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TALLER 1.

REGULACIN DE LA TRANSCRIPCION

1. Menciones los circuitos bsicos de control Regulacin de la transcripcin se puede dividir en tres principales vas de influencia: Gentica [ Interaccin directa de un factor de control con el gen ] La modulacin [ Interaccin de un factor de control de la maquinaria de transcripcin] Epigenticas [ No secuencia de cambios en la estructura del ADN, que influyen en la transcripcin]

La interaccin directa con el ADN es el mtodo ms simple y directo de una protena puede cambiar los niveles de transcripcin y genes a menudo tienen varios sitios de unin a protenas en la regin de codificacin con la funcin especfica de regulacin de la transcripcin. Hay muchas clases de sitios de ADN normativo vinculante conocido como potenciadores, aisladores, los represores y los silenciadores. Los mecanismos para la regulacin de la transcripcin son muy variados, desde el bloqueo de sitios de unin fundamental en el ADN de la RNA polimerasa de actuar como un activador de la transcripcin y la promocin de la asistencia obligatoria de ARN polimerasa. La actividad de factores de transcripcin se ve modulada por seales intracelulares que causan las protenas modificaciones postraduccionales incluyendo acetilado fosforilados, o glicosilada. Estos cambios influyen en la capacidad de un factor de transcripcin para enlazar, directa o indirectamente, con el ADN promotor, para reclutar a la ARN polimerasa, o para favorecer el alargamiento de una molcula de ARN recin sintetizado. La membrana nuclear en eucariotas permite una mayor regulacin de factores de transcripcin por la duracin de su presencia en el ncleo, el cual est regulado por cambios reversibles en su estructura y por la unin de otras protenas. Estmulos ambientales o seales endocrinas pueden provocar la modificacin de las protenas reguladoras provocar cascadas de seales intracelulares, que resultan en la regulacin de la expresin gnica. Ms recientemente se ha hecho evidente que hay una gran influencia de los efectos no especficos de la secuencia de ADN en la traduccin. Estos efectos se conocen como epigentica e involucrar a la estructura de orden superior de ADN, la secuencia no protenas de unin al ADN especfica y la modificacin qumica del ADN. En general los efectos epigenticos alteran la accesibilidad de ADN a las protenas y as modular la transcripcin.

2. Como ocurre el metabolismo de la lactosa en E. coli? dibujo.

Explquelo en un

Figura 1. Estructura del opern lactosa

Se requieren dos enzimas para la metabolizacin de la lactosa, la lactosa permeasa, una enzima de membrana que permite el transporte de la lactosa al interior celular y la -Galactosidasa, que cataliza la ruptura del enlace -1,4 entre la galactosa y la glucosa. La lactosa se degrada mediante rutas catablicas para la obtencin de energa, pero si en el medio no hay lactosa estas dos enzimas no son necesarias. La expresin de estas dos enzimas es inducible por lactosa. Cul es el mecanismo de esta regulacin? El sistema de utilizacin de lactosa por E. coli consta de dos clases de componentes (Figura 2). Genes estructurales que codifican las enzimas galactosidadas (gen LacZ), permeasa (gen Lac Y) y transacetilasa que solo se utiliza en el metabolismo de ciertos -galactosidos diferetes de la lactosa (gen

LacA), necesarias para el transporte y degradacin de lactosa. Y genes reguladores, el gen Lac I, el promotor lac P y el operador Lac O y el sito CRP. Menos el Lac I, el resto de genes componen un solo mRNA policistrnico. una regin del DNA que denominamos opern lac. Adems, los genes estructurales estn codificados en

Figura 2. Estructura del opern Lac en E. Coli

El gen Lac I sintetiza una protena llamada represora o inhibidora que se une al operador Lac O de forma que cuando la RNA polimerasa se una al promotor no pueda continuar la transcripcin. De tal forma que el sistema se encuentra normalmente reprimido y las protenas necesarias para metabolizar la lactosa no se sintetizan (Figura 3a). En presencia de lactosa, un derivado de sta, la alolactosa, se une al represor cambindolo conformacionalmente y haciendo que no tenga afinidad por el operador (la alolactosa acta como inductor), cuando esto ocurre el operador queda libre y la RNA polimerasa puede realizar la transcripcin de los genes. Se trata, por tanto, de una regulacin negativa pues todas las rdenes reguladoras son de prohibicin (Figura 3b).

