Microscopio de contraste de fases

Las clulas vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de fases o de contraste de fases interferencial. La posibilidad de que algunos componentes de la clula puedan perderse o distorsionarse durante la preparacin de las muestras no ha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La nica solucin a este problema es examinar las clulas mientras an estn vivas, sin ningn tipo de fijacin ni congelacin. Para este propsito son tiles microscopios con sistemas pticos especiales. Cuando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa vara en relacin al ndice de refraccin de la clula: la luz que pasa a travs de una zona relativamente gruesa o densa de la clula, como por ejemplo el ncleo, se retrasa y su fase queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado a travs de una regin adyacente de citoplasma, ms fina. El microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de fases interferencial aprovechan los efectos de interferencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas, creando de esta forma una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de microscopios pticos se utilizan habitualmente para visualizar clulas vivas.

Historia del Microscopio de Contraste de Fases

Hasta mediados del siglo XX un gran nmero de microscopios de luz haban salido al mercado, destacando los microscopios de la firma Carl Zeiss, debido a la colaboracin entre Ernst Abbe y Zeiss. Esta firma logr la produccin de microscopios de gran calidad, gracias a la aplicacin de la teora de formacin de imgenes de Abbe, diseando por primera vez un microscopio basado en clculos matemticos y conocimientos de ptica geomtrica. No obstante ello, se presentaban problemas muy grandes al tratar de observar muestras transparentes a la luz visible, como es el caso de algunos seres vivos. En el ao 1935, el fsico holands Fritz Zernike desarroll el Microscopio de Contraste de Fase, con lo cual se le otorg el Premio Nobel de Fsica en el ao 1953. Su contribucin consisti al afirmar que la imagen vista bajo un microscopio convencional, es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se

observa en el ocular. Si la muestra no absorbe la luz, no habr esencialmente contraste en la imagen visible (ser toda blanca); por ejemplo, la mayora de las clulas vivas absorben poca luz (a excepcin de las clulas rojas de la sangre y los cloroplastos) y por lo tanto, son difciles de visualizar a travs de un microscopio convencional. Por otro lado, aunque las clulas absorben poca luz, tienen diversos espesores y diversos ndices de refraccin en sus partes, lo que conduce a las diferencias de fase de las ondas de luz que pasan a travs de ellas. La fase de un haz de luz es inobservable a la vista (apenas se ve la intensidad, no la fase). Zernike calcul la manera de hacer que las diferencias de fase se observaran en la imagen como en la intensidad, logrando as, visualizar detalles que no eran posibles apreciar en un microscopio convencional. Este tipo de microscopios se utiliza habitualmente para estudiar clulas vivas.

Constitucin del microscopio de contraste de fase

Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio ptico de campo claro con algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales. El condensador presenta un disco que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos, se agregan unos anillos de fase, que son discos transparentes con un diseo en relieve, cabe destacar que existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre la luz y por lo tanto, las imgenes se ven diferentes en cada uno, esto se explicar ms adelante. Objetivos: En la de la derecha, se muestra un corte de un objetivo, mostrando el disco de fase. Hay que considerar adems que cada una de estas parte no es nica, sino que existen varios juegos de condensadores y de objetivos, dependiendo de la ocasin y el zoom que se necesite.

Fundamentos fsicos:
Este microscopio se basa en que la luz, al atravesar objetos con distintos ndices de refraccin, experimente retrasos (o desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder observarlos, el microscopio de contraste de fase, mediante las dos adaptaciones que aparecen a la derecha, acenta dichos retrasos, haciendo que zonas con distintos ndices de refraccin se traduzcan en una variacin de contraste lo cual puede ser observado.

La manera de funcionar es la siguiente: Por medio del condensador, se logran separar los rayos luminosos que no son difractados por el objeto de los que no lo hacen, al pasar por la muestra, los rayos que atraviesan objetos ms densos, experimentan un retraso de un cuarto de lambda, y al pasar por el anillo de fase estos rayos, debido a la forma del anillo de fase, estas ondas se retrasan un cuarto de lambda ms, en cambio, las que no se han retrasado, pasan por una parte ms delgada del anillo de fase y no se siguen retrasando. Entonces estos desfases de las ondas luminosas se perciben como diferencias en el contraste, en distintos tonos de gris. Adems el anillo de fase disminuye la intensidad de la luz. Adems, existen distintas formas de discos de fase, positivos y negativos, los que tienen distintos efectos sobre la luz difractada, haciendo que las imgenes se vean de diferente manera dependiendo cual se use.

