Ao 2006

SEMINARIO I
ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
La conversin microbiolgica de carbohidratos para obtener biomasa y
productos de inters industrial es tema de constante actualidad debido a la
creciente dependencia de los recursos renovables.
Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia
significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la
formulacin de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de
operacin de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede
transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos
juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante
de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de
sumo inters poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den
cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un biorreactor. Los
balances de materia y energ!a resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha
e"tendido ampliamente en ciencias bsicas y aplicadas.
La aparicin en el mercado de sensores que permiten medir importantes
variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los
biorreactores #biorreactor $ recipiente en el cual se cultivan los microorganismos%
han ampliado el horizonte para la aplicacin de balances de materia y energ!a. la
produccin de biomasa #biomasa $ concentracin de microorganismos e"presada
en gramos de clulas secas & litro de cultivo%, consumo de las fuentes de ' y
energ!a, de nitrgeno y ("!geno y las produccin de '(
)
y desprendimiento de
calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas
e"perimentales y utilizadas en el planteo y clculo de balances de materia y
energ!a.
*ntes de proceder a considerar el sistema de anlisis propuesto, es
conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre
algunas +regularidades, observadas e"perimentalmente en el cultivo de
microorganismos.
En primer lugar se ha encontrado que la composicin elemental de un
importante n-mero de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se
mantiene prcticamente constante. as! podemos definir un +microorganismo
promedio, #composicin standard% como aquel cuya composicin es #/ p&p%0 ' $
12,3. 4 $ 2,51. 6 $ 78,6 y 9 $ 86,:3, donde el apro"imadamente 3 / restante est
representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composicin elemental
promedio de la biomasa se mantiene prcticamente constante, la concentracin
intracelular de prote!nas, ;9* y dems constituyentes celulares puede variar
sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estad!os del
cultivo de un mismo microorganismo.
<eniendo en cuenta esta composicin media, podemos escribir lo que ser!a la
+frmula m!nima, de nuestro m.o. promedio como ' 4
8,=5
(
6,3
9
6,)
#en la que est
representada el 53/ p&p de la biomasa% y con fines netamente prcticos definir +8
'>mol de biomasa, como la cantidad de biomasa que contiene 8 tomo gramo de '.
*s! pues tenemos que0
g 25,8 =
95 , 0
2 , 0 x 14 5 , 0 x 16 79 , 1 12
= biomasa de mol - C 1
+ + +
1
?i llamamos +
"
, a la fraccin de ' en la biomasa y tenemos en cuenta que
para nuestro m.o. promedio
"
$ 6,123, obtendr!amos el mismo valor anterior
haciendo el siguiente clculo0 8)&6,123 $ )3,:. Estrictamente hablando, para
conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n '>moles de biomasa debemos
conocer su composicin elemental y en trminos generales el factor de conversin
resulta ser0
n.
12
g
x

de biomasa.
De forma anloga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 8 '>mol
de sustrato #entindase por sustrato fuente de carbono y energ!a, FCE%, 8 '>mol de
fuente de 9, etc. 'omo ejemplo, para la glucosa0 '
2
4
8)
(
2
, 8 '>mol de glucosa
estar representado por '4
)
( y pesar 76 g, y para el etanol, 8 '>mol de etanol
#'4
7
(
6,3
% pesar )7 g.
(tro concepto que debemos introducir es el de +grado de reduccin, o +grado
de reductancia,, el cual ser de gran utilidad en el momento de plantear nuestros
balances de materia y energ!a.
<omemos como ejemplo las siguientes reacciones de o"idacin0
' @ (
)
. '(
)
$ 1
'4
1
@ )(
)
'(
)
@ )4
)
( $ :
'( @ 6,3 (
)
'(
)
$ )
'4
)
( @ (
)
'(
)
@ 4
)
( $ 1
'4
7
(
6,3
@ 8,3 (
)
'(
)
@ 8,3 4
)
( A $ 2
Bodemos observar que los distintos valores de que figuran a la derecha de
cada ecuacin coinciden con el n-mero de +electrones disponibles, que fueron
transferidos desde el compuesto a o"idar al o"!geno. En general se e"presa en
trminos de n de e
>
disponibles & c>mol.
Bara calcular el valor de de un determinado compuesto se toman los grados
de reduccin 1 para el '. 8 para el 4. >) para el ( y >7 para el 9. En el caso del
'(
)
, 4
)
( y 94
7
no se tienen e
>
disponibles #estados de referencia%, luego
'()
$
4)(
$
947
$ 6. ?e considera adems que el estado de o"idacin predominante del 9 en
la biomasa es >7. En trminos generales para un compuesto de frmula '4
a
(
b
9
c
, su
grado de reduccin vendr dado por0
$ 1 @ a > )b > 7c #8%
?i tenemos un compuesto cuya frmula es '
h
4
i
(
j
9
C
, debemos llevarlo a la forma
h
k
h
j
h
i
N C!
?i tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su
"
#donde el sub!ndice
" indica biomasa% ser0
mol - C
dis". e
4,19 =
-
x

