200 doenas com
proliferao descontrolada das clulas anormais. No Brasil o tipo de cncer de maior
10

incidncia o de pele no-melanoma e, quanto a mortalidade, o cncer de mama e
de pulmo se destacam entre mulheres e homens brasileiros, respectivamente.
Dentre os fatores de riscos, presume-se que 35% dos cnceres estejam associados
aos hbitos alimentares, ocorrendo em razo de dietas inadequadas, caracterizadas
pelo consumo excessivo de gordura saturada e o baixo consumo de fibras, frutas e
hortalias. Os produtos naturais emergem como instrumento promissor no controle
do cncer, por meio de ao anticarcinognica, antioxidante, antiinflamatria, anti-
hormonais, dentre outros (BITTENCOURT; SCALETZKY; BOEHL, 2004; BRASIL,
2012).
Inmeras pesquisas visando o tratamento e preveno do cncer tm os
produtos naturais como foco, pois as plantas e frutos so considerados uma das
maiores fontes de compostos biologicamente ativos (RIVERA et al., 2012).
Neste contexto, pesquisadores do Departamento de Farmacologia Clnica da
University of Hawaii analisaram a atividade antitumoral in vitro do precipitado obtido
a partir do suco do fruto de Noni em carcinoma pulmonar de Lewis. No estudo foi
verificado a capacidade antitumoral desse precipitado por estimular a liberao de
macrfagos e a ativao das clulas T, promovendo o ataque s clulas tumorais
com efeito citosttico e citotxico. Neste estudo, observaram que a associao do
Noni com a quimioterapia pode reduzir os efeitos txicos com a reduo da dose dos
quimioterpicos administrados, alm de aumentar a possibilidade de cura
(HIRAZUMI; FURUSAWA, 1999).
Estudos posteriores in vivo realizado em cobaias confirmaram o potencial
antitumoral e imunomodulador do Noni, com cura de 25 a 45% dos camundongos.
Tambm foi comprovado efeitos benficos em associao do Noni com
medicamentos quimioterpicos antineoplsicos clssicos, i.e., cisplatina, bleomicina,
5-fluoruracil, vincristina (FURUSAWA et al., 2003).
Em outro estudo, pesquisadores do Mxico, isolaram e identificaram 18
compostos bioativos no Noni, dentre eles o damnacanthal, uma antraquinona
extrada das razes do noni, com capacidade de inibir o cncer (RIVERA et al., 2012;
WITAYASINTHANA; SHOTIPRUK, 2009). O damnacanthal um potente inibidor
seletivo da protena tirosina quinase p56
lck
linfcito-especfica (AOKI et al., 2000;
FALTYNEK, et al., 1995), alm de inibidor das funes RSV (Rat Sarcoma Vrus)
(HIRAMATSU et al., 1993), intenso efeito inibitrio contra a topoisomerase II (TOSA
11

et al., 1998) e atuando tambm como agente imunomodulador (NOORJAHAN et al.,
2010).

2.2.3 EFEITO ANTIDISLIPIDMICO
A dislipidemia um distrbio que altera os nveis sricos dos lipdios
(gorduras), sendo um dos fatores de risco para a ocorrncia de doenas
cardiovasculares e cerebrovasculares, dentre elas aterosclerose, infarto agudo do
miocrdio, doena isqumica do corao e acidente vascular cerebral (AVC). As
alteraes do perfil lipdico podem incluir alta nos nveis de colesterol total,
triglicrides e colesterol de lipoprotena de alta densidade (HDL), e baixa nos nveis
de colesterol de lipoprotena de baixa densidade (LDL) (BRASIL, 2011; SPOSITO et
al., 2007).
As dislipidemias esto diretamente associadas a bons hbitos de vida, como a
prtica de exerccios fsicos, alimentao saudvel, abandono do hbito de fumar,
controle de peso. Para o tratamento so prescritos medicamentos dos grupos das
estatinas, ezetimiba, colestiramina, fibratos e cido nicotnico, alm dos fitoterpicos.
(BRASIL, 2011).
Dentre os produtos de origem natural para o controle da dislipidemia o Noni
apresentou resultados potenciais aps pesquisa realizada pela Aga Khan University
Medical College (MANDUKHAIL; AZIZ; GILANI, 2010).
No estudo foi administrado extrato das folhas, fruto e raz de noni em ratos e
camundongos, submetidos a diferentes dietas. O tratamento dos ratos com 1000 mg
de extrato do fruto/kg, 1000 mg de extrato das folhas/kg e
500 mg de extrato de raiz resultaram em significativa reduo dos nveis de
colesterol (LDL), triglicrides e aumento nos nveis de HDL, ficando assim,
considerada como um excelente e promissor fitoterpico para o tratamento e
preveno, no apenas das dislipidemias, mas tambm das doenas
cardiovasculares (HORNICK et al., 2003; KAMIYA et al., 2004; MANDUKHAIL; AZIZ;
GILANI, 2010).

2.2.4 DOENAS GASTROINTESTINAIS
Desordens gastrointestinais so comuns em todas as faixas etrias e etnias
da populao mundial, sendo as doenas mais comuns a lcera pptica e o refluxo
12

gastresofgico. A lcera pptica uma afeco orgnica do aparelho digestivo,
sendo uma leso, quase sempre, de evoluo crnica, que pode comprometer as
diversas camadas do estmago ou do duodeno e atinge tanto o gnero masculino
quanto o feminino, geralmente em faixa etria de intensa atividade laboral. O termo
pptico se refere tendncia destas leses ocorrerem em regies expostas ao
cido clordrico e pepsina, principalmente estmago e duodeno proximal
(ZEITUNE, 2012).
A infeco pelo Helicobacter pylori e o uso crnico de antiinflamatrios no
esteroidais (Aines) so considerados os principais fatores etiolgicos desta
doena. Com o desenvolvimento de potentes inibidores da secreo cida gstrica
e o tratamento do H. pylori, tem-se conseguido a cicatrizao de quase a totalidade
das lceras gstrica e/ou duodenal (ZEITUNE, 2012).
A doena do refluxo gastroesofgico (DRGE) uma das afeces mais
frequentes na prtica mdica, sendo a afeco orgnica mais comum do tubo
digestivo. Define-se como uma afeco crnica decorrente do fluxo retrgrado do
contedo gastroduodenal para o esfago e/ou rgos adjacentes a ele, acarretando
um espectro varivel de sintomas e/ou sinais esofagianos e/ou extra-esofagianos,
associados ou no a leses teciduais (MORAES-FILHO et al., 2002).
Para o tratamento destas desordens gastrointestinais so prescritos vrios
medicamentos, como os anticidos, anti-histamnico H
2
, inibidores da bomba de
prtons, antibiticos e procinticos (ZEITUNE, 2012). Alm do tratamento
convencional, h estudos direcionados para a utilizao de produtos naturais para
preveno e tratamento das desordens gastrointestinais, a exemplo do noni
(MAHATTANADUL et al., 2011).
Em estudos realizados em ratos por pesquisadores da Tailndia
demonstraram os benefcios do uso do extrato do fruto do noni na preveno e
tratamento das lceras ppticas e do refluxo gastroesofgico. Esse benefcio est
diretamente relacionado concentrao do biomarcador escopoletina presente no
fruto do Noni, com potente atividade antioxidante, anti-inflamatria e no controle
dos nveis de serotonina. No estudo foi comparado a eficcia do extrato do fruto de
Noni e do marcador escopoletina frente a ranitidina e ao lanzoprazol, para a lcera
gstrica e a cisaprida para o refluxo gastroesofgico, obtendo resultados bem
satisfatrios (MAHATTANADUL et al., 2011).
13

Na lcera gstrica, o extrato aquoso de fruto de noni reduziu
significativamente a acidez estomacal e a atividade da pepsina; e no refluxo
gastroesofgico melhorou significativamente a taxa de esvaziamento gstrico e o
trnsito intestinal (MAHATTANADUL et al., 2011).

2.2.5 ISQUEMIA CEREBRAL
As isquemias cerebrais podem ocorrer por aterosclerose dos vasos intra ou
extracranianos, por embolia de natureza cardaca e por patologia dos pequenos
vasos cerebrais (TEIXEIRA, 2012).
O AVC isqumico representa uma das causas mais frequentes de morte, alm
de ser uma doena de alta morbidade deixando sequelas que respondem por
diversos tipos de incapacitao, devendo, por isso ser adequadamente identificado e
diagnosticado em suas diversas formas. Sua morbimortalidade deve ser conhecida
para que sua preveno seja realizada (TEIXEIRA, 2012; COLLI et al., 2008).
A isquemia transitria uma forma benigna de isquemia que pode se
apresentar como um dficit visual ou viso dupla, distrbios de linguagem,
dormncias ou formigamentos em um membro ou em um lado do corpo ou da face,
alm de tonturas, perdas do equilbrio, incoordenao motora, entre outros sintomas
(TEIXEIRA, 2012; ANDRE; VINCENT, 1997).
Pesquisadores do Departamento de Farmcia Clnica da Kobe Gakuin
University no Japo realizaram estudo para comprovar o efeito preventivo do Noni
nas isquemias cerebrais atravs de ensaios in vivo, administrando o suco do fruto
em camundongos, de acordo com protocolo estabelecido pelos pesquisadores. O
efeito neuroprotetor do suco do fruto do noni foi demonstrado claramente nos
camundongos submetidos a isquemia focal, e isso est diretamente relacionado com
os marcadores presentes no noni, principalmente os que apresentam efeitos
antioxidante e anti-inflamatrio. Portanto, nesse estudo, os pesquisadores afirmam
que o uso do suco de noni previne significativamente no apenas o desenvolvimento
de leso neuronal isqumica, como tambm de outras doenas cerebrovasculares
(HARADA et al., 2009).



14

2.3 ASPECTOS QUMICOS
Estudos prvios relatam que o Noni uma planta rica em compostos
quimicamente ativos presentes no fruto, folha e raiz. Foram isolados diversos
compostos qumicos atravs de vrias tcnicas cromatogrficas, i.e., lquida de alta
eficincia, camada delgada e gasosa (Quadro 2) (WEST; DENG, 2010; DENG et al.,
2009; POTTERAT et al., 2007; ANEKPANKUL et al., 2007; WITAYASINTHANA;
SHOTIPRUK, 2009).

Quadro 2 - Compostos qumicos isolados das folhas, fruto e raiz do Noni atravs de tcnicas
cromatogrficas.
Parte da
Planta
Compostos Qumicos Identificados Referncias
Folhas Glicerina
1
D-Arabinitol
1
Pentadecano
1

Hexadecano
1

Sorbitol
1

Heptadecano
1

cido Tetradecanoico
1

Octadecano
1

Heptacosano
1

cido n-Hexadecanoico
1

Fitol
1

cido Octadecanoico
1

cido Eicosanico
1

Gama Tocoferol
1

Vitamina E
1

Campesterol
1

Estigmasterol
1

Escopoletina
2

Rutina
2

RIVERA et al.,
2012
1
WEST; DENG,
2010
2

Fruto cido Hexanico
1

Ciclopropil carbinol
1

cido Octanico
1

RIVERA et al.,
2012
1

WEST; DENG,
15

2-Furancarboxialdedo
1

cido n-decanico
1

d-manitol
1

2-Carbamil
1

Vitamina d3
1

Alantona
1

cido Pentadecanico
1

9,12-cido Octadecanico
1

Ciclododecino
1

1,5-Ciclodecadino
1

5.alfa-androstano
1

cido n-hexadecanoico
1

Escopoletina
2,3

Rutina
2,3,4

Noniosdeo B
3

Noniosdeo C
3

cido Deacetilasperulosdico
2,3

cido Asperulosdico
2,3,4

1,5,15-tri-O-metilmorindol
4

5,15-di-O-metilmorindol
4
Antragalol-2-metileter
4
2-O-(-D-Glucopiranosil)-1-O-hexanoil--
D-gluropiranose
4
2-O-(-D-glucopiranosil)-1-O-octanoil--D-
gluropiranose, 6-O-(-D-glucopiranosil)-1-
O-hexanoil--D-glucopiranose
4
6-O-(-D-glucopiranosil)-1-O-octanoil--D-
glucopiranose, 2,6-di-O-(-D-
glucopiranosil)-1-O-hexanoil--D-
glucopiranose
4
2,6-di-O-(-D-glucopiranosil)-1-O-octanoil-
-D-glucopiranose, 3-metilbut-3-enil- -D-
glucopiranosil
4
2010
2
POTTERAT et
al., 2007
3
TOSHIHIRO et
al., 2007
4

