2 .

Materiais e mtodos
2.1. reagentes Phosphatidylinositol , Na sal (5 mg) , mistura de 16:00 / 18:02 e 18:00 / 18:02 a partir da anlise UHPLC - MSn ; soluo de 1,2- diacil- phosphatidylser -ine > 97 % ( PS ) de crebro de bovino em soluo CHCl3/CH3OH (5 mg ) , dipalmitoil - fosfatidiletanolamina - 16:00 / 16:00 (25 mg) , dipalmitoil - phosphatidylocholine - 16:00 / 16:00 (50 mg) , esfingomielina de crebro de bovino (> 97 %) - d18 : 1/16 : 0, d18 : 1 / 18:00 , d18 : 1/20 : 0, d18 : 1/22 : 0, D18 , 1/ 24: 1 ( 2 %, 50 %, 5 %, 7 %, 21 %) ( 10 mg) , acetato de amnio a 0,1% em acetonitrilo e 0,1 % de acetato de amnio em metanol de grau de HPLC -MS , foram adquiridos da Sigma Chemical Company (Sydney , Austrlia). Esfingomielina de leite bovino (SM) d18 : 1/16 : 0, d18 : 1/22 : 0, d18 : 1/23 : 0, d18 : 1/24 : 0, d18 : 1/24 : 1 (16% , 20 %, 34 %, 21 %, 3 %) ( 25 mg ) foi adquirido a partir de Auspep Pty Ltd (Melbourne , Austrlia). Todos os padres foram preparados em metanol, excepto para o PS, que foi preparado de cloro-formato, e armazenada a 20 C at serem usadas . As concentraes tpicas de uma soluo me mista foram: PI ( 30 lg / ml) , PS (10 lg / ml) , PE (30 lg / ml) , o PC (50 lg / ml) e SM (20 lg / ml). MEGA BE- slica (1 g) e MEGA BE- NH2 (1 g) cartuchos SPE foram adquiridos da Agilent Technologies ( Melbourne , Austrlia). Todos os outros qumicos e solventes foram AR grau ou superior. 2.2. Amostragem e preparao da amostra 2.2.1 Alimentando experincia As amostras de leite foram colhidas de vacas matriculados em uma fbrica de laticnios gado experimento de nutrio DPI Ellinbank , Victoria, Austrlia (latitude 38 140S , longitude 145 560E ) . O experimento foi conduzido no outono (maio) de 2011, e usou 144 vacas multparas temporada - aliado -parto Holstein - Friesian . Todas as vacas tinham entre 3 e 7 anos, foram 70 15,2 dias de lactao ( DIM ) (mdia DP) , e foram ordenhadas duas vezes ao dia no c . 07:00 h e as 15:00 h. O experimento foi realizado durante 28 dias. Isto incluiu um 14 - d perodo de pr- experimental, durante o qual as vacas adaptado quantidade de suplemento. Aps o perodo de pr-experimental, houve um perodo de medio de 14 - d durante a qual a matria seca (MS), em leva e produo de leite foram medidos. Antes do experimento, as vacas foram divididas em 24 grupos de seis vacas, com os grupos equilibrados para DIM, idade, peso corporal (PC) e produo prevalecente de leite, protena do leite e gordura do leite. Uma das trs dietas foi ento distribudos aleatoriamente para cada um dos 24 grupos. As dietas foram: (i ) Controle: vacas pastavam azevm perene (Lolium perenne L.)pasto suplementados com laminado gro de trigo alimentados duas vezes por dia na sala de ordenha e pasto silagem fornecidos no paddock . A proporo de gros : forrageira como suplemento alimentar foi de 75:25 ( base na MS ) . O abono de pastagem foi aproximadamente 14 kg de MS / vaca por dia , dos quais vacas consumiu cerca de 7-9 kg / vaca por dia. A dieta controle foi designado a 10 grupos ; ( ii ) rao parcial (PMR) : Vacas pastavam no mesmo permitir -ance de azevm perene como as vacas controle, e ofereceram uma rao contendo gro laminado de trigo , gros de milho ,