Este valor, junto a su correspondiente

"
$ 6,1, son dos de las +regularidades,
a las que nos hab!amos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser
2
empleados en balances de materia y energ!a en aquellos casos en que se
desconoce la composicin de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros
de clculo. (tras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de
reaccin por mol de e
>
transferidos al (
)
es relativamente constante para la
o"idacin de una amplia variedad de molculas orgnicas y corresponde a )=
Dcal&mol e
>
disponibles transferidos al (
)
.
Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de materia
y energ!a, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera una reaccin
qu!mica simple.
1
2 2 2
C mol S a mol fte de N b O y X y prod CO w H O q calor
x p
+ # # # # # $ %
& = 'elo(idad de
&ea((ion
Donde E significa +biomasa,, cuaquiera sea su naturaleza.
Debemos hacer notar que los coeficientes estequiomtricos estn referidos a
8 '>mol de fuente de ' y energ!a. *s! pues0
y
C mol de X
C mol de fte de C y E
x

-
- .

1
]
1
lo mismo para y
p
e y
'()
.
Feneralizando0
CH O a NH bO y CH O N y CH O N y CO wH O q
S S X X X X p P P P CO 2 2 ) 2 1 2 ) 1 2 )
2
2 2
# # # # # #
#8G
%
El balance de carbono para esta reaccin de formacin de biomasa y producto ser0
y y y
x " C
2
# # 1
#)%
De igual forma podemos establecer un balance del grado de reduccin0

s
@ #>1%b $ y
"
.
"
@ y
p
.
p
#7%
;eordenando y dividiendo por
s
obtenemos
4
1
b .
.
s
x x
s
" "
s

+ +
y
y
#1%
o lo que es lo mismo
@ @ $ 8 #3%
donde $
4b
s

#fraccin de e
>
disponibles del sustrato transferidos al (
)%
$
y
x x
s
.

#fracin de e
>
disp. del s transferidos a la biomasa%
$
y
" "
s
.

#fraccin de e
>
disp. del s transferidos al producto%
)
Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservacin de la
masa y la energ!a, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos ms
carbono del que un c>mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los
electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos.
?i asumimos, como ya se mencion, que el calor de reaccin por mol de e
>
disponibles transferidos al o"!geno es constante para un importante n de molculas
orgnicas, el primer trmino de la ecuacin #1% nos da la fraccin de energ!a del
sustrato que evoluciona como calor. ?i llamamos q
o
a esa constante con q
o
$ )=
Dcal&mol e
>
disponibles transferidos al (
)
, el calor generado en la ecuacin lG vendr
dado por0
q $ 1 q
o
b Ccal&'>mol de sustrato #2%
?i conocemos la velocidad de consumo de (
)
de nuestroo cultivo podemos
calcular la velocidad de produccin de calor y por lo tanto los requerimientos de 4
)
(
de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro biorreactor.
El concepto de e
>
disponibles nos brinda un mtodo simple de clculo para
chequear los resultados obtenidos e"perimentalmente en lo que se da en llamar
+anlisis de consistencia interna,. Empleando las ecuaciones #)% y #1% o #3% con
datos obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parmetros no medidos y tener
idea de cun confiables fueron nuestras determinaciones. Hedidas realizadas en el
laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos0
6,51 y
"
@ y
p
@ y
'()
8,62
6,57 @ @ 8,6=
Ialores inferiores o superiores a estos l!mites de aceptabilidad determinados
estad!sticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones
e"perimentales.
En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificacin de la biomasa producida
se efect-a gravimtricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa
e"presado en g&l #"% correspondiente a la utilizacin de una determinada cantidad
de sustrato #s% #igualmente e"presada en g&l% con lo cual definimos nuestro
rendimiento en base a sustrato como
s
x
*
x

al que tomamos como +rendimiento

global, en el que slo se tienen en cuenta los valores finales e iniciales de biomasa
y sustrato, ms rigurosamente J
"
debiera ser e"presado por el l!mite " & s con s
6, esto es0
*
dx
ds
x

#observar que el signo negativo es introducido porque " y s
var!an en sentido contrario%.
Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de y
"
, y
p
, y y
CO2
conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de
"
,
s
,
p
y
'()
tal cual vemos a continuacin0
+
C
C C
+
"
"
x
x x
2
2 2
* , , *

y Y y y
P
S
#=%
;esulta de gran inters conocer los destinos que toma la fuente de ' y
energ!a durante el crecimiento microbiano y la fraccin de la misma empleada por el
m.o. para obtener la energ!a necesaria para llevar adelante sus funciones
metablicas.
4
Bor balance de sustrato0
s $ s
"
@ s
p
@ s
E
#:%
donde ? $ ?ustrato total consumido
?
"
$ Kraccin de sustrato utilizado en la formacin de biomasa
?
p
$ Kraccin de sustrato utilizado en la formacin de producto
?
E
$ Kraccin de sustrato utilizado para obtener energ!a
Bor otro lado, se debe cumplir que0 > ?
"
.
s
$ E . " #5%
?
p
.
s
$ B . p #86%
por consiguiente0
?
E
$ ? > ?
"
> ?
p
?
E
$ ? @ E
..

