PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES STOCK MS COMUNES.

SOLUCIN
30% ACRILAMIDA (29:1)

PREPARACIN
Disuelve 29 g de acrilamida y 1 g de N,Nmetilenbisacrilamida en 60 ml de H2O. Usa la mosca roja. Calienta a 37C para favorecer la disolucin. Ajusta el volumen a 100 ml y filtra la solucin a travs de un papel de filtro o, mejor, de un filtro de nylon de 45 m de poro (Nalgene).

COMENTARIOS ! La acrilamida es un neurotxico que se absorbe por la piel y cuyos efectos son acumulativos. Acrilamida y bisacrilamida deben ser pesados en una campana de humos usando guantes y mascarilla. La balanza se podr sobre papel de filtro y tras la pesada el papel se desecha y la balanza se cepilla y limpia meticulosamente. Se usarn guantes siempre que se manejen soluciones con acrilamida. Aunque la poliacrilamida no se considera txica, ha de manejarse con cuidado debido a la posibilidad de que contenga pequeas cantidades de acrilamida no polimerizada. Los grados inferiores (ms baratos) de acrilamida y bisacrilamida suelen estar contaminados con iones metlicos. En estos casos, las soluciones stock de acrilamida se purifican mediante agitacin ON con 5 g de Amberilite MB-1 (SIGMA # MB-14) por cada 100 ml de solucin y posterior filtrado a travs de papel Whatman N 1. Durante su almacenamiento, acrilamida y bisacrilamida se van trasformando lentamente en cidos acrlico y bisacrlico, por lo que es mejor guardar las soluciones de acrilamida a 4C.
NH4OAc No es necesario siempre que las soluciones de acetato amnico sean estriles, pero en caso de que as se necesite no han de autoclavarse.

30% ACRILAMIDA (37,5:1)

Disuelve 29,22 g de acrilamida y 0,78 g de bisacrilamida en 60 ml H2O a 37C. Usa la mosca roja. Ajusta el volumen a 100 ml y filtra.

10 M AMONIO, ACETATO

Disuelve 770 g de NH4OAc en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro. Esterilizar por filtracin. Disuelve 77 g de NH4OAc en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro. Esterilizar por filtracin. Pesa 1 g de persulfato amnico en un tubo Falcon de 15 ml y enrasa a 10 ml con H2O. Disulve agitando. La solucin es estable a 4C durante uno a dos meses.

1 M AMONIO, ACETATO

10% AMONIO, PERSULFATO

Se pueden hacer alcuotas del volumen de APS a aadir por gel y guardarlas a 20C.

BSA 1 M CALCIO, CLORURO (CaCl2) 10 mM dATP Disuelve 11,0 g CaCl2 (anhidro, MW = 110,0) en H2O hasta un vol de 100 ml. Autoclavar. Disuelve 10 mg en 1697 l de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alcuotas de 50 l a 20C. MW = 589,2 Roche 103 977

