PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR COLESTEROL EN ALIMENTOS. MTODO POR CROMATOGRAFA GASEOSA AOAC 994.

10 MODIFICADO Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin 1. OBJETIVO

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Determinar el contenido de colesterol presente en alimentos, cuya formulacin deriva de productos o subproductos de origen animal. 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

El mtodo es aplicable a alimentos slidos y lquidos que contengan en su composicin materia de origen animal. 3. FUNDAMENTO

El mtodo consiste en una saponificacin directa a la muestra seguido de una extraccin del colesterol contenido en la fraccin insaponificable. El extracto es analizado por GC-FID para determinar el contenido de colesterol, utilizando un estndar interno. 4. 4.1 REFERENCIAS AOAC Official Method 994.10. Cholesterol in Foods. Direct Saponificactin-Gas Chromatographic Method. Cp. 45, pg. 100. AOAC Official Methods Of Analysis 18 Ed., 2005. TERMINOLOGA GC-FID: Cromatografa Gaseosa con deteccin de Ionizacin de Llama. ISTD: Estndar interno.

5. 5.1 5.2

6. 6.1 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS Materiales Tubos de centrifuga con tapa de 50 mL. Micropipetas de 200, 1000 y 5000 L. Propipetas de volumen variable. Pipetas totales de 20 mL. Esptulas, gradillas y material bsico de laboratorio.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR COLESTEROL EN ALIMENTOS. MTODO POR CROMATOGRAFA GASEOSA AOAC 994.10 MODIFICADO Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin 6.1.6 6.1.7 6.1.8 6.1.9 Matraz Erlenmeyer de 100 mL. Piseta.

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Elementos de seguridad como guantes, antiparras, mascarilla u otro que se considere pertinente. Columna capilar Agilent Technologies HP-5 (5% de fenil-metilsilicona) 30m x 0,32mm con film de 0,5m. Puede utilizarse una columna capilar de resolucin similar. Recipientes para desecho. Viales para automuestreador mbar de 1,5 a 2 mL con septa de tefln.

6.1.10 6.1.11 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 6.2.9 6.2.10 6.2.11 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3

Equipos Estacin de cromatografa gaseosa con al menos detector FID e idealmente un automuestreador. Balanza analtica con precisin de 0,0001 g. Balanza semianaltica con precisin de 0,001 g. Centrifuga con rotor para tubos de 50 mL (idealmente criocentrfuga). Bao termorregulado con capacidad de mantener temperaturas de 80C. Sistema de concentracin por gas Nitrgeno. Agitador orbital. Rotatubos (Multivortex). Bao de ultrasonido con temperatura regulable. Termmetro de inmersin. Temporizador.

Reactivos Agua redestilada o desionizada M*cm). Gas Nitrgeno ultrapuro. conductividad < 0,055 S/cm (resistividad 18

Gas Hidrgeno, Aire y Helio ultra puro.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR COLESTEROL EN ALIMENTOS. MTODO POR CROMATOGRAFA GASEOSA AOAC 994.10 MODIFICADO Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin 6.3.4 6.3.5 6.3.6 6.3.7 6.3.8 n-Hexano p.a. Etanol p.a.

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KOH al 50%: para 100 mL pesar 50 g de KOH en granallas p.a. al 85% y disolver con agua desionizada hasta su total disolucin. NaCl al 3%: para 100 mL pesar 3 g de NaCl p.a. y disolver con agua desionizada hasta el aforo, agitando hasta total disolucin. Solucin estndar de colesterol (solucin madre de 2 mg/mL): pesar 200 mg de colesterol (99,9% de pureza) en pesa substancias y transferir el contenido a un matraz Erlenmeyer de 100mL, lavando con n-Hexano y llenando hasta el aforo. Mezclar bien. Mantenga idealmente a 4C. La duracin estimada de la solucin es de un mes. Solucin estndar (ISTD) de 5-colestano (solucin madre de 2 mg/mL): pesar 200 mg de 5-colestano ( 97,0% de pureza) en pesa substancias y transferir el contenido a un matraz Erlenmeyer de 100mL, lavando con n-Hexano y llenando hasta el aforo. Mezclar bien. Mantenga idealmente a 4C. La duracin estimada de la solucin es de un mes. DESARROLLO Saponificacin directa de la muestra. Pesar con precisin de 0,1 mg 2 0.3 g de muestra en un tubo de centrifuga de 50 mL con tapa rosca. Adicionar 500 L de la solucin de ISTD 2 mg/mL. Adicionar 3 mL de la solucin de KOH al 50%. Adicionar 15 mL de Etanol p.a. Tapar bien y colocar sus viales en una gradilla. Llevar la gradilla a sonicar por 15 minutos o hasta notar total disgregacin de la materia. Luego llevar a un bao termorregulado de agua a 80C por 15 minutos (no tome los tubos, siempre tome solo la gradilla). Alternativamente, si cuenta con un bao de sonicacin termorregulado, puede colocar los tubos en el bao de sonicacin por 30 minutos a 80 C. Igualmente, solo manipule la gradilla con los tubos, y no cada tubo individualmente. Retirar del bao la gradilla con los tubos y dejar enfriar a temperatura ambiente. Nota: no lo enfri por corriente de aire, sino el tubo se deformara y corre el riesgo de perder. Una vez fro centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos, idealmente a 4C. Abrir cuidadosamente la tapa y adicionar 10 mL de la solucin de NaCl al 3%.