Figura 3. Regulacin de la transcripcin del opern Lac. (a) Ausencia de lactosa. (b) Presencia de lactosa.

No obstante, se observ adems que en presencia de lactosa y glucosa en el medio de cultivo no haba expresin de las protenas. Esto parece lgico porque si hay glucosa la bacteria no necesita recurrir a la degradacin de lactosa como fuente de carbono, de tal forma que la glucosa deba regular de algn modo el proceso. En que consiste la regulacin por glucosa? El efecto de la glucosa est mediado por el AMPc y una protena llamada protena receptora de cAMP (CRP) o protena activadora de catabolitos.

La protena CRP tiene sitios de unin para el ADN y para el AMPc. El complejo AMPc-CAP se une a una zona cercana al promotor lac, y favorece la unin de la ARN polimerasa al promotor, aumentando la transcripcin hasta 50 veces (Figura 4). Se ha demostrado que el AMPc y la CAP contribuyen a la iniciacin de la transcripcin, ayudando al reconocimiento del sitio de iniciacin por la ARN polimerasa.

Figura 4. Regulacin de la transcripcin del opern Lac. Presencia de lactosa y presencia de glucosa.

Los niveles de AMPc estn muy relacionados con la concentracin de glucosa, a altas concentraciones de glucosa los niveles de AMPc son bajos, lo que impide que ste se una a la protena CRP, de esta forma la ARN-Pol no puede colocarse en el promotor y se impide la transcripcin de los genes metabolizadores de lactosa. La funcin CRP-AMPc favorece la unin de la ARN polimerasa y acta como un efector o regulador positivo. El AMPc y la CRP estn implicados en la regulacin de muchos operones, especialmente los que codifican enzimas para el metabolismo de otros azucares. Una red de operones con un regulador comn se conoce con el nombre de reguln. De forma que se superponen dos regulaciones, la positiva por el efector glucosa y la negativa por el inductor lactosa que contrarresta el efecto inhibidor del represor sintetizado por Lac I. El opern solo se expresa en presencia de lactosa y ausencia de glucosa.

3. Cmo ocurre la represin catablica del opern lac: control positivo. Cuando la bacteria E. coli crece en un medio que contiene glucosa, prefiere este azcar como fuente de energa y como consecuencia los operones que ponen producen las enzimas necesarias para obtener energa de otros azcares estn bloqueados. Uno de los catabolitos del metabolismo de la glucosa acta sobre el AMP cclico (AMPc). El AMP cclico (AMPc) es necesario para la transcripcin de todos los operones que son inhibidos por el catabolismo de la glucosa. Es decir, para que se transcriban los genes del opern lactosa se necesitan niveles elevados de AMPc. Esto mismo sucede con los operones de arabinosa, maltosa, galactosa, etc. Se trata. por tanto de un sistema general de control positivo que se denomina represin catablica . Cuando E. coli crece en un medio con glucosa, los niveles de AMPc son muy bajos y como consecuencia no se transcriben los operones de otros azcares. An no se conoce el motivo por el que los niveles de AMPc son bajos cuando E. coli crece en un medio con glucosa como fuente de energa. Cuando E. coli crece en un medio sin glucosa pero con lactosa los niveles de AMPc son altos, el AMPc se une a la protena receptora de AMPc (CRP) activndola y la protena activada CRP-AMPc a su vez estimula la transcripcin de los genes estructurales del opern lactosa y de otros operones de azcares. La protena activadora por catabolitos (CAP) es un dmero que al unirse al AMPc se activa y estimula la transcripcin de los genes del opern lactosa, de manera que la protena activadora CAP-AMPc es necesaria para la unin de la ARN-polimerasa al promotor de los genes del opern lactosa. La protena activadora CAP-AMPc parece ser que se une a la regin promotora cerca del nucletido que ocupa la posicin -60 (60 nucletidos antes del comienzo del gen z). 4. Cmo ocurre el control positivo y negativo Los operones inducibles como los reprimibles pueden estar bajo control positivo negativo. Control positivo: La transcripcin no se produce hasta que la molcula reguladora estimule la produccin de RNA, es decir el producto del gen regulador activa la expresin de los genes, acta como un activador. Control Negativo: La expresin gentica se produce hasta que es desconectada por algn tipo de regulador el producto del gen regulador reprime o impide la expresin de los genes, acta como un represor.