16

3-metilbut-3-enil-6-O- -D-glucopiranosil-
-D-glucopiranose
4

Raiz 1-metoxi-3-hidroxi-2 formilantraquinona
(Damnacantal)
5,6,7
,

1-hidroxi-2-
metilantraquinona
5
, 2-metilantraquinona
5
,
2-formil-1-hidroxiantraquinona
5
, 1,3-
dihidroxi-2-formilantraquinona
5
, , 1-metoxi-
2-hidroxiantraquinona
5
, 1-metoxi-3-
hidroxiantraquinona
5
, 1-metil-3-
hidroxiantraquinona
5
, 2-
formilantraquinona
5
, 1,3-dihidroxi-2-
metilantraquinona
5
, 1,3-dimetoxi-2-
metoximetilantraquinona
5
, Ibericina
5
, 1,7-
dihidroxi-8-metoxi-2-metilantraquinona
5
,
cido Decmbico
5
, Colest-22-en-3-ol
5
,
Nonin A
5
, Nonin B
5
e Nonin C
5

LISHUANG et
al., 2011
5

WITAYASINTHA
NA;
SHOTIPRUK,
2009
6
ANEKPANKUL
et al., 2007
7


Estima-se que mais de 160 compostos fitoqumicos esto presentes nas folhas,
frutos, raiz e semente do Noni, sendo os responsveis pelos benefcios j
encontrados. Dentre estes compostos esto as antraquinonas, flavonides,
cumarinas, polissacardeos, glicosdeos, iridides, lignanas, triterpenos, fitoesterol,
steres de cido graxos saturados, entre outros (PAWLUS et. al., 2005; AHMAD;
BANO, 1980; SALUDES et al., 2002; TAKASHIMA et al., 2007; SANG et al.,
2001a,b,c,d; SANG, et al., 2003).
Dentre os compostos fitoqumicos j elucidados, de maior relevncia e,
potencialmente vinculados aos efeitos farmacolgicos, destacam-se os compostos
fenlicos, em geral fitoantioxidantes. Neste contexto, destacam-se os bioativos
antraquinonas, flavonides, cumarinas, cidos fenlicos e alcalides (WANG et al.,
2002; PAWLUS et al., 2005; RIVERA et al., 2012).
Exemplos especficos de compostos majoritrios identificados no Noni
responsveis pelas atividade farmacolgicas incluem o damnacantal, xeronina,
rutina, cido deacetilasperulosdico e escopoletina, extrados das diversas partes
do Noni.
17

O Damnacantal (Figura 5) uma antraquinona presente na raiz do Noni com
potente atividade inibitria da enzima tirosina quinase (pk56), alm de atividade
citotxica contra clulas cancergenas de mama e pulmo. Alm desses
benefcios, h outros que no ainda no foram elucidados como, atividade
antifngica contra Candida albicans e antituberculose contra o Mycobacterium
tuberculosis (FALTYNEK et al., 1995; KANOKMEDHAKUL; KANOKMEDHAKUL;
PHATCHANA, 2005; NUALSANIT et al., 2012).


Figura 5 - Estrutura Qumica do Damnacantal

A xeronina um alcalide tido como a substncia mais promissora encontrada
em todas as partes do Noni. O pesquisador, Ralphe Heinicke, patenteou essa
substncia aps sua descoberta em 1986 e acredita ser um composto bioqumico
fundamental que intervm numa sries de reaes metablicas, podendo atuar no
tratamento de vrias patologias como depresso, sinusite, gastrite, refluxo
gastroesofgico, doenas auto-imunes, infeces, entre outras (HEINICKE, 1985 e
2001). Embora h muitos indcios das propriedades farmacolgicas da xeronina,
nenhuma foi comprovada cientificamente, e sua estrutura qumica ainda no foi
elucidada (MCCLATHEY, 2002).
O flavonide rutina (Figura 6) um dos principais biomarcadores de maior
ocorrncia no reino vegetal, e est presente nas folhas e frutos do Noni. Devido ao
seu amplo espectro de atividades biolgicas, como anti-inflamatrios, anti-tumoral,
antimicrobiana, antioxidante, e as aes de vasodilatao, tm merecido grande
ateno da comunidade cientfica, alm de um ativo promissor no desenvolvimento
de medicamentos para preveno e tratamento da hipertenso, hemorragia e
doenas do sistema circulatrio (MALAGUTTI et al, 2006; YANG; GUO; YUAN,
2008).
18


Figura 6 Estrutura Qumica da Rutina

O cido deacetilasperulosdico (Figura 7) um composto qumico da classe
dos iridoides, um metablito secundrio encontrado em plantas e vegetais. A
ocorrncia desse composto foi observada no fruto do Noni, no havendo relatos de
outras fontes na literatura. As principais propriedades farmacolgicas inerentes ao
cido deacetilasperulosdico, comprovados em estudos in vivo e in vitro, so
antioxidante, antiinflamatrio, analgsico, anti-cncer, hepatoprotetor (PAWLUS et
al., 2005; POTTERAT et al., 2007; SANG et al., 2001a,b,c,d; SANG et al., 2003).

Figura 7 - Estrutura Qumica do cido Deacetilasperulosdico

J a escopoletina (Figura 8) uma cumarina hidroxilada tida como marcador
majoritrio de frutos e folhas de Noni, sendo um composto biologicamente ativo em
diversas espcies como Atropa belladonna (MOORE, 1911), Althaea officinalis
(SHAH et al., 2011), Erycibe obtusifolia (PAN et al., 2010), Gelsemium
sempervirens (KHUDA-BUKHSH et al., 2010), Tilia cordata (ARCOS et al., 2006),
Malva silvestris (DELLA-GRECA et al., 2009), Mentha spicata (ADAM et al., 2009),
muito utilizado na medicina tradicional. Foi isolada pela primeira vez por Eykman
em 1884 em uma rizoma Scopoloa japonica, que deu origem a seu nome
(MOORE, 1911; MAHATTANADUL et al., 2011; IKEDA et al., 2009).

19


Figura 8 - Estrutura Qumica da Escopoletina

Os benefcios farmacolgicos atribuidos a escopoletina e s espcies que as
contm so: atividade anti-fngica (LEE et al., 2010; VALLE et al., 1997), anti-
tumoral (KHUDA-BUKHSH et al., 2010; ARCOS et al., 2006; LIU et al., 2001), anti-
inflamatria (SHAH et al., 2011; DING, et al, 2008), antioxidante (SHAW et al.,
2003; IKEDA et al., 2009), gastrointestinal (MAHATTANADUL et al., 2011), entre
outras, mas sua principal atividade teraputica atribuda s propriedades anti-
inflamatrias (DING et al., 2008).
A escopoletina, por ser um composto qumico de alta relevncia, foi
desenvolvida sinteticamente a fim de obt-la com pureza (CROSBY, 1961), para
ser utilizada como padro de deteco em vrios mtodos i.e. cromatogrficos,
espectrofotomtricos, eletroanalticos (HAUER; RITTER; GROTEMEIER, 1995;
NAHATA; DIXIT, 2008; HU et al., 2011; WU; DEWALD, 2001).




















20

2.4 CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS NATURAIS
A cultura do uso de plantas e de outras fontes naturais com propriedades
teraputicas vem sendo valorizada em sociedades de todo mundo impulsionando o
aumento no consumo de medicamentos fitoterpicos. Esta tendncia mundial, se
deve em parte ao questionamento das populaes quanto ao alto custo e perigos do
uso de medicamentos alopticos sintticos e, assim procuram substitu-los pelo uso
de plantas medicinais (DE SMET, 2004; GIVEON et al., 2004; ROCHA; SOARES;
CORRA, 2004; BUGNO et al., 2005; TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006).
Entretanto, a prescrio de medicamentos fitoterpicos ainda bastante
restrita e desacreditada pelos profissionais prescritores. Entre as principais razes
deste descrdito esto a falta de estudos clnicos conduzidos dentro de padres
ticos e cientficos, e a falta de padronizao dos extratos. Assim, torna-se
imprescindvel a padronizao e o controle de qualidade dos extratos vegetais,
sendo estes pr-requisitos para um medicamento seguro e confivel (BARATA,
2005; SPRINGFIELD; EAGLES; SCOTT, 2005; SONAGLIO; PETROVICK;
BASSANI, 1986; DAVID; NASCIMENTO; DAVID, 2004).
As plantas medicinais produzem substncias de diferentes classes qumicas,
i.e., alcalides, flavonides, taninos, saponinas, cumarinas, entre outros, e os fazem
em diferentes propores, dependendo das caractersticas edafo-climticas e do
potencial gentico e, a padronizao visa detectar o teor da substncia presente em
maior quantidade no extrato, sendo seu marcador. O marcador de um extrato
vegetal pode ser o princpio ativo responsvel pelo efeito teraputico, bem como ser
utilizado como referncia no controle de qualidade da matria-prima e dos
medicamentos fitoterpicos (MIGLIATO et al., 2007; GOBBO-NETO; LOPES, 2007;
DAVID; NASCIMENTO; DAVID, 2004; BRASIL, 2004).
Neste contexto, de extrema importncia que o controle de qualidade de
produtos naturais seja realizado desde o cultivo da planta at o produto final.
Outrossim, deve ser realizado sob mtodos analticos em laboratrios devidamente
equipados, com profissionais capacitados e sob as normas do rgo
regulamentador, ANVISA. Todos os mtodos analticos e bioanalticos devem ser
devidamente validados de acordo com a RE n 899 de 29 de maio de 2003 a fim de
garantir que os mtodos atendam s exigncias das aplicaes analticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados. Um mtodo analtico abrange a
21

determinao qualitativa, semi-quantitativa e quantitativa das substncias presentes
no extrato ou no produto farmacutico (BRASIL, 2003; KLEIN et al., 2009).
Para o controle de qualidade de produtos naturais podem ser empregados
diferentes mtodos, sejam eles convencionais ou inovadores, desde que estejam
devidamente validados de acordo com os padres exigidos. Dentre os mtodos
convencionais ressalta-se as tcnicas cromatogrficas, i.e., cromatografia em
camada delgada (CCD), cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e
cromatografia gasosa (CG); e as tcnicas espectrofotomtricas, i.e., mtodo da
captura do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), ensaio ABTS. Entre os mtodos
inovadores destacam-se os eletroanalticos, como a voltametria cclica (VC) e a
voltametria de pulso diferencial (VPD), que so de fcil acesso, baixo custo, bons
parmetros analticos que asseguram resultados rpidos e confiveis (SONAGLIO;
PETROVICK; BASSANI, 1986; KLEIN et al., 2009; REIS et al., 2009; GIL, 2011).
Na rotina de laboratrios de controle de qualidade de produtos naturais
desejvel a utilizao de mtodos especficos, seletivos, simples, rpidos e de baixo
custo a fim de permitir a aprovao da matria-prima para a linha de produo do
medicamento (DRASARA; MORAVCOVA, 2004).

2.4.1 MTODOS CONVENCIONAIS
Os ensaios comumente empregados no controle de qualidade de produtos
naturais incluem mtodos convencionais, i.e., cromatogrficos, colorimtricos,
volumtricos e mtodos para determinao de atividade antioxidante. As vantagens
desses mtodos so sensibilidade, seletividade, facilidade de manuseio e exatido,
porm apresenta como desvantagens o alto custo tanto do equipamento quanto dos
reagentes e padres de referncia, bem como de materiais que compem os
equipamentos i.e. colunas, lmpadas (BUTERA et al., 2002; DRASARA;
MORAVCOVA, 2004; FAMEI et al., 2006; LIU et al., 2007; GIL, 2011).

2.4.1.1 MTODOS CROMATOGRFICOS
A cromatografia permite a separao e determinao das substncias
presentes no extrato vegetal. So mtodos fsico-qumicos presentes nos
compndios oficiais i.e. farmacopia brasileira 5 edio para controle de qualidade
22

e dividem-se em cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia lquida de
alta eficincia (CLAE) e cromatografia gasosa (CG) (BRASIL, 2010a).

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Na CCD a separao dos componentes de uma mistura ocorre atravs da
migrao diferencial sobre uma fase estacionria composta por uma fina camada de
adsorvente aplicado sobre um suporte plano, o qual pode ser constitudo de diversos
materiais tais como vidro, alumnio ou polister. A fase mvel por sua vez
constituda por diversas misturas de solventes e permanece no interior de um
recipiente ou cuba de material transparente e inerte, geralmente vidro,
permanecendo vedada onde se deposita a cromatoplaca em posio vertical sob
uma atmosfera saturada da fase mvel (BRASIL, 2010a; WEST; DENG, 2010).