6.3.9

7. 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 7.1.5 7.1.6

7.1.7 7.1.8 7.1.9

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR COLESTEROL EN ALIMENTOS. MTODO POR CROMATOGRAFA GASEOSA AOAC 994.10 MODIFICADO Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin 7.1.10 7.1.11 7.1.12 7.1.13 7.1.14 Adicionar 20 mL de n-Hexano. Sonicar por 10 minutos.

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Agitar en rotatubos por 10 minutos con una intensidad de al menos 1500 r.p.m. Alternativamente agitar 1 hora en agitador orbital de 200 rpm. Centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos, idealmente a 4C. Tomar una alcuota de 1 a 2 mL de la fase orgnica (fase superior) y dispensar a un vial con tapa de tefln cerrando hermticamente (NOTA: el vial debe mantenerse refrigerado a -20C hasta realizar el anlisis cromatogrfico). Si considera que es necesario guardar sus muestras por un tiempo ms prolongado, lleve la alcuota de fase orgnica a sequedad en un concentrador de nitrgeno, y resuspenda a igual volumen de la alcuota con n-hexano, sonicando de ser necesario por periodos breves, hasta obtener una disolucin homognea para su determinacin instrumental. Los parmetros cromatogrficos para la determinacin son los siguientes: - T detector: 300 C - T inyector: 250 C - Gas carrier: Helio - Flujo gas carrier: 2 mL - Split mode: Splitless - Volumen de inyeccin: 1 L. - Lavado de jeringa con acetona y n-Hexano, al menos 3 veces cada solvente, antes y despus de la inyeccin. - Programa de temperatura del horno: *Inicialmente a 190 C, mantener por 2 minutos. *Aumentar la temperatura a razn de 20 C por minuto hasta 230 C y mantener por 3 minutos. *Aumentar la temperatura a razn de 40 C por minuto hasta 255 C y mantener por 25 minutos. *Tiempo de post corrida de 0 minutos. *Tiempo total de corrida: 33 minutos. El ISTD debe ubicarse (idealmente) en su cromatograma a los 15,9 minutos, en tanto que el colesterol debe ubicarse a los 24,9 minutos. Debe verificarse siempre los tiempos de retencin con una dilucin del estndar antes de cualquier anlisis de muestra problema.

7.2 7.2.1

Determinacin de colesterol por GC-FID.

7.2.2

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7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.4 7.4.1

Aseguramiento de la calidad del ensayo Realizar las muestras al menos en duplicado. Realizar prueba de testigo de reactivo por cada batch de muestras. Realizar al menos un anlisis de una dilucin de estndar para verificar y/o ajustar tiempos de retencin. Realizar controles peridicos con material de referencia (carta control). Realizar curvas de calibrado para verificar linealidad (control de pendiente). Expresin de los Resultados. Realizar los clculos de acuerdo a la siguiente frmula:

Ci x d x c x m0 mg/100g de Colesterol = mn
Donde: C = concentracin en mg/mL entregada por el instrumento.. m0 = masa de muestra analizada. mn = 2 g = masa nominal de muestra utilizada para la metodologa. d = 20 = factor de dilucin. c = 50 = factor de conversin a mg/100g Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con un decimal. 7.4.2 Informar en mg/100g de colesterol en matriz.

8. 8.1

REGISTROS Registro de Anlisis Proximal en Alimentos

9.

ANEXOS

No Aplica