10 mM dCTP

Disuelve 10 mg en 1956l de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alcuotas de 50 l a 20C. Disuelve 10 mg en 1804l de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alcuotas de 50 l a 20C. Disuelve 10 mg en 1753 l de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alcuotas de 50 l a 20C. Disuelve 1,55 g de dithiothreitol en 10 ml de 0,01 M NaOAc pH = 5,2. Esteriliza por filtracin, dispensa en alcuotas de 1 ml y guarda a 20C. Disuelve en agitacin rpida 186,1 g de disodium ethylenediaminetetraacetate*2H2O en 750 ml H2O. Ajusta el pH a 8,0 con NaOH ( 20 g de lentejas de sosa). Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. Disuelve 1 g de espermidina (MW = 145,2, SIGMA # S2626) en H2O y lleva el volumen a 69 ml. Esteriliza por filtracin, dispensa en alcuotas y almacena a 20C. Aade 0,1 g de EtBr a 10 ml de H2O estril. Agita con la mosca roja durante varias horas o con el vrtex (en un Falcon de 15 ml) hasta que te canses. Cubre con papel de aluminio y almacena a 4C. Isopropylthio--D-galactoside (MW = 238,3). Disuelve 2 g de IPTG en 8 ml de H2O. Ajusta el volumen a 10 ml y esteriliza la solucin pasdola por un filtro de 0,22 m. Dispensa en alcuotas y almacena a 20C. Disuelve 120 g de NaOH (o KOH) en 120 ml de H2O. Deja enfriar lentamente a RT y entonces diluye a 1 litro con EtOH. Esta solucin funciona como un limpia-todo y no hace falta usar sosa de calidad (la del Mercadona vale) ni EtOH del caro (alcohol de quemar es suficiente). Disuelve 20 g de N-Laurylsarcosine (sal sdica, MW = 293,4, SIGMA #L5125) en 80 ml de H2O. Ajusta el volumen a 100 ml. Esterilizar por filtracin. Disuelve 214,46 g de acetato magnsico*4H2O en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro y esteriliza por filtracin. Disuelve 20,33 g de MgCl2*6H2O en 80 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. 300 l de 1 M Tris-HCl pH 7,5 40 l de 0,5 M EDTA pH = 8,0 H2O hasta 90 ml. Comprueba el pH aadiendo 1 l a un indicador de pH de papel. Si es necesario, lleva el pH a 7,0 con HCl y ajusta el volumen a 100 ml. Autoclavar.

MW = 511,1 Roche 104 035

10 mM dGTP

MW = 551,2 Roche 104 094

10 mM dTTP

MW = 570,2 Roche 104 264

1 M DTT

No autoclaves el DDT ni las soluciones que lo contengan.

0,5 M EDTA pH = 8,0

La sal disdica de EDTA no empezar a disolverse hasta que el pH no se acerque a 8.

0,1 M ESPERMIDINA

La solucin de trabajo se debe guardar a 4C.

10 mg/ml EtBr (Bromuro de Etidio)

! El bromuro de etidio es un
mutgeno. Usa guantes cuando lo manejes y, adems, una mscara al pesarlo.

IPTG

LIMPIADOR DE VIDRIO

Referencia: Gordon and Ford.1972. The Chemists Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques and References, pp 428429. John Wiley & Sons. Rev. 04/97

20% LSS

1M MAGNESIO, ACETATO

1 M MgCl2

El cloruro magnsico es muy higroscpico. Compra cantidades pequeas (100 g) y procura no abrir el bote ms de lo necesario. 3 mM Tris-HCl 0,2 mM EDTA pH = 7,0

OLB TE-7

PBS

Disuelve 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 en 800 ml de H2O. Ajusta el pH a 7,4 con HCl. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. Pesa 7,3 g NaCl y 10,0 g PEG 8000 (60008000 va bien) en un tubo Falcon de 50 ml. Aade H2O hasta enrasar 45 ml. Agita y trata de disolver el PEG. Se puede intentar incubando con agitacin en el horno de hibridacin a 37C durante 30. Cuando est disuelto, ajusta el volumen a 50 ml. Disuelve 9,82 g de acetato potsico e 90 ml de H2O. Ajusta el pH a 7,5 con 2 M cido actico. Ajusta el volumen a 100 ml. Esteriliza por filtracin, dispensa en alcuotas y guarda a 20C. 60 ml 5 M acetato potsico 11,5 ml cido actico glacial 28,5 ml H2O La solucin resultante es 3 M con respecto al potasio y 5 M respecto al acetato. Aade 0,2 g de proteinasa K a 10 ml de tampn de almacenamiento de PK: 5 ml glicerol 0,1 ml 1 M Tris-HCl pH = 7,5 0,5 ml 1 M Cl2Ca 0,055 g de Cl2Ca H2O hasta 10 ml Esterilizar por filtracin Dispensar la PK en alcuotas y almacenar a 20C. Disuelve 100 mg de RNAsa (SIGMA # R4875) en 10 ml de tampn de RNAsa: 0,1 ml Tris-HCl pH = 7,5 30 l 5 M NaCl H2O hasta 10 ml Usa un Falcon de 15 ml y ponlo en agua hirviendo durante 15. Deja enfriar lentamete a temperatura ambiente, dispensa e alicuotas y almacena a 20C. Usa un Falcon de 15 ml. Disuelve 100 mg de ADN de esperma de salmn (SIGMA # D1626) en TE pH = 8,0 y lleva el volumen a 10 ml. Resuspende agitando ON a 4C. Rompe el ADN pasndolo con una jeringa 45 veces por una aguja del calibre 22. Desaturaliza el ADN poniendo el Falcon en agua hirviendo durante 10 y enfralo rpidamente en hielo. Dispensa en alcuotas y conglalo a 20C. Disuelve 408,1 g de acetato sdico*3H2O en 800 ml de H2O. Ajusta el pH a 5,2 con cido actico glacial o a 7,0 con cido actico diluido. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. Disuelve 292,2 g de NaCl en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. Disuelve 200 g de dodecil sulfato sdico en 800 ml de H2O. Calienta a 50C para favorecer la disolucin. Ajustar el volumen a 1 litro.

