U1 Microbiologia 12

DIRECCIN DE EDUCACIN TCNICA SUPERIOR
rea: Qumica Industrial

Carrera: Tcnico Superior en Qumica.
Asignatura: Microbiologa.

Autor: MSc. Nelson Zamora Rodrguez.

Unidad 1:
Introduccin a la microbiologa

UNI DAD 1: I NT R ODUCCI N A L A MI CR OBI OL OG A.

Objeti vo General :

1. Destacar l a i mportanci a del estudi o de l a mi crobi ol og a como una forma
de comprender el papel que juegan l os mi croorgani smos en l a natural eza, as
como l as di ferentes tcni cas uti l i zadas en su estudi o, aprovechando l os
di ferentes medi os que permi tan su cul ti vo, observaci n y conservaci n.

Conteni do:

1 General i dades.
1.1 Defi ni ci n y objeto de estudi o de l a mi crobi ol og a.
1.2 Rel aci n de l a mi crobi ol og a con otras ci enci as.
1.3 Importanci a de l a mi crobi ol og a.
2 Equi pos e i nstrumentos uti l i zados en el l aboratori o de mi crobi ol og a.
2.1 El mi croscopi o compuesto.
2.2 Cri stal er a: caj a petri , portaobjetos, cubreobj etos, cuna de ti nci n.
2.3 Equi pos: autocl ave, bao mar a, centri fuga, i ncubadora.
3 Medi os y tcni cas de cul ti vo.
3.1 Cl asi fi caci n de l os medi os de cul ti vo.
3.2 Preparaci n de l os medi os de cul ti vo.
3.3 Al macenami ento de l os medi os de cul ti vo.
3.4 Si embra de mi croorgani smos y obtenci n de un cul ti vo puro.
3.5 Mtodos de ai sl ami ento y recuento mi crobi ano.
4 Tcni cas de observaci n.
4.1 Preparaci n de muestras mi croscpi cas.
4.2 Inocul aci n.
4.3 Tcni cas de Ti nci n.
4.4 Preparaci n de reacti vos y col orantes.

Unidad 1: Introduccin a la microbiologa / material de estudio
MSc. Nelson Zamora Rodrguez
1

1. GE NE R AL I DADE S :

La definicin clsica de la Microbiologa como la ciencia que trata de los organismos cuyo
tamao es demasiado pequeo para ser observados a simple vista es intelectualmente corta y
puramente metodolgica, y refleja claramente las limitaciones humanas para desentraar la
realidad natural. La tecnologa es a la vez la principal herramienta para el conocimiento y el
principal factor limitante, pues los hechos naturales no han sido diseados teleolgicamente
para que el hombre los comprenda. En otras palabras, y aunque nos pese, la Naturaleza no
est construida empleando escalas humanas.

Esto se refleja en la falta de homogeneidad estructural de los organismos tradicionalmente
estudiados en Microbiologa. Toda la Biologa podra abordarse tomando a los
microorganismos como excusa y esto, aunque sirva para dar importancia al trabajo con
microorganismos, impone serias restricciones prcticas para el trabajo diario del microbilogo.

Est claramente demostrado que los microbios sirven de banco de prueba para la elaboracin y
aplicacin de todas las teoras y tecnologas biolgicas, y la inmediatez con que puede pasarse
de la bioqumica a la biologa celular y a la gentica utilizando microorganismos es quizs la
razn por la cual hay tantos bilogos trabajando y estudiando microorganismos, desde los ms
diversos puntos de vista.

Resulta difcil imaginar que el microbilogo pueda acumular el conocimiento necesario para
saber todo de todos los microorganismos (como representantes de los seres vivos en general),
por lo que se impone una aproximacin ms humilde al trabajo con microorganismos, para
individualmente aportar pequeas piezas al puzzle de lo biolgico.

Muchos descubrimientos importantes son a veces puramente accidentales y tienen lugar
cuando se trabaja en reas muy alejadas de aquella en la que se est investigando. Eduard
Buchner descubri la fermentacin en extractos de levadura cuando, haciendo estudios
inmunolgicos, aadi azcar a un extracto para conservarlo. Alexander Fleming descubri
accidentalmente la penicilina cuando su placa de estafilococos se contamin con Penicillium. F.
Griffith descubri la transformacin cuando trabajaba en la epidemiologa de los neumococos.

Por tanto, el azar juega tambin un importante papel en la investigacin en general, y en la
microbiologa en particular. Muchos descubrimientos se llevan a cabo en varios sitios diferentes
y no relacionados, y muchos investigadores individuales cooperaron en la solucin de un
mismo problema, por lo que la distribucin de honores y mritos no deja de ser
frecuentemente injusta. Personajes rascendentales como Pasteur, Cohn, Beijerinck,
Winogradsky o Koch, contribuyeron a muchos aspectos diferentes del conocimiento
microbiolgico y se encuentran en la base de la estructura microbiolgica actual.

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Desarrollo histrico de la microbiologa:

La Microbiologa, considerada como una ciencia especializada, no aparece hasta finales del
siglo XIX, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodolgicos que se
haban empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisin
de ideas y prejuicios seculares sobre la dinmica del mundo vivo.

Siguiendo el ya clsico esquema de Collard (l976), se puede distinguir cuatro etapas o periodos
en el desarrollo de la Microbiologa:

1. Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende desde la antigedad hasta
llegar a los primeros microscopistas.

Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debi aguardar hasta
el ltimo tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la humanidad desde muy
antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones implicadas en la
produccin de bebidas alcohlicas, pan y productos lcteos, como las perjudiciales, en forma
de enfermedades infecciosas.

Diversas fuentes escritas de la antigedad griega y romana hablan de grmenes invisibles que
transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su "De rerum natura" hace
varias alusiones a "semillas de enfermedad". En el Renacimiento europeo, Girolamo
Frascatorius, en su libro "De contagione et contagionis" (1546) dice que las enfermedades
contagiosas se deben a "grmenes vivos" que pasan de diversas maneras de un individuo a
otro. Estos inicios de explicacin que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron
probablemente catalizados por la introduccin en Europa de la sfilis, una enfermedad en la
que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la "cosa" que se transmite en
la enfermedad sigui siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo.

2. Segundo periodo, de lenta acumulacin de observaciones (desde l675 aproximadamente
hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos
por Leeuwenhoek (l675).

Ya en el siglo XIV, con la invencin de las primeras lentes para corregir la visin, surgi una
cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamao aparente de los objetos. En el siglo
XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la fsica ptica de las lentes de aumento, pero no
encontraron una aplicacin inmediata. Se dice que Galileo hizo algunas observaciones
"microscpicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en
cualquier caso est claro que no tuvieron ninguna repercusin.

La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a
Constantijn Huygens, quien relata que el ingls Cornelis Drebbel tena en su
taller un instrumento magnificador, que recibi el nombre de microscopium
en l625, en la Accademia dei Lincei, de Roma.

El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante
holands de tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su

Leeuwenhoek
3

Robert Hooke
Louis Pasteur
pasin por pulir y montar lentes casi esfricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi lleg a
descuidar sus negocios. Fabric unos cuatrocientos microscopios simples, con los que lleg a
obtener aumentos de casi 300 dimetros. En 1675 descubri que en una gota de agua de
estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeas criaturas a las que denomin
"animlculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la
Microbiologa".

Durante varias dcadas Leeuwenhoek fue comunicando sus descubrimientos a la Royal Society
de Londres a travs de una serie de cartas que se difundieron, en traduccin inglesa, en las
"Philosophical Transactions". Sus magnficas dotes de observador le llevaron asimismo a
describir protozoos (como Giardia, que encontr en sus propias heces), la estructura estriada
del msculo, la circulacin capilar, a descubrir los espermatozoides y los glbulos rojos (por lo
que tambin se le considera el fundador de la Histologa animal), as como a detallar diversos
aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. Leeuwenhoek se percat de la
abundancia y ubicuidad de sus animlculos, observndolos en vinagre, placa dental, etc.

Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron inters al ser comunicados, pocos
intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. Adems, la fabricacin de lentes sencillas de
gran aumento era difcil y el manejo de los microscopios simples, bastante engorroso.

Simultneamente el ingls Robert Hooke (1635-1703) usando microscopios
compuestos, describi los hongos filamentosos (1667), y descubri la
estructura celular de las plantas (Micrographia, 1665), acuando el trmino
clula. Pero el trabajo con microscopios compuestos aplicados al estudio de
los "animlculos" languideci durante casi 200 aos, debido a sus
imperfecciones pticas, hasta que hacia 1830 se desarrollaron las lentes
acromticas.

3. Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales
del siglo XIX, donde las figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de
cristalizar a la Microbiologa como ciencia experimental bien asentada.

En 1857 demostr que los agentes de la fermentacin lctica eran
microorganismos, trabajando sobre un problema que haba surgido
entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentacin
alcohlica se vio sustituida por una indeseable fermentacin lctica.
Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habra de durar
hasta 1876, en los que Pasteur identific distintos microorganismos
responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. As, en
1860 adscribe inequvocamente la fermentacin alcohlica a ciertos
tipos de levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le vin resume sus
hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiologa Aplicada, una de las
primeras derivaciones prcticas no empricas emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX
eminentes bilogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su
actividad en industrias y destileras.

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Trabajando sobre los agentes de la fermentacin butrica, Pasteur descubri la presencia de
microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxgeno, lo cual desmenta la creencia de
que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acu los trminos aerobiosis y
anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de
oxgeno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi las distintas
implicaciones energticas subyacentes a la utilizacin de sustratos orgnicos en presencia y en
ausencia de oxgeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como
crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradacin total de las
correspondientes sustancias.

Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en 1897 Buchner obtuvo,
a partir de levaduras, una preparacin enzimtica (zimasa) que era capaz de realizar la misma
transformacin de "fermentacin" que las clulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las
propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y
biolgico: las fermentaciones eran procesos qumicos catalizados por enzimas presentes dentro
de clulas vivas, que podan ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica,
nacida como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena especializando en la enzimologa,
encontr una alianza fructfera y duradera con la joven Microbiologa.

4. Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros das), en el que los
microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiolgica, bioqumica, gentica,
ecolgica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiologa, el
surgimiento de disciplinas microbiolgicas especializadas (Virologa, Inmunologa, etc), y la
estrecha imbricacin de las ciencias microbiolgicas en el marco general de las Ciencias
Biolgicas.

Investigue cules fueron los principales aportes de Pasteur y Buschner en la comprensin de
los microorganismos?

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Defi ni ci n:

La Mi crobi ol og a se puede defi ni r, sobre l a base de su eti mol og a, como l a
ci enci a que trata de l os seres vi vos muy pequeos, concretamente de aquel l os
cuyo tamao se encuentra por debaj o del poder resol uti vo del ojo humano.
Esto hace que el objeto de esta di sci pl i na venga determi nado por l a
metodol og a apropi ada para poner en evi denci a, y poder estudi ar, a l os
mi croorgani smos.

Objeto de estudi o:

Todos l os aspectos y enfoques desde l os que se pueden estudi ar l os
mi croorgani smos conforman l o que denomi namos objeto formal de l a
Mi crobi ol og a: caracter sti cas estructural es, fi si ol gi cas, bi oqu mi cas, genti cas,
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taxonmi cas, ecol gi cas, etc., que conforman el ncl eo general o cuerpo bsi co
de conoci mi entos de esta ci enci a. Por otro l ado, l a Mi crobi ol og a tambi n se
ocupa de l as di sti ntas acti vi dades mi crobi anas en rel aci n con l os i ntereses
humanos, tanto l as que pueden acarrear consecuenci as perjudi ci al es (y en este
caso estudi a l os ni chos ecol gi cos de l os correspondi entes agentes, sus modos
de transmi si n, l os di versos aspectos de l a mi crobi ota patgena en sus
i nteracci ones con el hospedador, l os mecani smos de defensa de ste, as como
l os mtodos desarrol l ados para combati rl os y control arl os), como de l as que
reportan benefi ci os (ocupndose del estudi o de l os procesos mi crobi anos que
suponen l a obtenci n de materi as pri mas o el aboradas, y de su modi fi caci n y
mejora raci onal con vi stas a su i mbri caci n en l os fl uj os producti vos de l as
soci edades).

