TRABAJO PRCTICO N 6 Grupos sanguneos ABO y Rh: pruebas de Coombs

FUENTE: CTEDRA HE ATO!OG"A C!"N#CA UN!$ A% T#$#F#CAC#ON DE ANT#GENO& ABO EN HE AT#E&: $OR &ED# ENTAC#ON ETODO EN TUBO

a' $reparar una suspens()n de hema*es de grupo sanguneo des+ono+(do, a- . / en sa-(na 0res+a 123ase m4s aba5o e- apar*ado C. Preparacin de la suspensin globular al 2%'% b' Agregar una go*a de -a suspens()n g-obu-ar, a (gua- 2o-umen de suero an*(6A, an*(6 B, an*(6AB y p-asma AB norma- 1po-( o mono+-ona-es' en *ubos de 7ahn% +' &(mu-*4neamen*e +on*ro-ar +ada an*(suero +on*ra hema*es A8, B y O a- ./ d' #n+ubar 8 hora a *empera*ura amb(en*e o +en*r(0ugar 8 m(nu*o a 8999 rpm% e' !eer pr(mero -os +on*ro-es y -uego -os prob-emas m(+ros+)p(+amen*e en 2(sor y ma+ros+)p(+amen*e% 0' &+ores de -e+*ura: ::: un gran ag-u*(na*o :: 2ar(os ag-u*(na*os grandes : mu+hos ag-u*(na*os pe;ue<os pe;ue<os ag-u*(na*os, muy es+asos, 2(s(b-es a o5o desnudo 6 nega*(2o no se obser2an ag-u*(na*os B% T#$#F#CAC#ON DE ANT#CUER$O& ABO EN &UERO a' Tomar una mues*ra de suero -(bre de hema*es% b' En *ubos de 7ahn, agregar una go*a de suero a (gua- 2o-umen de suspens()n a- ./, de -os s(gu(en*es hema*es: 8' hema*es A +ono+(dos .' hema*es B +ono+(dos =' hema*es de- prop(o (nd(2(duo >' hema*es O +ono+(dos +' #n+ubar 8 hora a *a o +en*r(0ugar 8 m(nu*o a 8999 rpm% d' !eer pr(mero -os +on*ro-es y -uego -os prob-emas, m(+ros+)p(+amen*e en 2(sor y ma+ros+)p(+amen*e% C% $RE$ARAC#?N DE !A &U&$EN&#?N G!OBU!AR A! ./ a' &eparar -os hema*es de- p-asma y *ras2asar una por+()n de -os m(smos a un *ubo de 7ahn% b' !-enar e- *ubo +on so-u+()n 0(s(o-)g(+a a- 9%@A/ y +en*r(0ugar a 8999 rpm duran*e 8 m(nu*o% +' E-(m(nar e- sobrenadan*e y repe*(r -os -a2ados dos 2e+es m4s, *en(endo -a pre+au+()n de resuspender per0e+*amen*e e- +u-o* g-obu-ar an*es de +omp-e*ar e- agregado de so-u+()n 0(s(o-)g(+a% d' Tomar una go*a de +u-o* 1A9 -' y agregar-e 9,A m- de so-u+()n 0(s(o-)g(+a% &e *endr4 as -a suspens()n a- ./%

D% &UBAGRU$AC#ON DE! GRU$O A: a' b' +' d'

ETODO EN $!ACA

Co-o+ar una +an*(dad de sangre *o*a- (gua- a B de go*a% Agregar una go*a de an*(6A absorb(do8 y meC+-ar b(en +on una 2ar(--a de pun*a 0(na% A- *erm(nar de meC+-ar, d(sparar e- +ron)me*ro% Ro*ar -a p-a+a en 0orma +(r+u-ar y obser2ar -a apar(+()n de ag-u*(na+()n den*ro dem(nu*o%

!os s(gu(en*es +uadros resumen -os pos(b-es resu-*ados: G-)bu-os ro5os prob-ema An*( A : 6 6 : GR A 6 : : 6 An*( B 6 : 6 : GR B : 6 : 6 An*( AB : : 6 : GR AB : : : 6 Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB