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE)

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) uma tcnica de separao
fundamentada na distribuio dos componentes de uma mistura entre duas fases
imiscveis, a fase mvel, lquida, e a fase estacionria slida, contida em uma coluna
cilndrica. As separaes so alcanadas por partio, adsoro, troca inica,
excluso por tamanho ou interaes estereoqumicas, dependendo do tipo de fase
estacionria utilizada. A CLAE apresenta vantagens sobre a cromatografia a gs
para as anlises de misturas orgnicas, podendo ser aplicados a amostras no
volteis e termolbeis. A maioria das anlises farmacuticas est baseada no
mtodo de separao por partio e devem ocorrer em tempo curto de anlise.
Vrios fatores qumicos e fsico- qumicos influenciam na separao cromatogrfica,
os quais dependem da natureza qumica das substncias a serem separadas, da
composio e vazo da fase mvel, da composio e rea superficial da fase
estacionria (BRASIL, 2010a; DENG et al., 2009)

2.4.1.2 MTODOS COLORIMTRICOS
Os mtodos colorimtricos baseiam-se em trs fundamentos: a) absoro de
luz em determinada faixa de comprimento de onda do analito, b) capacidade
23

descolorante do analito e c) reao do analito com produo de cor frente a um
reagente especifico. So mtodos presentes na rotina do laboratrio de controle de
qualidade para identificar qualitativamente metablitos secundrios em extratos
brutos vegetais, para avaliao da capacidade antioxidante, pesquisa de fenis
totais, entre outros (MELLO; CORTEZ; CARDOSO, 1997; FALKENBERG; SANTOS;
SIMES, 2003).

2.4.1.2.1 MTODOS PARA AVALIAO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE
Os mtodos para avaliao da capacidade antioxidante envolvem diversos
testes que tm se tornado ferramentas usuais e extremamentes necessrias na
seleo inicial de substncias que possam ser utilizadas como frmacos, auxiliando
os pesquisadores na avaliao da atividade de substncias isoladas de produtos
naturais, bem como obtidas de fontes sintticas (KILMARTIN, 2001; ALVES et al.,
2010).

MTODO DO DPPH

O mtodo do DPPH foi desenvolvido por Brand-Williams em 1995 e trata-se de
um mtodo indireto para determinar a atividade antioxidante dos compostos
doadores de oxignio. um mtodo muito utilizado em extratos e substncias
isoladas como: compostos fenlicos totais ou isolados (SOUSA et al, 2007),
flavonides (LEJA et al, 2007), cumarinas (VOGEL et al, 2004), antocianinas,
antocianidinas (LEJA et al, 2007; DE LIMA; SUSSUCHI; DE GIOVANI, 2007),
carotenides (JILA et al, 2007), entre outros.
Este mtodo consiste em avaliar a capacidade antioxidante via atividade
sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila DPPH
.
. O radical DPPH
.

possui colorao prpura absorvendo a um comprimento de onda mximo de
aproximadamente 516 nm. Por ao de um antioxidante ou uma espcie radicalar, o
DPPH
.
reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de colorao amarela, com
conseqente desaparecimento da absoro, podendo a mesma ser monitorada pelo
decrscimo da absorbncia. A partir dos resultados obtidos determina-se a
porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres e/ou
24

porcentagem de DPPH
.
remanescente no meio reacional. (CHANDRASEKAR et al,
2006; KIM; THOMAS, 2006; RAYMUNDO; HORTA; FETT, 2004).
A porcentagem de atividade antioxidante (AA%) corresponde quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante
necessria para reduzir a concentrao inicial de DPPH em 50% denominada de
concentrao eficiente (CE
50
), tambm designada de concentrao inibitria (CI
50
).
Quanto maior for o consumo do radical livre DPPH por uma amostra, menor ser a
sua CE
50
e maior a sua capacidade antioxidante (BRAND-WILLIAMS; CUVELIER;
BERSET, 1995; SNCHES-MORENO; LARRAURI; SAURA-CALIXTO, 1998).

2.4.2 MTODOS ELETROANALTICOS
Essas tcnicas fornecem parmetros fisco-qumicos capazes de mostrar o
potencial redox, o nmero de eltrons envolvidos na etapa de transferncia de
carga, mecanismos de transferncia de carga e influncia de prtons, constantes de
reao, entre outros (ALVES et al., 2010; REIS et al., 2009).
Neste sentido, as tcnicas voltamtricas so as mais teis e versteis por
terem a capacidade de obter alm de uma caracterizao eletroqumica, uma
correlao entre os aspectos estruturais e a atividade antioxidante de substncia
presente nos produtos naturais, tais como cidos ascrbico e elgico, resveratrol,
flavonides, cumarinas, antraquinonas, entre outros (BORGES et al., 2011).
Entre as tcnicas voltamtricas mais difundidas esto a voltametria cclica (VC)
e a voltametria de pulso diferencial (VPD), que fornece importantes informaes
relativas ao processo de oxi-reduo. Para promover as reaes de oxidao ou
reduo aplicada uma perturbao de potencial a um eletrodo e a resposta se d
na forma de fluxo de eltrons, podendo ser da soluo para o eletrodo (processo de
oxidao) ou do eletrodo para a soluo (processo de reduo) resultando em uma
medida de corrente faradaica, que se relaciona com a concentrao da espcie
eletroativa. Os parmetros fornecidos pela VC e VPD so corrente de pico andico
(I
pa
), corrente de pico catdico (I
pc
), potencial de pico andico (E
pa
) e potencial de
pico catdico (E
pc
), sendo o I
pa
e E
pa
relativos ao processo de oxidao e I
pc
e E
pc
ao
processo de reduo (REIS et al., 2009).
As tcnicas voltamtricas so mtodos eletroanalticos com boa seletividade e
sensibilidade, alm de simplicidade, aplicabilidade, rapidez e o emprego de
25

equipamentos de baixo custo. So tcnicas viveis para as rotinas laboratoriais,
principalmente das grandes indstrias, em que h necessidade de mtodos simples,
rpidos, de baixo custo e que garanta bons resultados (REIS et al., 2009; BORGES,
et al., 2011; ALVES, et al., 2010).

VOLTAMETRIA DE PULSO DIFERENCIAL (VPD)

Na voltametria de pulso diferencial so aplicados pulsos de igual amplitude que
se sobrepem a uma rampa linear de potencial, sendo que a corrente amostrada
antes da aplicao do pulso inicial e alguns instantes antes do trmino do pulso, a
fim de obter uma diferena entre a corrente aps e antes da aplicao do pulso de
potencial e plotar em um grfico corrente vs potencial, resultando em voltamograma
na forma de pico (BLASCO; GONZALEZ; ESCARPA, 2004).
A voltametria de pulso diferencial apresenta-se mais sensvel que a voltametria
cclica, pelo simples fato que na VPD a medida de corrente lida diferencial,
eliminando a corrente capacitiva e favorecendo a deteco das baixas correntes
faradacas (GIL, 2011).

2.4.3 OUTROS MTODOS INSTRUMENTAIS APLICVEIS
Os mtodos inovadores ainda so poucos empregados pelos laboratrios de
controle de qualidade, mas merecem destaques por produzirem resultados
confiveis. Alguns desses mtodos, i.e., anlise trmica, espectrofotometria no
infravermelho prximo (NIR), j esto, inclusive, nos compndios oficiais nacionais e
internacionais para o controle de qualidade de medicamentos e correlatos (BRASIL,
2010a; REIS et al., 2009; KILINC, 2009).

2.4.4 ELETROANLISE EM PRODUTOS NATURAIS
A imensa variedade de produtos naturais, com diferentes e complexos
metablitos secundrios conferem, alm dos caracteres organolpticos, i.e., cor,
sabor, uma variedade de benefcios sade humana (HTTENSCHWILER;
VITOUSEK, 2000; DAI; MUMPER, 2010; HUANG; CAI; ZHANG, 2010). Vrias
pesquisas relacionadas a metablitos secundrios i.e. compostos fenlicos
26

confirmaram seus benefcios como quimiopreventivo, principalmente devido suas
propriedades antioxidantes (HUANG; CAI; ZHANG, 2010).
A propriedade antioxidante justificada pela funo redox dos compostos
fenlicos, seja preventiva ou curativa contra doenas relacionadas ao
envelhecimento e processos mediados por radicais livres, sendo bem reconhecido
entre a comunidade cientfica e tornando-se uma das questes mais importantes na
nutrio humana (PAULOVA; BOCHORAKOVA; TABORSKA, 2004).
Particularmente, o crescente interesse na preveno do cncer, usando
antioxidantes naturais destacou a relevncia dos compostos fenlicos, como os
flavonides, cidos fenlicos, cumarinas, quinonas, taninos, entre outros (GAO; HU,
2010).
A atividade antioxidante se manifesta por trs mecanismos principais:
propriedades doadoras de eltron/prtons, propriedades de quelao de metal e
interao com protenas biologicamente ativas, ou seja, oxiredutases, sendo que
todos estes mecanismos podem contribuir positivamente para o equilbrio do
estresse oxidativo (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; REIS et al, 2009). Todos
os compostos fenlicos podem ser eletroquimicamente oxidado devido aos grupos
hidroxilas ligados aos anis aromticos e, sabe-se tambm que o pH um dos
fatores mais importantes para se determinar a atividade antioxidante destes
compostos.
Assim, a conexo entre a atividade biolgica e o comportamento redox de tais
antioxidantes naturais em que foram empregadas tcnicas de eletroanlise, tm
gerado vrias publicaes de trabalhos cientficos (DICULESCU et al, 2012;
ENACHE; OLIVEIRA-BRETT, 2011; BARA et al, 2008; REIS et al, 2009; BLASCO;
GONZALEZ; ESCARPA, 2009; JANEIRO; OLIVEIRA-BRETT, 2007).
A correlao entre o comportamento eletroqumico e a atividade sequestradora
de radicais foi identificada em uma grande variedade de antioxidantes naturais
fenlicos, que inclui flavonides (quercetina, rutina, epigalocatequina), xantonides
(mangiferina, mangostin), cidos fenlicos (cido clorognico, cido cafico, cido
ferlico), steres de cidos fenlicos (verbascosdeo, cido rosmarnico e elgico),
antraquinonas (danthrona, emodina) (SALVI et al, 2002; BORN et al, 1996).
Porm, no possvel determinar o mecanismo redox de antioxidante naturais
fenlicos por mtodos bioqumicos e espectromtricos, cujo princpio de anlise
27

muito especfico (CAO; SOFIC; PRIOR, 1997; NARAYANA et al, 2001; NIJVELDT et
al, 2001; MONTORO et al, 2005). Este fato, faz com que haja a busca por mtodos
eletroanalticos mais baratos e, que so tambm mais rpidos (NIJVELDT et al,
2001; CAO; SOFIC; PRIOR, 1997; REIS et al, 2009; ROMANI et al, 2000) e
especficos em matrizes de maior complexidade, como vinhos, produtos
farmacuticos e produtos alimentares de origem vegetal (ARRIBAS; MARTINEZ-
FERNANDEZ; CHICHARRO, 2012). Tambm serve como ferramenta para elucidar
os mecanismos de oxidao que caracterizam o comportamento redox dos
compostos isolados (PAULOVA; BOCHORAKOVA; TABORSKA, 2004).
Os mecanismos de reao de antioxidantes polifenlicos tm sido
intensamente estudados por vrios mtodos analticos (HOTTA et al, 2001). Os
principais mtodos eletroqumicos utilizados para elucidar os mecanismos redox
incluem eletrlise de fluxo de coluna e tcnicas voltamtricas (REIS et al, 2009).
Na eletrlise de fluxo de coluna possvel avaliar com preciso o nmero de
eltrons (n) envolvidos no processo de oxidao. Na voltametria possvel obter a
reversibilidade, cintica e o processo de difuso ou adsoro, os quais determinam a
reao no eletrodo (REIS et al, 2009).
Sabendo-se do amplo consumo do Noni devido s suas propriedades
medicinais e da importncia do controle de qualidade dos produtos comercializados
base desta planta, as tcnicas de eletroanlise podero contribuir
significativamente na identificao e caracterizao dos metablitos secundrios do
Noni, elucidando assim seus marcadores e justificando os potenciais benefcios
deste fruto.










28

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

Aplicar mtodos cromatogrficos e voltamtrico na identificao de produtos
comerciais base de Noni atravs da identificao dos marcadores majoritrios.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Identificar a presena dos principais metablitos secundrios encontrados no
fruto de Noni atravs de ensaios farmacognsticos qualitativos.
Identificar a presena dos marcadores majoritrios do fruto de Noni nas
amostras comerciais avaliadas nesse estudo atravs de cromatografia em camada
delgada e cromatografia de alta eficincia.
Determinar o teor dos marcadores majoritrios do fruto de Noni nas amostras
comerciais avaliadas nesse estudo pelo mtodo da cromatografia lquida de alta
eficincia.
Comparar os resultados obtidos pelos mtodos cromatogrficos com os
resultados da voltametria de pulso diferencial em estado slido, e avaliar a
aplicabilidade desta tcnica eletroanaltica na identificao de produtos base de
Noni.
Avaliar a aplicabilidade do mtodo voltamtrico para identificar a presena do
marcador escopoletina, comparando os resultados com aqueles obtidos por mtodos
cromatogrficos.
Estimar a capacidade antioxidante dos produtos comerciais base de Noni
pelo mtodo do DPPH, tendo como referncia a amostra autntica do fruto maduro.








