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Quim. Nova, Vol. 36, No.

5, 697-710, 2013 O ESTADO DA ARTE NA DETERMINAO DE RESDUOS DE MEDICAMENTOS VETERINRIOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL EMPREGANDO TCNICAS CROMATOGRFICAS ACOPLADAS ESPECTROMETRIA DE MASSAS Osmar D. Prestes, Manoel L. Martins, Caroline do A. Friggi, Juliana S. Munaretto, Martha B. Adaime e Renato Zanella* Departamento de Qumica, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria RS, Brasil Recebido em 13/8/12; aceito em 3/12/12; publicado na web em 8/3/13

THE STATE OF THE ART IN DETERMINATION OF VETERINARY DRUG RESIDUES IN FOODS OF ANIMAL ORIGIN USING CHROMATOGRAPHIC TECHNIQUES COUPLED TO MASS SPECTROMETRY. The determination of veterinary drug residues in foods of animal origin is an important issue because of the risk these compounds pose to human health in addition to their persistence and tendency to bioaccumulate. In recent years, signicant progress has been made in the area and this review presents the state of the art in sample preparation procedures associated with chromatographic techniques coupled to mass spectrometry for multiresidue determination of veterinary drugs in food of animal origin at concentration levels suitable for the control of residues and contaminants in food. Keywords: chromatography; veterinary drugs; food.

INTRODUO A determinao de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal importante devido ao risco que estes compostos oferecem sade humana, tais como disfunes hepticas e digestivas, problemas cardacos e reaes alrgicas, alm da sua persistncia no meio ambiente e tendncia de bioacumulao. Nas ltimas dcadas, laboratrios vm desenvolvendo mtodos para a determinao destes compostos em alimentos. Contudo, a maioria dos mtodos est longe das condies que so consideradas ideais, tais como, rapidez, conabilidade, seletividade e detectabilidade aceitvel. Alimentos de origem animal como carnes, vsceras, leite, ovos e mel, dentre outros, so matrizes comumente analisadas em laboratrios de rotina, apresentando frequentemente resduos de diversas classes de medicamentos veterinrios.1 Assim, de fundamental importncia o desenvolvimento de mtodos multirresduo para a determinao de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal. Neste trabalho de reviso apresenta-se o estado da arte nos procedimentos de preparo de amostra, bem como das tcnicas cromatogrcas acopladas espectrometria de massas descritas na literatura para a determinao multirresduo de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal em nveis de concentrao adequados (faixa de ng ou g kg-1) para o controle de resduos e contaminantes em alimentos. Classicao dos medicamentos veterinrios A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) classica os medicamentos veterinrios como toda e qualquer substncia aplicada em qualquer animal destinado produo de alimentos com ns teraputicos, prolticos, de diagnstico, ou para modicar as funes siolgicas, de comportamento ou como promotor de crescimento.2 Na pecuria moderna os medicamentos veterinrios tm sido amplamente utilizados e administrados como aditivos em gua ou nos alimentos dos animais destinados ao consumo humano, com o intuito de prevenir o aparecimento de doenas e tambm como promotores
*e-mail: rzanella@base.ufsm.br

de crescimento.3 Alm disso, agentes promotores de crescimento so aplicados para estimular o crescimento dos animais, o que considerado uma prtica abusiva no uso desses medicamentos.2 No entanto, essas substncias podem ocorrer nos alimentos derivados dos animais tratados e podem exercer efeitos genotxicos, carcinognicos, endcrinos, entre outros.4 A agncia Food and Drug Administration (FDA), dos Estados Unidos, e a Unio Europeia exigem um severo controle no uso destes compostos envolvidos na produo de alimentos.5-7 De acordo com estes rgos reguladores, estas substncias so classicadas em dois grupos, juntamente com outros compostos: o grupo A compreende as substncias com efeito anabolizante e substncias no autorizadas (estilbenos, agentes antitireoideos, esteroides, lactonas do cido resorclico, beta-antagonistas e nitrofuranos) e o grupo B, medicamentos veterinrios e outros compostos autorizados, mas que possuem limites estabelecidos (bactericidas, anti-helmnticos, carbamatos e piretroides, sedativos, anti-inamatrios no esteroides, organoclorados e organofosforados).8,9 Resduos de medicamentos veterinrios De acordo com a norma NBR ISO 22000 o termo segurana alimentar descreve aspectos relacionados inocuidade, ou seja, os alimentos no devem constituir vias de exposio a perigos que possam causar danos sade, sejam eles agentes biolgicos, fsicos ou qumicos.10 Entre os perigos qumicos existentes, destacam-se os resduos e contaminantes.11 A Food and Agriculture Organization (FAO), rgo das Naes Unidas, dene o termo resduo como a frao de uma substncia, seus metablitos, produtos de converso ou reao e impurezas que permanecem no alimento proveniente de produtos agrcolas e/ou animais tratados com estas substncias.12 O termo contaminante denido como qualquer substncia que no seja intencionalmente adicionada aos alimentos. Os contaminantes podem estar presentes nos alimentos como resultado das etapas de produo, transformao, acondicionamento, embalagem, transporte e armazenamento do alimento.12 As decincias nas boas prticas para a utilizao de medicamentos de uso veterinrio incorrem no aparecimento de resduos que, em nveis acima dos Limites Mximos de Resduos (LMR), podem representar risco sade humana. Estes riscos esto estritamente

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correlacionados com o desrespeito s instrues de uso, tais como: espcie alvo, dosagem, via de administrao e perodo de carncia.4,13 As organizaes internacionais envolvidas com a sade pblica, como o Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA), rgo do Codex Alimentarius,14 o FDA dos EUA15 e a Agncia Europeia de Medicamentos,16 estabelecem valores para LMR. No Brasil, a competncia para estabelecer LMRs de resduos e contaminantes em alimentos do Ministrio da Sade, atravs da ANVISA.2 Para garantir que um mtodo analtico possa ser empregado para a determinao de resduos e contaminantes em alimentos, o mesmo deve ser validado.17 H vrios conceitos e denies relacionados validao de mtodos analticos, provenientes tanto de pesquisadores18,19 como de agncias e normas reguladoras nacionais20-22 e internacionais.12,23 Antes de um mtodo analtico ser implementado para anlises de rotina, ele deve primeiramente ser validado para demonstrar que adequado para seu uso pretendido.24 Recentemente o Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento publicou um manual de garantia da qualidade analtica.25 Excelente trabalho de reviso foi publicado em 2008 por Paschoal et al.26 sobre os parmetros de validao para mtodos de determinao de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos. Programas de monitoramento de resduos de medicamentos veterinrios O Plano Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes em Produtos de Origem Animal (PNCRC) foi institudo pela Portaria n 51, de 6/05/1986, sendo sua adequao realizada pela Portaria n 527, de 15/08/1995.27 um programa do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), que visa garantir a sade do consumidor por meio de um monitoramento da presena de resduos de medicamentos veterinrios e contaminantes ambientais em produtos de origem animal (carnes, leite, pescado e mel).28 Um dos principais objetivos do PNCRC integrar o esforo destinado melhoria da produtividade e da qualidade dos alimentos e, secundariamente, proporcionar ao pas condies de se adequar, do ponto de vista sanitrio, s regras do comrcio internacional de alimentos, preconizadas pela Organizao Mundial do Comrcio (OMC) e outros rgos, como FAO e Organizao Mundial da Sade (OMS).28 Em 2002, a ANVISA iniciou a implantao do Programa de Anlise de Resduos de Medicamentos Veterinrios em Alimentos de Origem Animal (PAMVet) visando fortalecer os mecanismos de controle sanitrio. Entre os alimentos selecionados, destaca-se o leite bovino, porm outras matrizes como carnes (frango, bovina e suna), pescado, ovos e mel, devero fazer parte do escopo monitorado, devido ao grande consumo destes produtos.29 Entretanto, at o momento, apenas anlises em leite foram efetuadas e o ltimo relatrio, divulgado em 2009, destaca os resultados para antimicrobianos e antiparasitrios em amostras de leite expostas ao consumo humano, coletadas em 2006/2007.30 Em relao aos antimicrobianos foi detectada a presena de -lactmico (cefapirina), tetraciclinas (oxitetraciclina, tetraciclina e clortetraciclina), sulfonamidas (sulfatiazol, sulfametazina e sulfadimetoxina), orfenicol e cloranfenicol. Com exceo do cloranfenicol (substncia de uso proibido, portanto o LMR zero) e do orfenicol (que no possui LMR estabelecido), para todos os outros antimicrobianos detectados os resduos estavam abaixo do LMR. Para os antiparasitrios, os resultados indicam um considervel uso indevido de ivermectina nas vacas em lactao, com resduos em 41,3% das amostras de leite UHT e 52,2% das amostras de leite em p. A doramectina apresentou resduos acima do LMR em 0,2% do leite UHT e 5,8% do leite em p. Os resduos de abamectina foram abaixo do LMR. Os resultados indicaram que as Boas Prticas Veterinrias no esto sendo seguidas pelos produtores,

pois foram detectados resduos de medicamentos no autorizados ou acima do LMR. Determinao de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal A determinao de resduos de medicamentos veterinrios envolve uma etapa de extrao dos compostos de interesse e limpeza do extrato, seguida da anlise cromatogrca, geralmente acoplada espectrometria de massas. A Figura 1 destaca as principais etapas envolvidas na anlise de medicamentos veterinrios em alimentos.