Fi nal mente, l a Mi crobi ol og a ha de ocuparse de todas l as tcni cas y
metodol og as desti nadas al estudi o experi mental , manej o y control de l os
mi croorgani smos, es deci r, de todos l os aspectos rel aci onados con el modo de
trabajo de una ci enci a emp ri ca.

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Investi gue l a rel aci n que guarda l a mi crobi ol og a con l as ci enci as si gui entes:
bi oqu mi ca, Tecnol og a ambi ental , Tecnol og a de l os al i mentos y l a Qu mi ca de
l os al i mentos. Presente un esquema en cl ase y establ ezca un conversatori o con
el grupo.

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La microbiologa es una ciencia que tiene amplia aplicacin en diferentes campos de la
actividad humana, entre ellas la medicina, histologa, ecologa, en la industria, en los alimentos,
etc.

En el caso de la transformacin de la materia prima en la industria de los alimentos, estos
pueden ser vehculos potenciales para la Transmisin de diversos microorganismos y de
metabolitos de origen microbiano, muchos de los cuales son patgenos para el hombre,
motivo por el cual se hace indispensable disponer de metodologas que permitan garantizar la
inocuidad de los productos destinados al consumo humano y animal. Esta metodologa es
proporcionada por la Microbiologa de los Alimentos, la cual entre otros aspectos, abarca dos
campos bien definidos: a) Salud Pblica, cuando se usa para proteger al consumidor frente a las
enfermedades de origen microbiano y b) Conservacin del Alimento, cuando se emplea en la
prevencin de las alteraciones de estos productos debidas a los microorganismos.

Cuando es la salud del consumidor la que est expuesta a riesgo, la legislacin sobre la calidad
microbiolgica de los alimentos debera ser exigente y muy severa. Por otro lado, las industrias
de alimentos de cualquier origen, estn expuestas a sufrir grandes prdidas econmicas como
consecuencia de la descomposicin de las materias primas y/o de los productos terminados,
por accin de diversos agentes microbianos.

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En ambos casos, dichas industrias deberan cumplir con las normas microbiolgicas establecidas
y si stas no existen, adoptar prcticas adecuadas de manipulacin, fabricacin y distribucin, a
fin de evitar en lo posible, brotes de intoxicaciones alimentaras. Las mismas les podran
acarrear graves repercusiones y responsabilidades que, por su propia naturaleza, son difciles de
afrontar.

La delimitacin de las reas antes sealadas, determina tres situaciones esenciales en
Microbiologa de los Alimentos:

1) Los alimentos que contienen microorganismos patgenos o niveles altos de toxinas
microbianas capaces de causar cuadros clnicos en el consumidor, por lo general no presentan
signos de alteracin que contraindiquen su consumo;

2) generalmente, las medidas que se toman para controlar el crecimiento de agentes
patgenos, no son las mismas que se emplean para evitar el desarrollo de los microorganismos
causantes de las alteraciones organolpticas del producto y

3) en otros casos, las medidas tomadas para reducir o inhibir el crecimiento de
microorganismos alterantes e infecciosos de naturaleza bacteriana y mictica no sanean el
alimento, por cuanto las mismas no previenen la presencia de patgenos como virus,
protozoos y helmintos, los cuales aunque no se multipliquen en los alimentos, pueden
conservar su poder infectivo. An ms, algunas toxinas provenientes de bacterias pueden
resistir los tratamientos conducentes a la eliminacin de microorganismos alterantes y
patgenos y en consecuencia, persistir en los alimentos.

Como se puede apreciar de lo expuesto anteriormente, la contaminacin de los alimentos es
difcil de evitar. El verdadero peligro ocurre cuando las bacterias patgenas logran multiplicarse
en el alimento y causan trastornos en la salud del consumidor. He aqu la responsabilidad del
microbilogo de alimentos, quien debe detectar a tiempo la anomala, identificar los agentes
infecciosos y velar porque ese producto no salga al mercado hasta tanto se tenga la seguridad
de que est apto para el consumo.

Con este fin, debe llevarse un control peridico de la poblacin microbiana deseada en
aquellos alimentos fermentados o madurados, para distinguir entre microorganismos alterantes
y la flora propia del aumento; as mismo, es necesario controlar la influencia de ciertos
factores, tales como los ambientales, que pueden ser fuente de contaminacin de los alimentos.
En el caso de productos enlatados, se debe controlar el proceso industrial de esterilizacin para
determinar con exactitud el grado trmico requerido y el tiempo ptimo de exposicin al
calor, adems de controlar peridicamente la efectividad de la mquina selladora a fin de
evitar el sellamiento deficiente de las latas, pues ste permite la formacin de grietas o poros, a
travs de los cuales se produce la contaminacin del producto terminado.

En trminos generales, puede decirse que se cuenta con suficientes conocimientos cientficos y
tecnolgicos para producir alimentos de excelente calidad microbiolgica pero, sin embargo,
siguen apareciendo brotes de infecciones e intoxicaciones alimentaras y los industriales
continan teniendo prdidas cuantiosas por la alteracin microbiana de sus productos.

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El problema parece residir, fundamentalmente, en que no se cumplen a cabalidad las normas
sanitarias establecidas para la manipulacin de la materia prima con la cual se elabora el
alimento, y en que los industriales siguen considerando errneamente, que el control de la
calidad microbiolgica de sus productos, les resulta muy dispendioso tanto en tiempo como
ecnomamente.

2 EQUI P OS E I NS T R UME NT OS UT I L I Z ADOS E N E L L AB OR AT OR I O DE
MI CR OBI OL OG A.

La observaci n y el estudi o de l os mi croorgani smos requi eren de l a uti l i zaci n y
debi do manejo de una seri e de equi pos e i nstrumentos que permi tan l a
magni fi caci n, preparaci n de medi os de cul ti vo, esteri l i zaci n y otra seri e de
acti vi dades.

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El mi croscopi o es un i nstrumento pti co que ampl i fi ca l a i magen de un obj eto
pequeo, si endo el i nstrumento ms uti l i zado en l os l aboratori os donde se
estudi an mi croorgani smos. Si bi en l as l entes de aumento han si do conoci das
desde muy temprano en l a hi stori a, sl o se l e uti l i z en bi ol og a con el
adveni mi ento del mi croscopi o de l uz moderno. Desde su i nvenci n, el
mi croscopi o ha si do una herrami enta val i osa en el desarrol l o de l a teor a
ci ent fi ca (Hei dcamp, 1995).

En general , un mi croscopi o est compuesto de dos el ementos, l os cual es
consti tuyen un si stema si mi l ar a un tel escopi o: a) l entes pri mari as
ampl i fi cadoras y b) l entes secundari as. Estos si stemas se denomi nan obj eti vos y
ocul ares, respecti vamente, y estn montados en l os extremos opuestos de un
tubo cerrado, de forma que el pri mero se encuentra en el punto focal del
segundo.

Entonces, l a l uz que pasa por un obj eto es focal i zada por ambos si stemas de
l entes (Hei dcamp, 1995), de manera que cuando se mi ra a travs del ocul ar se
ve una i magen vi rtual aumentada de l a i magen real .

Ti pos de mi croscopi o

Actual mente exi sten muchos ti pos de mi croscopi os, entre l os que se cuentan el
mi croscopi o pti co, el el ectrni co, el de sonda de barri do y el l aser. No
obstante, el mi croscopi o ms uti l i zado es el pti co, el cual se si rve de l a l uz
vi si bl e para crear una i magen aumentada del objeto.

El mi croscopi o pti co:
Los mi croscopi os pti cos pueden cl asi fi carse en si mpl es y compl ej os,
di ferenci ndose en su capaci dad ampl i fi cadora y en l a compl ej i dad del si stema
de l entes asoci ado. La pri nci pal ventaja de un mi croscopi o pti co es que
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permi te observar organi smos vi vos y tej i dos. Su pri nci pal desventaja, es que su
potenci a ampl i fi cadora est l i mi tada por l a l ongi tud de onda de l a l uz vi si bl e.

Mi croscopi o pti co si mpl e:
El mi croscopi o pti co ms si mpl e es l a l ente convexa dobl e, cuya di stanci a focal
es corta. Estas l entes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Tambi n se l es
denomi na mi croscopi os de bajo poder. Exi sten al menos dos ti pos de
mi croscopi os de bajo poder: monocul ares y bi nocul ares (Fi gura 2). Los
mi croscopi os monocul ares ti enen muy bajo poder ampl i fi cador, si endo uti l i zado
esenci al mente por ni os. Los mi croscopi os bi nocul ares, estreo mi croscopi os o
l upas, en cambi o, proveen un aumento mayor. Se caracteri zan, porque
presentan dos obj eti vos, de modo que el objeto se puede ver en forma
estereoscpi ca o tri di mensi onal .

Mi croscopi o pti co compl ejo:
Los mi croscopi os compl ejos
di sponen de vari as l entes con
l as que se consi guen aumentos
mayores, pudi endo i ncl usi ve
aumentar un objeto ms de
2.000 veces. Estos
mi croscopi os son, en general ,
l os ms uti l i zados (Fi gura 2).
En este caso, el objeti vo est
compuesto de vari as l entes
que crean una i magen real
aumentada del objeto
exami nado. El aumento total
del mi croscopi o depende de
l as l ongi tudes focal es de l os
dos si stemas de l entes.

Fi gura 2. Dos ti pos de mi croscopi o pti co: a) estereoscpi co bi nocul ar; b)
pti co bi nocul ar.

Mi croscopi os pti cos especi al es:
Hay di versos mi croscopi os pti cos para funci ones especi al es. Entre stos se
ti ene l os mi croscopi os de ul travi ol eta, petrogrfi co, de campo oscuro, de fase,
de campo cercano e i nverti do.

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Componentes de un mi croscopi o pti co bi nocul ar

Como se observa en l a
Fi gura, un mi croscopi o
pti co bi nocul ar consta de:
base, pedestal , cabeza. En
l a base se ubi ca l a fuente de
l uz. En el pedestal se ubi can
macro y mi cromtri co y l a
pl ati na; sobre l a pl ati na se
ubi can l as pi nzas, y el foco
coaxi al , mi entras que bajo
sta se ubi ca el di afragma.
En l a parte superi or del
pedestal se ubi ca el
revl ver, pi eza que porta
l os objeti vos. En l a cabeza
se ubi can l os ocul ares y el
si stema regul ador de l a
di stanci a focal .