29

4. MATERIAL E MTODOS

4.1 Amostras
Foram adquiridas 10 unidades de fruto maduro de Noni no Mercado Central de
Goinia e submetidos a anlise macroscpica quanto suas caractersticas
morfolgicas, a fim de te-lo como amostra autntica deste estudo (Figura 9).
As amostras comerciais (Figura 9) foram fruto desidratado, extrato lquido
comercial, cpsula 1, cpsula 2 e cpsula 3 adquiridas no Mercado Central de
Goinia e o extrato seco adquirido de um distribuidor de matrias-primas para o
ramo farmacutico. O extrato lquido auriana foi cortesia de um agricultor de Goinia-
GO, Sr. Vencio, que prepara esse extrato para fins medicinais com frutos maduros,
previamente limpos com gua e sabo, descontamidados com hipoclorito de sdio a
1% em gua por 15 minutos, compactados em frasco de vidro esterelizado e
mantido temperatura ambiente ( 25C) por 6 meses. Todas as amostras foram
extradas do fruto, conforme dado do fabricante.
Para as amostras comerciais em cpsulas foi feito o peso mdio conforme
descrito na Farmacopia Brasileira 5 edio. Pesou-se, individualmente, 20
unidades e determinou-se o peso mdio de cada amostra em cpsula pela mdia
aritmtica. As amostras cpsula 1, 2 e 3 continha 60 cpsulas cada e o peso mdio
foi de 0,397g; 0,390g e 0,286g respectivamente (BRASIL, 2010a).

Figura 9 Amostra autntica do fruto do Noni (1) e amostras comerciais: (2) fruto desidratado, (3)
extrato seco, (4) extrato lquido auriana, (5) extrato lquido comercial, (6) cpsula 1, (7) cpsula 2 e (8)
cpsula 3.


1
2 3 4
5 6 7 8
30

4.2 Padres e Reagentes
Escopoletina foi obtida da Extrasynthese

,

rutina a 94% da Sigma

, lcool
etlico PA 95% foi obtido da Impex

, radical DPPH foi obtido da Aldrich Chemistry

,
grafite em p da Merck/SA,

leo mineral Nujol

, tampo fosfato, acetato de etila PA


Quemis

, cido frmico 85% PA Vetec

, diclorometano PA Tedia

, metanol PA
Dinmina

, anisaldedo Labsynth

, cido sulfrico PA Vetec

, lcool etlico 75%,


cido clordrico SR, etr etlico Vetec

, amnia SR, cool etlico 70%, acetato de


chumbo a 10%, clorofrmio PA Vetec

, reativo de Liebermann-Burchard, cido


fosfrico PA Labsynth

, fita de magnsio metlico, soluo de cido brico, soluo


de cido oxlico, soluo de cloreto frrico 4,5%, reativo de Mayer, reativo de
Dragendorff, reativo de Bouchardat, reativo de Bertrand, reativo de Hager, cido
tnico a 1%, acetonitrila grau HPLC Tedia

, metanol grau HPLC Tedia

, gua filtrada
milli-Q

.

4.3 Preparo das amostras e mtodos

4.3.1. Identificao Morfolgica do Fruto
O fruto foi analisado macroscopicamente a fim de identificar a morfologia e
comparar com a literatura, comprovando assim, sua autenticidade. As caractersticas
morfolgicas do fruto de Noni descrita por Morton (1992) e McClathey (2002) so
formato ovalado, suculento, macio, praticamente inodoro at chegar a sua
maturao e quando maduro apresenta cheiro forte e ftido, superfcie grumosa
coberta de seces com formatos poligonais, 8 a 16 cm de dimetro, 4 a 7 cm de
largura, peso variando entre 50 a 300g e colorao verde at a fase de maturao e
quando maduro apresenta colorao branca esverdeada.

4.3.2. Ensaios de Identificao
Os ensaios de identificao foram realizados conforme protocolo descrito por
Costa (2001) para pesquisa de antraquinonas, cumarinas, flavonides e alcalides,
conforme descrito em literatura como metablitos secundrios presentes no Noni.
Foram realizados para todas as amostras, autnticas e comerciais, do fruto do Noni.

PESQUISA DE HETEROSDEOS ANTRAQUINNICOS
31

Ferveu-se 1g das amostras em estudo com 30 ml de lcool a 75% v/v, durante
3 minutos. Filtrou-se o lquido obtido, ainda quente. Para caracterizao foi
transferido 10 ml do filtrado para um bquer de 40 ml (I) e 10 ml para outro bquer
(II), o contedo do bquer I foi acidificado com 0,5 ml de HCl SR e fervido por 2 min.
O mesmo foi realizado com o bquer II, porm sem adio do cido. Os lquidos
obtidos foram transferidos para tubos de ensaio e, aps resfriamento, foi adicionado
a cada um, 10 ml de ter etlico. Os tubos foram agitados levemente e retirado uma
alquota de 5 ml dos tubos de ensaio I e II. Em ambos, foram adicionados 4 ml de
amnia SR, ficando a reao em repouso durante 5 min. Para resultado positivo de
heterosdeos antraquinnicos, a camada amoniacal dever ter uma colorao rsea,
conforme a quantidade de princpio ativo (agliconas libertadas das cadeias
glicdicas).

PESQUISA DE HETEROSDEOS CUMARNICOS
Extraiu-se 2g da amostra em 30 ml gua (a quente) e filtrado em papel filtro.
Foi adicionado 1 ml de HCl 1 N (at pH 1) e transferido para funil de separao para
extrao com 10 ml de ter etlico. O volume foi reduzido e a parte etrica foi
gotejada sobre papel de filtro. Acrescentou-se 1 gota de NaOH 1N na regio do
papel filtro em que foi aplicado o extrato etreo e observado sob luz UV. A reao
positiva para heterosdeos cumarnicos se desenvolver fluorescncia verde.

PESQUISA DE HETEROSDEOS FLAVONIDES
Foi feita extrao com 7g da amostra em 60 ml de etanol a 70% e submetido a
fervura por 5 minutos. Aps, foi filtrado em papel filtro previamente umedecido com
etanol 70% e reservado para as reaes. As caracterizaes foram feitas atravs
das reaes relacionadas com o ncleo fundamental e com as hidroxilas fenlicas.
Para a pesquisa de heterosdeos flavonides relacionados com o ncleo
fundamental foram realizadas as reaes de Shinoda, Oxalo-Brica e com H
2
SO
4

concentrado. Para a reao de Shinoda foi transferido 3 ml do filtrado para um tubo
de ensaio, adicionado cerca de 1 cm de fita de magnsio finamente cortada e 1 ml
de HCl concentrado. A cor desenvolvida foi observada e anotada. Para a reao
oxalo-brica foi evaporado 5 ml da soluo extrativa em cpsula de porcelana,
adicionado ao resduo semi-seco 3 ml de soluo de cido brico a 3% e 1 ml de
32

soluo de cido oxlico a 10% e evaporado at secura. Adicionou-se ao resduo
seco 7 ml de ter etlico e observado em luz ultravioleta, sendo a reao positiva
para a fluorescncia amarelo-esverdeada. Por fim, para a reao com H
2
SO
4

concentrado foi adicionado 3 ml da soluo extrativa em cpsula de porcelana,
evaporada at semi-secura e adicionado 0,5 ml de H
2
SO
4
concentrado. A reao foi
observada sob luz ultravioleta e a colorao desenvolvida anotada.
Para a pesquisa de heterosdeos flavonides relacionados a hidroxilas
fenlicas, foram realizadas as reaes com os hidrxidos alcalinos, cloreto de
alumnio e cloreto frrico. Para a reao com os hidrxidos alcalinos, retirou-se uma
alquota de 3 ml da soluo extrativa para um tubo de ensaio, adicionou-se 1 mL de
NaOH 20% e agitou-se o tubo, observando a colorao desenvolvida. Para a reao
com o cloreto de alumnio, uma alquota de 5 mL da soluo extrativa foi tranferida
para uma cpsula de porcelana. Quando a soluo atingiu a metade do volume
inicial, transferiu-se para um pedao de papel, umedeceu-se com cloreto de alumnio
a 5% e observou-se a fluorescncia sob luz ultravioleta. A reao com cloreto frrico
foi realizada transferindo-se 3 mL da soluo extrativa para um tubo de ensaio,
sendo a seguir adicionadas 2 gotas de cloreto frrico a 4,5% e obervado a colorao
desenvolvida.

PESQUISA DE ALCALIDES
Pesou-se 2g das amostras, adicionou-se 20 mL de cido sulfrico a 5% ,
ferveu-se por 3 minutos e filtrou-se em algodo, sendo aps resfriado e reservado o
filtrado. Transferiu-se o filtrado para funil de separao, alcalinou-se com NH
4
OH a
10% e realizou-se extrao com 2 pores de 10 mL de clorofrmio. O clorofrmio
do filtrado foi evaporado em rotaevaporador, o resduo dissolvido em 2 mL de cido
sulfrico a 5%, sendo adicionado de 2 a 3 gotas em tudo de ensaio e, 3 a 6 gotas
dos reativos gerais dos alcalides. Posteriormente, foram obervandas as coloraes
desenvolvidas. Os reativos gerais dos alcalides so: Mayer, Dragendorff,
Bouchardat, Bertrand, Hager e cido Tnico a 1%.

4.3.3. Cromatografia em Camada Delgada
A CCD foi realizada com intuito de detectar presena de rutina, escopoletina e
cido deacetilasperulosdico nas amostras de fruto. Para a realizao da CCD
33

pesou-se 500 mg das amostras cpsula 1, cpsula 2, cpsula 3 e extrato seco, e 1 g
das amostras fruto fresco e fruto desidratado que foram diludas em 1 mL de etanol.
As amostras de extrato lquido comercial e extrato lquido auriana foram utilizadas
sem prvia diluio. Aps pesagem das amostras e adio de etanol foram
submetidas a ultrassom por 15 minutos, filtradas em filtro Millex

descartvel e
armazenado em frascos Eppendorf

. As placas cromatogrficas foram de silica gel


F254 da Silicycle

tamanho 10x20 cm e aplicado 5 L de cada amostra com auxlio


de micropipeta. O padro da escopoletina foi preparado a 1 mM e o da rutina a 1
mg/mL. Utilizou-se cuba cromatogrfica previamente saturada com o vapor da fase
mvel composto de diclorometano para escopoletina; acetato de etila:cido
frmico:gua, v/v/v, 7:1,5:1,7 para a rutina e diclorometano:metanol:gua, v/v/v,
13:6:1 para o cido deacetilasperulosdico (WEST; DENG, 2010). Para revelao da
placa com escopoletina foi utilizado luz ultravioleta 365nm (WEST; DENG, 2010),
para a rutina spray reagente NP-PEG (difenilborato de aminoetanol) para deteco
de flavonides e luz ultravioleta 365nm (WAGNER; BLADT, 2001) e para o cido
deacetilasperulosdico spray reagente com 2% de anisaldedo e 10% com cido
sulfrico em etanol (WEST; DENG, 2010).