&uero prob-ema

E% T#$#F#CAC#ON DE! FACTOR D DE! &#&TE A Rh a' Co-o;ue . go*as de suero an*(6D en un *ubo de 7ahn% b' Ad(+(one una go*a pe;ue<a de suspens()n de g-)bu-os o en su de0e+*o de sangre en*era de -a mues*ra% +' Ag(*e para meC+-ar -os rea+*(2os y +en*r(0ugue duran*e 8 m(nu*o a 8A99 rpm% d' Desprenda sua2emen*e e- +u-o* g-obu-ar y -ea% !a -e+*ura se har4 m(+ros+)p(+amen*e +on un 2(sor y ma+ros+)p(+amen*e% e' $ro+eda de -a m(sma manera +on -os *ubos +on*ro-es% E.1 Controles a' $rueba sobre -a bondad de- suero: sangre D pos(*(2a : an*(6D b' $rueba sobre -a (nespe+(0(+(dad respe+*o de an*(6D: sangre D nega*(2a : an*(6D +' Con*ro- de seudoag-u*(na+()n: mues*ras de sangre : p-asma de persona AB% E.2 Reacciones $os(*(2a: -os hema*es D1Rho' pos(*(2os permane+er4n ag-u*(nados a- ;uerer desprender e- +u-o* g-obu-ar% Nega*(2a: -os hema*es 1Rh6rh' se suspender4n nue2amen*e s(n e2(den+(ar ag-u*(na+()n%

Tamb(3n se puede u*(-(Car un mono+-ona- an*(6A8

F% $RUEBA $ARA DETECTAR Du Nun+a puede ser d(agnos*(+ada +omo nega*(2a -a sangre de un dador por o0re+er rea++(ones nega*(2as 0ren*e a sueros an*( DD% &(empre debe des+ar*arse -a pos(b(-(dad de es*ar en presen+(a de un (nd(2(duo Du% $ara e--o es ne+esar(o ap-(+ar -a prueba de Coombs% Co-o;ue dos go*as de suero an*( DD1Rho' en un *ubo de 7ahn.% Agregue 8 go*a de una suspens()n sangunea a- ./ en sa-(na% Ag(*e para meC+-ar -os rea+*(2os e (n+ube duran*e =9 m(nu*os a =EFC% !a2e -os hema*es = 2e+es +on abundan*e +an*(dad de &F 1o+upando +as( *odo e2o-umen de- *ubo'% Cen*r(0ugue y e-(m(ne e- sobrenadan*e% A' Agregue . go*as de- suero an*(g-obu-(na humana% G' Ag(*e para meC+-ar -os rea+*(2os y +en*r(0ugue (nmed(a*amen*e duran*e 8 m(nu*o a 8A99 rpm, desprenda sua2emen*e e- +u-o* g-obu-ar y -ea% !a -e+*ura se har4 ma+ro y m(+ros+)p(+amen*e% 8' .' =' >' F.1 Reacciones $os(*(2a: -os hema*es Du 1Rhou' pos(*(2os permane+er4n ag-u*(nados -uego de (n*en*ar desprender e- +u-o* g-obu-ar% Nega*(2a: -os hema*es Rh61rh' y Du 1Rhou' nega*(2os se resuspender4n y no ag-u*(nar4n%

F.2 Controles utiliza os &e u*(-(Can *res +on*ro-es para 8% $robar -a bondad de- suero .% Comprobar su espe+(0(+(dad =% $ara seudoag-u*(na+()n $ara e- pr(mer +on*ro- pos(*(2o deben emp-earse hema*es Rh pos(*(2os de dador +ono+(do OR8r 1CdeH+de'% Es a+onse5ab-e usar esos hema*es y e2(*ar emp-ear er(*ro+(*os D1Rho' pos(*(2os +on e- an*geno E1rhI' presen*e ,dado ;ue, en *a-es hema*es e- 0a+*or D1Rho' es mas rea+*(2o% E- +on*ro- nega*(2o +ons(s*e en e-(m(nar -a pos(b(-(dad de es*ar u*(-(Cando un suero ;ue +on*enga ag-u*(n(nas (nespe+0(+as para e- an*geno en +ues*()n 1por e5emp-o: an*(6A yHo an*(6B no absorb(dos duran*e -a prepara+()n de- suero'% Es*os dos pr(meros +on*ro-es s(r2en para demos*rar ;ue e- suero a emp-ear es espe+0(+o y no posee n(ngJn +on*am(nan*e ;ue pueda 0a-sear -os resu-*ados% E- *er+er +on*ro-, es de seudoag-u*(na+()n y para e--o se reemp-aCa e- suero an*( DD por suero de persona de grupo sanguneo AB, se -o en0ren*a +on -os hema*es ;ue es*4n s(endo *(p(0(+ados%