Tipos de contraste
Contraste de fase oscuro o positivo: cuando los rayos de luz, la desviada y la no desviada tienden a cancelarse creando una interferencia destructiva y hacer que el objeto aparezca mucho ms oscuro que los alrededores. Contraste de fase brillante o negativo: se presenta cuando retrasamos la luz no desviada y la hacemos 1/4 de longitud de onda menor, lo que hace que salga al tiempo con la luz desviada, que tiene un retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando de esta manera que salgan al mismo tiempo y se recombinen para dar brillo, creando una interferencia constructiva; aumentando en esta forma el objeto mientras su contorno permanece con menos intensidad.

Objetivo
La microscopia de contraste de fases y la del microscopio de interferencia nos dan la posibilidad de observar clulas vivas y sin ninguna preparacin, ya que al realizar otros procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedan perderse o distorsionarse por mtodos como la fijacin, coloracin, congelacin, y otros, as, estos instrumentos pticos ayudan a resolver el problema.

Principio de la microscopia de contraste

Las clulas vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luz pasan a travs sin sufrir prdidas en intensidad. La luz transmitida a travs de las clulas vivientes, sin embargo, encuentra a su paso, regiones de ndices de refraccin diferentes, y diferentes grosores y/o densidades, lo que es capaz de alterar su velocidad y su direccin. En la imagen se da la representacin esquemtica en donde dos regiones adyacentes de una misma clula, A y B, de un diferente grosor, t1 y t2 y con diferentes ndices de refraccin, n1 y n2, son atravesadas por un rayo luminoso. Las variaciones en grosor e ndices de refraccin son capaces de producir una diferencia en el curso ptico de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso especfico, le toma ms tiempo pasar a la luz a travs de la fraccin B, cuyo ndice de refraccin es mayor (n2) y por lo tanto est retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de atravesar la porcin A, cuyo ndice de refraccin es ms bajo. Si la diferencia de los ndices de refraccin es pequea, la magnitud del cambio de fase inducido igualmente es muy pequea y se mide en trminos de longitudes de onda (l). As, en la representacin de la Imagen, el rayo que pasa a travs de la parte B se muestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( l/4) y emerge fuera de fase. Con respecto a la transmisin que nos muestra la parte A.

Aplicaciones de este tipo de Microscopio.

Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, del microscopio de contraste de fases interferencial y del microscopio de campo oscuro estriba en que los tres permiten observar las clulas en accin y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migracin celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmente resulta til hacer pelculas o vdeos por el sistema de aceleracin de movimiento (microcinematografa). En esto casos, se toman fotografas sucesivas, separadas por breves perodos de tiempo, de modo que cuando la pelcula o video registrados se proyectan a la velocidad normal los acontecimientos aparecen muy acelerados. Esta tcnica microscpica se usa para medir ndice de refraccin y concentracin de slidos de las estructuras celulares utilizando un mtodo de refractometra por inmersin, as se sumergen las clulas en una solucin isotnica cuyo ndice de refraccin puede variarse. Esta refractometra se ha empleado para ser medidos en procesos como la divisin celular y el desarrollo de esporas fngicas. Igualmente es til para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares.

Ventajas y desventajas de este tipo de Microscopio

Ventajas Produce una imagen brillante contra un fondo oscuro sin halos de difraccin de una clula viva. Determinacin del ndice de refraccin Determinacin de slidos, masa seca y espesor de las estructuras celulares

Desventajas Alto costo del equipo por los diferentes aditamentos utilizados en el microscopio (alrededor de 50,000 pesos el microscopio + 14,000 pesos en aditamentos) Costo alto y mantenimiento cuidadoso de la muestra de clulas vivas La microcinematografa requerida para mirar los procesos que realiza la clula in vivo requiere de equipos especiales y personal entrenado.

Fuentes
Bibliografa
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Cibergrafa
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