En sntesis, podemos decir:

5. Explique el opern de la arabinosa, y como ocurre el control positivo y negativo. La arabinosa es un azcar de cinco de carbono que puede ser utilizado por E. coli como una fuente de carbono alternativa. Las enzimas necesarias para el metabolismo de la arabinosa son codificadas por el opern arabinosa. El opern arabinosa dispone de un complejo sistema de regulacin. Por lo tanto el opern arabinosa es tambin un opern inducible. En E. coli clulas en crecimiento en ausencia de arabinosa, las tres enzimas diferentes que intervienen en su metabolismo estn presentes en la clula en cantidades muy pequeas y no hay expresin del opern. Este es un mecanismo adaptativo que asegure que estas enzimas necesarias para catabolizar arabinosa slo se producen en cantidades suficientes cuando arabinosa est presente en el medio ambiente. El opern arabinosa tambin exhibe la represin catablica. Un complejo AMPc-CRP debe estar formado para que la expresin positiva del opern arabinosa a ocurrir. Los altos niveles de glucosa en el medio ambiente se reprimir el opern arabinosa debido a los bajos niveles de la molcula de AMPc. Esto es similar a las condiciones necesarias para la lactosa para ser utilizado como una fuente de carbono. El opern arabinosa slo expresar sus genes si arabinosa es la mejor fuente presente en el medio ambiente de carbono.

Funcionamiento de alto nivel del opern ara exige la presencia simultnea de dos indicadores de control positivo, la presencia de arabinosa como la mejor fuente de carbono y un gen funcional C. El Ara C gen es un gen intrigante que controla el opern ara tanto positiva como negativamente. Codifica una protena reguladora. Cuenta con tres sitios de unin, O1 , O2 y ara me . En la ausencia de arabinosa la protena reguladora se une simultneamente a la ara I y de O2 regiones haciendo que el opern se pliegue sobre s misma bloqueando de este modo la transcripcin de la ara B, los genes A y D. Sin embargo, cuando arabinosa est presente, se une a la Ara C y el producto del gen estimula la transcripcin de la estructural B, los genes A y D. Los cAMP-CRP actos complejos, promoviendo un reordenamiento del ara C gen cuando arabinosa est presente. En la reorganizacin, que reprime la transcripcin a un estado en el que se activa el promotor, PBAD del ara B , A y D genes. El Ara C gen tambin regula la expresin de su propio producto gnico. Por lo tanto, se trata de un autoregulator. Slo cuando los niveles de su producto gnico se convierten bajo, no la Ara C gen activar su promotor, PC y cdigo para su producto gnico, independientemente de los niveles de arabinosa presentes en el medio ambiente. Los genes estructurales B, A y D codifican enzimas para la catabolysis de arabinosa. El ara Un gen codifica para isomerasa que descompone a la Larabinosa ribulosa. El ara B gen codifica para su enzima, la quinasa que se descompone L-ribulosa a L-ribulosa-5-fosfato, que si se acumula, se convierte en txico para la clula. Esto slo puede ocurrir si hay una mutacin en el ara D gen de la prevencin de la ruptura an ms hacia abajo del sustrato. El Ara D genes entonces los cdigos para su producto gnico, epimerasa que se descompone Lribulosa-5-fosfato de D-xyulose-5-fosfato y este compuesto se subdivide a travs de una va glicoltica. 6. Explique la atenuacin La atenuacin es un mecanismo de control que se da en ciertos operones de rutas biosintticas (sobre todo de aminocidos), por el cual una onda de transcripcin recin iniciada puede terminar prematuramente en una zona denominada atenuador, antes de alcanzar al primer gen estructural de ese opern. A nivel de ADN, el atenuador est situado entre el promotor y el inicio del primer gen estructural, dentro de la porcin que a nivel de ARN representa al "lder". La atenuacin se produce por un control ejercido por la traduccin, que a su vez responde al nivel intracelular del ARNt cargado con el aminocido de la ruta biosinttica en cuestin:

Si existe suficiente nivel de ese aa-ARNt, habr atenuacin de la transcripcin; Si no existe suficiente de ese aa-ARNt, no habr atenuacin, y por lo tanto la transcripcin continuar hasta el final.