silagem de milho e silagem de pasto em um feedpad aps cada ordenha. A rao foi formulada para fornecer a mesma energia metabolizvel estimada (ME) ingesto de suplementos oferecidos s vacas controle, e tinha a mesma proporo de gros: forragem ( com base na MS 75:25 ) . Esta dieta foi atribuda a 10 grupos; ( iii ) RMP + Canola : Os animais foram alimentados da mesma forma como o PMR vacas , exceto que uma parte do trigo na PMR foram substitudos por meio de solventes de canola e a silagem pastagem foi substituda com feno de alfafa. Esta rao foi formulada para fornecer o mesmo como o de controle ME e tratamentos PMR, mas tinham quantidades mais elevadas de metaboliza protena ble ( MP) . Esta dieta foi atribuda a quatro grupos. Dentro de cada dieta, os grupos foram divididos em diferentes nveis de alimentao. Para o controle e PMR vacas, dois grupos foram designados para receber ou 8, 10 , 12, 14 ou 16 kg de MS de suplemento / vaca total por dia . Para a RMP + Canola vacas, dois grupos, foram receber 14 ou 16 kg de MS de suplemento / vaca por dia. 2.2.2. Amostragem de leite Em duas ordenhas dirias consecutivas (PM seguido por AM) durante o 2 - perodo de medio de semana, uma amostra representativa do leite diria de cada vaca foram coletadas por meio de linha de medidores de leite (DEL-aval International, Tumba, Sucia) que coletam uma amostra representativa do leite dirio para cada vaca. Depois da ordenha, as amostras de leite foram reunidas por grupo, para formar 24 amostras. Estas amostras foram ento armazenadas a 4 C durante a noite, em seguida, uma amostra de leite de manh foi recolhidos a partir de cada vaca e volumoso, utilizando o mesmo procedimento. Assim, havia um total de 24 amostras de leite que eram representativas do leite diria produzida por cada grupo de 6 vacas. Uma subamostra foi colhida a partir de cada uma destas 24 amostras para anlise de fosfolipdios. Uma amostra de leite creme comercial completo foi adquirido a partir de um fornecedor local e analisadas para comparar o contedo lipdico polar com os lipdios polares presentes nas amostras de leite cru da nutrio experimento. 2.2.3 . Extraco de gordura do leite A gordura do leite foi extrado seguindo o mtodo descrito por Rom- baut et ai. (2005 ) com algumas modificaes . Uma alquota de 10 ml de leite foi diluda com 20 ml de gua Milli-Q , misturado com 80 mL de 2:1 ( v / v) de clorofrmio : metanol e agitou-se durante 2 minutos a tempera-tura ambiente . A mistura foi deixada separar e a camada inferior de clorofrmio foi claro removido. A extraco foi repetida duas vezes com 40 ml de 20:1 (v / v) de clorofrmio: metanol. Aps a remoo da fase orgnica, a fase superior foi misturada com 40 ml de 86:14:1 (v / v / v) de clorofrmio : metanol : gua ( gua contida NaCl a 0,9% ) , e deixou-se separar a fase orgnica inferior era removido. A fase orgnica combinada ( principalmente clorofrmio) foi lavada com 20 ml de soluo de NaCl a 0,9 % e a soluo de clorofrmio - fuged centrifugao a 5000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi removido e o solvente foi evaporado utilizando um evaporador rotativo a vcuo a 35 C. O lpido extrado foi dissolvido em 10 ml de 2:1 ( v / v) de clorofrmio : metanol e armazenada a a20 C, antes de limpar - se pelo assim extrao em fase tampa (SPE) 2.2.4. Extrao em fase slida (SPE)

Dois mililitros do extrato lipdico da Seo 2.2.3 foram concentrou a 1 ml sob uma corrente de azoto, e 0,5 ml desta soluo foram ento carregados para um cartucho de SPE Si que havia sido condicionado com 8 ml de hexano. Os lipdeos no polares foram eludos com 3 mL de 8:2 (v / v) de hexano: ter dietlico, seguido de 3 ml de 01:01 (v / v) de hexano: ter dietlico. Os lpidos polares foram eludos com 2 ml metanol, seguido por 4 ml de 03:05:02 (v / v) de clorofrmio: meta-nol: gua. O eluente foi soprada at secura sob uma corrente de azoto. O resduo foi dissolvido em metanol (0,5 ml) e filtradas atravs de um disco de filtro de 0,2 de lm de Teflon antes da anlise por UHPLC-MSN.