!a de*e++()n de Du *amb(3n se puede ha+er +on an*(+uerpo mono+-ona- an*(6Du%

G% CO $ROBAC#?N DE !A $RE&ENC#A DE ANT#CUER$O& #N UNE& ED#ANTE !A $RUEBA DE COO B&% !.1 Prue"a e Coo#"s in irecta 8' Co-o+ar en un *ubo de 7ahn . go*as de suero prob-ema y . go*as de suspens()n de hema*es de grupo O Rh: a- ./% Ag(*ar sua2emen*e . o = 2e+es duran*e e- perodo de (n+uba+()n de 8 hora a =E FC% $ro+eder de -a m(sma manera +on un *ubo +on*ro;ue +on*(ene . go*as de so-u+()n 0(s(o-)g(+a y . go*as de suspens()n de hema*es O Rh: a- ./% .' Cen*r(0ugar, ;u(*ar e- sobrenadan*e y -a2ar = 2e+es +on so-u+()n 0(s(o-)g(+a, e-(m(nando +omp-e*amen*e e- sobrenadan*e en e- J-*(mo -a2ado% =' $reparar o*ros +on*ro-es s(gu(endo -as (nd(+a+(ones de- apar*ado F%. >' !eer a- m(+ros+op(o an*es de- agregado de- suero an*(g-obu-(na humana% A' Agregar una go*a de suero an*(g-obu-(na humana% Cen*r(0ugar 8 m(nu*o a 8A99 rpm% !eer m(+ros+)p(+amen*e +on 2(sor y m(+ros+)p(+amen*e% !.2 Prue"a e Coo#"s irecta G' Co-o+ar en un *ubo de 7ahn . go*as de suspens()n a- ./ de hema*es prob-ema% $reparar un *ubo +on*ro- ;ue +on*enga . go*as de suspens()n de hema*es O Rh: sens(b(-(Cados a- ./% E' $reparar o*ros +on*ro-es s(gu(endo -as (nd(+a+(ones de- apar*ado F%. @' !eer a- m(+ros+op(o an*es de- agregado de- suero an*(g-obu-(na humana% K' Agregar una go*a de suero an*(g-obu-(na humana% Cen*r(0ugar 8 m(nu*o a 8A99 rpm% !eer m(+ros+)p(+amen*e +on 2(sor y m(+ros+)p(+amen*e%

Anti-A, Anti-B o Anti A,B

Monoclonal
Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos altamente reactivos en su superficie. Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional. Por este motivo, la tipificacin de los grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los dems ensayos pretransfusionales. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los casos, implica grupo O. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ratn. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS) - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS) - Alb mina Bo!ina "#$ de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a% R&col&cci'n: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. b% A(iti!o): pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c% E)tabili(a( & in)t*+ccion&) (& almac&nami&nto: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL RE,UERIDO (no provisto) - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placas - Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". PROCEDIMIENTO En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solucin fisiolgica, PBS o LISS. I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10% Co!o alternati"a puede e!plearse una suspensin al #$-%$% en plas!a del !is!o pa&iente o sangre entera 0 1' A una gota de (ea&ti"o Anti-A, Anti-B o Anti-A,B !ono&lonal &olo&ada en una pla&a li!pia, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos

)'

*e+&lar el (ea&ti"o , los glbulos &on un palillo des&artable &ubriendo un -rea &ir&ular de ) &! de di-!etro , balan&ear la pla&a &ontinua!ente durante ) !inutos .bser"ar aglutina&in "isible !i&ros&pi&a!ente /asta los ) !inutos No debe e!plearse !i&ros&opio

