EXTRACION Y CARACTERIZACION DE ADN DE LEVADURA

OBJETIVO: Aislar ADN de levadura y determinar algunas de sus caractersticas. FUNDAMENTO: Todos los tejidos contienen ADN, pero algunos no son muy buena fuente. La presencia de enzimas, protenas, polisacridos y de otros cidos nucleicos hacen que la extraccin de ADN en su forma nativa sea difcil. Basta solo con la ruptura qumica o enzimtica de un solo nucletido de cada 1.000 para suprimir la funcin y la estructura macromolecular.. Debido a que el ADN es una molcula muy grande su aislamiento en forma intacta y la separacin de protenas y polisacridos es muy difcil por lo cual, probablemente, lo que se obtenga en la practica sean solo fracciones de ADN con un considerable grado de impurezas. Un mtodo consistente en cuatro fases: 1) rotura de las clulas de levaduras 2) su homogenizacin en presencia de un detergente y gracias a la elevada fuerza inica del medio los iones que pueden precipitarlo son secuestrados por el EDTA. 3) Las protenas se desnaturalizan en gran proporcin por agitacin por cloroformo, formndose aglomerados de protenas y cloroformo por los extremos lipoflicos de aquellas que permiten la separacin de buena parte de las protenas en la interfase del sistema cloroformo: agua, lo que hace disminuir fuertemente el contenido del extracto del ADN; 4) este se precipita por adicin de etanol.

MATERIALES Y REACTIVOS Balanza analtica Centrfuga 10 g de levadura Mortero con su mango Bao mara metlico Erlenmeyer de 250 ml Termmetro Erlenmeyer de 125 ml Probeta de 50 ml Varilla de vidrio gruesa Arena lavada con cido y agua. solucin salina de EDTA: NaCl 0.1% en EDTA 0.1 M Solucin de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 25% perclorato de sodio o de potasio 6M Solucin de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1 (v/v) etanol absoluto o etanol 95% Molibdato de amonio 25% Cloruro estannoso 2% Reactivo de difenilamina. 0.8 g. en 100 ml de acido actico glacial. Aada 2 ml de H2SO4 concentrado. Reactivo de Shiff:

PROCEDIMIENTO Pese 5 g de levadura seca y 10 g de arena fina y depostelos en un mortero previamente enfriado en la nevera.( todas las operaciones subsiguientes realcelas en fri, a menos que se indique lo contrario). Macere fuertemente por lo menos 5 minutos, hasta dejar muy fina la levadura. Pase este slido a un erlenmeyer de 250 ml con tapa y adicione 30 ml de solucin salina de EDTA. Adicione ahora 2 ml de SDS al 25% y, en el bao de hielo, agite durante dos minutos. A continuacin caliente el conjunto durante 20 minutos, a 60 C, en un bao de agua, con agitacin suave. Enfre a temperatura ambiente y aada 5 ml de perclorato de sodio 6 M, agitando fuertemente para conseguir una distribucin rpida y uniforme. Adicione 40 ml de cloroformo, alcohol isoamlico (24:1) y agite durante 15 minutos. La emulsin resultante se centrifuga a 5000 rpm durante 10 minutos. Recoja con cuidado la fase superior acuosa sobrenadante con una pipeta Pasteur, cuidando de no arrastrar los precipitados de la interfase. Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 125 ml colocando en un bao de hielo y aada lentamente por las paredes del erlenmeyer 70 ml de etanol frio sobre la solucin procurando que no se mezcle demasiado con el liquido contenido en el matraz. A continuacin, con una varilla de vidrio gruesa y limpia se agita suavemente el conjunto: el ADN precipita en forma de fibras blanquecinas que se aprietan contra las paredes para que pierdan lquido. Este ovillo se disuelve en una mezcla de 3 ml de agua y 0.5 ml de solucin salina de EDTA, pudindose guardar congelado o utilizarse para las reacciones de identificacin del ADN. CARACTERIZACIN: Soluciones de cidos nucleicos Con el ADN obtenido prepare una solucin acuosa de cido nucleico al 1% aproximadamente. Con 10 ml de solucin es suficiente. Prueba de Fosfatos A 1 ml de la solucion de cido nucleico agregue 2 ml de molibdato de amonio y 1 ml de cloruro estannoso la aparicin de color azul indica la presencia del grupo fosfato Desoxipentosas A 1 ml de las solucin de cido nucleico adicione 2 ml de cido tricloroactico al 10% y caliente el conjunto en un bao mara durante unos 15 minutos. Agregue 6 ml del reactivo de difenilamina, agite bien y deje en un bao mara durante diez minutos. El desarrollo de un color azul indica la presencia de una 2-desoxipentosa. Reaccin de Feulgen-Shiff En un tubo de ensayo se coloca 2 ml del reactivo de Shiff (color azul) y se agrega 2 ml de hidrolizado y coloquela durante 5 minutos a bao mara. La solucin tomar un color violeta. Si la prueba es negativa, agrege un poco ms del hidrolizado (2 ml) RESULTADOS: Presente informe escrito sobre la obtencin de ADN y las pruebas de caracterizacin con sus reacciones.