2.3. Aparelho 2.3.1. UHPLC-MSN Os ensaios foram realizados com um binrio Agilent srie 1290 UHPLC sistema de distribuio de solvente com um auto-amostrador refrigerado (4 C) e aquecimento da coluna (Agilent , Waldbron Alemanha) acoplado a um Thermo Fisher LTQ espectrmetro de massa de armadilha de ies de funcionamento no modo de ionizao por electropulverizao io negativo ( Thermo Fisher , San Jose, CA ) . As espcies foram separadas por uma coluna de 150 a 2,1 milmetros 2,6 lm Kinetex HILIC 100A equipado com uma coluna de guarda HILIC ( Phenome nex , Sydney , Austrlia) mantida a 30 C. A fase mvel consistiu de con - acetato de amnio a 0,1% em acetonitrilo (A) e acetato de amnio a 0,1% em metanol ( B) com a eluio a seguir pro -file: 0% B ( 0 minutos) , 10% de B (0,1 min) , 20% de B (10 min ), 25 % de B (50 minutos), 0 % B (50,5 minutos). A taxa de fluxo foi de 0,2 ml / min e um LL do extrato SPE foi carregado na coluna. O espectrmetro de massa foi sintonizado por infuso de uma soluo padro misturado a uma velocidade de 10 ll / min, misturado com 0,2 ml / min UHPLC fase mvel B atravs de uma pea em T, antes de entrar no espectrmetro de massa. A tenso de pulverizao ESI tenso capilar e foram ajustados para 4 kV e A24 V, respectivamente. O capilar foi aquecido, mantida a 200 C e a bainha, e varrer os gases auxiliares foram a 20 , 5 e 3 unidades , respectivamente. Foram utilizados verificao completa MS3 protocolos com uma energia de coliso normalizado de 35. Software V2.1 Excalibur foi usado para processar os dados. A resposta do detector para o io molecular / adutor de uma srie mista de normas (PI 16:00 / 18:02 , PE 16:00 / 16:00 , PC 16:00 / 16:00 , SM d18 : 1 / 16 , d18 : 1/20, d18 : 23/1 : 0 e d18 : 1/24 : 0) foi linear (r2 = 0,99) a partir de 5-100 lg / ml. Dados precisos sobre massas foram obtidas utilizando um LTQ Velos Orbitrap espectrmetro de massa acoplado a um Agilent 1290 UHPLC sistema operacional, como descrito acima. A fonte de ies de electropulverizao foi mantida a 50 C, a tenso de gs de pulverizao e revestimento foram ajustados para 3,2 kV e 15 unidades , respectivamente. Massa exata foram dados acrias com uma resoluo de 100.000.

2.4. A anlise estatstica Leite dados lpidos polares foram submetidos a anlise de varincia ( ANOVA ), utilizando o PROC GLM do SAS (2009 ), utilizando um delineamento em blocos casualizados completa de

acordo com o modelo Yij = l + Ri + Tij + eij , onde Yij = valor observado da varivel resposta de replicar ( i) e tratamentos ( j ) , l = mdia da populao, Ri = efeito da repetio , Tij = efeito do tratamento ( diferentes nveis de suplemento total ofertado como tratamentos dietticos ) e eij = erro experimental. Tratamentos mdios foram comparados usando LSD protegido ao nvel de significncia de 5 %.

4. Concluso Um procedimento UHPLC-MSN foi desenvolvido para separar e identificar os principais lipdios polares presentes na gordura do leite a partir de leite obtido a partir de uma experincia de alimentao. Modificaes perceptveis nas quantidades relativas de alguns dos componentes lipdicos polares foram observadas com as diferentes dietas de vacas. Algumas das espcies, e.g. PI 18:01 / 18:02, PE 14:00 / 18:02 PE 14:00 / 18:01, PC 16:00 / 14:00, PC 16:00 / 15:00, 14:00 PC / 18 : 1 PC 15:00 / 18:01, 16:00 PC / PC 18:00 17:00 / 18:01 e PC 18:01 / 18:01, informou neste estudo no tenham sido previamente identificados no leite bovino.