II- TECNICA EN T0B. 1por &entri2uga&in' 1' A una gota de (ea&ti"o Anti-A, Anti-B o Anti-A,B !ono&lonal &olo&ada en un tubo de /e!lisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al #-$% III- TECNICA EN T0B. 1por sedi!enta&in' 1' A una gota de (ea&ti"o Anti-A, Anti-B o Anti-A,B !ono&lonal &olo&ada en un tubo de /e!lisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al #-$% )' *e+&lar e in&ubar durante 30 !inutos a te!peratura a!biente #' Agitar el tubo para despegar las &4lulas , e5a!inar !a&ros&pi&a!ente la aglutina&in INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin positiva. Grupo sanguneo A B 0 AB Variants dbiles del grupo A como Ax Antisuero Anti-B + + -

Anti-A + + +/-

Anti-A,B + + + +

METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones dbiles pueden observarse en las siguientes situaciones: - Neonatos: los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin nacido. Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros. - Leucemias u otros desrdenes malignos. - Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idntico. - Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificacin de los grupos sanguneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos qumicos o con partculas de slica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. - Aglutininas fras: en presencia de aglutininas fras, el lavado de los glbulos rojos 4-6 veces con solucin fisiolgica, resulta generalmente suficiente para obtener clulas aptas para la tipificacin. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas clulas con 2 gotas de solucin fisiolgica. No debe producirse aglutinacin. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152). Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154). Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153). BIBLIOGRAFIA - Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use. Pars, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59. - Widman, F.K. Technical Manual. 9 th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

-i&n&* lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1076/89 (Anti-A) Disp. N: 1073/89 (Anti-B) Disp. N: 1071/89 (Anti-A,B)

Anti-6 1(/o'
monoclonal
Reactivo para la deteccin de antgeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea por transfusin o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemoltica del recin nacido. Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno D el que posee mayor importancia en la clnica despus del sistema ABO. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antgeno correspondiente, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO Anti-D /R0o%: solucin de anticuerpos monoclonales humanos. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - S+&*o Anti-0+mano /1oli&)1&c23ico% provisto separadamente por Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D /R0o%: listo para usar. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a% R&col&cci'n: obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes. b% A(iti!o): pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). c% S+)tancia) int&*3&*&nt&) conoci(a): los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situacin deber realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. (% E)tabili(a( & in)t*+ccion&) (& almac&nami&nto: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL RE,UERIDO (no provisto) Dependiendo de la tcnica que se emplee, podrn ser necesarios: - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placa de vidrio - Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. Tambin puede emplearse sangre entera. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

3)

Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de dimetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

II- TECNICA EN TUBO Preparar una suspensin de glbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autlogos, o en solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 4) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37 oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describi en 4). Las muestras que an en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antgeno Du. III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos rojos en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

3)
4) A' 6)

Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Lavar las clulas 3-4 veces con solucin fisiolgica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las clulas luego de cada lavado. Agregar 2 gotas de S+&*o Anti-0+mano /1oli&)1&c23ico% , mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos sensibilizados. Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 45-50 oC. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443155). BIBLIOGRAFIA - Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940. - Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959. - Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9, 1985. - Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pg. 178, 1975.

-i&n&* lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1074/89

7uero Anti-/u!ano
(poliespecfico)
Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o ndirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente haca referencia a antgenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en casi todos los grupos sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: P*+&ba Anti4lob+lina In(i*&cta - Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. - Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin. - Fenotipo de glbulos rojos. - Identificacin y titulacin de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. P*+&ba Anti4lob+lina Di*&cta - Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido. - Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin. - Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glbulos rojos. FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecfico) a glbulos rojos que estn cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinacin de los glbulos rojos visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO S+&*o Anti-0+mano /1oli&)1&c23ico%: suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. REACTIVOS NO PROVISTOS - Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos. De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS). - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS). INSTRUCCIONES PARA SU USO S+&*o Anti-0+mano /1oli&)1&c23ico%: listo para usar. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos a% R&col&cci'n: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. b% A(iti!o): pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c% E)tabili(a( & in)t*+ccion&) (& almac&nami&nto: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extraccin).

Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. MATERIAL RE,UERIDO (no provisto) - Centrfuga - Bao de agua a 37oC - Tubos de hemlisis PROCEDIMIENTO I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal). 1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar. 2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.