Figura 1. Principais etapas da anlise de medicamentos veterinrios em alimentos

Utilizao de tcnicas cromatogrcas acopladas espectrometria de massas na anlise de resduos de medicamentos veterinrios No incio dos anos 1970 a cromatograa em camada delgada (thin layer chromatography, TLC) foi amplamente utilizada na anlise qualitativa de medicamentos veterinrios, como tireostticos e sulfonamidas em amostras de origem animal. A especicidade, simplicidade de execuo e possibilidade de atingir baixos limites de deteco (limit of detection, LOD) tornaram a cromatograa lquida de alta ecincia (high performance liquid chromatography, HPLC) com deteco por uorescncia (uorescence detector, FD) atrativa para estas anlises. Outra tcnica que apresentou LODs aceitveis foi a cromatograa gasosa com deteco por captura de eltrons (gas chromatography with electron capture detection, GC-ECD), porm demanda uma etapa de derivatizao dos compostos, sendo os reagentes poliuorados os mais comumente empregados.31,32 A HPLC com deteco espectrofotomtrica na regio do ultravioleta-visvel (UV) no possui seletividade e detectabilidade sucientes para a determinao de resduos de medicamentos veterinrios em amostras de origem animal. Os sistemas de HPLC-UV com derivatizao ps-coluna foram muito utilizados com a nalidade de diminuir tais limitaes.33,34 Durante os anos 1990, observou-se a migrao dos mtodos de determinao de medicamentos veterinrios empregando sistemas de HPLC-UV e TLC para sistemas de cromatograa gasosa acoplada espectrometria de massas (gas chromatography coupled to mass spectrometry, GC-MS). Esta mudana ocorreu devido ao desenvolvimento de vrios sistemas comerciais de GC-MS, que operavam principalmente no modo de monitoramento do on selecionado

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(selected ion monitoring, SIM). O modo SIM permitiu que os sistemas de GC-MS fossem considerados altamente seletivos e com considervel especicidade e detectabilidade na anlise de resduos de medicamentos veterinrios em amostras de origem animal. Mais recentemente, o modo SIM foi substitudo nos equipamentos de GCMS por sistemas que operam com a varredura completa (full scan, FS) baixa concentrao e/ou com a espectrometria de massas em srie (tandem mass spectrometry, MS/MS) entre outros.35 Entre os analisadores de massas normalmente empregados na determinao de resduos de medicamentos veterinrios destaca-se o triplo quadrupolo (QqQ) como o mais amplamente utilizado.36 No nal dos anos 1990 passou-se a utilizar sistemas robustos de cromatograa lquida acoplados espectrometria de massas em srie (liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, LC-MS/MS).37-43 A introduo de tcnicas de ionizao presso atmosfrica, como a ionizao por eletronebulizao (electrospray ionization, ESI)44 permitiu o emprego da tcnica LC-MS/MS na determinao de resduos de medicamentos veterinrios de elevado peso molecular e termossensveis. A partir dos anos 2000 a espectrometria de massas de alta resoluo (high resolution mass spectrometry, HRMS), altamente seletiva, passou a ser amplamente empregada como detector na anlise de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal.35 A HRMS permite a obteno de espectros no modo de varredura, que proporcionam uma melhor caracterizao da composio da amostra e da estrutura de compostos desconhecidos ou suspeitos.45-48 Atualmente, a HRMS compete fortemente com a MS em srie clssica pelo domnio dos mtodos multirresduo quantitativos, porm alteraes na instrumentao e nos softwares necessitam ser realizadas para que a HRMS se torne uma tcnica quantitativa preferencial.45-52 Tcnicas de preparo de amostra empregadas na determinao de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos O preparo de amostras geralmente envolve a extrao dos analitos e a subsequente limpeza do extrato com a nalidade de isolar os compostos de interesse e remover interferentes da matriz que afetam os sistemas de anlise, aumentando a concentrao dos analitos a nveis acima do LOD da tcnica analtica.53 Nos ltimos anos tem havido um grande nmero de mudanas na abordagem do preparo de amostra para a determinao de resduos e contaminantes orgnicos em alimentos. Estas esto intimamente relacionadas ao grande nmero de aplicaes envolvendo a cromatograa acoplada MS.54,55 No passado, os mtodos analisavam um nmero limitado de compostos, geralmente uma nica classe. Atualmente, a MS oferece a possibilidade de analisar um nmero maior de compostos em uma nica anlise, propiciando o desenvolvimento de mtodos de extrao e limpeza para o maior nmero possvel de analitos. O uso da MS tambm permite a utilizao de mtodos simples de preparo de amostra do tipo dilute and shoot.56 Porm, devido ao efeito dos constituintes da matriz, que promovem problemas como distoro de espectros, supresso inica e aumento do sinal analtico, sabe-se que o desempenho desta tcnica pode ser afetado. Portanto, mesmo com o avano nas tcnicas de separao e de deteco, o preparo de amostra continua sendo parte essencial do processo analtico visando alcanar resultados conveis e manter o bom desempenho do instrumento.53-55 Tcnicas manuais de extrao de resduos de medicamentos veterinrios Extrao slido-lquido e extrao lquido-lquido Nas ltimas duas dcadas, as tcnicas mais amplamente utilizadas para extrao de medicamentos veterinrios em alimentos de origem

animal foram a extrao slido-lquido (solid liquid extraction, SLE) e extrao lquido-lquido (liquid liquid extraction, LLE).53-57 A SLE e a LLE consistem na extrao sucessiva de amostras slidas e lquidas, respectivamente, com solvente orgnico empregando agitao vigorosa. Estas tcnicas tm sido aplicadas para amostras de alimentos de origem animal como carnes, vsceras, ovos e leite na extrao de diferentes classes de medicamentos veterinrios.53-57 A abordagem realizada durante o desenvolvimento e/ou aplicao destas tcnicas depende da natureza das amostras (isto , lquidas ou slidas) e das propriedades fsico-qumicas dos compostos de interesse (polaridade, pKa etc.). Em geral, a maioria destas tcnicas emprega solventes orgnicos em alguma de suas etapas. A acetonitrila considerada um dos melhores solventes, uma vez que promove uma extrao bastante eciente (altos percentuais de recuperao) e extrai baixas concentraes de coextrativos da matriz, sendo ecaz na desnaturao de protenas e na inativao de enzimas.58 Metanol e acetato de etila tambm so amplamente utilizados, porm extraem elevadas quantidades de coextrativos da matriz.54-57 Nos ltimos anos vrias tcnicas de extrao e limpeza foram desenvolvidas com o objetivo de utilizar uma menor quantidade de solventes. Porm, as tcnicas LLE e SLE continuam sendo amplamente empregadas, devido simplicidade de execuo. A desvantagem na utilizao destas tcnicas para a extrao de compostos lipoflicos em amostras com alto teor de gordura est relacionada com a grande quantidade de coextrativos lipdicos. Extrao lquido-lquido com partio baixa temperatura A utilizao de temperaturas muito baixas (-70 C) para separao de coextrativos gordurosos presentes nos extratos obtidos por extrao lquido-lquido de amostras de origem animal foi descrita originalmente por Juhler,59 no entanto, o uso de temperaturas to baixas diculta a aplicao da tcnica na rotina. Recentemente a aplicao de temperaturas mais amenas foi descrita para a limpeza de extratos de amostras de leite60 e de gua.61 A tcnica denominada extrao lquido-lquido com partio baixa temperatura (liquidliquid extraction with low temperature partitioning, LLE-LTP) consiste na extrao com um pequeno volume de solvente orgnico, geralmente acetonitrila, seguida de resfriamento do extrato a -20 C por algumas horas at o congelamento da fase aquosa e a precipitao dos slidos gordurosos, que cam aprisionados na fase congelada. A acetonitrila permanece lquida, sendo retirada facilmente e o extrato pode ser analisado.62 Recentemente, aplicaes das tcnicas de LLE e SLE combinadas com limpeza baseada na PBT, foram descritas para a determinao de piretroides em amostras de origem animal (leite, manteiga e mel)60,63,64 e outras matrizes como gua, bebidas e vegetais.62,65 Esta tcnica apresenta a vantagem de ser facilmente executada e tem sido aplicada com sucesso para o preparo de amostra visando a determinao de resduos de medicamentos veterinrios em msculo suno,66 msculo bovino67 e leite.68 Mtodo QuEChERS Anastassiades et al.69 introduziram um procedimento de preparo de amostra para extrao de resduos e contaminantes denominado QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Este mtodo tem como vantagens ser rpido, fcil, econmico, efetivo, robusto e seguro, explorando as possibilidades oferecidas pela instrumentao analtica moderna.70 Inicialmente desenvolvido para ser aplicado na extrao de resduos de agrotxicos em alimentos de origem vegetal, vem ganhando espao tambm na anlise de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal.71-73 O mtodo QuEChERS envolve as seguintes etapas: extrao (agitao manual ou mecnica da amostra e acetonitrila (geralmente