x
s
-.
-
s
+
f
E
$

+
+
*
x
s
*
"
s
.
x "
1

f
E
0 fracc. de K'E destinada a la obtencin
de E.
f
E
$ 8 > y
"
> y
p
$
y
C
2
#88%
E"perimentalmente lo que se hace es determinar la produccin global de '(
)
y conociendo la masa de '(
)
y sustrato consumido y calcular ?
E
por
estequiometr!a. Este mtodo presenta dos inconvenientes0 en primer lugar e"isten
reacciones enzimticas que incorporan (
)
a determinados componentes celulares
#(
)
que no es empleado para obtener energ!a% no obstante este consumo puede ser
despreciado frente al global para o"idar la fte. de ' y E. y el ms importante es que
debemos suponer que
"

s
, caso contrario se introduce un grosero error en el
clculo.
4asta aqu! los balances planteados por el mtodo de e
>
disponibles
consideran el caso particular de formacin de biomasa y producto cuando la fuente
de 9 es 94
7
. *hora bien, qu sucede cuando sta no es 94
7
L
Lo que se hace en este caso es modificar los estados de referencia para que
en los balances0 C
2
$ !
2
$
fte.de 9
$ 6 con lo cual estamos estableciendo un
Mgrado de reduccin generalizadoM.
<omemos0 Niomasa $ '
! N
a b (
1 1 1
?ustrato $ '
! N
a b (
2 2 2
Broducto $ '
! N
a b (
) ) )
Kuente de 9 $
C ! N
d a b (
4 4 4 4
5
?e definen los
i
generalizados como0

"
$ 1 @ a
8
>
2
b
1
> ( )
C
C
d a b
1
4
4 4 4

_
,

+ 4 2

s
$ 1 @ a
)
>) b
2
> ( )
C
C
d a b
2
4
4 4 4

_
,

+ 4 2
M

p
$ 1 @ a
7
> )b
)
> ( )
C
C
d a b
)
4
4 4 4

_
,

+ 4 2
M

N
4
4
4
4
4
4
4
4 4
4
4
a
d
b
d
C
C
d
d
a
d
b
d
+

_
,

_
,

4 2 4 2
4
Ieamos ahora algunos ejemplos aplicados al anlisis de datos
Ejemplo 80
En un cultivo continuo de Saccharomyces cerevisiae se encontr que por
cada '>mol de biomasa formada se consumieron 1,)2 '>moles de glucosa, 6,73
moles de (
)
y se formaron 8,5) '>moles de etanol. La fuente de 9 fue 94
7
y la
glucosa. a fuente de ' y energ!a. La composicin elemental es '4
8,:
(
6,32
9
6,8=
.
Ierifique si el consumo de (
)
es correcto.

"
$ 1,8=
p
$ 2
s
$ 1 #'
)
4
2
(%
y
"
$
1
4 26 ,
$ 6,)73 y
p
$
1 92
4 26
,
,
$ 6,13
'4
)
( @ c 94
7
@ b (
)
y
"
biomasa @ y
p
'4
7
(
6,3
@ #8>y
c
>y
p
%'(
)
@ O 4
)
(

s
> 1b $ y
"
.
"
@ y
p
.
p
b $ #
s
> #y
"
.
"
@ y
p
.
p
% % P $ 6,6=5
mol de
C- mol de +
2
Ialor e"perimental $ 6,73
mol de
C- mol de biomasa
2
Ierificacin0
mol de
C- mol de biomasa
b
/
2
x
0 )4 ,
Ejemplo )0
Qn microorganismo crece anaerbicamente en un medio con glucosa como
fuente de ' y energ!a. 94
7
como fuente de 9 y 9(
7
>
como aceptor de electrones. El
6
y
"
$ 6,2 '>mol&'>mol. El 9(
7
>
es reducido por el microorganismo a 9
)
. 'unto 9(
7
>
ser necesario para obtener 7,3 g de biomasa&lL
*l no tener datos sobre la composicin elemental de la biomasa supongamos0
'4
8,:
(
6,3
9
6,
sales 3 /, en consecuencia 8 mol de biomasa pesar )3,: g y
"
$ 1,85.
9(
7
>
$ >3
'4
)
( @ n 9(
7
>
@ c 94
7
>>>>>>> y
"
biomasa @ #8>y
"
% '(
)
@ m 9
)
@ O 4
)
(

s
> 3n $ y
"
.
"
, luego ser n $

s x x )
mol de N
C- mol de +

y .
5
ser pues
mol de N
C- mol de biomasa
n
/
)
x

0 49 , , por lo tanto se necesitarn0

) 5
25 8
,
,
0 0
g 0 l
g 0 l
x 0,49 mol de N l = 0,066 mol de N l
) )

7