3)
4)

5) 6) 7)

Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del ltimo lavado. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm. Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles. Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados con IgG dbiles.

II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica). El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos. Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solucin una suspensin de glbulos rojos al 3%. 1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar. 2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS. 3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I). III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA 7e e!plea para de!ostrar la absor&in 8in "i"o9 de Ig: ,;o 2ra&&iones del &o!ple!ento en la super2i&ie de los glbulos rojos 1) Preparar una suspensin de glbulos rojos a probar en PBS al 3%. 2) En un tubo de hemlisis colocar 1 gota de esta suspensin y continuar con los pasos 4) a 7) de la tcnica I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: - Contaminacin qumica o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. - Lavado inadecuado de las clulas. - Tiempo o temperatura de incubacin inadecuados. - Tiempo o velocidad de centrifugacin inadecuados. - Concentracin inadecuada de glbulos rojos. - Agitacin excesiva para despegar los glbulos rojos aglutinados. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443156). BIBLIOGRAFIA - Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945. - Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945. - Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pg. 376, 1985.

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2000 Rosario - Argentina
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 2503/91

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A% T#TU!AC#?N DE ANT#CUER$O& A.1 T$cnica "%sica e titulaci&n A%8%8% $repara+()n de d(-u+(ones madres% a' Co-o+ar en una grad(--a 89 *ubos de 7ahn numerados de- 8 a- 89 1e- nJmero de *ubos puede aumen*arse o d(sm(nu(rse s( 0uera ne+esar(o'% b' En -os *ubos . a- 89, +o-o+ar 9,899 m- de so-u+()n 0(s(o-)g(+a 1&F'% Co-o+ar 9,=99 m- de suero a *(*u-ar en e- *ubo NF8% +' Tomar 9,899 m- de suero de- *ubo 8 y *rans2asar-o a- *ubo NF.% d' Homogene(Car -a meC+-a de suero y &F +on -a m(sma p(pe*a% !uego se *oman 9,899 m- de -a m(sma y se *ras2asan a- *ubo de 7ahn NF=% Homogene(Car y repe*(r -a opera+()n has*a +omp-e*ar -as d(-u+(ones% A%8%. T(*u-a+()n a' &e *oman 89 *ubos de 7ahn, numerados de- 8 a- 89 y se d(sponen en una grad(--a% Con una p(pe*a $as*eur para +ada d(-u+()n, +o-o+ar . go*as de -as m(smas en -os +orrespond(en*es *ubos% b' Ad(+(onar +on p(pe*a $as*eur . go*as de suspens()n de hema*es a- ./% Ag(*ar -a meC+-a% +' #n+ubar a -a *empera*ura aprop(ada , e- *(empo re;uer(do% d' &(mu-*4neamen*e se --e2an a +abo +on*ro-es de au*oag-u*(na+()n y de espe+(0(+(dad de- suero% e' !eer -os resu-*ados ma+ro y m(+ros+)p(+amen*e +omenCando por -os +on*ro-es y -uego por e- *ubo de mayor d(-u+()n% E- grado de ag-u*(na+()n se +ons(derar4 segJn -os s+ores an*er(ormen*e (nd(+ados% E- **u-o es -a re+pro+a de -a d(-u+()n m4s a-*a donde se obser2a ag-u*(na+()n % &( en -a J-*(ma d(-u+()n, +on ag-u*(na+()n, e- *(po de ag-u*(na*o es *r, e- **u-o se de*erm(nar4 promed(ando d(+ha d(-u+()n +on -a pre+eden*e% $or e5emp-o, s( en e- *ubo NF A +uya d(-u+()n es 8H8G, e- *(po de ag-u*(na*o es *r, e- **u-o ser4 18G:@'H.L8.% a' Con*ro- de au*oag-u*(na+()n: +ons(s*e en en0ren*ar dos go*as de suspens()n de hema*es a usarse +on dos go*as de- suero de- dador de hema*es% b' Con*ro- de espe+(0(+(dad de- suero: +ons(s*e en en0ren*ar dos go*as de hema*es O +on dos go*as de- suero a *(*u-ar%