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na proporo 1:1); partio: adio de sais para promover o efeito salting out, o tamponamento do pH do meio, alm da remoo de gua) e limpeza do extrato (realizada por extrao em fase slida dispersiva (dispersive solid phase extraction, D-SPE).69 A extrao em tubo fechado possui as vantagens de possibilitar a extrao em campo e evitar a necessidade de lavagem do homogeneizador entre as extraes.69,70 A utilizao de acetonitrila como solvente extrator permite que um grande escopo de analitos seja extrado, sendo adequada para as determinaes por LC e GC. Os mtodos multirresduo que utilizam acetonitrila, desenvolvidos at ento, no empregavam adio de nenhum tipo de solvente apolar no processo de partio.74,75 Na extrao com acetonitrila, a adio de sais muito conveniente, uma vez que rpida, fcil, apresenta baixo custo, no dilui o extrato e proporciona a separao das fases orgnica e aquosa.76,77 A utilizao de sais secantes como sulfato de sdio (Na2SO4) tem a nalidade de melhorar a recuperao de analitos polares.78 No mtodo QuEChERS a escolha do MgSO4 ocorreu devido maior capacidade de remover gua quando comparado a outros sais e sua hidratao uma reao exotrmica que aquece a amostra entre 40 e 45 C, favorecendo a extrao, especialmente dos compostos apolares.69,70

A verso original deste mtodo apresentou excelentes resultados em diferentes tipos de amostras.79-81 Porm, algumas aplicaes mostraram que certos compostos apresentavam problemas de estabilidade e/ou recuperao de acordo com o pH da matriz.82,83 A utilizao de tampes de pH atravs da adio de sais como, por exemplo, acetato de sdio (pH 4,8) e mistura de sais citrato (faixa de pH 5,0 a 5,5) promove recuperaes satisfatrias para compostos dependentes do pH, independente da matriz utilizada.84 A Tabela 1 apresenta aplicaes que utilizam o mtodo QuEChERS no preparo de amostras de alimentos de origem animal, visando a determinao de resduos de medicamentos veterinrios. As modicaes j realizadas no mtodo QuEChERS indicam um futuro promissor na anlise multirresduo de medicamentos veterinrios. O mtodo tem sido empregado de forma satisfatria quando aliado MS, porm no est limitado somente a este tipo de detector.82,83 O mtodo QuEChERS foi desenvolvido para matrizes com mais de 75% de gua e posteriormente foi adaptado para outras matrizes com baixo teor de gua. Para produtos com teor de gua abaixo de 25%, tais como cereais, frutas secas e algumas matrizes de origem animal, a quantidade de amostra utilizada na extrao reduzida e

Tabela 1. Mtodos que empregam QuEChERS no preparo de amostras de origem animal para determinao de medicamentos veterinrios Analitos Amostra Procedimento de extrao 5 g amostra + 5 mL H2O + 20 mL MeCN agitao vortex 30 s + banho de ultrassom 2 min 2 g NaCl agitao vortex 2 min + banho de ultrassom 2 min centrifugao recolher o sobrenadante adicionar 20 mL MeCN (repetir todo o processo) misturar os dois sobrenadantes evaporao reconstituio em 1 mL de MeCN 10 g amostra + 10 mL 1% HAc em MeCN + 10 mL Na2EDTA 0,1 M agitao vortex 1 min 4 g MgSO4 + 1 g CH3COONa agitao vortex 1 min centrifugao extrato 10 g amostra + 12 mL MeCN agitao vortex 1 min 4 g MgSO4 + 1 g NaCl agitao vortex 1 min centrifugao extrato 10 g amostra + 10 mL 1% HAc em MeCN + 10 mL Na2EDTA 0,1 M agitao vortex 1 min 4 g MgSO4 + 1 g CH3COONa agitao vortex 1 min centrifugao extrato Limpeza D-SPE: 1 mL extrato reconstitudo 25 mg PSA agitao vortex 30 s centrifugao injeo de 100 L Tcnica de anlise LOD/LOQ CC/CC (g kg-1) Recuperao (%) (RSD,%) Ref.

cloranfenicol

mel

LC-ESIMS/MS

CC: 0,002 CC: 0,006

83-89 ( 3,9)

85

18 antibiticos multiclasse

leite

38 antihelmnticos multiclasse

leite

21 medicamentos veterinrios multiclasse

leite

2 mL extrato ltrao 0,20 m diluio (1:1) com 0,01% de HF misturar os dois sobrenadantes evaporao reconstituio em 1 mL de MeCN D-SPE: extrato 500 mg C18 + 1,5 g MgSO4 agitao vortex 1 min centrifugao sobrenadante evaporao a 50 C com N2 reconstituio com 2,5 mL DMSO ultrassom 1 mL extrato diluio (1:1) com 0,01% de HF ltrao UHPLC- LOD: 0,1-4,0 0,20 m injeo de 5 L ESI-MS/ LOQ: 0,3-10,0 MS Leite de cabra: D-SPE: extrato 500 mg C18 + 1,5 g MgSO4 agitao vortex 1 min centrifugao 6 mL sobrenadante + 250 L DMSO evaporao da MeCN a 50 C com N2 ltrao 0,20 m UHPLC injeo de 5 L ESI-MS/ Carne ovina: MS D-SPE: 1 mL extrato 50 mg C18 + 150 mg MgSO4 agitao vortex 1 min centrifugao 600 L sobrenadante + 600 L DMSO evaporao da MeCN a 50 C com N2 ltrao 0,20 m injeo de 5 L

86

87

63,0-122,3 ( 25)

88

Monepantel e monepantel sulfona

leite de cabra e carne ovina

10 g amostra + 12 mL MeCN agitao vortex 30 s 4 g MgSO4 + 1 g NaCl agitao vortex 1 min centrifugao extrato

Leite de cabra CC: 2,08-2,2 CC: 2,16-2,41 Carne ovina CC: 746-771 CC: 855-898

Leite de cabra 105,0-110,0 ( 4,0) 89 Carne ovina 96,0-131,0 ( 14,2)

Vol. 36, No. 5 Tabela 1. continuao Analitos

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Amostra Procedimento de extrao

Limpeza D-SPE: 5 mL extrato 250 mg PSA + 750 mg MgSO4 agitao vortex 1 min centrifugao 2 mL sobrenadante evaporao com N2 redissoluo com 2 mL de MeOH:H2O (2:8 v/v) ltrao 0,45 m injeo de 20 L SPE: 1 mL extrato cartucho WAX eluio 1 mL 1% HF em MeCN diluio (1:1) 1% HF em MeCN injeo de 10 L

Tcnica de anlise

LOD/LOQ CC/CC (g kg-1)

Recuperao (%) (RSD,%)

Ref.