Base: Corresponde a l a parte i nferi or del i nstrumento, uti l i zada como
soporte.
Pedestal o brazo: pi eza que soporta al tubo que conti ene el si stema de l entes
y que l e conecta con l a base.
Cabeza: pi eza, general mente mvi l , sobre l a que se ubi can l os ocul ares y el
si stema regul ador de l a di stanci a focal .
Fuente de l uz: corresponde a una ampol l eta u otra fuente l uz acti vada por
corri ente o pi l a. Anti guamente se uti l i zaba un espej o que concentraba l a l uz
ambi ental .
Macromtri co: torni l l o que permi te el ajuste grosero de l a muestra a
observar. Se compl ementa con el uso del mi cromtri co.
Mi cromtri co: torni l l o que permi te un ajuste fi no de l a muestra a observar.
Pl ati na: pi eza di spuesta hori zontal mente y sobre l a cual se ubi can l as pi nzas y
el foco coaxi al . Pl ati na, pi nzas y foco coaxi al permi ten ubi car una muestra para
ser observada. La muestra debe estar di spuesta sobre un portaobj eto y
protegi da por un cubreobj eto). Bajo l a pl ati na se encuentran el di afragma y el
fi l tro.
Pi nzas: Pi ezas prensi l es que permi ten suj etar l a muestra, conteni da en un
portaobj eto, contra l a pl ati na.
Foco coaxi al : Si stema compuesto por dos ejes de despl azami ento hori zontal ,
l os cual es, di spuestos perpendi cul armente entre s , permi ten ajustar una muestra
para ser observada al mi croscopi o. Un ej e despl aza l a muestra en senti do l ateral
(i zqui erda - derecha del observador) y el otro en senti do frontal (al ejando -
acercando l a muestra del observador). Ambos movi mi entos se real i zan en el
pl ano que defi ne l a pl ati na.
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Di afragma: Si stema que control a l a canti dad de l uz que l l ega al obj eto. El
di afragma permi te control ar i ntensi dad de l uz y el tamao del cono de l uz
proyectado sobre l a muestra.
Condensador: Conj unto de l entes que focal i zan l a l uz sobre l a muestra. Las
l entes condensadoras ms ti l es poseen poderes superi ores a l os 400x y ms. El
uso de condensador permi te mej orar l a observaci n de l a muestra. Cuando est
presente en el i nstrumento, el condensador se ubi ca general mente bajo l a
pl ati na (Fi gura 3).

Fi gura 3. a) Obj eti vos di spuestos sobre el revl ver de un mi croscopi o pti co
bi nocul ar. Detal l e de l os objeti vos: l a banda col oreada i ndi ca el aumento del
l ente conteni do en el objeti vo: rojo i ndi ca que el aumento es de 4X, amari l l o,
que es de 10X; azul que es de 40X y bl anco, que el aumento es de 100X; b)
detal l e del condensador. Fuente: Mi croscopeworl d

Fi l tro: Al gunos mi croscopi os portan fi l tros o un si stema de stos, l os que
corresponden a l entes de di sti nto col or que permi ten enfati zar l a observaci n
de determi nadas partes de l a muestra, general mente destacadas con ti nci ones.
Revl ver: Mecani smo gi ratori o sobre el cual se di sponen l os obj eti vos. El
revl ver permi te cambi ar el aumento con que se observa una muestra
determi nada. Un revl ver general mente porta cuatro obj eti vos: 4x, 10x, 40x y
un obj eti vo de i nmersi n (100x) (Fi gura 3).
Objeti vos: Conjunto de l entes responsabl es de aumentar y resol ver (di sti ngui r
l as di sti ntas partes) de l a muestra a observar.
Objeti vo de i nmersi n: El objeti vo de i nmersi n permi te l ograr una mej or
resol uci n en un mi croscopi o pti co medi ante el uso de l as propi edades de
refracci n de l uz del acei te de i nmersi n. Requi ere de l a di sposi ci n de una
gota de este acei te sobre l a muestra fresca o sobre el cubreobj eto, en el caso de
preparaci ones fi jas; el objeti vo de i nmersi n debe acercarse a l a muestra de
modo que toque l a gota de acei te.

Aumento y resol uci n de un mi croscopi o
La funci n de cual qui er mi croscopi o es mej orar l a resol uci n, muchas veces
confundi da con l a ampl i fi caci n (aumento). Como el mi croscopi o es uti l i zado
11

para crear una vi sta aumentada de un objeto tal que se observen detal l es no
vi si bl es al oj o humano, se confunde resol uci n con l a ampl i fi caci n o aumento
de tamao de l a i magen de l a muestra u objeto. En general , a mayor aumento,
mayor resol uci n, pero esto no si empre es verdad, pues exi sten l i mi taci ones
prcti cas en el di seo de l as l entes, l as cual es permi ten mejorar el aumento si n
mejorar l a resol uci n.

El poder resol uti vo de un mi croscopi o es una propi edad i mportante, pues l a
resol uci n o poder resol uti vo es l a capaci dad de di sti ngui r separados dos
puntos muy cercanos. Cuanto mayor es el poder resol uti vo, mayor es l a
defi ni ci n con que se observa l a i magen de un obj eto. De este modo, l os
mi croscopi os de gran poder resol uti vo son adecuados para ver pequeas
estructuras.

En un mi croscopi o compuesto o compl ejo, el poder resol uti vo depende de l a
l ongi tud de l a onda uti l i zada y de una propi edad pti ca de l a l ente conoci da
como apertura numri ca. Como l os mi croscopi os pti cos uti l i zan l uz vi si bl e, l a
l ongi tud de onda est predefi ni da. Esta es l a razn por l a cual l a resol uci n de
un obj eto es funci n de l a apertura numri ca; cuanto mayor es l a apertura, el
obj eto resuel to u observado es ms pequeo. Un factor que afecta a l a apertura
numri ca, adems de l a construcci n de l a l ente, es el medi o a travs del cual
pasa l a l uz. Mi entras que el obj eti vo est separado del obj eto por el ai re, su
apertura numri ca nunca ser mayor de 1,0; para consegui r aperturas numri cas
mayores que sta, el obj eti vo debe estar i nmerso en un l qui do de mayor ndi ce
de refracci n que el ai re. A estos l qui dos se l es denomi na acei tes de i nmersi n,
l os cual es se uti l i zan con l os objeti vos de i nmersi n obteni endo una apertura
numri ca entre 1,2 y 1, 4. An as , al uti l i zarse l a l ongi tud de onda de l a l uz
vi si bl e, estos mi croscopi os l l egan a tener un poder de resol uci n de
aproxi madamente 0,25 m, l o que si gni fi ca que l as part cul as con un tamao
ms pequeo que 0,25 m no pueden di sti ngui rse unas de otras.

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La cri stal er a desempea un papel i mportante en el l aboratori o de
mi crobi ol og a, especi al mente l a de ti po Pi rex, resi stente a l a temperatura.
Debi do a que el cul ti vo de mi croorgani smo requi ere el uso de medi os estri l es
que evi ten l a contami naci n de l os medi os de cul ti vo y l as muestras, se requi ere
que l a cri stal er a a uti l i zar sea esteri l i zado ya sea por cal or hmedo o seco, as
como el uso de guantes de l tex que evi ten el contacto de l os dedos con l as
superfi ci es de l os portaobjetos y cubreobj etos. Entre l a cri stal er a ms uti l i zada
se encuentra l a si gui ente:

Caja petri : cpsul a formada por dos di scos de cri stal
que pueden adaptarse entre s . En el di sco que forma el
fondo de l a caja se deposi ta cal do gel osado y el conjunto
puede ser fci l mente esteri l i zado, sembrado y col ocado en
l a estufa. La caja de Ptri , se uti l i za general mente para l a
12

separaci n de l os mi crobi os cuyas col oni as se desarrol l an ai sl adamente y
pueden ser estudi adas con faci l i dad.

Portaobjeto: pl aca rectangul ar de 70 mm de l ongi tud por 22 mm de ancho y
2 a 4 mm de espesor, puede ser l i sa o presentar una o dos cavi dades cncavas,
si es l i sa se uti l i za para muestras secas, l as cual es se fi jan medi ante cal or y
adi ci n de col orantes que faci l i tan l a observaci n de muestras mi croscpi cas,
mi entras que l as cncavas se uti l i zan para observar muestras hmedas.

Cubreobj etos: pl aca cuadrada de aproxi madamente 22 x 22 mm, con un
espesor de 1 mm, que se col oca sobre el portaobjeto a fi n de evi tar el contacto
del objeti vo con l a muestra, evi tar l a contami naci n de l a l ente y faci l i tar l a
observaci n de l a muestra, sobre todo cuando se uti l i za el l qui do de i nmersi n.

Cuna de ti nci n: ti ene l a apari enci a de una cuna, de donde deri va su nombre,
se uti l i za para col ocar vari os portaobj etos y faci l i tar de esta manera l a ti nci n
de ml ti pl es muestras y agi l i zar l a preparaci n de l as muestras que han de
observarse en el mi croscopi o.

2.3 Equi pos: autocl ave, bao mar a, centri fuga, i ncubadora.

El estudi o de l os mi croorgani smos requi ere de l a preparaci n de ci ertas
condi ci ones que faci l i ten el creci mi ento y desarrol l o de l os mi smos. Dado que
son prol i feros, es necesari o control ar di chas condi ci ones a fi n de favorecer el
creci mi ento de unos y evi tar l a apari ci n de otros no deseados, que reci be el
nombre contami naci n de l a muestra, para el l o se requi eren l os equi pos
si gui entes:

Autocl ave: es un di sposi ti vo que si rve para esteri l i zar
materi al de l aboratori o, uti l i zando vapor de agua a al ta
presi n y temperatura para el l o, evi tando con l as al tas
presi ones que el agua l l egue a ebul l i r a pesar de su al ta
temperatura. El fundamento del autocl ave es que coagul a l as
prote nas de l os mi croorgani smos debi do a l a presi n y
temperatura, aunque reci entemente se ha l l egado a saber de
al gunos mi croorgani smos, as como l os pri ones, que pueden
soportar l as temperaturas de autocl ave.

Las autocl aves funci onan permi ti endo l a entrada o generaci n de vapor de agua
pero restri ngi endo su sal i da, hasta obtener una presi n i nterna de 103 kPa, l o
cual provoca que el vapor al cance una temperatura de 121 grados cent grados.
Un ti empo t pi co de esteri l i zaci n a esta temperatura y presi n es de 15-20
mi nutos. Las autocl aves ms modernas permi ten real i zar procesos a mayores
temperaturas y presi ones, con ci cl os estndares a 134 C a 200 kPa durante 5
mi n para esteri l i zar materi al metl i co; l l egando i ncl uso a real i zar ci cl os de vac o
para acel erar el secado del materi al esteri l i zado.

13

El hecho de contener fl ui do a al ta presi n i mpl i ca que l as autocl aves deben ser
de manufactura sl i da, usual mente en metal , y que se procure construi rl as
total mente hermti cas.
Las autocl aves son ampl i amente uti l i zadas en l aboratori os, como una medi da
el emental de esteri l i zaci n de materi al . Aunque cabe notar que debi do a que el
proceso i nvol ucra vapor de agua a al ta temperatura, ci ertos materi al es no
pueden ser esteri l i zados en autocl ave, como el papel y muchos pl sti cos (a
excepci n del pol i propi l eno).

El funci onami ento del autocl ave
El proceso compl eto de esteri l i zaci n en un autocl ave se compone de di ferentes
fases:
Fase de purgado: A medi da que l a resi stenci a cal i enta el agua del fondo
del cal der n, se va produci endo vapor que despl aza el ai re, haci ndol o sal i r por
l a vl vul a de purgado que est abi erta. Esta fase termi na cuando se al canza l a
temperatura de esteri l i zaci n.
Fase de esteri l i zaci n: Una vez cerrada l a vl vul a de purgado y al canzada
l a temperatura de esteri l i zaci n previ amente sel ecci onada se i ni ci a el proceso
de esteri l i zaci n.
Fase de descarga: Termi nado el proceso de esteri l i zaci n, dej a de
funci onar l a resi stenci a cal efactora, con l o que deja de produci rse vapor y l a
presi n y temperatura del cal der n empi eza a baj ar poco a poco.

