Transformacin gentica del frijol comn (Phaseolus vulgaris L.

) con el marcador de color Gus, la barra de resistencia a herbicidas, y la cebada (Hordeum vulgare) HVA1 genes de tolerancia a la sequa.
Cinco variedades de frijol comn (Phaseolus vulgaris L.) como "Cndor", "Matterhorn", "Sedona", "Olathe" y "Montcalm" eran genticamente transformados mediante el bombardeo biolstica shoot del meristemo apical primordio . Los transgenes incluyen marcadores de colores gus que confirm visualmente eventos transgnicos, la barra de resistencia al herbicida marcador seleccionable utilizado para la seleccin in vitro de cultivos transgnicos y confirm que las plantas resistentes a los herbicidas Liberty, y la cebada (Hordeum vulgare) protena abundante embriognesis tarda (HVA1) que confera la sequa la tolerancia con el correspondiente aumento en longitud de la raz de las plantas transgnicas. La investigacin que aqu se presenta puede ayudar en la produccin de germoplasma de P. vulgaris mejor.

1. INTRODUCCION El frijol comn (Phaseolus vulgaris L.) es una muy importante fuente de protena vegetal, especialmente en aquellas regiones del mundo en el que las protenas animales son escasos. El frijol comn proporciona el 22% de las necesidades totales de protenas en todo el mundo [1]. El Mejoramiento gentico ha contribuido significativamente a la mejora rasgo de P. vulgaris. Sin embargo, la cra no puede agregar ciertos genes que no existen de forma natural en el acervo gentico de P. vulgaris. Debido a esta limitacin del cultivo de plantas, nuevo rasgo mejora se acerca como interespecfica horizontal necesita la transferencia de genes a travs de la ingeniera gentica para ser utilizado a fin de complementar las limitaciones de los mejoramientos convencionales de este cultivo [2, 3]. Sobre todo, la transformacin mediada por Agrobacterium y la pistola de genes mtodo de bombardeo de microproyectiles de haber sido utilizado para la transformacin gentica de P. vulgaris. Sin embargo, ninguno de estos sistemas ha demostrado tan alto como los que se observan en gentica transformacin de los cereales [4]. Los investigadores tienen xito, intentado transformar protoplastos de P. vulgaris, ya sea a travs de polietilenglicol o electroporacin [5]. Una transformacin mediada por Agrobacterium relativamente avanzada de P. vulgaris se ha informado sobre el uso de sonicacin e infiltracin en vaco para la transferencia de un grupo de 3 LEA (finales embriognesis protenas abundantes) los genes de Brassica napus [6]. Aunque la eficacia de la transformacin usando este sistema fue baja, las plantas transgnicas mostraron una alta tasa de crecimiento bajo sal y estrs hdrico. Un reciente informe [7] sobre la transformacin de P. vulgaris variedades Mwitemania y Rose de coco con el gus gen marcador de color revela la importancia de la especificidad de los Cepas de Agrobacterium en la expresin del gen gus en P. vulgaris. Por ejemplo, la infeccin de P. vulgaris explantes con EHA 105 (pCAMBIA 1201) o EHA 105 (pCAMBIA 1301) dieron como resultado en azul GUS coloracin, sin embargo, no mostr la GUS expresin cuando los explantes fueron infectados con LBA 4404 (pBI 121) cepa de Agrobacterium. Uso de bombardeo biolstica de una construccin que contiene el gen bar, Arag ~ ao et al. [3] desarrollaron transgnico P. vulgaris que confiere resistencia al glufosinato de amonio, el ingrediente activo del herbicida Liberty (Aventis, Estrasburgo, Francia), en concentraciones de 500 g ha-1 en invernaderos y 400 g ha-1 en el campo. P. vulgaris tambin fue genticamente por Bonfim et al. [8] constructo utilizando RNAi-horquilla para silenciar la regin CA1 del genoma viral de haba Virus del Mosaico Dorado Gminis (BGMGV). Sin embargo, fuera de 2,706 plantas, slo se obtuvieron 18 lneas transgnicas putativas.

Figura 1: Plsmido construcciones. (A) Mapa lineal de pACT1F vector de plsmido. Arroz promotor de la actina ( Act1), gen gus (uidA) y nopalina terminador sintasa (Tnos); (b) Mapa lineal de pBY520 vector de plsmido. Promotor de la actina del arroz (Act1) y el inhibidor de la proteasa de patata II (Pin II-3) Terminator, cebada o Hordeum vulgare (HVA1) LEA gen 3, Virus mosaico de la coliflor 35S, el gen bar y nopalina sintasa terminator (Nos-3).