4.3.4. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
A CLAE foi realizada com intuito de confirmar os resultados obtidos por CCD,
por ser um mtodo mais eficiente. Para realizao do CLAE pesou-se 2 g das
amostras fruto maduro, fruto desidratado, extrato seco e cpsula 1, solubilizou-se em
2 mL de metanol, permaneceu em ultrassom por 20 e filtrou-se em filtro Millex

descartvel. Para as amostras cpsula 2 e cpsula 3 pesou-se 2 g, solubilizou-se em
3 mL de metanol, permaneceu em ultrassom por 20 e filtrou-se em filtro Millex

descartvel. As amostras extrato lquido auriana e extrato lquido comercial foram
diretamente filtradas em filtro Millex

descartvel, sem prvia diluio. O padro de
escopoletina foi preparado a 0,064 mg/mL e o da rutina a 0,2 mg/mL.
A anlise foi realizada em um cromatgrafo lquido de alta eficincia Waters


(Massachussets, USA) equipado com bomba quaternria, modulo de separao
e2695 com detector de Photodiodo Array (PDA 2998).
As separaes cromatogrficas foram conduzidas em coluna Zorbax XDB

C18
5 m (25 cm de comprimento x 4,6 mm de interno) mantida em temperatura de
34

30C, empregando como fase mvel acetonitrila:metanol:gua milli-Q acidificada
com 2% de cido actico (10:17:73, v/v/v) (DENG; WEST; JENSEN, 2010; ZU et al.,
2006), com volume de injeo de 10L, sob fluxo gradiente de 2.0 mL.min
-1
por 28
minutos e deteco UV em 350nm. A aquisio e anlise dos dados foram otidas
pelo software Empower

.
O teor foi calculado somente para as amostras positivas, sendo fruto maduro,
fruto desidratado, cpsula 1 e cpsula 2 para escopoletina e rutina, e extrato lquido
auriana somente para escopoletina. A frmula para clculo do teor foi:


4.3.5. Voltametria de Pulso Diferencial (VPD) em estado slido

PREPARO DA PASTA DE CARBONO
As amostras do fruto maduro, fruto desidratado, extrato seco, extrato lquido
auriana, extrato lquido comercial, cpsulas 1, 2 e 3 foram previamentes preparadas
a 10%, seguindo-se o seguinte protocolo: 1) Pesagem de 2 g de cada amostra slida
(fruto maduro, fruto desidratado, extrato seco e cpsulas) ou 2 mL de cada amostra
lquida (extrato lquido auriana e extrato lquido), 2) Transferncia para frasco e
adio de 20 mL de etanol PA 95%, 3) Extrao por sonicao por 1 h, 4) Filtrao
em papel filtro quantitativo Quanty

JP42 faixa azul com poros de 8 m, 5)


Armazenamento em tubos Falcon

. Aps, alquotas de 250 L foram misturas com


70 mg de grafite em p, submetido secagem por 24 h temperatura ambiente,
adicionado 20 mg de leo mineral e homogeineizado at formao de uma pasta.
Essas pastas foram utilizadas no preparo dos eletrodos e submetidos ao ensaio
voltamtrico da VPD para anlise eletroqumica.
Para anlise eletroqumica da escopoletina, as manchas observadas nas
cromatoplacas correspondentes frao de escopoletina das amostras e padro
foram cuidadosamente raspadas com esptula de plstico, recolhidas e
armazenadas em frasco Ependorff

temperatura ambiente. As manchas raspadas
foram apenas das amostras positivas para escopoletina, padro e branco (silica), e a
quantidade foi proporcional ao tamanho da mancha, sendo 2 mg de fruto fresco; 2,7
mg de fruto desidratado; 1,5 mg de extrato lquido auriana; 2,1 mg de cpsula 1; 3,4
35

mg de cpsula 2; 3,5 mg de padro e 3,5 mg do branco. As alquotas das amostras,
padro e branco foram misturadas com 70 mg de grafite em p e 20 mg de leo
mineral e homogeneizadas at formao de uma pasta. Essas pastas foram
utilizadas no preparo dos eletrodos e submetidos ao ensaio voltamtrico da VPD
para determinao quantitativa de escopoletina.

ENSAIO VOLTAMTRICO
A anlise da VPD foi realizada num Potenciostato/Galvanostato AUTOLAB


da Eco Chemie (Holanda) acoplado ao software GPES verso 4.9 para aquisio de
dados; conectado a uma clula eletroqumica com sistema de trs eletrodos
(trabalho, referncia e auxiliar). Os eletrodos de trabalho foram eletrodos de pasta de
carbono preparadas conforme descrito anteriomente, o eletrodo auxiliar foi de espiral
de platina e o eletrodo de referncia de calomelano. Para pesagem dos
componentes da pasta utilizou-se uma balana analtica Radwag XA110.
As medidas foram feitas em clula eletroltica contendo 8 mL de soluo
tampo fosfato 0,1 mol.L
-1
, pH 7,0 como eletrlito suporte, velocidade varredura de
10 mV.s
-1
e faixa de varredura de -0,25 a 1,25 V.
Os voltamogramas obtidos foram tratados com o software Origin 6.0.

4.3.6. Atividade Antioxidante
A anlise do potencial antioxidante foi obtida atravs do mtodo do DPPH,
seguindo protocolos estabelecidos pela literatura (BRAND-WILLIAMS; CUVELIER;
BERSET, 1995). As amostras foram previamentes preparadas a 10%, seguindo-se o
seguinte protocolo: 1) Pesagem de 2 g de cada amostra slida (fruto fresco, fruto
desidratado, extrato seco e cpsulas) ou 2 mL de cada amostra lquida (extrato
lquido comercial e extrato lquido auriana), 2) Transferncia para frasco e adio de
20 mL de etanol PA 95%, 3) Extrao por sonicao por 1 h, 4) Filtrao em papel
filtro quantitativo Quanty

JP42 faixa azul com poros de 8 m, 5) Armazenamento


em tubos Falcon

.
Para a preparao da soluo-me pesou-se 0,010g do radical DPPH que foi
diludo com etanol PA 95% em balo volumtrico de 100mL protegido com papel
alumnio, solubilizados em ultrasom por 1h e deixando em repouso por 24h em
geladeira. Aps, misturou-se 1mL da soluo-me com 2mL de etanol PA 95%,
36

realizando leitura em espectrofotmetro UV/Visvel Quimis

com comprimento de
onda de 517nm e absorbncia de 0,7 sendo este o controle positivo do teste. As
alquotas testadas foram de 50, 100 e 250 L de cada amostra, todas realizadas em
triplicata. A quantidade de DPPH remanescente foi calculada pela absorbncia lida
aps 3 minutos e a mdia das triplicatas foi utilizada para calcular a % de inibio do
DPPH atravs da equao % inibio = 1- [abs
DPPH
abs
f
/ abs
DPPH
] x 100. Para
saber o volume de amostra para inibir o radical em 50% (CE
50
) foi aplicado regra de
trs simples entre as mdias das alquotas (133,33 L) e as mdias da % de
inibio, segundo o esquema:

133,33 L mdia das % inibio
CE
50
(L) 50%


























37

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1. Identificao Morfolgica do Fruto

As 10 unidade de fruto foram analisadas macroscopicamente quanto ao
comprimento, largura, peso, formato, odor, aspecto da superfcie e colorao
segundo Morton (1992) e McClathey (2002).
Os frutos maduros apresentaram, em mdia, comprimento de 10,8 cm; largura
de 5,9 cm; peso de 167,4g; formato ovalado, odor forte e ftido, superfcie grumosa
coberta de seces com formatos poligonais e colorao branca esverdeada.
Diante anlise morfolgica, seguindo os parmetros descritos em literatura,
pode-se inferir que o fruto maduro adquirido uma amostra autntica de fruto de
Noni, e, neste estudo, ser a amostra de referncia frente as amostras comerciais.

5.2. Ensaios de Identificao

PESQUISA DE HETEROSDEOS ANTRAQUINNICOS
O reconhecimento de heterosdeos antraquinnicos pode ser feito atravs da
reao de Borntraeger, que consiste na formao de fenatos de amnia, de
colorao rsea, aps a extrao das agliconas livres e das libertadas por hidrlise
cida. Nesta reao, a cor desenvolvida, em no mximo 5 minutos, devido as
formas antraquinnicas (dicetona). A colorao se intensifica progressivamente, por
oxidao das formas reduzidas antrona e antranol em antraquinona (COSTA,
2001).
A pesquisa de antraquinona nas amostras autntica e comerciais de fruto de
Noni no desenvolveram colorao rsea na camada amoniacal, logo, podemos
inferir que no h presena de antraquinonas, pois este metablito encontra-se
abundante nas raizes do Noni e no no fruto, conforme LISHUANG et al., 2011;
WITAYASINTHANA; SHOTIPRUK, 2009 e ANEKPANKUL et al., 2007.

PESQUISA DE HETEROSDEOS CUMARNICOS
A pesquisa de heterosdeos cumarnicos positiva quando se observa sob luz
UV fluorescncia verde. A amostra autntica e as amostras comerciais de fruto
desidratado, extrtao lquido auriana e cpsulas 1, 2 e 3 desenvolveram tal colorao,
38

sendo reao positiva para cumarinas. A reao foi negativa para as amostras
comerciais de extrato seco e extrato lquido comercial, ou seja, ausncia de
marcadores cumarnicos. A resposta positiva esperada para as amostras de fruto
de Noni, visto que o principal marcador, a escopoletina, uma cumarina encontrada
nas folhas e frutos, segundo WEST; DENG, 2010 e POTTERAT et al., 2007.

PESQUISA DE HETEROSDEOS FLAVONIDES
Os flavonides so compostos naturais que possuem como ncleo
fundamental o benzopirano ou cromano, podendo ocorrer no estado livre, ou mais
comumente, como O-glicosdeos, embora exista um nmero considervel de C-
glicosdeos. Os heterosdeos flavonides tm agliconas derivadas dos seguintes
ncleos: chalconas e diidrochalconas, flavonas e flavanonas, isoflavonas e
isoflavanonas, flavonol, auronas e mais recentemente os neoflavonoides. A pesquisa
e identificao dos compostos flavonides baseia-se em reaes caractersticas do
ncleo fundamental benzopirano e em reaes caractersticas de hidroxilas
fenlicas.
Nas amostras autntica e comerciais de fruto de Noni, as reaes relacionadas
com o ncleo fundamental esto relacionadas abaixo, no Quadro 3.

Quadro 3 Pesquisa qualitativa de flavonides, relacionados ao ncleo fundamental, nas amostras
autntica e comerciais de fruto de Noni.
Amostras Reao de
Shinoda
Reao Oxalo-brica Reao com
H
2
SO
4
conc
Fruto Maduro Amarelo-claro Amarelo-esverdeado violeta
Fruto Desidratado Castanho Amarelo-esverdeado violeta
Extrato Seco Amarelo-claro Amarelo-esverdeado violeta
Extrato Lquido Auriana Amarelo-claro Amarelo-esverdeado violeta
Extrato Lquido Comercial Amarelo-claro Amarelo-esverdeado violeta
Cpsula 1 Castanho-claro Amarelo-esverdeado violeta
Cpsula 2 Castanho Amarelo-esverdeado violeta
Cpsula 3 Castanho Amarelo-esverdeado violeta

39

Para a reao de Shinoda o desenvolvimento de colorao laranja, vermelha e
violeta infere a presena de flavonas, flavonis e flavanonas, respectivamente, e
todas as amostras no desenvolveram tais coloraes.
Na reao Oxalo-brica a colorao para presena de flavonides amarelo-
esverdeada, e todas as amostras desenvolveram tal colorao.
Na reao com H
2
SO
4
concentrado, a fluorescncia desenvolvida deve ser
violeta para indicar a presena de flavonides, e todas as amostras desenvolveram
tal colorao.
Nas amostras de fruto de Noni, as reaes de caracterizao de hidroxilas
fenlicas esto relacionadas abaixo, no Quadro 4.

Quadro 4 - Pesquisa qualitativa de flavonides, relacionados s hidroxilas fenlicas, nas amostras
autntica e comerciais de fruto de Noni.
Amostras Reao com
Hidrxidos
Alcalinos
Reao com
Cloreto de
Alumnio
Reao com
Cloreto Frrico
Fruto Maduro Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Fruto Desidratado Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Extrato Seco Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Extrato Lquido
Auriana
Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Extrato Lquido
Comercial
Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Cpsula 1 Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Cpsula 2 Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro
Cpsula 3 Laranjado Amarelo-escuro Verde-escuro

Na reao com hidrxidos alcalinos a colorao para presena de flavonides
amarela, e todas as amostras desenvolveram colorao amarelo-escuro,
evidenciando a presena de flavonides.
Na reao com cloreto de alumnio a colorao para presena de flavonides
fluorescncia amarela intensa quando observado sob luz UV, e todas as amostras
analisadas desevolveram colorao amarelo, indicando a presena de flavonides.
40

Na reao com cloreto frrico a colorao para presena de flavonides pode
ser varivel entre amarelo, verde, azul, castanho e violeta, e todas as amostras
desenvolveram colorao verde-escuro.
Diante as reaes para pesquisa de flavonides o desenvolvimento das
coloraes descritas acima indica a presena de flavonides para todas as
amostras, autnticas e comerciais.

PESQUISA DE ALCALIDES

Os alcalides so compostos naturais, nitrogenados, oxigenados ou no, com
um tomo de nitrognio geralmente pertencente a um ncleo heterocclico. Possuem
carter bsico e o processo de extrao se baseia na sua solubilidade, assim, os
alcalides na forma livre so solveis em solventes orgnicos apolares e insolveis
em gua, e quando combinados, formam sais de alcalides, tornando-se solveis
em gua e insolveis em solventes orgnicos apolares. A pesquisa dos alcalides
baseia-se nos chamados reagentes gerais dos alcalides (COSTA, 2001). Estes
reagentes so utilizados para caracterizao dos alcalides por precipitao, e
podem ser agrupados em:
1. Reagentes iodados: precipitam os alcalides das solues cidas, sob a
forma de poli-iodetos complexos.
a) Reativo de Mayer (tetra-iodomercurato de potssio): precipitado branco.
b) Reativo de Dragendorff (iodo-bismutato de potssio): precipitado vermelho
tijolo.
c) Reativo de Bouchardat (soluo aquosa de iodo em iodeto de potssio):
precipitado marron-avermelhado.
2. Policidos minerais complexos: precipitam os alcalides em meios cidos ou
neutros na forma de compostos amorfos ou cristalinos.
a) Reativo de Bertrand (cido slico-tungstico a 1%): precipitado branco.
3. Base de cidos orgnicos: precipitam os alcalides de solues cidas ou
neutras formando compostos cristalinos que dissolvem-se na presena de lcalis.
a) Reativo de Hager (cido pcrico a 2%): precipitado amarelo.
b) cido Tnico a 1%: precipitado bege.
A pesquisa de alcalides foi negativo para todas as amostras, autnticas e
comerciais, no apresentando nenhuma turvao ou precipitao de alcalides. Este
41

fato pode ser justificado pela ausncia de dados cientficos que confirmem a
presena de alcalide no fruto do Noni, ficando apenas restrito ao alcalide xeronina
patenteada por Heinicke em 1985 (HEINICKE, 1985), porm sem comprovao
cientfica (MCCLATHEY, 2002).