Al gunas consi deraci ones para una correcta esteri l i zaci n del materi al
Para que l a esteri l i zaci n de medi os de cul ti vo sea efi caz, l a temperatura y
el ti empo sel ecci onados deben al canzarse en todo el l qui do. Como qui era que
l a transmi si n del cal or en el l qui do de l os reci pi entes se real i za de fuera haci a
dentro, es evi dente que l a efi caci a del proceso depender del vol umen de
l qui do.
En general , no convi ene esteri l i zar juntos reci pi entes grandes y pequeos.
En todo caso l a sel ecci n de l a temperatura y ti empo se efectuar segn sea el
vol umen de l os reci pi entes.
Los reci pi entes con ci erre hermti co deben ser i ntroduci dos en el
autocl ave si n cerrar total mente el tapn, para faci l i tar l a entrada del vapor
durante el proceso. Al vaci ar el autocl ave despus de l a esteri l i zaci n
procederemos a cerrar total mente estos reci pi entes.
Los reci pi entes vac os preci san de un ti empo de esteri l i zaci n mayor que
l os reci pi entes con l qui do en su i nteri or.

Bao mar a: El bao Mar a o bao de Mar a es un mtodo empl eado en l as
i ndustri as (farmacuti ca, cosmti ca, de al i mentos y conservas), en l aboratori o
de qu mi ca y en l a coci na, para conferi r temperatura uni forme a una sustanci a
l qui da o sl i da o para cal entarl a l entamente, sumergi endo el reci pi ente que l a
conti ene en otro mayor con agua que se l l eva a o est en ebul l i ci n.

El concepto fundamental es el de bao que i mpl i ca el cal entami ento i ndi recto,
por convecci n trmi ca del medi o (agua del bao) y por conducci n trmi ca de
14

l a sustanci a; ese medi o (bao) puede ser de acei te mi neral , de agua pura o
sol uci ones sal i nas de agua de concentraci ones y sol utos di ferentes, etctera,
segn l a temperatura a que se requi era l l evar l a sustanci a. De este modo, l o que
se cal i enta en pri mer l ugar es el agua conteni da en el reci pi ente de mayor
tamao y sta es l a que poco a poco va cal entando el conteni do del reci pi ente
menor, de un modo suave y constante.

Centr fuga: Una centr fuga es una mqui na que pone en
rotaci n una muestra para separar por fuerza centr fuga
sus componentes o fases (general mente una sl i da y una
l qui da), en funci n de su densi dad.

Exi sten di versos ti pos de centr fugas, comnmente para
obj eti vos espec fi cos.

Una apl i caci n t pi ca consi ste en acel erar el proceso de
sedi mentaci n, di vi di endo el pl asma y el suero en un
proceso de anl i si s de l aboratori o. Tambi n se uti l i za
para determi nar el grupo sangu neo medi ante una toma
de muestra capi l ar. En este caso l a mqui na uti l i zada se
denomi na mi crocentr fuga.

Incubadora: Se denomi na i ncubadora a di sposi ti vos de di ferente ti po que ti enen
l a funci n comn de crear un ambi ente con l a humedad y temperatura
adecuadas para el creci mi ento o reproducci n de seres vi vos.

En mi crobi ol og a una i ncubadora es un equi po cerrado
que permi te control ar l a temperatura, humedad y otras
condi ci ones necesari as para el desarrol l o de un cul ti vo
mi crobi ol gi co.

Las i ncubadoras ms si mpl es son cmaras ai sl adas con
temperatura ajustabl e que t pi camente va de 60 a 65
C, aunque pueden al canzar temperaturas mayores,
general mente hasta 100 C. Los model os mas
sofi sti cados i ncl uyen l a posi bi l i dad de refri gerar el
conteni do, control ar l a humedad, y el ni vel de di xi do
de carbono.

La mayor a de l os equi pos i ncl uye un tempori zador programabl e, para real i zar
ci cl os de temperaturas vari abl es al i gual que de l os otros factores ambi ental es.
El tamao de l as i ncubadoras puede vari ar desde un tamao para usar sobre una
mesa, hasta cmaras del vol umen de una habi taci n.

Otra capaci dad de l as i ncubadoras de este ti po es control ar l a vel oci dad de
vi braci n, medi da en revol uci ones por mi nuto.

15

La temperatura de cul ti vo para l as bacteri as ms comunes, como por ejempl o
Escheri chi a col i es de 36 a 37C. Para otros organi smos como el de l a l evadura
de cerveza (Saccharomyces cerevi si ae) se requi eren temperaturas del orden de
30C.

3 ME DI OS Y T CNI CAS DE CUL T I VO.

Uno de l os si stemas ms i mportantes para l a i denti fi caci n de mi croorgani smos
es observar su creci mi ento en sustanci as al i menti ci as arti fi ci al es preparadas en el
l aboratori o. El materi al al i menti ci o en el que crecen l os mi croorgani smos es el
Medi o de Cul ti vo y el creci mi ento de l os mi croorgani smos es el Cul ti vo. Se han
preparado ms de 10.000 medi os de cul ti vo di ferentes.

Para que l as bacteri as crezcan adecuadamente en un medi o de cul ti vo arti fi ci al
debe reuni r una seri e de condi ci ones como son: temperatura, grado de
humedad y presi n de ox geno adecuado, as como un grado correcto de aci dez
o al cal i ni dad. Un medi o de cul ti vo debe contener l os nutri entes y factores de
creci mi ento necesari os y debe estar exento de todo mi croorgani smo
contami nante.

La mayor a de l as bacteri as patgenas requi eren nutri entes compl ej os si mi l ares
en composi ci n a l os l qui dos orgni cos del cuerpo humano. Por eso, l a base de
muchos medi os de cul ti vo es una i nfusi n de extractos de carne y Peptona a l a
que se aadi rn otros i ngredi entes.

El agar es un el emento sol i di fi cante muy empl eado para l a preparaci n de
medi os de cul ti vo. Se l i ca compl etamente a l a temperatura del agua hi rvi endo
y se sol i di fi ca al enfri arse a 40 grados. Con m ni mas excepci ones no ti ene efecto
sobre el creci mi ento de l as bacteri as y no es atacado por aquel l as que crecen en
l .

La Gel ati na es otro agente sol i di fi cante pero se empl ea mucho menos ya que
bastantes bacteri as provocan su l i cuaci n.

En l os di ferentes medi os de cul ti vo se encuentran numerosos materi al es de
enri queci mi ento como hi dratos de carbono, suero, sangre compl eta, bi l i s, etc.
Los hi dratos de Carbono se adi ci onan por dos moti vos fundamental es: para
i ncrementar el val or nutri ti vo del medi o y para detectar reacci ones de
fermentaci n de l os mi croorgani smos que ayuden a i denti fi carl os. El suero y l a
sangre compl eta se aaden para promover el creci mi ento de l os
mi croorgani smos menos resi stentes.

Tambi n se aaden col orantes que actan como i ndi cadores para detectar, por
ej empl o, l a formaci n de ci do o como i nhi bi dores del creci mi ento de unas
bacteri as y no de otras (el Roj o Fenol se usa como i ndi cador ya que es roj o en
pH bsi co y amari l l o en pH ci do. La Vi ol eta de Genci ana se usa como
16

i nhi bi dor ya que i mpi de el creci mi ento de l a mayori a de l as bacteri as Gram-
posi ti vas).

La evol uci n de l os medi os de cul ti vo

Podemos deci r que l a mi crobi ol og a empi eza su verdadero desarrol l o como
ci enci a en el momento en que se descubre el mi croscopi o y comi enza l a
observaci n de l os pri meros mi croorgani smos, pero es i ndudabl e que l a puesta
a punto de l os medi os de cul ti vo y l a uti l i zaci n del agar como sol i di fi cante,
marcan dos i mportantes puntos de i nfl exi n en su evol uci n.

La pri mera noti ci a de l a uti l i zaci n de medi os de cul ti vo nos l l ega del mi cl ogo
Brefel d, que consi gui ai sl ar y cul ti var esporas de hongos en medi os sl i dos
real i zados a base de gel ati na.

Si n embargo este si stema no era adecuado para l as bacteri as (por su menor
tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Li ster popul ari z un mtodo
enfocado al cul ti vo puro basado en di l uci ones seri adas en un medi o l qui do.

Koch real i z sus i nvesti gaci ones uti l i zando en un pri mer momento rodaj as de
patata como soporte nutri ti vo sl i do, pero no tard en recurri r al cal do de
carne l qui do, di seado por Loeffl er, al que, en 1881, aadi gel ati na, l ogrando
un medi o sl i do transparente i deal para l a observaci n de l a morfol og a
macroscpi ca de l as col oni as mi crobi anas.

En el ao 1882 ti ene l ugar uno de l os grandes avances de l a mi crobi ol og a en
rel aci n con l os medi os de cul ti vo: el mdi co al emn Wal ter Hesse i ntroduce el
agar-agar (pol i sacri do extra do de al gas rojas) como sol i di fi cante.

En 1887 un ayudante de Koch l l amado Petri , comi enza a uti l i zar pl acas de
cri stal pl anas, que se l l aman desde entonces pl acas de Petri , para susti tui r a l as
cl si cas bandejas de vi dri o cubi ertas con campanas que se usaban hasta
entonces.

Bei jeri nck y Wi nogradsky, que desde de 1888 real i zaron sus i nvesti gaci ones
sobre l as bacteri as qui mi oauttrofas (uti l i zaci n de ni trgeno y azufre sobre
todo) tuvi eron gran i mportanci a en el desarrol l o de l os medi os sel ecti vos y de
enri queci mi ento. Di searon este ti po de medi os de tal forma que su especi al
composi ci n qu mi ca favorec a el creci mi ento de ci ertos ti pos de
mi croorgani smos que, en funci n de sus procesos metabl i cos, eran l os ni cos
capaces de uti l i zar para su desarrol l o ci ertos nutri entes del medi o.

En 1892 Wrtz i mpul s el uso de l os medi os di ferenci al es, i ncorporando
i ndi cadores de pH a l a composi ci n de ci ertos medi os con l o cual se pod a
observar l a producci n de ci dos en l a fermentaci n en ci ertos
mi croorgani smos.

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En l os l aboratori os de mi crobi ol og a se uti l i zan di ferentes ti pos de medi os de
cul ti vo que pueden ser preparados en forma l qui da o en forma sl i da.
Usual mente para preparar un medi o sl i do se parte de un medi o l qui do al que
se l e aade un agente sol i di fi cante como el agar, l a gel ati na o l a s l i cagel .

Los medi os de cul ti vo se pueden cl asi fi car de acuerdo a l a natural eza de sus
consti tuyentes en:

Medi os natural es o compl ejos: consti tui dos por sustanci as compl ejas de
ori gen ani mal o vegetal , l as que son usual mente compl ementadas por l a adi ci n
de mi neral es y otras sustanci as. En el l os no se conocen todos l os componentes
ni l as canti dades exactas presentes de cada uno de el l os.

Medi os defi ni dos o si ntti cos: son l os medi os que ti enen una composi ci n
qu mi ca defi ni da cual i y cuanti tati vamente. General mente se usan en trabajos de
i nvesti gaci n. Ll evan fuente de carbono, fuente de ni trgeno, sal es que supl an
i ones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros el ementos como son esti mul adores del
creci mi ento (eri tri tol para Bruci l l a abortus) pero si empre a concentraci ones
conoci das.

De acuerdo al uso del medi o de cul ti vo, stos se cl asi fi can en:

Medi os de enri queci mi ento: son medi os l qui dos que favorecen el creci mi ento
de un ti po de mi croorgani smo en parti cul ar. Permi ten aumentar el nmero de
mi croorgani smos de ese ti po. Usual mente conti enen una o ms sustanci as
i nhi bi doras del creci mi ento de l os mi croorgani smos con excepci n de l os que se
qui eren cul ti var. Ej empl o: adi cci n de sangre, suero o extractos de tej i dos de
ani mal es y pl antas.

Medi os sel ecti vos: son pareci dos a l os de enri queci mi ento, se di ferenci an por
ser medi os sl i dos y estn di seados para el ai sl ami ento de mi croorgani smos
espec fi cos.