De las 18 supuestas plantas transgnicas, slo una planta exhibi resistencia al virus. Los ensayos de campo de las progenies de la sola planta transgnica mostr resistencia a este virus [9]. Vianna et al. [10] desarrollado un enfoque de transferir el conjunto de transgn como piezas de fragmentos de ADN, como se diferencia de todo el plsmido en P. vulgaris. Un protocolo fue publicado [11] en una transformacin gentica relativamente eficiente de P. vulgaris. Debido a la naturaleza "molesto" de P. vulgaris transformacin gentica, un artculo describe un mtodo llamado "composite transgnico" de P. vulgaris a travs del uso de Agrobacterium rhizogenes transformacin de derooted plantas de semillero [12]. La eficiencia de la ingeniera gentica de P. vulgaris sigue siendo un desafo. Un informe relativamente reciente explica el efecto de las condiciones in vitro en la organognesis indirecta (brotes mltiples de meristemas y cotiledones derivados regeneracin de los callos) para la produccin de un promedio de 0,5 disparar por grupo de callos. La regeneracin indirecta de diferentes genotipos de P. vulgaris tambin fue informado [13]. Kwapata et al. [14] citan que un cultivo in vitro de un solo brote apical meristema primordio podra producir hasta 20 brotes mltiples, que es un nmero relativamente mayor en comparacin con el trabajo presentado anteriormente. Sin embargo, esta regeneracin in vitro la eficiencia es todava muy bajo en comparacin con la deseada 100s regenerada a partir de los cultivos in vitro de cada brote apical meristemo primordios de los cultivos de cereales [4]. La transformacin gentica de P. vulgaris puede mejorar la tolerancia al estrs bitico y abitico. Factores de estrs bitico como enfermedades resultan en P.

vulgaris prdida de rendimiento. Brasil acaba de anunciar [15] el uso comercial de mosaico dorado del virus resistentes a P. vulgaris que fue desarrollado a travs de la interferencia de ARN mediante el bloqueo de la replicacin del gen del virus [8]. Esta es de hecho una de las principales paso en la aceptacin de la bioseguridad de los transgnicos P. vulgaris. Adems, los investigadores de Dinamarca informaron recientemente la clonacin del virus del mosaico comn del frijol gen (BCMV) y su aplicacin para el desarrollo de la resistencia a BCMV [16]. Los estreses biticos, incluyendo las plantas de sequa causan de perder turgencia celular, seguida por el mal plegamiento y la agregacin de las protenas y las prdidas de rendimiento [17]. Un grupo importante de abitico genes de tolerancia al estrs que codifican la embriognesis tarda protenas incluyen una clase de protenas de choque trmico (Hsp) que son extremadamente hidrfilo y resistente a calor, tales que no coagulan a temperaturas de ebullicin. La LEA protenas juegan un papel en la fijacin de agua, el secuestro de iones, y la macromolcula y la estabilizacin de la membrana [18]. En la investigacin que aqu se presenta, la cebada HVA1 [19] gen era transferido en P. vulgaris, ya que este gen codifica una de tipo III Protenas LEA. El gen HVA1 cebada ha sido previamente transferido al arroz [20], el trigo [21, 22], caa de azcar [23], creeping bentgrass [24] la mora [25], y de la avena [26, 27]. En todos los casos, las plantas desarrollan tolerancia a estreses abiticos tales como la sequa y / o sal. Aqu se presenta la transferencia de Cebada HVA1 gen a diferentes variedades de P. vulgaris y reportar el desarrollo de la tolerancia a la sequa de las plantas transgnicas en nivel de efecto invernadero.

2. MATERIALES Y METODOS 2.1. Plsmidos y explante. Dos vectores plasmdicos diferentes fueron utilizados en esta investigacin (Figura 1). Los plsmidos utilizados incluido (a) pACT1F que alberga el gen gus y (b) pBY520 que alberga el HVA1 y el gen bar, que confiere la sequa la tolerancia y la libertad de herbicidas (glufosinato de amonio)resistencia, respectivamente. Preparacin explante: el explante utilizado para estandarizar la transformacin gentica fue P. vulgaris var. "Sedona".