13 antibiticos multiclasse

camaro

10 g amostra + 10 mL 1% HAc em MeCN agitao vortex 1 min 4 g MgSO4 + 1,75 g NaCl agitao vortex 1 min centrifugao extrato

LC-ESILOD: 0,06-7,1 MS/MS

33,0-118,0 ( 14,9)

90

fumagilina

mel

25 medicamentos veterinrios multiclasse

ovos

5 g amostra + 10 mL gua agitao vortex 1 min 1% HF em MeCN agitao vortex 1 min 4 g MgSO4 + 1 g NaCl + Na3C6H5O7 agitao mecnica 10 min centrifugao sobrenadante diluio com 20 mL de 1% HF em MeCN extrato 10 g amostra + 10 mL 1% HAc em MeCN + 10 mL Na2EDTA 0,1 M agitao vortex 1 min 4 g MgSO4 + 1 g CH3COONa agitao vortex 1 min centrifugao extrato

LC-ESIMS/MS

LOD: 0,02 LOQ: 0,07

88,1-99,4 ( 4,9)

91

1 mL extrato diluio (1:1 v/v) com soluo de MeOH/0,05% de UHPLCHF ltrao 0,2 m ESI-MS/ injeo de 5 L MS

51,0-96,0 ( 32,0)

92

21 medicamentos veterinrios multiclasse

5 g amostra + 5 mL H2O + 10 mL 1% HAc em MeCN/H 2O (80:20 v/v) msculo agitao 15 min 4 g MgSO4 + 1 g de frango NaCl, 1 g Na3C6H5O7 + 0,5 g disodium citrate sesquihydrate agitao 15 min centrifugao extrato 5 g amostra + 15 mL 1% HAc em MeCN 4 g MgSO4 agitao 15 min agitao 30 s centrifugao extrato

16 antibiticos multiclasse 20 medicamentos veterinrios multiclasse 38 antihelmnticos multiclasse

msculo bovino

5 g amostra + 15 mL 1% HAc em MeCN msculo + 10 mL Na2EDTA 0,1 M agitao de frango 5 g MgSO4 agitao vortex 30 s centrifugao extrato leite ou fgado bovino 10 g amostra + 10 mL MeCN 4 g MgSO4 + 1 g NaCl agitao 1 min centrifugao extrato

D-SPE: 1 mL extrato 150 mg LOD: 3,2-16,0 PSA agitao 30 s centriLOQ: 10,0fugao ltrao 0,2 m UHPLC30,0 diluio (1:1 v/v) com soluo ESI-MS/ CC: 18,51% HF em MeCN/H2O (50:50 MS 411,8 v/v) injeo de 5 L CC: 26,3423,6 D-SPE: extrato + 500 mg PSA LOQ: 5,0-60,0 contato 15 min centrifugao CC: 13,0LC-ESI injeo de 20 L 249,0 MS/MS CC: 16,0298,0 D-SPE: extrato + 500 mg NH2 contato 15 min agitao LC-ESIcentrifugao injeo de 3 L MS/MS D-SPE: 1 mL extrato 150 mg MgSO4 + 50 mg C18 agitao vortex 1 min centrifugao injeo de 10 L

65,6-117,9 ( 22,1)

73

22,0-93,0 ( 19,0)

93

55,0-89,0 ( 14,0)

94

LOQ: 5,0-10,0 CC: 11,0LC-ESI51,0-128,0 1721,0 95 MS/MS ( 27,0) CC: 11,01943,0 LC-ESI-MS/MS: liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with electrospray ionization; UHPLC-ESI-MS/MS: ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with electrospray ionization.

efetuada uma adio de gua para melhorar a ecincia de extrao.96 Nos ltimos anos, o mtodo QuEChERS tem sido adotado com frequncia no preparo de amostra para anlise de medicamentos veterinrios em alimentos. A relao entre a quantidade de amostra e de solvente (1 g mL-1) utilizada no mtodo QuEChERS baixa se comparada com os valores tpicos de 2 a 5 g mL-1 dos mtodos que utilizam solventes apolares.69 Portanto, sem considerar a possibilidade de variao da intensidade do rudo proveniente da matriz, a relao desfavorvel entre a quantidade de amostra e de solvente no mtodo QuEChERS pode conduzir a valores de LOQ mais elevados. Entretanto, considerando a alta detectabilidade das tcnicas cromatogrcas disponveis atualmente, o mtodo QuEChERS adequado para o preparo de amostra visando o controle de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos. Porm, nos ltimos anos esta limitao vem sendo contornada com a possibilidade de combinar os extratos provenientes do mtodo QuEChERS com outras tcnicas como, por exemplo, a microextrao lquido-lquido dispersiva (dispersive liquid liquid microextraction, DLLME). Desta forma, h a possibilidade de

concentrao dos analitos sem que ocorra comprometimento com o tempo de extrao, custo e facilidade de execuo.97,98 O princpio bsico da tcnica DLLME, desenvolvida em 2006 por Rezaee et al.,99 a disperso de um solvente extrator (imiscvel com gua) e um solvente dispersor (miscvel em gua e no solvente extrator) em uma soluo aquosa, o que proporciona uma grande rea de contato entre a fase aquosa e o solvente extrator. Uma mistura apropriada do solvente dispersor e do solvente extrator injetada rapidamente, com auxlio de uma seringa, na soluo aquosa. Aps leve agitao, uma soluo turva com microgotas formada. As microgotas consistem no solvente extrator mais o analito j extrado. Aps centrifugao, ocorre a sedimentao das microgotas formando uma fase sedimentada, que retirada com o auxlio de uma seringa sendo efetuada a quanticao dos analitos pela tcnica mais apropriada.100,101 Disperso da matriz em fase slida Introduzida em 1989 por Barker e colaboradores,102 a disperso da matriz em fase slida (matrix solid phase dispersion, MSPD) combina

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diretamente a amostra com um sorvente (dispersante), permitindo a realizao simultnea de vrias etapas no preparo de amostra.103,104 A MSPD consiste basicamente em introduzir a amostra em um recipiente contendo um suporte slido (sorvente), misturar at homogeneizao, transferir o material (matriz e adsorvente) para a coluna e eluir com solvente apropriado. A coluna de MSPD consiste, portanto, da matriz dispersa no sorvente.102-104 O suporte slido ou dispersante atua como abrasivo, promovendo o rompimento da estrutura fsica da amostra; como sorvente de compostos da matriz; o material misturado pode ser empacotado na coluna e os analitos podem ser eludos sequencialmente com o eluente. Geralmente o suporte-sorvente faz uso de materiais como C18 e C8.103,104 Na etapa de homogeneizao da amostra com o sorvente pode-se fazer a adio de reagentes para modicar a amostra, como antioxidantes, agentes quelantes, cidos e bases, para afetar a eluio, distribuio e/ou reteno do analito.103,104 A natureza da coluna de MSPD e a faixa de interaes torna a MSPD uma tcnica apropriada para isolar e/ou limpar multirresduo a partir de matrizes complexas.102-114 O suporte slido e o solvente de eluio so parmetros crticos, mas esses certamente tm inuncia menor que a disperso da matriz do topo at a base da coluna de MSPD. Na extrao em fase slida (solid phase extraction, SPE), a maioria das substncias da amostra retida nos primeiros milmetros do topo da coluna (efeito da matriz), enquanto que em MSPD a deposio da amostra com o sorvente na coluna uniforme.105,106 Uma das tcnicas mais interessantes de MSPD a que emprega a extrao com gua alta temperatura. Bogialli et al.115,116 publicaram vrios trabalhos durante os ltimos anos utilizando MSPD e um sistema home made baseado na tcnica de extrao com lquido pressurizado (pressuzired liquid extraction, PLE) para a determinao de medicamentos veterinrios em diversas matrizes. O parmetro crtico na extrao com gua alta temperatura (65 a 120 C) a realizao de uma extrao efetiva sem a degradao trmica dos analitos e com a presena mnima de coextrativos da matriz. Um fator limitante o baixo nmero de compostos que podem ser extrados de forma simultnea por esta tcnica.117 Tcnicas instrumentais de extrao de resduos de medicamentos veterinrios Nas ltimas dcadas, vrias tcnicas alternativas de extrao foram desenvolvidas baseadas na reduo do volume de solvente e na automatizao das etapas do procedimento de extrao. Entre estas novas tcnicas podemos destacar a microextrao em fase slida (solid phase micro extraction, SPME),118 extrao sortiva em barra magntica (stir bar sorptive extraction, SBSE),119 extrao por uido supercrtico (supercritical uid extraction, SFE),120 extrao por lquido pressurizado (pressurized liquid extraction, PLE)121 e a extrao assistida por micro-ondas (microwave assisted extraction, MAE).122 So exemplos de tcnicas que apresentam, dentre outras caractersticas, elevada ecincia, embora demandem investimento considervel em instrumentao. As tcnicas de extrao que possuem como base a instrumentao demandam analistas treinados e etapas de limpeza do sistema entre extraes, o que implica em um maior tempo de anlise. Outra desvantagem geralmente apresentada o escopo limitado de compostos que podem ser extrados sob determinadas condies. Sendo assim, estas tcnicas podem ser empregadas em algumas aplicaes, mas geralmente esto distantes de serem consideradas ideais para um mtodo multirresduo.123 Extrao assistida por micro-ondas A tcnica MAE utiliza energia micro-ondas para promover o movimento molecular e de rotao do lquido com dipolo permanente,