Ej empl o: CO
2
como fuente de carbono es sel ecti vo para auttrofos;
adi ci onando cri stal vi ol eta se i nhi be el creci mi ento de l os Gram. (+); uti l i zando
mal tosa como ni ca fuente de carbono sl o crecern l os que usen mal tosa.

Medi os di ferenci al es: son medi os que conti enen i ndi cadores de productos
deri vados de l a acti vi dad mi crobi ana de l os mi croorgani smos, esta desti nados a
faci l i tar l a di scri mi naci n de mi croorgani smos de una mezcl a por sus
propi edades di ferenci al es de creci mi ento en di chos medi os. No conti enen
ni ngn ti po de sustanci a con acti vi dad anti mi crobi ana. Permi ten revel ar
caracter sti cas fi si ol gi cas de l os mi croorgani smos.

18

Ej empl o: Agar sangre di ferenci a hemol ti cos de no hemol ti cos; McConkey
di ferenci a l actosa (+) de l actosa (-).

Los medi os de cul ti vo se pueden preparar en el l aboratori o a parti r de cada uno
de sus consti tuyentes bsi cos o por si mpl e rehi drataci n de productos asequi bl es
comerci al mente (medi os de cul ti vo deshi dratados). General mente se prefi ere el
uso de l os medi os de cul ti vo deshi dratados porque, adems de si mpl i fi car el
trabajo, con el l os se ti ene mayor probabi l i dad de obtener resul tados
reproduci bl es.

3
33 .
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22 P
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Para su preparaci n se deben tener en cuenta l os si gui entes aspectos:

1. Prepararl os sl o a parti r de productos que provengan de fabri cantes o
proveedores que sumi ni stren productos de cal i dad.
2. Uti l i zar agua desti l ada o desmi neral i zada con una cal i dad mi crobi ol gi ca y
fi si coqu mi ca adecuada.
3. Uti l i zar materi al es de vi dri os bi en l avados y enjuagados con agua desti l ada o
desmi neral i zada.
4. Control ar el ti empo y l a temperatura recomendada durante su esteri l i zaci n.
Nunca se deben exceder l as condi ci ones seal adas por el fabri cante.

Agar nutri ti vo:
Medi o de cul ti vo uti l i zado para propsi tos general es, para el ai sl ami ento de
mi croorgani smos poco exi gentes en l o que se refi ere a requeri mi entos
nutri ti vos. Su uso est descri to en muchos procedi mi entos para el anl i si s de
al i mentos, aguas y otros materi al es de i mportanci a sani tari a.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada.
Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar
suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su
disolucin. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15
minutos
Extracto de carne 3.0
Cloruro de sodio 8.0
Agar 15.0
pH final: 7.3

Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos
nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente
de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano.

El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Caractersticas del medio: mbar claro a medio ligeramente opalescente.
19

Base agar gel osa sangre:
Medi o para propsi tos general es,
para el ai sl ami ento y cul ti vo de
numerosos mi croorgani smos. Con
l a adi ci n de sangre, el medi o es
ti l tanto para el ai sl ami ento y
cul ti vo de mi croorgani smos
aerobi os y anaerobi os
nutri ci onal mente exi gentes a parti r de una gran vari edad de muestras, como
para l a observaci n de reacci ones de heml i si s.

Tambi n, este medi o de cul ti vo, puede uti l i zarse como medi o base para
preparar el medi o agar chocol ate.

Fundamento:
La i nfusi n de mscul o de corazn y l a peptona, otorgan al medi o un al to val or
nutri ti vo, que permi te el creci mi ento de una gran vari edad de mi croorgani smos,
an de aquel l os nutri ci onal mente exi gentes.

El cl oruro de sodi o manti ene el bal ance osmti co.
El agregado de sangre al medi o de cul ti vo, en concentraci n fi nal de 5-10%,
aporta nutri entes para el creci mi ento bacteri ano, y permi te detectar heml i si s.

Caracter sti cas del medi o:
Medi o preparado: mbar.
Medi o preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

Mac Conkey Agar
Este medi o se uti l i za para el ai sl ami ento de baci l os Gramnegati vos de fci l
desarrol l o, aerobi os y anaerobi os facul tati vos. Permi te di ferenci ar bacteri as que
uti l i zan o no, l actosa en muestras cl ni cas, de agua y al i mentos. Todas l as
especi es de l a fami l i a Enterobacteri aceae desarrol l an en el mi smo.

Frmul a (en gramos por l i tro) Instrucci ones
Peptona 17.0 Suspender 50 g del pol vo por l i tro de
agua desti l ada. Reposar 5 mi nutos y
mezcl ar hasta uni formar. Cal entar
suavemente y hervi r 1 a 2 mi nutos hasta
di sol ver. Esteri l i zar en autocl ave a 121C
durante 15 mi nutos.

Pl uri peptona 3.0
Lactosa 10.0
Mezcl a de sal es bi l i ares 1.5
Cl oruro de sodi o 5.0
Agar 13.5
Roj o neutro 0.03
Cri stal vi ol eta 0.001
pH fi nal : 7.1

Frmul a (en gramos por l i tro)
Infusi n de mscul o de corazn 375.0
Peptona 10.0
Cl oruro de sodi o 5.0
Agar 15.0
pH fi nal : 7.3
20

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Los medi os de cul ti vo deshi dratados se deben al macenar en envases sel l ados
bajo l as condi ci ones que seal e el fabri cante. General mente se al macenan en un
l ugar fresco (entre 15 y 25C), con poca humedad y protegi dos de l a l uz sol ar
di recta. Nunca se deben al macenar cerca de autocl aves, hornos, ni otra fuente
de cal or o vapor.

Los medi os de cul ti vo deshi dratados se deben descartar cuando se hi draten o
decol oren.

Una vez que el medi o de cul ti vo ha si do preparado y esteri l i zado se debe
al macenar entre 2 y 8C, a menos que el medi o requi era al guna condi ci n
di ferente. Se deben mantener en reci pi entes bi en cerrados para evi tar su
deshi drataci n. Cuando se usa tapn de al godn se debe col ocar por enci ma
una envol tura de papel (Craft).

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El cul ti vo de mi croorgani smos consi ste en proporci onarl es l as condi ci ones
f si cas, qu mi cas y nutri ti vas adecuadas para que puedan mul ti pl i carse de forma
control ada. En general , podemos di sti ngui r cul ti vos l qui dos y sl i dos en
funci n de l as caracter sti cas del medi o y cul ti vos di sconti nuos y conti nuos en
funci n de l a di sponi bi l i dad de nutri entes en el medi o.

Durante el creci mi ento mi crobi ano se produce un aumento del nmero de
mi croorgani smos a l o l argo del ti empo. Por tanto, no nos referi mos al
creci mi ento de un ni co mi croorgani smo que denomi naremos ci cl o cel ul ar, si no
al demogrfi co de una pobl aci n.

Se denomi na ci cl o cel ul ar al proceso de desarrol l o de una bacteri a ai sl ada. A l o
l argo del ci cl o ti ene l ugar l a repl i caci n del materi al genti co, l a s ntesi s de
componentes cel ul ares, l a el ongaci n de l a bacteri a para al canzar un tamao
dobl e del i ni ci al y su di vi si n por bi parti ci n para dar l ugar a dos cl ul as hi jas.
La duraci n del ci cl o cel ul ar coi nci de con el ti empo de generaci n y depende,
en general , de l os mi smos factores de l os que depende este.

Creci mi ento mi crobi ano en medi o l qui do: Si l a bacteri a crece en un medi o
l qui do, en l a mayor a de l os casos l as cl ul as que se producen en cada di vi si n
conti nan su vi da i ndependi entemente formndose una suspensi n de cl ul as
l i bres.

En un cul ti vo di sconti nuo de bacteri as en medi o l qui do, se pueden di ferenci ar
cuatro fases en l a evol uci n de l os parmetros que mi den el creci mi ento
mi crobi ano:

21

a.- Fase l ag o de adaptaci n durante l a que l os mi croorgani smos adaptan su
metabol i smo a l as nuevas condi ci ones ambi ental es (abundanci a de nutri entes y
condi ci ones de cul ti vo) para i ni ci ar l a fase de creci mi ento exponenci al .

b.- Fase exponenci al o l ogar tmi ca: en el l a l a vel oci dad de creci mi ento es
mxi ma y el ti empo de generaci n es m ni mo. Durante esta fase l as bacteri as
consumen a vel oci dad mxi ma l os nutri entes del medi o. La evol uci n del
nmero de cl ul as durante esta fase se expl i ca con l os model os matemti cos que
descri bi remos a conti nuaci n.

c.- Fase estaci onari a: en el l a no se i ncrementa el nmero de bacteri as (ni l a
masa u otros parmetros del cul ti vo). Las cl ul as en fase estaci onari a
desarrol l an un metabol i smo di ferente al de l a fase exponenci al y durante el l a se
produce una acumul aci n y l i beraci n de metabol i tos secundari os que pueden
tener i mportanci a i ndustri al .

Los mi croorgani smos entran en fase estaci onari a porque se agota al gn
nutri ente esenci al del medi o o porque l os productos de desecho que han
l i berado durante l a fase exponenci al hacen que el medi o sea i nhspi to para el
creci mi ento mi crobi ano.

La fase estaci onari a ti ene gran i mportanci a porque probabl emente represente
con mayor fi del i dad el estado metabl i co real de l os mi croorgani smos en l os
ambi entes natural es.

d.- Fase de muerte: se produce una reducci n del nmero de bacteri as vi abl es
del cul ti vo.

Creci mi ento mi crobi ano en medi o sl i do: Las fases, parmetros y ci nti ca de
creci mi ento di scuti das para el caso de l os cul ti vos l qui dos se presentan tambi n
en cul ti vos sl i dos. La ci nti ca de creci mi ento, en este caso, se puede estudi ar
22

si gui endo l a evol uci n del nmero de cl ul as vi abl es por uni dad de superfi ci e o
por uni dad de masa.

Cuando una cl ul a ai sl ada e i nmvi l comi enza a crecer sobre un substrato
sl i do, el resul tado del creci mi ento al cabo del ti empo es una col oni a. Por
consi gui ente, se denomi na uni dad formadora de col oni a (UFC) a una cl ul a
bacteri ana vi va y ai sl ada que si se encuentra en condi ci ones de substrato y
ambi ental es adecuadas da l ugar a l a producci n de una col oni a en un breve
l apso de ti empo. Si el nmero i ni ci al de bacteri as por uni dad de superfi ci e es
muy al to, l a confl uenci a de l as col oni as da l ugar a l o que se l l ama un csped
cuando se real i zan l os cul ti vos en pl acas de l aboratori o.

En el caso de mi croorgani smos mvi l es (desl i zantes) o en el de l os hongos
fi l amentosos que ti enen un creci mi ento trfi co no se producen col oni as ai sl adas
si no formaci ones ms di fusas o mi cel i ares.

Concepto de muerte de un mi croorgani smo: Desde el punto de vi sta
mi crobi ol gi co, un mi croorgani smo muere cuando pi erde de forma i rreversi bl e
l a capaci dad de di vi di rse. Como consecuenci a de esta prdi da, no se produce
aumento en el nmero de mi croorgani smos y, por tanto, no hay creci mi ento.

Si n embargo, un mi croorgani smo puede estar muerto desde el punto de vi sta
mi crobi ol gi co y conti nuar desarrol l ando una acti vi dad metabl i ca que se
traduzca, por ejempl o, en l i beraci n de toxi nas. Por otra parte, hay que
consi derar que l a capaci dad de mul ti pl i caci n (creci mi ento) de un
mi croorgani smo puede verse transi tori amente afectada por l esi ones o por l as
condi ci ones f si cas o qu mi cas del entorno. En estos casos, podr amos consi derar
como muertos mi croorgani smos que pueden reanudar su creci mi ento si l as
condi ci ones son de nuevo favorabl es.