5.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Com o intuito de detectar os marcadores majoritrios do fruto do Noni foi
realizado cromatografia em camada delgada das amostras, autnticas e comerciais,
dos padres rutina e escopoletina, e para o cido deacetilasperulosdico foi feito
apenas comparativo com literatura, devido a falta do padro. A distncia percorrida
pela fase mvel foi de 8 cm para todas as placas. O coeficiente de variao aceitvel
para o fator de reteno foi de 15%, segundo validao do mtodo de cromatografia
em camada delgada realizada por Valentini, Sommer e Matioli (2004).
Na Figura 10 foi realizada CCD do padro de escopoletina e de todas as
amostras e a evidncia da presena de escopoletina so manchas azul-fluorescente
observadas em luz UV 365nm e fator de reteno (Fr) de 0,1350,02.


Figura 10 - Placa cromatogrfica de CCD na pesquisa de escopoletina nas amostras de fruto de
Noni. Amostras: Escopoletina (Padro), fruto maduro (1), fruto desidratado (2), extrato seco (3),
extrato lquido auriana (4), extrato lquido comercial (5), cpsula 1 (6), cpsula 2 (7), cpsula 3 (8).

As manchas azul-fluorescente foram observadas nas amostras fruto maduro,
fruto desidratado, extrato lquido auriana, cpsula 1 e cpsula 2 com os Fr de 0,14;
0,13; 0,14; 0,13; 0,13 respectivamente. Nesse sentido, podemos inferir que nas
amostras fruto maduro, fruto desidratado, extrato lquido auriana, cpsula 1 e
cpsula 2 foram detectados presena do marcador escopoletina, j nas amostras
1 Padro 2 3 4 5 6 7 8
42

extrato seco, extrato lquido comercial e cpsula 3 no foi observado a presena de
escopoletina.
Na Figura 11 foi realizado CCD do padro de rutina e de todas as amostras, e
a evidncia da presena de rutina so manchas amarelas aps revelao com spray
reagente para deteco de flavonides NP-PEG e visualizao em luz UV 365nm. O
Fr do padro foi de 0,560,08.


Figura 11 - Placa cromatogrfica de CCD na pesquisa de rutina nas amostras de fruto de Noni.
Amostras: Rutina (Padro), fruto maduro (1), fruto desidratado (2), extrato seco (3), extrato lquido
auriana (4), extrato lquido comercial (5), cpsula 1(6), cpsula 2 (7) e cpsula 3 (8).

As manchas amarelas foram observadas nas amostras fruto maduro, cpsula 1
e cpsula 2 com os Rf de 0,55; 0,55 e 0,55 respectivamente. Como o spray reagente
de NP-PEG especfico para flavonides e cidos fenlicos o aparecimento de
manchas azuis indica presena de compostos fenlicos.
Na Figura 12 foi realizado a CCD de todas as amostras para deteco do cido
deacetilasperulosdico de acordo com West e Deng (2010) a fim de comparar os
resultados. Evidencia presena do cido deacetilasperulosdico o aparecimento de
manchas azul escuro aps revelao com spray reagente de anisaldedo e calor. O
calor foi obtido por chapa de aquecimento pr-aquecida 30C. No trabalho
realizado por West e Deng (2010) foram detectadas as manchas azuis com Fr de
0,30,04 e no presente trabalho as manchas foram detectadas nas amostras fruto
maduro, fruto desidratado, extrato lquido auriana, cpsula 1 e cpsula 2 com o Rf
de 0,3; 0,31; 0,3; 0,33 e 0,32 respectivamente. O aparecimento das manchas azuis
com fator de reteno correspondente ao descrito no artigo sugere a presena do
cido deacetilasperulosdico de acordo com West e Deng (2010).
1 2 3 4 5 6 7 8 Padro
43



Figura 12 - Placa cromatogrfica de CCD na pesquisa de cido deacetilasperulosdico nas amostras
de fruto de Noni. Amostras: extrato seco (1), cpsula 1 (2), cpsula 2 (3), cpsula 3 (4), fruto
desidratado (5), fruto maduro (6), extrato lquido auriana (7) e extrato lquido comercial (8).

5.4 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
Com o objetivo de confirmar os resultados obtidos por CCD e a autenticidade
das amostras pela presena dos marcadores rutina e escopoletina, foi realizado
anlise por cromatografia lquida de alta eficincia para padres e amostras. Nos
cromatogramas foram analisados a presena de picos, o tempo de reteno (Tr) e o
espectro de absoro desses picos dos padres e, esses parmetros foram
comparados com as amostras. A fase mvel aplicada acetonitrila:metanol:gua
acidificada com 2% de cido actico mostrou-se seletiva ao mtodo utilizado, no
apresentando nenhuma interferncia dos picos, tanto dos padres, quanto das
amostras (Figura 13). O desvio padro aceitvel para o tempo de reteno foi de
2%, conforme descrito na Farmacopia Brasileira 5 edio (BRASIL, 2010a).
Figura 13 Cromatograma da fase mvel acetonitrila:metanol:gua acidificada utilizada na anlise
dos padres e amostras, mostrando que no interferiu no mtodo.

O perfil cromatogrfico do padro da escopoletina mostrou a presena de um
pico bem definido com tempo de reteno de 9,782 minutos ( 0,195 min) (Figura
A
U
0,000
0,002
0,004
0,006
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
1 2 3 4 5 6 7 8
44

14A) com dois mximos de absoro (229,9 e 344,0 nm) e um intermedirio em
296,2 nm (Figura 14C). A presena de um pico bem definido e espectro ultravioleta
com dois mximos de absoro caracterstico da cumarina escopoletina, de acordo
com Xia et al (2007).
O perfil cromatogrfico do padro de rutina mostrou a presena de um pico
bem definido com tempo de reteno de 12,421 minutos ( 0,248 min) (Figura 14B)
com dois mximos de absoro (255,9 e 354,8 nm) (Figura 14D). De acordo com
Zuanazzi e Montanha (2003) os flavonis possuem espectros de absoro
caractersticos no ultravioleta, com dois mximos de absoro, um ocorrendo entre
240-285 nm e outro entre 352-385 nm.





















45




Figura 14 A: Cromatograma do padro da escopoletina (Tr = 9,782 min). B: Cromatograma do
padro da rutina (Tr = 12,421 min). C: Espectro de absoro no UV com mximos de absoro de
229,9 e 344,0 nm para padro da escopoletina. D: Espectro de absoro no UV com mximos de
absoro de 255,9 e 354,8 nm para padro da rutina. Deteco no UV com comprimento de onda em
350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de materiais e
mtodos.

Com o intuito de comprovar a autenticidade das amostras analisadas neste
estudo, e tendo o fruto maduro como amostra autntica aps identificao
macroscpica, podemos comprovar diante os resultados de CCD e CLAE que no
fruto maduro foi identificado os dois marcadores do fruto de Noni, escopoletina e
rutina, pela presena de picos com tempo de reteno e mximo de absoro
semelhantes aos padres. No fruto maduro, o pico que caracteriza escopoletina teve
um Tr de 9,812 minutos e o pico da rutina Tr de 12,513 minutos (Figura 15A). Na
espectroscopia no ultravioleta, o pico da escopoletina obteve absoro em 229,9;
296,2 e 344,0 nm (Figura 15B); e o da rutina absoro em 255,9 e 354,8 nm (Figura
E
s
c
o
p
o
l
e
t
i
n
a

-

9
,
7
8
1
A
U
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
R
u
t
i
n
a

-

1
2
,
4
2
1
A
U
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00
9,782 Peak 1
209,9
229,9
296,2
344,0
A
U
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
12,421 Peak 1
219,3
255,9
354,8
A
U
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
A
B
C D
46

15C), resultados que quando comparado com os padres confirma a presena
destes compostos, logo a autenticidade da amostra.



Figura 15 A: Cromatograma da amostra do fruto maduro com presena dos picos para os
marcadores da escopoletina (Tr = 9,812 min) e da rutina (Tr = 12,513 min). B: Espectro de absoro
no UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm para escopoletina. C: Espectro de absoro
no UV com mximos de absoro de 255,9 e 354,8 nm para rutina. Deteco no UV com
comprimento de onda em 350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na
seo de materiais e mtodos.

Nesse mesmo sentido, foi confirmado atravs do perfil cromatogrfico por
CLAE que as amostras fruto desidratado, cpsula 1 e cpsula 2 so, de fato,
originrias do fruto de Noni por apresentarem os dois marcadores, rutina e
escopoletina.
Para o fruto desidratado o pico caracterstico da escopoletina e rutina tiveram
tempo de reteno de 9,748 min e 12,513 min, respectivamente (Figura 16A). Os
mximos de absoro para o pico da escopoletina foram de 229,9 e 344,0 nm
(Figura 16B); e para rutina de 255,9 e 354,8 nm (Figura 16C).

E
s
c
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p
o
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t
i
n
a

-

9
,
8
1
2
R
u
t
i
n
a

-

1
2
,
5
1
3
A
U
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
9,812 Peak 1
229,9
296,2
344,0
12,512 Peak 2
216,9 255,9
354,8
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
C
B
A
47



Figura 16 A: Cromatograma da amostra do fruto desidratado com presena dos picos para os
marcadores da escopoletina (Tr = 9,748 min) e da rutina (Tr = 12,427 min). B: Espectro de absoro
no UV com mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm para escopoletina. C: Espectro de absoro
no UV com mximos de absoro de 255,9 e 354,8 nm para rutina. Deteco no UV com
comprimento de onda em 350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na
seo de materiais e mtodos.

A amostra cpsula 1 apresentou dois picos com tempo de reteno de 9,742
e 12,427 minutos, valores que quando comparados com os padres infere ser pela
presena dos compostos escopoletina e rutina, respectivamente (Figura 17A). Os
espectros desses picos tambm confirma mximos de absoro semelhantes aos
padres, sendo de 229,9 e 344,0 nm para escopoletina (Figura 17B) e de 255,9 e
354,8 nm para rutina (Figura 17C).

E
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a

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,
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1
2
,
4
2
8
A
U
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
9,748 Peak 1
229,9
296,2
344,0
A
U
0,00
0,05
0,10
0,15
12,427 Peak 2
206,3
255,9
354,8
A
U
0,000
0,010
0,020
0,030
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
A
B
C
48



Figura 17 A: Cromatograma da amostra da cpsula 1 com presena dos picos para os marcadores
da escopoletina (Tr = 9,742 min) e da rutina (Tr = 12,442 min). B: Espectro de absoro no UV com
mximos de absoro de 229,9 e 344,0 nm para escopoletina. C: Espectro de absoro no UV com
mximos de absoro de 255,9 e 354,8 nm para rutina. Deteco no UV com comprimento de onda
em 350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de materiais e
mtodos.

A amostra cpsula 2 tambm apresentou dois picos bem caractersticos com
os os padres escopoletina e rutina, com tempo de reteno de 9,743 e 12,469
minutos (Figura 18A) e mximos de absoro de 231,1 e 344,0 nm para
escopoletina (Figura 18B); 255,9 e 356,0 para rutina (Figura 18C) que confirmam a
presena dos dois marcadores e a veracidade da amostra, em ser de fato com
origem do fruto de Noni.

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,
7
4
1
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-

1
2
,
4
4
2
A
U
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
9,742 Peak 1
211,0
229,9
290,3
344,0
A
U
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
12,442 Peak 2
204,0 255,9
354,8
A
U
0,000
0,010
0,020
0,030
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
A
B
C
49



Figura 18 A: Cromatograma da amostra da cpsula 2 com presena dos picos para os marcadores
da escopoletina (Tr = 9,743 min) e da rutina (Tr = 12,469 min). B: Espectro de absoro no UV com
mximos de absoro de 231,1 e 344,0 nm para escopoletina. C: Espectro de absoro no UV com
mximos de absoro de 255,9 e 356,0 nm para rutina. Deteco no UV com comprimento de onda
em 350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de materiais e
mtodos.

