Universidade Estadual do Rio Grande do Sul - UERGS

Unidade Bento Gonalves Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Recuperao e Purificao de Bioprodutos I Professor: Francine Fioravanso Tramontina Aluno: Monichara Marinello

Rompimento celular
necessria a quebra celular para produtos como enzimas e produtos recombinantes intracelulares. A forma de realizar o rompimento celular depende do tipo de microrganismos empregado e ocorre aps a etapa de separao e lavagem das clulas obtidas ao final do cultivo. Os critrios para a seleo da tcnica empregada deve considerar fatores como o tamanho da clula, tolerncia e tenses de cisalhamento, necessidade de controle de temperatura, tempo de operao, rendimento do processo, gasto de energia, custo e capital de investimento. Clulas envolvidas s por membranas celulares so frgeis e facilmente rompidas sob baixas tenses de cisalhamento ou por simples variao da presso osmtica do meio, adio de detergentes ou aplicao de ultra-som de baixa intensidade e requerem pouca energia para sua realizao. Uma simples operao de bombeamento nessas clulas pode provocar perda da molcula alvo e isso se tornaria um problema no processamento do meio. Por outro lado, clulas com estruturas de parede robusta so de difcil rompimento. Aps o rompimento celular obtm-se homogeneizado celular constitudo por molculaalvo, biomolculas contaminantes e fragmentos celulares. Os compostos indesejveis devem ser removidos por processos de filtrao, centrifugao, precipitao ou extrao lquido-lquido. Os principais mtodos de rompimento celular so divididos em mecnicos, no-mecnicos, qumicos e enzimticos. Onde os mecnicos so subdivididos em homogeneizador de alta presso, moinho de bolas, prensa francesa e ultra-som. Os no-mecnicos so o choque osmtico, congelamento ou descongelamento, aquecimento e secagem. Os qumicos so divididos em lcalis, solventes, detergentes e cidos. E os mtodos enzimticos possuem lise enzimtica ou inibio da sntese da parede celular. Rompimento mecnico: No rompimento mecnico o homogeneizador a alta presso o mtodo mais utilizado para a quebra celular e adaptado das indstrias de laticnios. Esse tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio. O calor gerado no processo pode aumentar a temperatura da suspenso em 1,5C para cada 1000psi na presso de operao.

O homogeneizador constitudo por pistes projetados para aplicar altas presses, forando a passagem da suspenso celular por um orifcio estreito seguido de coliso contra uma superfcie rgida e imvel em uma cmara presso atmosfrica, ou coliso contra um segundo fluxo sob presso elevada. A reduo instantnea da presso associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomolculas. O rompimento das clulas ocorre de acordo com fatores que atuam simultaneamente sobre as clulas, como cavitao, turbulncia e cisalhamento. Os seguintes fatores afetam o desempenho de um homogeneizador: presso de operao, velocidade de alimentao, temperatura, estado fisiolgico do microrganismo, condies de cultivo, tipo de clula e sua concentrao. A quantidade de clulas rompidas proporcional presso na alimentao. O homogeneizador a alta presso possibilita a recirculao do material, o que melhora a eficincia do rompimento. Esse procedimento apresenta as seguintes desvantagens: elevao do custo do processo, possibilidade e degradao a molcula-alvo e gerao de fragmentos celulares muito pequenos. O moinho de bolas utilizado para romper clulas microbianas, fungos filamentosos e microalgas. O moinho de bolas constitudo por uma cmara cilndrica fechada, horizontal ou vertical, um sistema de refrigerao e um eixo que gira em alta rotao. Nessa cmara so adicionadas esferas de vidro e clulas em suspenso. Ao longo do eixo de rotao esto distribudos um ou mais discos ou hastes que giram em alta velocidade e provocam atrito entre as esferas e as clulas intactas e causam rompimento celular. O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas. As condies de rompimento nesse equipamento so facilmente controlveis e a eficincia do processo depende da geometria da cmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga de esferas e da concentrao celular, da velocidade de alimentao e da temperatura. As cmaras horizontais so mais eficientes porque comportam maiores cargas de esferas e abrigam mais esferas de dimetros reduzidos. Nas cmaras verticais a vazo de fluido na direo ascendente e ocorre a fluidizao das esferas. As esferas devem ocupar entre 80 e 85% do volume da cmara horizontal e entre 50 e 60% se a cmara for vertical. A velocidade do agitador influencia o nmero de contatos entre as clulas e as esferas e quanto maior a velocidade e rotao, mais rpido o rompimento celular. O tipo de agitador tambm influencia a eficincia de rompimento. Os agitadores podem estar dispostos no eixo central ou fora ele, perpendicular ou obliquo. Para auxiliar na agitao eles podem conter sulcos, pequenos cortes ou furos. O material mais utilizado nas esferas o vidro, mas tambm so usados materiais como o ao, o inox e a cermica. Quanto menor o dimetro da esfera, mais eficiente o rompimento.