Condi ci ones general es para el cul ti vo de mi croorgani smos

El desarrol l o adecuado de l os mi croorgani smos en un medi o de cul ti vo se ve
afectado por una seri e de factores de gran i mportanci a y que, en al gunos casos,
son aj enos por compl eto al propi o medi o.

a- di sponi bi l i dad de nutri entes adecuados: Un medi o de cul ti vo adecuado para
l a i nvesti gaci n mi crobi ol gi ca ha de contener, como m ni mo, carbono,
ni trgeno, azufre, fsforo y sal es i norgni cas. En muchos casos sern necesari as
ci ertas vi tami nas y otras sustanci as i nductoras del creci mi ento. Si empre han de
estar presentes l as sustanci as adecuadas para ej ercer de donantes o captadores
de el ectrones para l as reacci ones qu mi cas que tengan l ugar.

Todas estas sustanci as se sumi ni straban ori gi nal mente en forma de i nfusi ones de
carne, extractos de carne o extractos de l evadura. Si n embargo, l a preparaci n
de estas sustanci as para su apl i caci n a l os medi os de cul ti vo provocaban l a
prdi da de l os factores nutri ti vos l bi l es.
23

Actual mente, l a forma ms extendi da de aportar estas sustanci as a l os medi os es
uti l i zar peptona que, adems, representa una fuente fci l mente asequi bl e de
ni trgeno y carbn ya que l a mayor a de l os mi croorgani smos, que no suel en
uti l i zar di rectamente l as prote nas natural es, ti enen capaci dad de atacar l os
ami noci dos y otros compuestos ms si mpl es de ni trgeno presentes en l a
peptona.

Ci ertas bacteri as ti enen necesi dades nutri ti vas espec fi cas por l o que se aade a
muchos medi os, sustanci as como suero, sangre, l qui do asc ti co, etc. Igual mente
pueden ser necesari os ci ertos carbohi dratos y sal es mi neral es como l as de cal ci o,
magnesi o, manganeso, sodi o o potasi o y sustanci as promotoras del creci mi ento,
general mente de natural eza vi tam ni ca.

Muy a menudo se aaden al medi o de cul ti vo ci ertos col orantes, bi en como
i ndi cadores de ci ertas acti vi dades metabl i cas o bi en por sus capaci dades de
ej ercer de i nhi bi dores sel ecti vos de ci ertos mi croorgani smos.

b- consi stenci a adecuada del medi o: Parti endo de un medi o l qui do podemos
modi fi car su consi stenci a aadi endo productos como al bmi na, gel ati na o agar,
con l o que obtendr amos medi os en estado semi sl i do o sl i do.

Los medi os sol i di fi cados con gel ati na ti enen el gran i nconveni ente de que
muchos mi croorgani smos no se desarrol l an adecuadamente a temperaturas
i nferi ores al punto de fusi n de este sol i di fi cante y de que otros ti enen l a
capaci dad de l i cuarl a.

Actual mente l os medi os sl i dos son de uso uni versal , por su versati l i dad y
comodi dad, pero hay tambi n gran canti dad de medi os l qui dos cuyo uso est
ampl i amente extendi do en el l aboratori o.

c- presenci a (o ausenci a) de ox geno y otros gases: Gran canti dad de bacteri as
pueden crecer en una atmsfera con tensi n de ox geno normal . Al gunas
pueden obtener el ox geno di rectamente de vari ados sustratos. Pero l os
mi croorgani smos anaerobi os estri ctos sl o se desarrol l arn adecuadamente en
una atmsfera si n ox geno ambi ental . En un punto i ntermedi o, l os
mi croorgani smos mi croaerfi l os crecen mejor en condi ci ones atmosfri cas
parci al mente anaerobi as (tensi n de ox geno muy reduci da), mi entras l os
anaerobi os facul tati vos ti enen un metabol i smo capaz de adaptarse a cual qui era
de l as ci tadas condi ci ones.

d- condi ci ones adecuadas de humedad: Un ni vel m ni mo de humedad, tanto en
el medi o como en l a atmsfera, es i mpresci ndi bl e para un buen desarrol l o de
l as cl ul as vegetati vas mi crobi anas en l os cul ti vos. Hay que prever el
manteni mi ento de estas condi ci ones m ni mas en l as estufas de cul ti vo a 35-37C
proporci onando una fuente adecuada de agua que mantenga l a humedad
24

necesari a para el creci mi ento de l os cul ti vos y evi tar as que se deseque el
medi o.
e- Luz ambi ental : La mayor a de l os mi croorgani smos crecen mucho mej or en l a
oscuri dad que en presenci a de l uz sol ar. Hay excepci ones evi dentes como ser a
el caso de l os mi croorgani smos fotosi ntti cos.

f- pH: La concentraci n de i ones hi drgeno es muy i mportante para el
creci mi ento de l os mi croorgani smos. La mayor a de el l os se desarrol l an mej or
en medi os con un pH neutro, aunque l os hay que requi eren medi os ms o
menos ci dos. No se debe ol vi dar que l a presenci a de ci dos o bases en
canti dades que no i mpi den el creci mi ento bacteri ano pueden si n embargo
i nhi bi rl o o i ncl uso al terar sus procesos metabl i cos normal es.

g- Temperatura: Los mi croorgani smos mesfi l os crecen de forma pti ma a
temperaturas entre 15 y 43C. Otros como l os psi crfi l os crecen a 0C y l os
temfi l os a 80C o i ncl uso a temperaturas superi ores (hi pertemfi l os). En l neas
general es, l os patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms
cortos, al rededor de 37C, y l os saprof tos ti enen rangos ms ampl i os.

h- Esteri l i dad del medi o: Todos l os medi os de cul ti vo han de estar
perfectamente estri l es para evi tar l a apari ci n de formas de vi da que puedan
al terar, enmascarar o i ncl uso i mpedi r el creci mi ento mi crobi ano normal del o
de l os especi menes i nocul ados en di chos medi os. El si stema cl si co para
esteri l i zar l os medi os de cul ti vo es el autocl ave (que uti l i za vapor de agua a
presi n como agente esteri l i zante)

Concepto de cul ti vo puro: Se denomi na cul ti vo puro (axni co) al que conti ene
sl o un ti po de mi croorgani smos. Los cul ti vos puros se i ni ci an a parti r de
col oni as ai sl adas, de manera que todos l os i ndi vi duos del mi smo tengan l a
mi sma composi ci n genti ca. Los cul ti vos puros son esenci al es para poder
estudi ar l as caracter sti cas de l os mi croorgani smos y para poder i denti fi carl os
con seguri dad.

Si n embargo, cada vez se va conoce ms sobre el funci onami ento de l as
comuni dades bacteri anas l o que debe hacernos refl exi onar sobre el hecho de
que un cul ti vo puro supone unas condi ci ones no natural es y que, por
consi gui ente, l a fi si ol og a de l os mi croorgani smos en ambi entes natural es puede
ser di ferente de l a que presentan en condi ci ones de cul ti vos puros.

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Mtodos de ai sl ami ento: El ai sl ami ento de bacteri as a parti r de muestras
natural es se real i za, en l a mayor a de l os casos, medi ante l a producci n de
col oni as ai sl adas en cul ti vos sl i dos. El creci mi ento expl osi vo de l as bacteri as
permi te produci r un gran nmero de el l as a parti r de una ni ca cl ul a i ni ci al de
forma que, tras un peri odo de i ncubaci n en l as condi ci ones ambi ental es
25

adecuadas, se produce una col oni a observabl e a si mpl e vi sta y formada por
i ndi vi duos i gual es (un cl on bacteri ano).

Si n embargo, no todos l os mi croorgani smos presentes en l as muestras
ambi ental es son cul ti vabl es (mi croorgani smos no cul ti vabl es). Esto es debi do a
di fi cul tades i ntr nsecas en el cul ti vo (mi croorgani smos parsi tos de otros), al
desconoci mi ento de l os requeri mi entos espec fi cos de cul ti vo, y a l a exi stenci a
de grupos de mi croorgani smos que deben mantenerse en equi l i bri o para poder
sobrevi vi r (casos de si ntrof a por ejempl o).

Se esti ma que en sl o en torno al 1% de l as bacteri as del suel o al 0,1 - 0,01 %
de l as bacteri as mari nas son cul ti vabl es. Exi sten procedi mi entos de
enri queci mi ento del nmero de bacteri as de ambi entes natural es para faci l i tar su
ai sl ami ento. Uno de el l os es l a Col umna de Wi nogradski que crea un
mi crocosmos para enri quecer el nmero de ci ertos ti pos de mi croorgani smos
presentes en ambi entes natural es con obj eto de faci l i tar su ai sl ami ento.

Medi da del creci mi ento y enumeraci n de mi croorgani smos: Exi sten di ferentes
si stemas para detectar y medi r el creci mi ento de mi croorgani smos. Los
pri nci pal es, se enumeran a conti nuaci n:

a.- Recuento di recto: consi ste en l a observaci n al mi croscopi o de vol menes
muy pequeos de suspensi ones de bacteri as. Se usan unos portaobj etos
especi al es denomi nados cmaras de Petroff-Hausser. Para que l a medi da sea
correcta es necesari o que l a densi dad de cl ul as sea del orden de 105 por ml .
b.- Medi da de l a masa de cl ul as: el si stema se basa en que l as cl ul as en
suspensi n di spersan l a l uz causando l a turbi dez del cul ti vo. La turbi dez
depende de l a masa en suspensi n y, por tanto, mi di endo esta se puede esti mar
aquel l a. Este es el parmetro de medi da ms fci l de usar en l os cul ti vos de
l aboratori o. La densi dad de cl ul as debe ser del orden de 105 por ml .
c.- Recuento de vi abl es: consi ste en sembrar un vol umen determi nado de
cul ti vo o muestra sobre el medi o de cul ti vo sl i do adecuado para esti mar el
nmero de vi abl es contando el nmero de col oni as que se forman puesto que
cada una de estas deri va de una cl ul a ai sl ada. Para que l a medi da sea correcta
desde el punto de vi sta estad sti co, es necesari o contar ms de 300 UFC.

En ci ertas ocasi ones en l as que l a densi dad de mi croorgani smos es demasi ado
baja, stos se pueden recol ectar por fi l traci n a travs de una membrana (de
0.2 m de tamao de poro) y posteri or col ocaci n de l a membrana en un
medi o de cul ti vo adecuado para que se formen l as col oni as.

d.- Medi da del nmero de part cul as usando contadores el ectrni cos de
part cul as. Estos si stemas no nos i ndi can si l as part cul as corresponden a cl ul as
vi vas o muertas; pero nos pueden dar una i dea del tamao de l as part cul as.
e. - Medi da de parmetros bi oqu mi cos tal es como l a canti dad de ADN, ARN,
prote nas, pepti dogl i cano, etc. por uni dad de vol umen de cul ti vo.
26

f.- Medi da de acti vi dad metabl i ca de l as bacteri as como que respi ran producen
una di smi nuci n del potenci al redox del medi o en que se encuentran como
consecuenci a del consumo de ox geno (uti l i zaci n de col orantes sensi bl es a
oxi daci n-reducci n tal es como el azul de meti l eno).

4 T CNI CAS DE OBS E R VACI N.

El examen mi croscpi co es el pri mer paso para el estudi o de l as muestras
mi crobi ol gi cas. Es un examen ori entati vo que proporci ona datos como l a
presenci a de bacteri as, su morfol og a, movi l i dad y caracter sti cas ti ntori al es y
estructural es. Los mi croorgani smos obteni dos a parti r de una muestra cl ni ca
pueden verse vi vos o muertos, aunque para l a i nvesti gaci n de al gunas
caracter sti cas bi ol gi cas como l a movi l i dad, es necesari o observarl os vi vos.