Para a amostra extrato lquido auriana, o perfil cromatogrfico apresentou
apenas 1 pico com Tr de 9,805 (Figura 19A) e mximos de absoro de 229,9 e
344,0 nm (Figura 19B), o que caracteriza presena apenas do marcador
escopoletina. Como o extrato foi obtido atravs do fruto, uma amostra autntica, o
mtodo de extrao pode ter degradado a rutina, j que o tempo de extrao foi de 6
meses temperatura ambiente em frasco de vidro transparente e armazenado em
local desconhecido, j que foi um processo de extrao artesanal. Segundo
Friedman e Jrgens (2000) os flavonides, por serem compostos polifenlicos, so
sensveis presena de metais, radiao ultravioleta, temperatura e hidrlise, fato
que pode justificar o no aparecimento do marcador rutina tanto na CCD quanto na
CLAE. A ausncia do marcador rutina no negativa a autenticidade da amostra do
extrato lquido auriana, visto que foi detectado um dos dois marcadores, que o
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,
7
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2
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A
U
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0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
9,743 Peak 1
207,5
231,1
293,9
344,0
A
U
0,00
0,02
0,04
12,469 Peak 2
207,5
255,9
356,0
A
U
0,000
0,010
0,020
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
A
B
C
50

produto foi obtido pela extrao de frutos maduro (amostra autntica) e por ter sido
um mtodo de extrao artesanal, a rutina pode ter sofrido degradao pela
exposio h algum dos fatores que podem favorecer esse processo.

Figura 19 A: Cromatograma da amostra do extrato lquido auriana com presena de um nico pico
para o marcador escopoletina (Tr = 9,805 min). B: Espectro de absoro no UV com mximos de
absoro de 229,9 e 344,0 nm para escopoletina. Deteco no UV com comprimento de onda em 350
nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de materiais e
mtodos.

Em contrapartida, as amostras do extrato seco, extrato lquido comercial e
cpsula 3 no apresentaram nenhum dos picos caractersticos para os marcadores
do fruto do Noni, escopoletina e rutina.
O perfil cromatogrfico do extrato seco (Figura 20A) apresentou dois picos com
tempo de reteno de 9,358 e 10,793 min, porm nenhum espectro UV semelhante
aos padres, mesmo considerando a variao do tempo de reteno pelo desvio
padro de 2%, sendo entre 9,586 a 9,977 minutos para escopoletina e 12,172 a
12,669 minutos para rutina. Assim, pela diferena entre os tempos de reteno dos
picos dos padres e das amostras, pode-se afirmar que no extrato seco no h
presena dos marcadores para o fruto de Noni, logo esta amostra no um produto
base de fruto de Noni.
Neste mesmo sentido, o cromatograma da amostra do extrato lquido comercial
(Figura 20B) tambm no apresentou picos caractersticos para os marcadores,


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,
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A
U
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0,020
0,030
0,040
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
9,805 Peak 1
229,9
296,2
344,0
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
A
B
51

houve apenas a deteco de 1 pico prximo ao tempo de reteno dos padres,
porm o Tr desse pico em 11,589 min elimina a possibilidade de ser de um dos
marcadores, mesmo considerando a variao do tempo de reteno pelo desvio
padro, sendo para escopoletina entre 9,586 a 9,977 minutos e para rutina entre
12,172 a 12,669 minutos. Assim, pode-se afirmar que o extrato lquido comercial no
um produto produzido a partir do fruto de Noni, sendo justificado pela ausncia dos
marcadores escopoletina e rutina.
Os cromatogramas do extrato seco e extrato lquido comercial no
apresentaram picos com tempo de reteno semelhantes aos padres, logo no
apresentaram os espectros de absoro caractersticos para os padres de
escopoletina e rutina.
Diferente do perfil cromatogrfico das amostras do extrato seco e extrato
lquido comercial, a cpsula 3 apresentou em seu cromatograma um pico
caracterstico do marcador escopoletina com Tr de 9,715 min (Figura 20C), porm,
ao analisar o espectro no UV (Figura 21), os mximos de absoro foram de 231,1 e
327,3 nm diferentes do padro, que tem dois mximos de absoro de 229,9 e 344,0
nm e um intermedirio de 296,2 nm; assim exclundo a possibilidade desse pico ser
do marcador escopoletina, logo inferindo que a cpsula 3 no foi manipulada a partir
de matria-prima extrada do fruto de Noni.










52




Figura 20 A: Cromatograma da amostra do extrato seco com presena de dois picos, prximos aos
padres, com Tr = 9,358 e 10,793 min. B: Cromatograma da amostra do extrato lquido comercial
com presena de um pico prximo aos padres com Tr = 11,589 min. C: Cromatograma da amostra
da cpsula 3 com presena de um pico prximo aos padres com Tr = 9,715 min. Deteco no UV
com comprimento de onda em 350 nm. Outras condies experimentais esto detalhadas no item
4.3.4 na seo de materiais e mtodos.



Figura 21 Espectro de absoro no UV da amostra cpsula 3 com mximos de absoro de 231,1
e 327,3 nm para o pico com Tr de 9,715 min. Deteco no UV com comprimento de onda em 350 nm.
Outras condies experimentais esto detalhadas no item 4.3.4 na seo de materiais e mtodos.
9
,
3
5
8
1
0
,
7
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0,010
0,015
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0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
1
1
,
5
8
9
A
U
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
A
U
0,00
0,10
0,20
0,30
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
9,715 Peak 1
204,0
231,1
327,3
A
U
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
nm
220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
A
B
C




9
,
7
1
5

53

Em uma anlise geral, o perfil cromatogrfico das amostras foram semelhantes
para ambos mtodos cromatogrficos, CCD e CLAE, em que foi confirmado a
autenticidade da amostra do fruto maduro e a origem das amostras comerciais do
fruto desidratado, cpsula 1 e cpsula 2, que, de fato, foram produzidas a partir do
fruto de Noni, pela presena dos marcadores escopoletina e rutina. A amostra do
extrato lquido auriana tambm tem origem comprovada, embora com qualidade
comprometida, que foi extrado do fruto de Noni, mesmo com a deteco apenas no
marcador escopoletina, mas a ausncia do marcador rutina pode ser justificada pelo
mtodo de extrao utilizado e pela sensibilidade dos compostos flavonides
fatores como radiao UV, temperatura, hidrlise que causam degradao deste
composto.
Em contrapartida, seguindo nesse mesmo raciocnio, as amostras comerciais
do extrato seco, extrato lquido comercial e cpsula 3 no so amostras com origem
comprovada a partir do fruto de Noni, diante os resultados da CCD e da CLAE. O
extrato lquido comercial e a cpsula 3 esto apenas rotuladas como produzidos a
partir de fruto de Noni, sem nenhum estudo comprobatrio ou nmero de registro
nos rgos regulamentadores, i.e., ANVISA, Ministrio da Agricultura, sendo apenas
produtos de venda livre destinados ao mercado popular, sem fiscalizao, mas no
deixando de ser produtos falsificados.
Porm, os resultados da amostra comercial do extrato seco, que confirmam
no originrio do fruto de Noni, preocupante, visto que este produto foi adquirido
de um renomado fornecedor de matrias-primas para o ramo farmacutico, com
laudo do fornecedor (Anexo 1) afirmando que um extrato seco de Morinda citrifolia,
nome cientfico do Noni, e que a parte da planta utilizada foi o fruto; mas que de fato
no foi, ou seja, trata-se de um produto falsificado.

TEOR DE ESCOPOLETINA E RUTINA
O clculo do teor foi aplicado com o objetivo de prever a quantidade dos
marcadores majoritrios, escopoletina e rutina, em relao aos padres, nas
amostras analisadas. O teor de escopoletina e rutina foram, respectivamente, fruto
maduro (8,37x10
-4
e 2,84x10
-3
%), fruto desidratado (4,96x10
-3
e 4,40x10
-3
%),
cpsula 1 (2,02x10
-3
e 4,26x10
-3
%) e cpsula 2 (2,02x10
-3
e 2,73x10
-3
%). Na
54

amostra extrato lquido auriana, foi encontrado apenas o marcador escopoletina com
teor de 0,9%.
A amostra com maior teor de escopoletina foi o extrato lquido auriana e com
maior teor de rutina foi a cpsula 1.

5.5 Voltametria de Pulso Diferencial (VPD) em estado slido
Com o objetivo de avaliar e comparar mtodos eletroqumicos frente aos
cromatogrficos, foi realizado a voltametria de pulso diferencial em estado slido.
A VPD a tcnica voltamtrica mais sensvel, quando comparada a voltametria
cclica e de onda quadrada; e por ser uma tcnica diferencial, quando essa diferena
de potencial plotada em funo da rampa linear do potencial aplicado, resulta em
voltamograma em forma de pico. Nesta tcnica um pulso de potencial extra
aplicado na forma de rampa e a corrente resultante amostrada de forma diferencial
favorece que boa parte da corrente capacitiva, ou seja, corrente no Faradaica (no
associada ao processo redox) seja eliminada (GIL, 2011).
Neste sentido, foi utilizado o mtodo da voltametria de pulso diferencial em
estado slido em todas as amostras a fim de avaliar os parmetros eletroqumicos e
compara-los aos resultados cromatogrficos.

PREPARO DOS EPC
Como mtodo de preparao do EPC 1, utilizou-se a tcnica de formao de
compsito, onde misturou-se as amostras previamente preparadas (modificador),
como descrito no material e mtodos, com o grafite em p (condutor eltrico) e
homogeineizado com a adio de leo mineral (aglutinante).
Para o EPC 2, tambm foi utilizado a tcnica de formao de compsito, em
que misturou-se as amostras de manchas de silica contendo o analito (modificador),
raspadas das cromatoplacas para pesquisa de escopoletina (Figura 22), com o
grafite em p (condutor eltrico) e homogeineizado com a adio de leo mineral
(aglutinante).
sabido que a modificao de EPCs com propores exatas da espcie
eletroativa de interesse pode, segundo a Lei de Faraday, fornecer dados qualitativos
(BARA et al., 2006; REIS et al., 2009).
55


Figura 22 Cromatoplaca na anlise de escopoletina raspadas para compor os EPCs aps eluio
em fase mvel composta por diclorometano. Amostras: Escopoletina (Padro), fruto maduro (1), fruto
desidratado (2), extrato seco (3), extrato lquido auriana (4), extrato lquido comercial (5), cpsula 1
(6), cpsula 2 (7), cpsula 3 (8).

A Figura 23 apresenta os voltamogramas de pulso diferencial obtidos em
estado slido, com eletrodos EPC 1, para as amostras do fruto maduro, fruto
desidratado, extrato seco, extrato lquido auriana e extrato lquido comercial.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
2a'
1a
2a
3a
2a
1a

500 nA
E / V (vs Ag/AgCl/KCl
sat
)

Figura 23 - Voltamogramas de Pulso Diferencial obtidos em Tampo Fosfato 0.1 M, pH 7.0 para
eletrodos de pasta de carbono modificados com 250 L das amostras (- - -) extrato seco; () extrato
lquido auriana; (--) fruto maduro; (--) fruto desidratado; () extrato lquido comercial. Amplitude de
Pulso 50 mV, velocidade de varredura 10 mV s
-1
.

Para a amostra do fruto maduro foi observado a presena de 3 picos bem
definidos com parmetros eletroqumicos de 0,17 V (0,6 A); 0,46 V (0,4 A) e 0,72
V (0,6 A) para os picos andicos 1a, 2a e 3a, respectivamente (Figura 23). Esse
perfil voltamtrico, com presena de 3 picos, pode ser utilizado como parmetro de
identificao de amostras obtidas partir de fruto de Noni, j que o fruto maduro
comprovadamente uma amostra autntica.
Padro 1 2 3 4 5 6 7 8
56

Os resultados obtidos para amostra do extrato lquido auriana (Figura 23) foram
relativamente semelhantes ao fruto maduro, porm com nveis de correntes
superiores. Observou-se 3 picos andicos, 1a, 2a e 3a em 0,09; 0,40 e 0,77 V, cujas
intensidades de correntes medidas foram de 0,8; 0,6 e 2,6 A, respectivamente.
Pode-se inferir que os picos 1a, 2a e 3a do fruto maduro e do extrato lquido
auriana se correspondem, sugerindo a presena de espcies eletroativas com perfil
de oxidao semelhantes, at por serem produtos de mesma origem, como
comprovado pelos ensaios cromatogrficos. O deslocamento observado para os
potenciais correspondente aos picos andicos, 1a, 2a e 3a (Figura 23) pode estar
relacionado a inerente complexidade fsica e qumica das diferentes amostra.
J no caso do extrato seco (Figura 23) observou-se apenas 1 pico bem
definido, 2a em 0,3 V com intensidade de corrente de 4,9 A e 2 ombros, aqui
nomeados como picos, 1a e 2a, em 0,12 e 0,42 V com intensidade de corrente 2,9 e
3,9 A, respectivamente. O perfil do extrato seco apresentou-se diferente pela
presena de um nico pico bem definido e com alto potencial de oxidao (2a) e o
desaparecimento do pico 3a. Essa grande diferena entre os parmetros
eletroqumicos observados pelos voltamogramas do fruto maduro e do extrato seco
justificado pelos resultados da cromatografia, que mostrou a no autenticidade do
extrato seco, logo um produto falsificado e, pela anlise voltamtrica, possivelmente
adulterado com substncias potencialmente eletroativas, devido ao alto valor de I
pa

do pico 2a, sugerindo alta concentrao de espcies eletroativas pelo alto valor de
corrente, segundo a Lei de Faraday.
Nas amostras do extrato lquido comercial e fruto desidratado (Figura 23) no
foram detectados picos de oxidao, fato que pode estar relacionado ao preparo da
pasta de carbono, a concentrao de espcies eletroativas e a origem do produto,
que podem interferir nos potencias e na oxidao das espcies eletroativas.
Especificamente, neste caso, pode-se sugerir que o no aparecimento dos 3 picos
caractersticos para amostra base de fruto de Noni foi, para o fruto desidratado,
pelo mtodo de preparao da amostra que pode ter diludo significativamente as
substncias eletroativas presentes, j que esta amostra foi comprovada como de
origem do fruto de Noni pelos mtodos cromatogrficos da CCD e CLAE. Para o
extrato lquido comercial, a possvel explicao foi pela ausncia de espcies
57

eletroativas, j que houve comprovao pelos mtodos cromatogrficos que trata-se
de uma amostra que realmente no foi produzida a partir de fruto de Noni.
Na Figura 24, esto representados os voltamogramas obtidos das amostras
cpsula 1, 2 e 3.