levando a um rpido aquecimento do solvente e da amostra, a m de que ocorra a partio dos analitos de interesse da matriz da amostra para o solvente.53,54 A utilizao de energia micro-ondas permite que o solvente seja aquecido rapidamente, entretanto, aplicvel apenas a compostos termicamente estveis. A tcnica MAE possibilita que vrias amostras sejam extradas simultaneamente com baixo consumo de solvente (10 a 30 mL).54,124 Como solventes apolares no absorvem energia de micro-ondas, pelo menos algum solvente polar, como a gua, deve ser utilizado.125 Sistemas MAE podem operar em dois modos: aberto (MAE focalizada) ou fechado (MAE pressurizada). As principais vantagens da MAE so os altos percentuais de recuperao dos analitos e a possibilidade de extrao simultnea de diferentes amostras, sem interferncias.122 No entanto, a escolha do solvente um fator limitante e geralmente necessria uma etapa adicional de limpeza dos extratos.124 Poucos trabalhos tm sido reportados na literatura empregando MAE para a extrao de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal. Isso geralmente devido difuso limitada do solvente em amostras contendo mais de 30% de gua na sua composio, como o caso de alimentos, resultando em baixa recuperao dos analitos. Este problema pode ser contornado por liolizao prvia das amostras.55 A Tabela 2 apresenta aplicaes envolvendo diferentes tcnicas de preparo de amostra e limpeza de extratos para a determinao de resduos de medicamentos veterinrios por GC-MS e LC-MS. Extrao por lquido pressurizado A PLE tem recebido vrios nomes, tais como extrao acelerada por solvente (accelerated solvent extraction, ASE), extrao por uido pressurizado (pressurized uid extraction, PFE), extrao por solvente aquecido pressurizado (pressurized hot solvent extraction, PHSE), extrao por solvente subcrtico (subcritical solvent extraction, SSE) e extrao por gua aquecida (hot water extraction, HWE).121 Esta tcnica utiliza solventes que so levados prximos regio supercrtica, onde estes demonstram melhores propriedades de extrao. Em altas temperaturas, os percentuais de recuperao aumentam, pois a viscosidade e a tenso supercial diminuem, enquanto a sua solubilidade e a taxa de difuso na amostra aumentam.53 O uso combinado de altas presses (500 a 3000 psi) e temperaturas (50 a 200 C) possibilita um processo de extrao rpido (5 a 10 min), com menor quantidade de solvente em comparao com a extrao tradicional.126 A tcnica PLE pode ser realizada nos modos esttico e dinmico (uxo contnuo), ou uma combinao de ambos. No modo esttico, a amostra colocada em um recipiente de ao inoxidvel e preenchida com um solvente de extrao. Aps a extrao, o extrato purgado com N2 e coletado em um frasco. No modo dinmico, um sistema de uxo contnuo de solvente bombeado atravs da amostra, ocorrendo a diluio do extrato. Secantes, como sulfato de sdio, terra diatomcea ou celulose, podem ser adicionados na clula de extrao ou materiais sorventes podem ser usados para promover a limpeza in situ. As condies de extrao podem ser otimizadas atravs de procedimentos estatsticos.127,128 Comparando PLE LLE ou extrao por Soxhlet, podemos citar como vantagens a reduo do consumo de solventes e do tempo de extrao, porm demanda uso de equipamentos caros. No entanto, o grande problema com matrizes gordurosas, como no caso de alimentos de origem animal, a presena de grandes quantidades de lipdios coextrados, o que gera a necessidade da eliminao de lipdios do extrato.114 Como apresentado na Tabela 2, vrios autores tm demonstrado a viabilidade do uso da MAE e da PLE para o preparo de amostra na determinao de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos de origem animal.

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Tabela 2. Mtodos que empregam MAE, PLE, GPC e UF no preparo de amostras de origem animal para determinao de medicamentos veterinrios Analitos Amostra Procedimento de extrao Limpeza Tcnica de anlise LOD/LOQ CC/CC (g kg-1) Recuperao (%) (RSD,%) Ref. 129

6 tireostticos

2 g amostra + 5 mL acetato de etila (2x) tireoide ultrassom 10 min centrifugao bovina, ovina (10 min/3500 rpm) evaporao at e suna 1 mL com N2 diluio at 2 mL ltrao 0,45 m

11 antibiticos multiclasse

peixe e mexilho

MAE: 2 g amostra de tecido liolizado + 5 mL gua deionizada + 50 L soluo proteinase-K micro-ondas por 5 min a 50 W centrifugao (5 min/8000 rpm) fase lquida tratada com 100 L cido frmico + 5 mL diclorometano agitao manual por 1 min fase orgnica + diclorometano evaporados com N2 reconstituio 1 mL gua deionizada ltrao 0,22 m injeo de 20 L 1 mL amostra + 1 mL acetonitrila centrifugao (15 min/3500 rpm) diluio 20 L sobrenadante + 1 mL gua deionizada

GPC: 1 mL extrato coluna Waters Envirogel (19 x 300 mm) eluio 1:1 acetato de etila + ciclohexano frao de 35 UHPLCmL coletada (entre 15-21 min) CC: 1,2-14,8 ESI-MS/ evaporao at 200 L com CC: 6,2-25,1 MS N2 reconstituio at 1000 L (gua desionizada) banho de ultrassom por 1 min ltrao 0,45 m injeo de 10 L LOD: 2-16 LOQ: 5-57 CC: 1-9 CC: 1-15

75-96 ( 8,3)

130

LC-ESIMS/MS

70-100 ( 12)

5 sulfonamidas

leite

150 medicamentos veterinrios multiclasse

leite

750 L amostra + 750 L acetonitrila agitao em vortex por 1 min centrifugao (5 min/13.300 rpm)

7 penicilinas, 4 cefalosporinas, 7 sulfonamidas

PLE: 3 g amostra + 5 g terra diatomcea + gua e metanol (95:5) extrator ASE 300 temperatura 55 C em 1500 alimentao psi intervalos de pr-aquecimento, animal aquecimento e esttico (5 min cada) (rao) 3 ciclos de lavagem da clula com gua (volume 100% da clula) 30 mL de extrato obtido

4 tetraciclinas

PLE: 1 g amostra + 11 g terra diatomcea + EDTA extrator ASE 200 temperacarne bovina, tura 70 C em 1500 psi aquecimento suna frango, (5 min), esttico (10 min cada) 1 e cordeiro ciclo de lavagem da clula com gua (volume 60% da clula) 40 mL de extrato obtido PLE: 5 g de msculo liolizado + 7 g xido de alumnio + metanol extrator ASE 200 temperatura 80 C em 1500 psi pr-aquecimento (5 min), esttico (15 min) 2 ciclos de lavagem da clula carne bovina com gua (150% da clula) 40 mL e peixe de extrato extrato concentrado at 1 mL adicionado 2x 0,5 mL de metanol evaporao at secura em Turbovap redissoluo em 0,5 mL metanol ltrao 0,45 m

UF: 0,5 mL do extrato diludo ultraltrao (ultraltro de peso molecular 30 kDa) centrifugao (30 min/5000 rpm) injeo de 100 L UF: 0,5 mL do extrato ultraltrao (ultraltro de peso molecular 3 kDa) centrifugao (60 min/13.300 rpm) evaporao da acetonitrila centrifugao (5 min/13.300 rpm) coleta do sobrenadante injeo SPE: condicionamento do cartucho C18HD com 1 mL metanol + 1,5 mL gua + 1,5 mL tampo pH 8,5 (5 mL min-1) adio 0,5 mL do extrato usando 1 mL de tampo (2 mL min-1) lavagem do cartucho com 1,5 mL de tampo + 1,5 mL gua (5 mL min-1) eluio com metanol/ gua 0,1% cido frmico (0,7 mL min-1 em 5 min) SPE: condicionamento do cartucho HLB Oasis com 5 mL metanol + 5 mL gua adio do extrato usando lavagem do cartucho com 2 mL gua 5% metanol eluio com 2 mL metanol acidicado com 10 mM de cido frmico evaporao em Turbovap redissoluo em 1 mL metanol/gua (50:50) -

LC-ESIMS/MS

LOQ: 5-10 CC: 102,8107,1 CC: 107,7114,8

131 90-125 ( 7,9) 45

LOD: 0,5-25 UHPLCCC: 0,1-222 TOF-MS CC: 0,2-246

Maioria 70-120 ( 20)

132 LOD: 0,092,17 LOQ: 0,255,79 CC: 10-174 CC: 22-182

LC-ESIMS/MS

93-134 ( 8,3)

133 LOD: 0,1-0,3 LC-ESI- LOQ: 0,5-1,0 MS/MS CC: 101-116 CC: 112-130

89-98 ( 17)

134

7 antibiticos macroldeos

LC-ESIMS/MS

LOD: 15 LOQ: 25 CC: 6-208 CC: 15-211

58-91 ( 9)

704 Tabela 2. continuao Analitos Amostra Procedimento de extrao

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Limpeza -

Tcnica de anlise

LOD/LOQ CC/CC (g kg-1) LOD: 3-15 LOQ: 10-50 CC: 12-308 CC: 14-327

Recuperao (%) (RSD,%)