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La observaci n de l os mi croorgani smos requi ere de su respecti va preparaci n
para su observaci n, si endo l as ms comunes l as si gui entes:

A. Examen en fresco (preparaci ones si n tei r). Preparaci n entre porta y
cubre objeto.

B. Examen de preparaci ones col oreadas:
-de grmenes vi vos -> col oraci n vi tal
-de grmenes muertos -> ti nci ones

C. Estudi o de l a movi l i dad bacteri ana o de gota pendi ente

A. Examen en fresco (preparaci ones si n tei r)
Consi ste en observar l os mi croorgani smos vi vos que puede haber en el producto
exami nado, si n fi jaci n ni ti nci n, en suspensi n acuosa, pudi endo obj eti var su
canti dad, sus caracter sti cas morfol gi cas y su movi l i dad.

Es una tcni ca de fci l real i zaci n, en l a que el producto a exami nar se si ta
entre porta y cubre. Si el materi al procede de una toma en medi o sl i do o de
una toma di recta, se emul si onar en una gota de agua desti l ada o sol uci n
sal i na. Si el materi al es l qui do se deposi tar di rectamente entre porta y cubre.

El vol umen de l a gota debe ser adecuado a l as di mensi ones del cubreobjetos ya
que, en caso contrari o, un exceso de l qui do se traduci r en un desbordami ento
de ste baj o l os l mi tes del cubre, o un cubre "fl otante" que di fi cul tar l a
observaci n por l a formaci n de corri entes l qui das.

Si el producto va a permanecer mucho ti empo en el portaobj etos, es
conveni ente preveni r l a desecaci n medi ante l a apl i caci n de parafi na en l os
bordes i nferi ores del cubreobj etos.
27

La observaci n se real i za, en general , con objeti vo de 40x en mi croscopi o de
campo cl aro. La mi croscop a de contraste de fases y de campo oscuro faci l i ta
mucho l a vi si n en fresco. Los exmenes en fresco permi ten, adems, observar
l a presenci a de otros el ementos formes, como l eucoci tos, cri stal es, etc., que
pueden ser de gran ayuda en l a val oraci n de l as muestras.

B. Examen de preparaci ones col oreadas:
Las tcni cas de col oraci n permi ten l a observaci n morfol gi ca con un mej or
contraste que en el examen en fresco, as como l a observaci n de estructuras
cel ul ares. El examen mi croscpi co de preparaci ones tei das ti ene una seri e de
pasos comunes previ os a l a ti nci n, que son:

Preparaci n del froti s:
a. La extensi n del materi al sobre el portaobjetos se har de di ferentes formas,
en funci n de l a procedenci a del producto a exami nar. Si el producto es
l qui do, se deposi tar una pequea (muy pequea) canti dad de materi al en el
centro del porta objeto, extendi ndol o con el asa hasta consegui r una capa
fi na y homognea.
b. Si l a extensi n debe hacerse a parti r de un cul ti vo en medi o sl i do, l a
col oni a que vayamos a estudi ar se mezcl ar con una goti ta de agua desti l ada
estri l col ocada en el centro del porta objeto. Convi ene recordar que no es
necesari o deposi tar una gran canti dad de producto, pues se di fi cul tar a l a
vi sual i zaci n, y que un exceso de agua sol o contri buye a
aumentar el ti empo en secar l a preparaci n.
c. Por l ti mo, si el producto se ha recogi do con una torunda
(exudados) debe extenderse di rectamente sobre el
portaobj etos, procurando que el al godn "ruede", en vez de
"frotar" el porta; de esta manera se consi gue preservar
mejor l os el ementos cel ul ares que pudi esen acompaar a l as
bacteri as, a l a vez que se conserva l a agrupaci n de stas,
en caso de que l as hubi ere. Froti s en caja
Froti s en pl aca

Secado:
a. Una vez efectuada l a extensi n del froti s debemos dej ar secar al ai re l a
preparaci n.
b. Cuando l a preparaci n est seca l a superfi ci e del froti s pasa de ser bri l l ante a
mate.
c. El secado se puede acel erar cal entando l i geramente l a parte i nferi or del
porta objeto (si n quemar).

28

Fi jado:
a. El l ti mo paso antes de proceder a l a ti nci n es l a fi jaci n de l a preparaci n
al portaobj etos, medi ante l a coagul aci n rpi da de l as al bmi nas
ci topl asmti cas. Con esto consegui mos que el producto adheri do al
portaobj etos no sea el i mi nado, ni vea al teradas sus caracter sti cas
morfol gi cas y estructural es en l os procedi mi entos de ti nci n posteri ores.
b. La fi jaci n puede hacerse por cal or suave, pasando el portaobj eto sobre una
l l ama o medi ante l a uti l i zaci n de pl acas cal efactoras especi al es a 37C.
c. Tras l a fi jaci n por cal or es muy i mportante esperar a que l a preparaci n se
enfr e antes de proceder a real i zar cual qui er procedi mi ento de ti nci n.
d. Si el materi al que se va a tei r puede poseer abundante materi al cel ul ar
(l eucoci tos, cl ul as epi tel i al es, etc.) que convi ene vi sual i zar tambi n, es
preferi bl e recurri r al al cohol met l i co para fi jar l a preparaci n
e. Una vez cubi erta de al cohol l a preparaci n, se deja actuar durante un
mi nuto, el i mi nando despus el exceso y dejando secar a temperatura
ambi ente.

Col oraci n o ti nci n:
a. La ti nci n consi ste en cubri r l a preparaci n con uno o vari os col orantes de
forma secuenci al durante un ti empo determi nado.
b. La adi ci n de un col orante a un froti s si n enfri ar puede provocar l a
preci pi taci n del col orante y l a vi sual i zaci n de artefactos que pueden
confundi rnos en el proceso de observaci n al mi croscopi o.
c. Tras l a ti nci n, l a preparaci n se l ava con agua, procurando que el chorro
no cai ga con fuerza sobre l a preparaci n y fi nal mente se seca al ai re o
medi ante absorci n con papel .

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El trmi no i nocul aci n se refi ere a l a i ncorporaci n de una sustanci a en un
organi smo. Puede real i zarse para trasmi ti r una enfermedad o proporci onar
medi os de defensa o i nmuni dad a di cho organi smo.

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La ti nci n es una tcni ca uti l i zada para resal tar rasgos estructural es de l os
mi croorgani smos, como l a presenci a de ci l i os o fl agel os, resal tar organel os
cel ul ares como el ncl eo o bi en para di ferenci ar a l os mi croorgani smos.

Ti pos de preparaci ones col oreadas:

A. Ti nci ones si mpl es
-Azul de meti l eno
-Cri stal vi ol eta
-Fucsi na
C. Ti nci ones estructural es
-Ti nci n de cpsul as
-Ti nci n de fl agel os
-Ti nci n de esporas
-Ti nci n de corpscul os
metacromti cos

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B. Ti nci ones dobl es, compuestas o
di ferenci al es
-Ti nci n de Gram
-Ti nci n de Zi ehl -Ni el sen
-Ti nci n de Tam-Thi am-Hok
D. Ti nci ones especi al es:
-Ti nci n negati va
-Ti nci ones fl uorescentes
-Ti nci n de aurami na-rodami na
-Ti nci n con naranj a de acri di na

A. Ti nci ones si mpl es:
Las ti nci ones si mpl es se uti l i zan para observar l a morfol og a y el agrupami ento
bacteri anos. Cual qui er col orante es vl i do para este ti po de ti nci n, aunque l os
ms uti l i zados habi tual mente son: Azul de meti l eno, Cri stal vi ol eta, Fucsi na

El mtodo para real i zar una ti nci n si mpl e es bi en senci l l o:
1) hacer un froti s sobre un portaobj eto, secar y fi jar,
2) cubri r l a preparaci n con el col orante el egi do, durante el ti empo
especi fi cado,
3) l avar con agua, arrastrando todo el exceso de col orante,
4) secar al ai re o al cal or suave,
5) observar al mi croscopi o a 1000x con objeti vo de i nmersi n (y acei te)

Las bacteri as se vern tei das del mi smo col or que el col orante que se uti l i z.

B. Ti nci ones di ferenci al es:
Se uti l i zan para poner de mani fi esto di ferenci as estructural es entre bacteri as

Ti nci n de Gram:
Es l a col oraci n di ferenci al ms uti l i zada en Mi crobi ol og a, ya que di ferenci a a
l as bacteri as en dos grandes grupos: Gram posi ti vas y Gram negati vas, segn
retengan o no el cri stal vi ol eta uti l i zado en l a ti nci n.

Prcti camente todos l os autores estn de acuerdo en uti l i zar esta ti nci n como
pri mer paso en l a i denti fi caci n bacteri ana. Su i mportanci a resi de en que una
i ncorrecta i nterpretaci n puede hacer vari ar el nmero de pruebas subsi gui entes
desti nadas a efectuar l a i denti fi caci n, al ejndonos consi derabl emente del
gnero y especi e verdaderos.

El fundamento de esta ti nci n se basa en l a i ncapaci dad de l as bacteri as Gram
negati vas para retener el cri stal vi ol eta cuando son decol oradas por una mezcl a
de al cohol y acetona. Las bacteri as Gram posi ti vas, que no son decol oradas por
el al cohol acetona, reti enen el col orante i ni ci al (cri stal vi ol eta) y mostrarn esa
col oraci n al fi nal de l a tcni ca. Las bacteri as Gram negati vas cogern el
segundo col orante (safrani na) y se mostrarn como bacteri as de col or roj o.

Resul tados:
Bacteri as Gram posi ti vas: se vern de col or vi ol eta o azul i ntenso.
Bacteri as Gram negati vas: se observarn de col or rojo.

30

Observaci ones:
El l ugol se uti l i za como mordi ente (no como col orante), para favorecer l a
retenci n del cri stal vi ol eta por parte de l as bacteri as Gram posi ti vas.

Los cul ti vos vi ej os (ms de 24 horas) pueden hacerse ms sensi bl es a l a
decol oraci n, pudi endo aparecer como Gram negati vas bacteri as que no l o son.

Ti nci n de Zi ehl Neel sen
Se uti l i za para objeti var l a presenci a de baci l os ci do-al cohol resi stente en una
muestra o preparaci n.

El mtodo uti l i za un procedi mi ento si mi l ar al de l a ti nci n de Gram, es deci r:
col oraci n i ni ci al , decol oraci n y adi ci n de un contra col orante o col orante de
contraste.

Tras l a preparaci n del froti s, secado y fi jaci n se procede como si gue:
1. Cubri r l a preparaci n total mente con carbol -fucsi na o fucsi na feni cada
2. Cal entar l a preparaci n hasta l a emi si n de vapores tres veces, dej ando que
se enfr e.
3. Lavar y decol orar con al cohol cl orh dri co al 3% hasta que no suel te ms
col orante rojo.
4. Lavar y cubri r con azul de meti l eno durante unos mi nutos.
5. Lavar, secar y observar con obj eti vo de i nmersi n. Las bacteri as ci do
al cohol resi stentes quedan tei das de rojo y l as que no l o son, de azul .

Ti nci n de Tan-Thi am-Hok
Esta col oraci n permi te una ti nci n ms rpi da que el cl si co procedi mi ento de
Zi ehl -Neel sen y evi ta l a necesi dad de cal entami ento. El resul tado es el mi smo
que en l a ti nci n anteri or, observndose l os mi croorgani smos ci do al cohol
resi stente de col or rojo.

C. Ti nci ones estructural es:

Ti nci n de esporas
Se real i zan para poner de mani fi esto l as formas de resi stenci a de l as bacteri as
(esporas) y su l ocal i zaci n en l a cl ul a. Suel en uti l i zarse col orantes muy
concentrados y ti nci n forzada por cal entami ento hasta emi si n de vapores.