La presencia o ausencia del aa-ARNt concreto determina si el ribosoma puede traducir, o no, una zona temprana del ARNm (dentro de la porcin del lder): si el ribosoma puede traducir esa zona (porque existe nivel de ese aa-ARNt), el avance del ribosoma detrs de la ARN polimerasa impide ciertos emparejamientos intracatenarios dentro del ARNm naciente, pero permite otros emparejamientos alternativos de modo que se forma una estructura secundaria de tipo terminador simple (independiente de r ). Por lo tanto la ARN- polimerasa se atranca en esta horquilla y finalmente se separa, detenindose as la transcripcin antes de que la onda de transcripcin haya alcanzado al primer gen estructural. Mecanismo molecular de la atenuacin: Para el caso del opern triptfano (trp).

Si existe suficiente triptfano en el medio:

La bacteria capta triptfano, y sintetiza el triptofanil-ARNt (ARNttrp); habr "pool" suficiente de este ARNttrp como para poder ser usado normalmente en la sntesis de protenas. La ARN polimerasa va transcribiendo el opern trp, y detrs de ella los ribosomas comienzan a cubrir la zona del pptido dentro de lder del ARNm. Tras traducir la porcin 1 del lder, el ribosoma cubre enseguida y traduce la porcin 2. Mientras tanto, la ARN-polimerasa acaba de transcribir las porciones 3 y 4. La porcin 3 se empareja espontneamente con la 4. (Obsrvese que a la porcin 3 no le queda ms remedio, ya que la porcin 2, con la que tericamente tambin puede emparejarse no est disponible, ya que est "oculta" -cubierta- por el ribosoma). Consecuencia: al formarse la horquilla 3:4, seguida por la ristra de uracilos (U), se constituye un tpico terminador de transcripcin independiente de r : se termina prematuramente la transcripcin (antes de que la onda de transcripcin haya alcanzado al primer gen estructural,trpE): este es precisamente el fenmeno de atenuacin.

Si el triptfano es limitante en el medio:

La bacteria dispondr de pocos ARNt cargados on el aminocido triptfano (o sea, el "pool" intracelular de ARNttrp estar a bajos niveles). El ribosoma, al llegar a los codones de triptfano dentro de la porcin codificadora del lder, se quedar "atrancado", debido a que no encuentra el ARNt trp que introduzca el triptfano frente a dos codones seguidos para ese aminocido. El ribosoma se queda, pues, detenido en la porcin 1. Mientras tanto, la ARN polimerasa "le va sacando ventaja" al ribosoma, de modo que transcribe la porcin 2, luego

la porcin 3... pero antes de terminar con la porcin 4, la 2 y la 3 se emparejan entre s (de modo que es ahora la 4 la que se queda sin emparejarse). Esto implica que ya no se puede formar la estructura secundaria 3:4 seguida de varios U: por lo tanto, no hay terminacin de la transcripcin, sino que sta contina y abarca a todo el opern trp, y finalmente se sintetizan las enzimas biosintticas que conducirn a la sntesis del aminocido triptfano.

7. Por qu es importante la regulacin de los factores transcripcionales? Debido a que los factores de transcripcin son protenas que coordinan y regulan la expresin de un gen o de un grupo de genes podemos afirmar que los factores de transcripcin interaccionan con regiones especficas del ADN, con elementos de la maquinaria de transcripcin como la ARN polimerasa, con otros factores de transcripcin o con molculas que activan o inhiben su actividad. Conectan los estmulos externos e internos con las respuestas biolgicas actuando como transductores de seales. stos factores posibilitan el acoplamiento de la ARN polimerasa al promotor del gen en concreto y la sntesis del mensajero en una cantidad precisa. Todos estos aspectos se ven reflejados en lo que conocemos como diferenciacin celular, ya que sta depende de la expresin de un patrn especfico de genes. Sintetizando podramos decir que una fina regulacin de los factores de transcripcin es fundamental para el correcto funcionamiento de la maquinaria celular.