Ref. 135

PLE: 1 g amostra + 11 g terra diatomcea + EDTA extrator ASE 200 tempera31 tura 70 C em 1500 psi aquecimento antimicrobianos carne bovina (5 min), esttico (10 min) 1 ciclo de multiclasse lavagem com gua (60% da clula) 40 mL de extrato evaporao at 10 mL empregando evaporador rotativo PLE: 2 g amostra + 5 g terra alumina + 6 g de sulfato sdio anidro + acetonitrila extrator ASE 200 temperatura 50 C em 1500 psi pr-aquecimento, leite bovino aquecimento e esttico (5 min cada) extrato coletado e mantido por 30 min a -20 C evaporao at secura com N2 redissoluo com 2 mL de metanol + 5 mL gua

LC-ESIMS/MS

75-99 ( 18)

SPE: condicionamento do cartu136 cho C18 com metanol + tampo tris (pH 8,5) adio do extrato lavagem do cartucho com 2 mL tampo tris 20 mM + 2 mL LOD: 2 7 esteroides LC-ESImetanol/gua (40/60 v/v) CC: < 2 100-135 anabolizantes MS/MS eluio com 2 mL metanol CC: 0,3-0,9 evaporao com N2 at secura redissoluo 75 L acetonitrila + 75 L de cido frmico 0,5% injeo 75 L LC-ESI-MS/MS: liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with electrospray ionization; UHPLC-ESI-MS/MS: ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with electrospray ionization; UHPLC-TOF-MS: ultra high performance liquid chromatography coupled to time-of-ight mass spectrometry, LC-TOF-MS.

Extrao por uido supercrtico Os experimentos de Hannay e Hogarth (1879) sobre a dissoluo de solutos empregando uidos supercrticos introduziram a possibilidade de um novo meio solvente. No entanto, apenas na dcada de 1960 que as aplicaes de uidos supercrticos em processos comerciais de extrao passaram a ser extensivamente examinadas.137 Apesar do desenvolvimento de instrumentos comerciais para extrao com uido supercrtico (supercritical uid extraction, SFE) na dcada de 1980, somente nos anos 1990 comearam a ser publicados estudos utilizando a SFE como tcnica de extrao em combinao com tcnicas cromatogrcas.138 O uido supercrtico tem propriedades nicas que permitem a sua aplicao para o preparo de amostras slidas para a anlise de resduos. A SFE seletiva e consome menor quantidade de solvente quanto comparada com outras tcnicas de extrao. Em alguns casos, a maior diculdade da SFE, quando empregada na forma off-line a evaporao do solvente recolhido no nal da extrao para aumentar a concentrao, pois este um procedimento demorado onde pode ocorrer a contaminao e/ou perda ou degradao dos analitos.139 O solvente supercrtico mais utilizado o dixido de carbono (CO2), que possui as condies crticas de 30,9 C e 73,8 bar, barato e ambientalmente adequado. O dixido de carbono supercrtico (SCCO2) apresenta ainda as caractersticas de alta difusividade combinada com a fora de dissoluo facilmente ajustvel. Outra vantagem que o CO2 gasoso em temperatura e presso ambiente, o que faz com que a recuperao do analito seja muito simples e a extrao seja considerada livre de solventes. Outra caracterstica importante para o preparo de amostra de alimentos e de outros produtos naturais a possibilidade de executar a SFE utilizando CO2 em baixas temperaturas com um meio no oxidante, que permite a extrao de compostos lbeis termicamente e/ou facilmente oxidveis. O maior problema da SCCO2 sua baixa polaridade, que pode ser melhorada com o emprego de modicadores polares (cossolventes) para modicar a polaridade do uido supercrtico e aumentar o poder de dessolvatao dos analitos de interesse. Os modicadores normalmente utilizados so metanol, acetonitrila, hexano, entre outros solventes orgnicos e reagentes de par-inico. Estes compostos promovem a dessoro do analito, melhorando a ecincia e seletividade da extrao.137

Nos equipamentos comerciais para SFE a amostra colocada em uma cela de extrao, o uido bombeado a uma presso acima do seu ponto crtico, a temperatura da cela aumentada at ultrapassar o ponto crtico do uido em uso. Aps a despressurizao, o analito recolhido em um pequeno volume de solvente orgnico ou em um cartucho preenchido com fase slida. A extrao pode ser executada na forma esttica, dinmica ou com recirculao.57,140 A aplicao de SFE utilizando acetato de etila como modicador do SCCO2 para a determinao de resduos de cloranfenicol, orfenicol e tianfenicol em camaro foi investigada como forma de preparo de amostra com derivatizao in situ. O tempo de extrao foi de 5 min no modo esttico, seguido de uma etapa de extrao dinmica com temperatura de 60 C e presso de 25 MPa. Para a derivatizao foram utilizados 20 L de N-O-bis(trimetil-silil) triuoroacetamida contendo 1% (v/v) de trimetilclorosilano em 20 mL de acetato de etila como solvente de recolhimento. A quanticao por GC-MS com ionizao qumica no modo negativo apresentou faixa linear para o mtodo de 20 a 5000 ng kg-1, com limites de deteco de 8,7 a 17,4 ng kg-1. As recuperaes obtidas variaram entre 66 e 92%, com RSD <15,3% e baixo efeito matriz.141 Extrao em fase slida Nesta tcnica, um sorvente com alta anidade para determinados analitos ir reter e concentrar os compostos de uma amostra lquida ou em soluo. uma tcnica largamente aplicada para muitos tipos de matrizes, incluindo alimentos. As tcnicas baseadas na SPE incluem a MSPD, SPME e SBSE, entre outras.53 A tcnica de SPE envolve o uso de cartuchos descartveis ou discos para reter os analitos.142 A tcnica apresenta vantagens em relao extrao LLE convencional, pois permite simultaneamente a remoo de substncias interferentes com a concentrao dos analitos, pode ser automatizada, alm de utilizar uma quantidade menor de solventes orgnicos. Outra vantagem que na SPE vrias amostras podem ser processadas em paralelo.142 Para tornar possvel a aplicao da SPE em matrizes slidas (como solo, vegetais, frutas, cereais, carnes, ovos e vsceras) necessria uma etapa inicial de preparo para homogeneizao, ltrao, sonicao ou centrifugao. Uma limitao da SPE a determinao de

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compostos muito polares ou com pouca anidade com o sorvente quando esto presentes substncias interferentes, tais como sais, cidos hmicos e outras substncias orgnicas no caso da gua ou protenas, lipdeos e carboidratos no caso de alimentos, em especial os de origem animal.143 Recentemente, a SPE foi comparada em termos de recuperao e nmero de compostos extrados, com extrao por solvente, MSPD e mtodo QuEChERS modicado para determinao de tetraciclinas, macroldeos, quinolonas, sulfonamidas e anti-helmnticos em ovos para determinao por cromatograa a liquido de ultra alta presso acoplada espectrometria de massas em srie (ultra high pressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, UHPLCMS/MS). A tcnica que apresentou melhores resultados foi a extrao por solvente. O procedimento por QuEChERS modicado foi muito simples e rpido, mas promoveu a extrao de um menor nmero de compostos. A MSPD no permitiu a extrao de tetraciclinas e quinolonas e a SPE no extraiu os macroldeos e as tetraciclinas.92 Um mtodo automtico foi desenvolvido para quanticao simultnea de 15 aminoglicosdeos em msculo e fgado (suno, ave, bovino), em rim (suno e bovino), leite (bovino) e ovos por LC-MS. As amostras previamente homogeneizadas com tampo fosfato monobsico e cido etileno diamino tetra-actico foram extradas por SPE automatizada. Os analitos foram separados em coluna especca para aminoglicosdeos e eludos com cido tiuoractico e acetonitrila. Os limites de deciso (CC) para apramicina, gentamicina, tobramicina, paramomicina, hidromicina, neomicina, kanamicina, sisomicina, netilmicina, ribostamicina, causgamicina, amicacina, streptomicina, di-hidro-streptomicina e pectinomicina foram de 8,1 a 11,8 g kg-1. As recuperaes obtidas foram consideradas razoveis, variando entre 71 e 108% com baixo RSD, sendo o mtodo considerado simples, rpido e altamente sensvel para a determinao de aminoglicosdeos em amostras complexas.144 A Tabela 3 apresenta algumas aplicaes das tcnicas de SFE e SPE e o preparo de amostra na determinao de resduos de medicamentos veterinrios em diferentes tipos de matrizes de origem animal.