Uno de l os mtodos ms uti l i zados es el mtodo de Wi rtz o del verde de
mal aqui ta, que consi ste en l a uti l i zaci n de este col orante en cal i ente y
posteri or uti l i zaci n de fucsi na di l ui da como contracol orante.
Tras l a ti nci n l as esporas, si exi sten, se observan de col or verde, mi entras que
l as formas vegetati vas aparecen de col or rojo.

Ti nci n de fl agel os
La observaci n de fl agel os en preparaci ones tei das es muy di f ci l , debi do a que
se retraen con mucha faci l i dad y se adhi eren a l a pared cel ul ar. Se deben
31

uti l i zar cul ti vos jvenes (de menos de 24 horas), sembrados en agar semi sl i do,
empl endose tcni cas que engruesan l os fl agel os para faci l i tar su observaci n.

Tras l a real i zaci n de l a del i cada tcni ca (extensi n por i ncl i naci n -si n asa-,
secado si n cal or, fi j aci n con vapores de xi do de osmi o) l os fl agel os aparecen
vi si bl es al mi croscopi o debi do al preci pi tado de pl ata formado a su al rededor.

Ti nci n de cpsul as
La cpsul a es una capa gel ati nosa, de espesor vari abl e, si tuada al rededor de l a
pared cel ul ar bacteri ana. Como es di f ci l tei rl as, se consi guen mej ores
resul tados uti l i zando mtodos que, col oreando el fondo de l a preparaci n y el
mi croorgani smo, hacen resal tar l as cpsul as si n tei r.

El mtodo ms uti l i zado es el de Burri o de l a ti nta chi na, en el que se ti en
pri mero l os mi croorgani smos con fucsi na di l ui da y posteri ormente se cubre l a
preparaci n con ti nta chi na.

Tras el procedi mi ento de ti nci n, se observan sobre un fondo negro l os
mi croorgani smos tei dos de rojo y l a cpsul a como un hal o bl anco que l os
rodea.

Ti nci n de corpscul os metacromti cos:
Los corpscul os metacromti cos son grnul os de reserva de fosfato del
mi croorgani smo, que al tei rl os dan el col or compl ementari o al col orante
uti l i zado. Sol o aparecen en el gnero Corynebacteri um. Se uti l i zan vari os
mtodos para su vi sual i zaci n (Nei sser, Loeffl er y Al bert), dependi endo el
resul tado fi nal del mtodo uti l i zado.

D. Ti nci ones especi al es:

Ti nci n negati va:
Es una tcni ca i ntermedi a entre l as ti nci ones propi amente di chas y l a
observaci n en fresco, ya que carece de l as etapas de fi j aci n y col oraci n. Se
uti l i za, sobre todo, para estudi os de ti po morfol gi co. Tras l a ti nci n con
ni grosi na, l os mi croorgani smos aparecen i ncol oros sobre un fondo negro.

Ti nci n de aurami na -rodami na
Estos dos fl uorocromos se fi jan sel ecti vamente sobre el ci do mi cl i co de l a
pared cel ul ar de l as mi cobacteri as, por l o que l a i nvesti gaci n de stas es su
pri nci pal apl i caci n.

Tras l a ti nci n, l os mi croorgani smos aparecen como puntos amari l l os o
amari l l o-verdosos bri l l antes sobre fondo negro. Es una ti nci n equi val ente a l a
de Zi ehl -Neel sen, aunque mucho ms sensi bl e y espec fi ca.

32

Ti nci n de naranja de acri di na:
Se basa en l a ti nci n sel ecti va y di ferenci al de l os ci dos nucl ei cos por parte del
fl uorocromo naranj a de acri di na. Se uti l i za en l a i nvesti gaci n de muestras con
escaso nmero de mi croorgani smos.

Tras l a ti nci n, l os mi croorgani smos se observan con un col or rojo-anaranjado,
mi entras que otras cl ul as o restos de teji dos presentes en l a muestra aparecen
con una fl uorescenci a amari l l o-verdosa.

Estudi o de l a movi l i dad bacteri ana:

Las bacteri as pueden tener l a capaci dad de despl azarse en suspensi ones l qui das
graci as a l os fl agel os. La observaci n de esta caracter sti ca puede ser muy
i mportante en el proceso de i denti fi caci n bacteri ana.

El estudi o de l a movi l i dad real i zado medi ante l a observaci n entre porta y
cubre de una gota de cal do de cul ti vo de vari as horas de creci mi ento puede
i nduci r a error al confundi r el movi mi ento bacteri ano con el "arrastre" de
bacteri as que se produce por l as corri entes l qui das que se generan hasta que se
equi l i bra el componente l qui do entre porta y cubre.

Tcni ca de l a gota pendi ente:
La tcni ca de l a gota pendi ente consi ste en l a observaci n de una pequea
canti dad de suspensi n de mi croorgani smos en fase de creci mi ento exponenci al
en medi o l qui do, pero exenta de l as fl uctuaci ones provocadas por l as
corri entes l qui das que se generan entre porta y cubre.

Para l a real i zaci n de l a tcni ca de observaci n medi ante el mtodo de l a gota
pendi ente, se uti l i zan unos portas especi al es con una o dos excavaci ones que
permi ten col ocar un cubreobjetos i nverti do del que pende una pequea gota de
l a suspensi n bacteri ana que vamos a observar.

El tamao de l a gota debe ser l o sufi ci entemente pequeo como para evi tar su
contacto con el portaobj eto y l o sufi ci entemente grande para evi tar una rpi da
desecaci n durante el ti empo de observaci n.

Es i mportante saber di ferenci ar el movi mi ento browni ano de part cul as en
suspensi n con el movi mi ento real produci do por l os mi croorgani smos. Las
repeti das observaci ones prcti cas de di ferentes mi croorgani smos permi ti rn
di sti ngui r perfectamente estos movi mi entos.

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I. TINCION SIMPLE.

a) Safrani na b) Cri stal vi ol eta c) Azul de meti l eno.
Safrani na........ 0.5 g
Agua desti l ada.100 mL
Cri stal vi ol eta..1 g
Agua desti l ada.100 mL
Azul de meti l eno... 3 mL
Etanol de 96%.....20 mL
Agua desti l ada....100 mL
Preparaci n:
Di sol ver el col orante en
el agua
Preparaci n:
el agua.
Preparaci n:
al cohol .
Agregar el agua y fi l trar.

II. TINCION DE GRAM.

a) Cri stal vi ol eta y oxal ato de amoni o. (Reacti vo de Hucker)

Sol uci n A:

Cri stal vi ol eta (pureza del col orante de por l o menos, el 90%)........ 2 g
Etanol (95%)................................................................................... 20 mL
Sol uci n B:

Oxal ato de amoni o.............................................. 0.8 g
Agua desti l ada..................................................... 80 mL

Preparaci n:
Mezcl ar cada uno de l os sol utos en su di sol vente respecti vo.
Dej ar l a sol uci n de oxal ato de amoni o en reposo durante una noche o cal entar
l i geramente hasta que se sol ubi l i ce.
Mezcl ar l as dos sol uci ones y fi l trar.

b) Sol uci n de yodo yodurado. (Lugol )

Yodo (qu mi camente puro).............. 1 g
Yoduro de potasi o. .......................... 2 g
Agua desti l ada............................ 300 mL

Preparaci n:
Combi nar el yodo y el yoduro de potasi o con l a ayuda de un mortero.
Lavar el conteni do de ste con pequeas al cuotas de agua desti l ada.
Agregar agua sufi ci ente para obtener un total de 300 mL.
Agi tar fuertemente.
Al macenar l a sol uci n en una botel l a oscura y con tapn de vi dri o.

34

c) Al cohol acetona.

Al cohol et l i co (95%)................................ 500 mL
Acetona.................................................... 300 mL

Preparaci n:
Mezcl ar l os i ngredi entes respecti vos de cada combi naci n para su uso.

d) Safrani na.

Safrani na (pureza del col orante, 90%). ... ... 0.25 g
Al cohol et l i co (95%)...................................... 10 mL
Aforar con agua desti l ad .................................. 1000 mL

Preparaci n:
Di sol ver el col orante en el al cohol .
Agregar el agua desti l ada.
Fi l trar.
Al macenar en frasco con tapn de vi dri o.

III. TINCION DE ESPORAS. (Mtodo de Schaeffer y Ful ton)

a) Verde de mal aqui ta al 5%. b) Safrani na al 0.5%.
Verde de mal aqui ta................. 5 g
Agua desti l ada..................... 100 mL
Safrani na.............................. 0.5 g
Agua desti l ada..................... 100 mL
Preparaci n:
Di sol ver el col orante en el agua y
dej ar en reposo durante una hora y
medi a. Fi l trar. Guardar en frasco
oscuro.
Preparaci n:
Di sol ver el col orante y fi l trar.

IV. TINCION PARA FLAGELOS. (Mtodo de Lei fson)

Col orante de Lei fson*.

Di sol uci n acuosa saturada de Al K(SO
4
)
2
12H
2
0
Al NH
4
(SO
4
)
2
12H
2
O.................................................. 20 mL
Di sol uci n acuosa al 20% de Aci do tni co................. 10 mL
Agua desti l ada....................................................... . 40 mL
Al cohol et l i co al 95%.............................................. 15 mL
Di sol uci n saturada en al cohol et l i co al 95% de fucsi na bsi ca 3 mL

Preparaci n:
Mezcl ar l os i ngredi entes en el orden ci tado.
Guardar en un frasco bi en tapado.

* Se encuentra en el comerci o en forma de pol vo.
35

V. TINCION DE FLAGELOS. (Al ternati va)

Sol uci n A: Sol uci n B: Sol uci n C:
Fucsi na bsi ca.... 1.2 g
Etanol (95%)..... 100 mL
Aci do tni co....... 3 g
Agua desti l ada... 100 mL
Cl oruro de sodi o.....1.5 g
Agua desti l ada....100 mL
Preparaci n:
Di sol ver el col orante.
Fi l trar y tapar
perfectamente para
evi tar l a evaporaci n.
Preparaci n:
Di sol ver el reacti vo.
Si l a mezcl a no se usa
pronto adi ci onar fenol al
0.2% para preveni r el
desarrol l o de hongos.
Preparaci n:
Di sol ver el reacti vo.
Esta sol uci n es establ e a
temperatura ambi ente.

Preparaci n:

Mezcl ar canti dades i gual es de l as sol uci ones A, B y C.
Guardar en frasco de vi dri o y mantener bi en tapado.

NOTA: La sol uci n es establ e por 5 semanas a temperatura ambi ente y en
refri geraci n dura vari os meses.

Col orante de contraste.

p-rosa ani l i na o azul de meti l eno................... 1 g
Agua desti l ada........................................... 100 mL

Preparaci n:
Di sol ver el col orante en el agua.

VI. LACTOFENOL AZUL DE ALGODON.

Agua desti l ada................... 20 mL
Cri stal es de fenol Q. P........20 g
ci do l cti co......................20 mL
Gl i ceri na........................ 20 mL
Azul de al godn................... 0.05 g
Preparaci n:
Di sol ver el fenol en el agua.
Agregar el ci do y l a gl i ceri na.
Cal entar a 70 C.
Adi ci onar el col orante.
Guardar en frasco de vi dri o.

Bibliografa:

http://es.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADfuga
http://es.wikipedia.org/wiki/Incubadora
Gustavo A. Daz Martn. 2 008. Tcnicas de observacin de microorganismos. 8 p.
Microbiologa aplicada. Manual de Laboratorio
Gema Martnez Peral. 2 004. Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgicos. 33 p.
Sanz, J. L. 2 003. Microbiologa Ambiental. UAM. 4 p.

U1 Microbiologia 12

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