PBS = Phosphate-Buffered-Saline.

20% PEG-2,5 M NaCl

1 M POTASIO, ACETATO (pH = 7,5)

KOAc

POTASIO, ACETATO (para la lisis alcalina en miniprep)

20 mg/ml PROTEINASA K

La PK consigue su actividad ptima en 2 mM Ca+2. Si aadimos 400 g PK/ml tampn de lisis a partir de este tampn de almacenamieto coseguiremos una solucin de lisis que es al menos 1 mM Ca+2 (un tejido en digestin es otra fuente de Ca+2).

10 mg/ml RNAsa A

ssDNA (10 mg/ml ADN de esperma de salmn)

3 M SODIO, ACETATO (pH 5,2 y pH 7,0)

NaOAc

5 M NaCl

20% SDS

! El SDS forma cristales minsculos

que se dispersan muy fcilmente, hasta los pulmones. Psalo en una campana de humos y usa mscara y guantes al pesarlo. Limpia bien el rea de pesada y la balanza. No es ni necesario ni conveniente

esterilizarlo. 1 M NaPO4 pH = 6,5 (Tampn fosfato de transferencia Southern) 184 g NaH2PO4*H2O (MW = 137,99) 180 g Na2HPO4*7H2O (MW = 268,07) 800 ml H2O Ajusta el pH a 6,5 con lentejas de NaOH y el volumen a 1 litro con H2O. Autoclava. Disuelve 40 g de NaOH en 800 ml H2O. Ajusta el volumen a 1 litro. Disuelve 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato sdico*2H2O en 800 ml de H2O. Ajusta el pH a 7,0 con unas pocas gotas de 10 N NaOH. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. 242 g Tris base 57,1 ml cido actico glacial 100 ml 0,5 M EDTA pH = 8,0 H2O hasta 1 litro. 54 g Tris base 27,5 g cido brico 20 ml o,5 M EDTA pH = 8,0 1 ml de 1 M Tris-HCl pH = 8,0 200 l de 0,5 M EDTA pH = 8,0 H2O hasta 100 ml Autoclavar Disuelve 121,1 g de Tris base en 800 ml de H2O. Ajusta el pH con HCl concentrado. Deja enfriar la solucin a temperatura ambiente antes de ajustar el pH definitivamente. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava. 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--Dgalactosidase. Disuelve 0,2 g de X-gal en 10 ml de dimetil-formamida. Usa tubos de vidrio o de polipropileno. Dispensa e alicuotas y cubre con papel de aluminio los tubos para proteger el X-gal de la luz. Almacena a 20C. No es necesario esterilizar. 3 M NaCl 0,3 M Citrato sdico

1 M SODIO, HIDRXIDO

20 X SSC

50X TAE

No se esteriliza.

5X TBE

No se esteriliza.

TE

10 mM Tris-HCl pH = 8,0 1 mM EDTA pH = 8,0

1 M Tris-HCl

El pH del Tris depende de la temperatura y disminuye unas 0,03 unidades de pH por cada 1C de aumento en la temperatura.

20 mg/ml X-gal