Microextrao em fase slida A SPME uma tcnica de preparo de amostra sem o uso de solventes orgnicos, a qual utiliza bra de slica fundida recoberta com uma fase estacionria apropriada montada em uma microsseringa modicada. A SPME foi proposta por Pawliszyn e colaboradores, em 1990, e consiste de uma etapa de partio dos analitos entre a amostra e a fase estacionria que recobre a bra e uma etapa de dessoro dos analitos concentrados na fase estacionria/bra. A dessoro pode ser direta no cromatgrafo a gs, onde os componentes da amostra so dessorvidos termicamente, ou extrados/dessorvidos com um eluente para cromatograa a lquido, seja no modo esttico ou em uxo.125 Um aspecto importante da SPME que a temperatura e o tempo de agitao da amostra devem ser otimizadas para cada aplicao. Outra caracterstica o pequeno volume de fase estacionria que pode ser ligado bra, que pode limitar a capacidade de concentrao (enriquecimento) desta tcnica. Os efeitos de matriz podem interferir severamente, sendo necessrio o preparo de padres na matriz, a utilizao de adio padro para correo deste efeito ou, ainda, a utilizao de padres internos isotopicamente marcados. A presena de componentes da matriz ou de outros analitos em altas concentraes pode levar adsoro competitiva ou dessoro seletiva levando a possveis erros no processo de partio.125 As principais vantagens da SPME so a reduo ou eliminao do uso de solventes, a combinao da extrao da amostra em uma nica etapa e a possibilidade de analisar quantidades muito pequenas de amostra. Esta tcnica possui ainda uma alta sensibilidade e pode ser usada para analitos, tanto polares quanto apolares, em uma grande variedade de matrizes para determinao tanto por GC como por LC. Como desvantagens destacam-se a variao na homogeneidade das bras e a robustez da tcnica.125 Uma tendncia recente no desenvolvimento da SPME, atravs do emprego de novos dispositivos especcos, a aplicao in vivo permitindo estudos de farmacocintica, bioacumulao e de mecanismos metablicos.145 A SPME in vivo permite determinar o analito livre diretamente no organismo vivo, sendo simples e rpida. Esta tcnica

Tabela 3. Mtodos que empregam SPE e SFE no preparo de amostras de origem animal para determinao de medicamentos veterinrios Analitos tetraciclinas, macroldeos, quinolonas, sulfonamidas e anti-helmnticos Amostra Procedimento de Extrao Extrao por solvente, disperso da matriz em fase slida (MSPD) e QuEChERS SFE com derivatizao in situ Limpeza Tcnica de anlise UHPLC-MS/ MS LOD/LOQ CC/CC Recuperao (%) (RSD,%) Ref.

ovos

No utilizada

92

cloranfenicol, orfenicole LOD: 8,7 a 66 a 92 141 camaro No utilizada GC-MS tiamfenicol 17,4 ng kg-1 (<15,3) apramicina, gentamincina, tobramicina, paramomicimsculo e na, hidromicina, neomicia, fgado (suno, kanamicina, sisomicina, de ave, bovino) CC: 8,1 a 71 a 108 netilmicina, ribostamicina, em rim (suno Extrao com tampo e SPE LC-MS 144 11,8 g kg-1 (-) causgamicina, amicacina, e bovino), leite streptomicina, di-hidro- bovino e ovos -streptomicina e pectino(galinha) mincina benzimidazoles, macroldeos, penicilinas, quinoliCC adequado nas, sulfonamidas, pirimi- carne, peixe e UHPLC-TOF70 a 100% Extrao slido-lquido SPE para >90% dos 151 dinas, tetraciclinas, nitroiovos MS (-) compostos midazoles, tranquilizantes, ampenicols e outros UHPLC-MS/MS: ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry; GC-MS: gas chromatography coupled to mass spectrometry; LC-MS: liquid chromatography coupled to mass spectrometry; UHPLC-TOF-MS: ultra high performance liquid chromatography coupled to time-of-ight mass spectrometry, LC-TOF-MS.

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permite monitorar as modicaes provocadas pelo metabolismo sobre a espcie qumica estudada. Assim, possui capacidade de medir concentraes de substncias altamente hidrofbicas normalmente removidas em processos de ltrao, sendo caracterizada como um ensaio no destrutivo.146 Um mtodo para determinao simultnea de anti-inamatrios no esteroides (ibuprofeno, naproxeno, cetoprofeno, diclofenaco, cido ufenmico, cido tolfenmico e cido meclofenmico) foi aplicado em leite bovino empregando SPME, aps uma etapa de derivatizao, e GC-MS.147 Trs tipos de bras de SPME (poliacrilato, polidimetilsiloxano/divinilbenzeno e polidimetilsiloxano) foram avaliados e os melhores resultados foram obtidos com a bra de PDMS. Tcnicas de limpeza de extratos provenientes de amostras de alimentos de origem animal Uma importante etapa no preparo de amostra a limpeza dos extratos, pois constituintes da matriz podem ser coextrados e posteriormente coeludos com os compostos que sero analisados e, consequentemente, interferir na identicao e quanticao do analito.57 A etapa de limpeza minimiza problemas e melhora a detectabilidade, permitindo resultados mais exatos e precisos, alm de possibilitar o aumento da vida til das colunas cromatogrcas. Alm disso, reduz a necessidade de limpeza dos sistemas de anlise. Vrias tcnicas de limpeza do extrato tm sido aplicadas para eliminar interferncias coextradas das amostras de alimentos de origem animal, incluindo SPE, D-SPE, cromatograa por permeao em gel (gel permeation chromatography, GPC) e ultraltrao (ultraltration, UF). A limpeza do extrato indispensvel para evitar o efeito matriz em mtodos que empregam tcnicas cromatogrcas acopladas MS (GC-MS e LCMS). Comparando com os sistemas analticos dotados de detectores tradicionais, essas tcnicas permitem a obteno de um alto nvel de seletividade e detectabilidade. Os componentes coeludos da matriz podem levar obteno de resultados falso-positivos, falso-negativos ou, ainda, quanticao inexata causada pela supresso ou aumento de sinal analtico. Esse efeito denominado de efeito matriz, o qual decorrente de vrios fatores. Constituintes da matriz podem ser coextrados e posteriormente coeludos com os compostos que sero analisados e podem, consequentemente, interferir na identicao e quanticao do analito.57 Na LC-MS os componentes coeludos da matriz podem causar supresso ou aumento da ionizao na fonte, dependendo do tipo de matriz. O mesmo efeito pode ocorrer em sistemas GC-MS, onde diferentes mecanismos (por ex., interao com os stios ativos) so responsveis pelo efeito matriz.148 Compostos coextrados, principalmente lipdios, tendem a adsorver no insersor do injetor e na coluna dos sistemas de GC, resultando em baixo desempenho cromatogrco.149,150 Extrao em fase slida A SPE tem sido empregada como tcnica de limpeza de extratos para remover compostos coextrados com muitas classes de analitos para uma grande variedade de alimentos de origem animal.57 Os processos tpicos de limpeza de extratos requerem, aps a extrao, mltiplas etapas baseadas no uso de vrios adsorventes, como orisil, C18, alumina e slica gel, de forma a eliminar substncias interferentes oriundas da matriz, que podem degradar rapidamente a ecincia da coluna cromatogrca e interferir na exatido de identicao e quanticao dos analitos.148,151 Uma estratgia muito utilizada para anlise de alimentos a combinao de SPE com QuEChERS, que apresenta a vantagem de um consumo de solventes relativamente baixo, quando comparado com os mtodos baseados na partio lquido-lquido tradicionais. No caso de matrizes ricas em lipdeos, a limpeza realizada empregando uma combinao dos sorventes