Figura 24 - Voltamogramas de Pulso Diferencial obtidos em Tampo Fosfato 0.1 M, pH 7.0 para
eletrodos de pasta de carbono modificados com 250 L das amostras () cpsula 1; (--) cpsula 2;
() cpsula 3. Amplitude de Pulso 50 mV, velocidade de varredura 10 mV s
-1
.

Para as cpsulas 1 e 2 observaram-se 3 picos, 1a, 2a e 3a, tendo para a
cpsula 1 potenciais em 0,13; 0,4 e 0,78 V com intensidade de corrente de 2,5; 3,28
e 9,37 A, respectivamente; e para a cpsula 2 os parmetros eletroqumicos foram
respectivamente de 0,12 V (6,78 A); 0,41 V (1,01 A) e 0,64 V (1,21 A). A
presena de 3 picos para as cpsula 1 e 2 sugere origem a partir de fruto de Noni,
pela semelhana com o perfil eletroqumico do fruto maduro. Assim, pode-se afirmar
que as amostras cpsulas 1 e 2 foram obtidas a partir de matrias-primas obtidas de
fruto de Noni, o que foi comprovado pelos ensaios cromatogrficos. O deslocamento
observado para os potenciais da cpsula 2, correspondente aos picos andicos (1a,
2a e 3a) podem estar relacionado a inerente complexidade fsica e qumica das
diferentes amostra (Figura 24).
Em contrapartida, o perfil voltamtrico da amostra cpsula 3 (Figura 24)
apresentou-se diferente da amostra autntica (fruto maduro) com a presena de 5
picos andicos 1a, 2a, 2a, 3a e 3a com potenciais de 0,16; 0,31; 0,42; 0,77 e 0,61 V
e intensidades de correntes de 4,1; 8,8; 9,1; 1,6 e 3,7 A, respectivamente. Este
fato, relacionado com os resultados cromatogrficos, afirma que a cpsula 3 no foi
obtida de matria-prima base de fruto de Noni. Os altos valores de corrente sugere
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
1a
1 A

3a'
2a'
1a
3a
2a
2a
E / V (vs Ag/AgCl/KCl
sat
)
58

que essa amostra pode ter sido produzida a partir de matria-prima rica em
substncias eletroativas, segundo a Lei de Faraday.
Os resultados obtidos pela tcnica voltamtrica da VPD podem ser
correlacionados com os obtidos pelas tcnicas cromatogrficas, j que diante o perfil
eletroqumico da amostra autntica possvel sugerir a origem das amostras
comerciais, e os resultados analisados foram semelhantes para as duas tcnicas.
Logo, esse mtodo eletroqumico pode ser til na identificao de amostras
comerciais base de fruto de Noni.
Com o objetivo de analisar o perfil voltamtrico das amostras em que foram
identificados o marcador escopoletina, a Figura 25 mostra os voltamogramas da
VPD em estado slido obtidos com eletrodos EPC 2 para as amostras fruto maduro,
fruto desidratado, cpsula 1 e cpsula 2. O padro foi obtido da mancha referente ao
padro escopoletina e o branco da mancha contendo apenas silica e fase mvel.


Figura 25 Voltamogramas de Pulso Diferencial obtidos em Tampo Fosfato 0.1 M, pH 7.0 para
eletrodos de pasta de carbono modificados com manchas raspadas da cromatoplaca para pesquisa
de escopoletina das amostras fruto maduro (FRE), fruto desidratado (DES), cpsula 1 (CAP1) e
cpsula 2 (CAP2) contendo escopoletina, do padro (PAD) e do branco (SIL) contendo silica.
Amplitude de Pulso 50 mV, velocidade de varredura 10 mV s
-1
.

O perfil voltamtrico do padro de escopoletina apresentou apenas 1 pico, bem
definido, com I
pa
= 7,58 A e E
pa
= 0,49 V, parmetros que sero comparados s
amostras. O branco, composto de silica, teve um leve pico com I
pa
= 0,67 A e Epa =
0,59 V, que exclui a presena do composto escopoletina pelo baixo valor de I
pa
, logo
59

mnimas quantidades de espcies eletroativas e pela grande diferena do E
pa,
que
caracterstico do composto.
Os parmetros eletroqumicos para as amostras em que foram detectadas
manchas na CCD caracterstico da escopoletina foram para o fruto maduro (I
pa
=
1,53 A e E
pa
= 0,508 V), fruto desidratado (I
pa
= 3,8 A e E
pa
= 0,50 V), extrato
lquido auriana (I
pa
= 3,19 A e E
pa
= 0,50 V), cpsula 1 (I
pa
= 3,08 A e E
pa
= 0,50 V)
e cpsula 2 (I
pa
= 2,51 A e E
pa
= 0,508 V). Tais parmetros sugerem, pela
semelhana do valor de E
pa
com o padro a presena de escopoletina, porm em
quantidades variveis devido os diferentes valores de I
pa
. Nesse sentido, aplicando a
Lei de Faraday em que quanto maior o nvel de corrente maior a concentrao de
espcies eletroativas, e a escopoletina sendo uma espcie eletroativa, pode-se
sugerir, quanto a concentrao de escopoletina presente nas manchas das amostras
que, fruto desidratado > extrato lquido auriana > cpsula 1 > cpsula 2 > fruto
maduro.
Essa anlise, quanto ao perfil eletroqumico das manchas das amostras com
escopoletina, apenas sugestiva e qualitativa, pois h outros fatores, i.e., pureza do
grafite e do leo mineral, preparo da amostra, concentrao do extrato, composio
da cromatoplaca, quantidade de amostra aplicada, solubilidade, pH, entre outros,
que no foram avaliados nesse estudo e que podem interferir nos resultados.
Portanto, a aplicabilidade dessa tcnica para detectar a presena de marcadores
precisa ser avaliada, padronizada e validada para ter resultados com todos os
parmetros de confiabilidade.

5.6 Avaliao Espectrofotomtrica da Atividade Antioxidante
Considerando a presena de cumarinas e flavonides como principais
metablitos encontrados no fruto do Noni, e por serem compostos com capacidade
de reagir com radicais livres, ou seja, com potencial antioxidante, foi avaliado o
comportamento das amostras frente ao radical DPPH.
O ensaio DPPH indica a capacidade com que uma amostra de carter redutor
descolore o radical de cor violeta intensa a sua forma no radicalar de cor amarela.
Tais resultados podem ser espressos em equivalentes de um determinado
antioxidante (redutor), i.e., trolox, cido glico, cido ascrbico ou no volume
necessrio para reduzir a 50% a soluo contendo o radical DPPH, cuja absorbncia
60

deve ser ajustada para 0.7. Assim, considerando os valores de CE
50
(concentrao
eficiente)

como opo para expressar a atividade antioxidante das diferentes
amostras de fruto de Noni, realizou-se ensaios, em triplicata, com trs diferentes
alquotas (50, 100 e 250 L) que foram adicionadas soluo inicial. Os resultados
foram expressos em volume da amostra (L) para reduzir o radical DPPH em 50%,
sendo CE
50
(Quadro 5).

Quadro 5 Volumes (L) em que as amostras analisadas reduziram a concentrao do radical
DPPH em 50%, sendo expressos em CE
50
.









Para esse ensaio, j est esclarecido quais amostras so verdadeiramente
base de fruto de Noni e quais no so desta origem. A avaliao do potencial
antioxidante foi realizada, para todas as amostras, com o intuito de estimar a
capacidade antioxidante frente a amostra autntica (fruto maduro) que teve uma
CE
50
de 13,82 L. As amostras, com origem comprovada do fruto de Noni, fruto
desidratado (CE
50
=

40,41 L), extrato lquido auriana (CE
50
=

124,37 L) e cpsula 2
(CE
50
=

26,92 L) tiveram um perfil antioxidante inferior ao fruto maduro, j a cpsula
1 (CE
50
=

9,67 L) se mostrou superior ao fruto maduro quanto sua capacidade
antioxidante.
As amostras, comprovadamente no originrias do fruto de Noni, extrato seco
(CE
50
=

0,186 L) e cpsula 3 (CE
50
=

0,22 L) apresentaram volumes para reduo
do radical DPPH em 50% muito inferiores ao fruto maduro, indicando um alto
potencial antioxidante. O extrato lquido comercial teve uma CE
50
de

98,03 L, j que
no amostra original.
Amostra CE
50
(L)
Amostra CE
50
(L)
Fruto Maduro 13,82 Extrato Lquido
Comercial
98,03
Fruto
Desidratado
40,41 Cpsula 1 9,67
Extrato Seco 0,186 Cpsula 2 26,92
Extrato Lquido
Auriana
124,37 Cpsula 3 0,22
61

Assim, as amostras extrato seco e cpsula 3, alm de falsificadas, pode-se
sugerir, pelos altos picos de oxidao nos voltamogramas da VPD e pelos baixos
volumes de CE
50
, adulterao com a adio de substncias reconhecidamente
antioxidantes, logo, eletroativas.





































62


6. CONCLUSES
Pelo exposto ao longo deste trabalho, podemos concluir que as anlises
cromatogrficas das amostras avaliadas foram capazes de identificar se as amostras
comerciais analisadas foram de fato obtidas a partir de fruto de Noni.
A amostra do fruto maduro foi denominado como a amostra autntica do fruto
de Noni pelos resultados obtidos na anlise macroscpica, pela presena dos
principais metablitos secundrios (cumarina e flavonide) pela identificao
farmacognstica e pela deteco dos marcadores principais (escopoletina, rutina e
cido deacetilasperulosdico) pelos mtodos cromatogrficos.
A identificao farmacognstica detectou a presena dos metablitos
secundrios, flavonide e cumarina, nas amostras fruto desidratado, extrato lquido
auriana, cpsula 1 e cpsula 2. Nas amostras extrato seco e extrato lquido
comercial foi encontrado apenas o metablito flavonide.
Nos ensaios cromatogrficos foi possvel detectar a presena dos marcadores
principais, escopoletina e rutina, nas amostras fruto desidratado, cpsula 1 e cpsula
2, sendo estas amostras comprovadamente originais de fruto de Noni. A amostra
extrato lquido auriana, um extrato obtido a partir de amostras autnticas, tambm
pode ser considerada como sendo original, mesmo com o no aparecimento do pico
caracterstico da rutina, possivelmente por ter sofrido algum processo de
degradao. Por sua vez a ausncia de cumarinas, em especial do marcador
escopoletina, bem como do flavonide rutina no extrato seco, extrato lquido
comercial e amostra 3 confirmam a no autenticidade destes produtos, indicando
que foram elaborados por outras partes vegetais, que no o fruto ou por outro
produto, que no o Noni.
O ensaio voltamtrico pode ser uma ferramenta til na identificao de
produtos naturais base de Noni e na deteco do marcador escopoletina, pela
semelhana dos resultados com os encontrados nos ensaios cromatogrficos,
porm um mtodo que precisa ter as condies experimentais aprimoradas, logo
com a possibilidade de validao. A validao do mtodo voltamtrico uma
perspectiva futura deste trabalho.
Neste contexto ressalta-se a importncia de um maior controle dos produtos
naturais pelos rgos fiscalizadores, i.e., ANVISA, VISA, Ministrio da Agricultura
63

pelo fato de ser realidade o comrcio de produtos fitoterpicos falsificados, tanto no
mercado popular quanto por distribuidores de insumos farmacuticos com situao
regular perante ANVISA.






































64

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8. ANEXO