A frao de clulas rompidas diminui com o aumento do fluxo de alimentao do moinho, pois diminui o tempo de residncia no rompedor. O fluxo timo de alimentao depende da velocidade do agitador, da carga de esferas, da geometria do equipamento e das propriedades do microrganismo. As temperaturas de operao em processos de rompimento celular devem ser controladas para prevenir a destruio da biomolcula-alvo. Neste processo liberada grande quantidade de calor. Na ampliao de escala do rompimento com moinho de bolas devem se manter constantes os seguintes parmetros: tamanho das esferas, proporo em volume entre a suspenso celular e as esferas de vidro e velocidade de rotao do eixo ou velocidade perifrica das ps do agitador. O rompimento celular por ultra-som o mtodo mais utilizado em escala de laboratrio e ocorre quando ondas sonoras, com freqncia da ordem de 20 kHz, so convertidas em vibraes em um meio liquido e causam o fenmeno de cavitao. Essas vibraes formam bolhas muito pequenas que entram em colapso que geram ondas de choque que circulam pelo meio liquido e resultam em impacto e aumento da tenso de cisalhamento, com conseqente rompimento celular. O uso do ultra-som para o rompimento em larga escala invivel, pois necessrio utilizar grande quantidade de sondas dispostas em serie e instalar um eficiente sistema de refrigerao. Rompimento no-mecnico: O choque osmtico insuficiente para romper a clula integralmente, mas pode propiciar permeabilizao seletiva. Esse tipo de rompimento indicado para bactrias Gram-negativas. No rompimento por congelamento ou descongelamento h a formao intracelular de grandes cristais de gelo que podem perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou lesion-la a ponto de formar poros permeveis biomolcula-alvo. Os fatores de influencia nesse processo so o tipo e a idade da clula, temperatura e velocidade dos ciclos de congelamento/descongelamento. Este mtodo simples e indicado para o rompimento de patgenos, mas um processo demorado, de custo elevado e inadequado para biomolculas sensveis ao congelamento. No rompimento atravs da termlise a suspenso celular pode ser aquecida em banho termostatizado, com injeo de vapor direto, em tambor rotativo ou em spray-drier. Mtodo utilizado no rompimento de algas, fungos filamentosos, leveduras e bactrias destinadas produo de protena microbiana. Este mtodo gera fragmentos celulares com maiores dimenses e facilmente removveis por filtrao ou centrifugao. Rompimento qumico: Os lcalis mais utilizados so amnia e hidrxido de sdio, porque causam inativao de patgenos ou microrganismos geneticamente modificados durante o rompimento. A gerao de poluentes a principal desvantagem no uso de lcalis em rompimento celular.

Os detergentes tm a propriedade de dissociar protenas e lipoprotenas das paredes celulares, provocar a formao de poros e liberar a molcula-alvo. A eficincia do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentado por um pr-tratamento base de solventes orgnicos que iniciam e estimulam a autlise. Os solventes podem ser utilizados em desidratantes qumicos das clulas. Esse procedimento indicado s para biomolculas que no sejam desnaturadas na presena do solvente empregado. Rompimento enzimtico: O mtodo de lize enzimtica adequado para a recuperao de biomolculas sensveis tenso de cisalhamento ou presso de trabalho dos homogeneizadores. Os seguintes fatores devem ser considerados: presena de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima e resistncia tenso de cisalhamento. O mecanismo de rompimento baseado no fato de que a presso osmtica interna rompe a membrana, ou parte dela, ser removido por ao das enzimas, permitindo que o contedo intracelular seja liberado para o meio externo. As vantagens desse mecanismo so: fcil controle do pH e da temperatura do meio; baixo investimento de capital; alta especificidade para degradao da parede celular; e uso em associao com mtodos mecnicos. Preservao da biomolcula-alvo: Aps o rompimento, as protenas podem ser degradadas por proteases. essencial reduzir a temperatura e adicionar inibidores de proteases para reduzir seus efeitos deletrios.