PSA (primary secondary amine), GCB (graphitized carbon black) e C18.110,152 Um mtodo para determinao de medicamentos veterinrios em carne, peixe e ovos foi desenvolvido recentemente utilizando extrao slido-lquido com uma mistura de acetonitrila e gua, seguida de agitao e centrifugao, com limpeza do extrato sobrenadante por SPE, utilizando sorventes polimricos, aps diluio do extrato com gua. Para amostras de ovos foi necessrio a lavagem do cartucho com 3 mL de gua e a eluio foi efetuada com uma mistura de metanol/ acetato de etila (1:1, v/v). Para as amostras de carnes e peixes foi dispensada a lavagem do cartucho e para eluio foi utilizada uma mistura de metanol/acetonitrila (1:1, v/v). Em ambos os casos, os extratos foram evaporados at a secura com N2 a 40 C e redissolvidos em acetonitrila para anlise por cromatograa lquida acoplada a espectrmetro de massas do tipo tempo de voo (liquid chromatography coupled to time-of-ight mass spectrometry, LC-TOF-MS) no modo de varredura. O mtodo possibilitou a obteno de bons resultados, permitindo atingir uma seletividade adequada para identicao dos analitos. A validao do mtodo demonstrou bons resultados com recuperaes entre 70 e 100% e capacidades de deteco (CC) adequadas para mais de 90% dos compostos.51 Extrao em fase slida dispersiva A D-SPE proposta por Anastassiades et al.69 baseada em um procedimento muito simples para ser empregado na limpeza de extratos destinados anlise cromatogrca de resduos e contaminantes em alimentos. Na proposta original, agita-se o extrato (1 mL) com pequena quantidade de sorvente (25 mg). A agitao tem como objetivo a distribuio uniforme do sorvente e assim facilitar o processo de limpeza. O sorvente ento separado por centrifugao, sendo uma alquota do extrato nal retirada para anlise.49,50 A D-SPE foi desenvolvida simultaneamente com o mtodo QuEChERS, tendo como objetivo a obteno de um extrato nal com menor quantidade de interferentes, aliado a um menor custo quando comparada com tcnicas tradicionais. Uma das principais vantagens da D-SPE a versatilidade no estabelecimento de novos mtodos, uma vez que permite a utilizao de diferentes quantidades e/ou misturas de sorventes, dependendo do tipo de matriz e analitos de interesse.49,50 Alm disso, outra vantagem desta tcnica a possibilidade de realizar a fcil combinao de diferentes tipos de sorventes de acordo com a necessidade do analista, do tipo de matriz e do equipamento que ser utilizado na determinao dos analitos de interesse. Soma-se a isto a possibilidade de realizar a remoo de gua residual de forma simultnea com a limpeza do extrato, uma vez que os sais secantes (MgSO4 ou Na2SO4) podem ser adicionados ao mesmo tempo que o sorvente. Esta etapa de remoo de gua proporciona um extrato nal de menor polaridade, facilitando assim a precipitao de coextrativos polares. O sorvente PSA retm as interferncias da matriz, sendo que depois da agitao manual e centrifugao o extrato est pronto para ser injetado no sistema cromatogrco.49,50 A estrutura bidentada do PSA tem um elevado efeito quelante, devido presena dos grupos amino primrio e secundrio.153 Como resultado, a reteno de cidos graxos livres e de outros compostos polares presentes na matriz muito forte. Uma limpeza eciente garante uma maior vida til para insersores e colunas cromatogrcas, reduzindo assim a contaminao do sistema cromatogrco, minimizando o efeito matriz.154-156 Outra modicao bastante relevante foi a adio de 50 mg de sorvente C18,157 juntamente com 50 mg de PSA na etapa de D-SPE. O sorvente C18 promoveu uma limpeza mais efetiva de extratos provenientes de algumas amostras com alto teor de gordura como, por exemplo, leite, ovos e abacate.158-161 Lehotay et al.84 combinaram o mtodo QuEChERS com etapa de limpeza do extrato empregando resfriamento, visando a remoo dos coextrativos lipdicos (ceras

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e leos) provenientes de amostras de lima. Esta etapa baseou-se na coleta do sobrenadante proveniente da verso citrato do mtodo QuEChERS e posterior resfriamento por 1 h a -20 C. De acordo com os autores, esta etapa reduziu a quantidade de coextrativos. Porm, a adio do sorvente C18 na etapa de D-SPE mais rpida e fcil, e promove uma remoo igualmente ecaz dos lipdios. Alm destas modicaes, a reduo do teor de clorola nos coextrativos provenientes de amostras como pigmentao verde, foi outro avano efetuado na etapa de limpeza,160 obtido atravs da adio de uma pequena quantidade de carbono gratizado.158,159 Outra modicao realizada na etapa de limpeza foi o uso de uma maior quantidade de PSA na etapa de D-SPE em amostras de cereais como objetivo de remover, de forma mais eciente, os cidos graxos coextrados.161 Cromatograa por permeao em gel A tcnica de GPC baseia-se no princpio de excluso por tamanho, sendo amplamente utilizada na anlise de resduos de medicamentos veterinrios. A GPC considerada uma excelente alternativa para a separao de compostos de baixo peso molecular (at 400 Da), tais como agrotxicos e medicamentos veterinrios, de compostos de alta massa molecular, tais como lipdios (600 a 1500 Da).162-164 O sistema de GPC compreende uma bomba de LC, um coletor de frao e um detector (opcional). As colunas so feitas de microesferas porosas polimricas, que permitem a separao de compostos de acordo com seus pesos moleculares. Usando este princpio, fraes de medicamentos veterinrios so separadas de fraes de lipdios de alto peso molecular.110 A m de obter um melhor desempenho nos sistemas de GPC,158 alguns autores substituram sistemas lentos de limpeza por colunas de slica descartveis de alta capacidade (high-capacity disposable silica, HCDS) contendo 28 g de slica cida, 16 g de slica alcalina e 6 g de slica neutra, o que permitiu reter at 4 g de lipdios por amostra.165 Estas colunas tm sido aplicadas na limpeza de extratos de amostras contendo alto teor de lipdios como, por exemplo, aves, peixes e ovos. A tcnica de GPC tem sido amplamente utilizada para limpeza de extratos de alimentos de origem animal, com alto teor de gordura. No entanto, compostos coextrados, incluindo traos de lipdios, podem estar presentes no eluato proveniente do sistema GPC e interferir na anlise subsequente. Amostras complexas, como peixes, carnes e extratos de outras matrizes gordurosas, muitas vezes requerem duas etapas de limpeza combinando GPC e cromatograa por adsoro em srie.163,164 Ultraltrao uma tcnica de limpeza de extratos alternativa para a anlise de resduos de medicamentos veterinrios. A ultraltrao (UF) resultante do desenvolvimento de mtodos multirresduo por LC-MS/ MS. Na anlise de resduos de alimentos a UF usada principalmente para separar analitos de interesse de macromolculas, como protenas, peptdeos, lipdios e acares, que podem interferir na anlise, afetando particularmente a ionizao em MS. Na anlise de resduos, dispositivos de corte de peso molecular ou ltros de spin acoplados a tubos de microcentrfuga so os formatos mais comumente usados. Formatos alternativos tambm esto disponveis comercialmente, tais como placa de 96 poos, mas requerem sistemas de vcuo.45 van Rhijn et al.131 empregaram a ultraltrao no preparo de amostra para a determinao de resduos de sulfonamidas em leite por LC-MS/MS, possibilitando maior rapidez no preparo de amostra e boa recuperao dos analitos. A ultraltrao, aps uma etapa de precipitao das protenas, tambm foi empregada na determinao de 150 medicamentos veterinrios multiclasse em leite por UHPLC-TOF-MS.45

CONCLUSES E PERSPECTIVAS As novas tecnologias analticas como, por exemplo, as mudanas nos espectrmetros de massas aliadas a inovaes em separaes cromatogrcas, permitiram que nos ltimos anos procedimentos rpidos e ecientes fossem desenvolvidos. Alm disso, a automao de etapas, miniaturizao e utilizao de novos sorventes conferiram ecincia e rapidez para algumas tcnicas, como a SPE. Somam-se a estas caractersticas a possibilidade do preparo de amostra em batelada e a consequente diminuio do tempo na realizao de algumas etapas do processo analtico. Estes avanos esto resultando na substituio dos mtodos tradicionais de anlise de resduos e contaminantes em alimentos, que apresentavam como caractersticas a morosidade de suas diversas etapas, o emprego de grandes volumes de solvente, alto custo etc. O preparo de amostra permanece como uma das etapas principais na determinao de resduos e contaminantes em alimentos, sendo a ecincia do procedimento de extrao o aspecto principal. Por isso, o nmero de etapas deve ser o menor possvel, uma vez que cada etapa pode resultar em perdas dos compostos de interesse e ser fonte de contaminao. Portanto, um procedimento de preparo rpido pode reduzir os custos e as fontes de erro. Atualmente, a tendncia o desenvolvimento de mtodos multirresduo robustos e que permitam o preparo de amostra de forma unicada para um grande nmero de matrizes. Estes mtodos devem apresentar como vantagens a possibilidade de analisar um grande nmero de compostos, altos percentuais de recuperao dos analitos, remoo dos possveis interferentes da amostra, boa preciso e robustez, baixo custo, rapidez, facilidade e segurana (utilizam pequenos volumes de solventes de baixa toxicidade). Outra abordagem, bastante recente o interesse pela determinao dos produtos de degradao e/ou metablitos dos medicamentos veterinrios em alimentos, pois alguns destes compostos so considerados genotxicos e/ou cancergenos. Futuramente, o desenvolvimento de novos procedimentos de extrao de resduos de medicamentos veterinrios estar baseado na aplicao de abordagens mais amplas de extrao, que tero como objetivo principal promover a reduo do tempo do preparo de amostra e a facilidade da execuo dos procedimentos. REFERNCIAS
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O estado da arte na determinao de resduos de medicamentos veterinrios

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