Comunicado 136

Tcnico

ELETROFORESE
BIDIMENSIONAL E ANLISE DE
PROTEOMAS



Thales Lima Rocha
1
Paulo Henrique Alves da Costa
2
Jos Cesamildo Cruz Magalhes
3
Raphael Garcia Souza Evaristo
4
rico Augusto Rosas de Vasconcelos
5
Marise Ventura Coutinho
6
Norma Santos Paes
7
Maria Cristina Mattar da Silva
8
Maria de Ftima Grossi-de-S
9


ISSN 9192-0099
Braslia, DF
Outubro, 2005

1

1
Pesquisador, Ph.D., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
2
Bolsista-FACUAL, MSc., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
3
Tcnico de Laboratrio, Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
4
Estudante/Graduao, Biologia, Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
5
Bolsista DTI/CNPq, MSc., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
6
Pesquisadora, MSc., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
7
Tcnico de Nvel Superior, MSc., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
8
Pesquisadora, Ph.D., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
9
Pesquisadora, Ph.D., Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
1- PROTEOMA

O proteoma reflete o estado atual
de funcionamento do sistema em
condies fisiolgicas especficas, ou
seja, a expresso funcional do genoma.
Esta caracterstica faz com que o
estudo do proteoma se torne um grande
desafio, pois a expresso gnica de
uma clula bastante dinmica,
dependendo do estado de
desenvolvimento, da presena de
ativadores ou inibidores e tambm das
condies do meio ambiente. Apesar
disso, a protemica a ferramenta mais
apropriada para se entender o
funcionamento dos genes, porque
analisa o produto final do genoma
(PANDEY e MANN, 2000).
Embora a identificao de todas
as protenas codificadas no genoma de
um organismo parea uma tarefa
bastante difcil de realizar, mesmo em
organismos mais simples, so cada vez
mais completas as informaes obtidas
atravs de estudos protemicos
(SURESH et al., 2005). Esses novos
conhecimentos esto relacionados s
vias de sinalizao celular, conjuntos de
protenas reguladoras, modificaes
ps-traducionais, bem como outras
informaes cruciais sobre os estados
fisiolgicos e fisiopatolgicos de clulas
e organismos.
O estudo da protemica em
questo pode levar a trs vertentes
bsicas, com implicaes diretas em
vrios campos da biologia e da
biotecnologia: (1) permite a descoberta
de vias metablicas nas diversas etapas
celulares, gerando um conhecimento
sem precedentes na biologia celular e
na bioqumica; (2) permite viabilizar a
identificao de novas molculas
bioativas em extratos biolgicos
naturais, levando ao desenvolvimento
de novos medicamentos; e (3) permite
tambm a identificao e caracterizao
de marcadores biolgicos, ou seja,
molculas endgenas ou exgenas
especficas de um determinado estado
patolgico. A capacidade de identificar
essas molculas extremamente til no
diagnstico precoce de doenas e no
acompanhamento da evoluo do
tratamento.
Atualmente, as principais
tcnicas usadas na protemica so a
eletroforese bidimensional (2D) e a
espectrometria de massa. Este
comunicado tcnico tem como objetivo
principal tornar mais acessveis os
procedimentos envolvidos na tcnica de
2D. Para tanto, uma descrio
detalhada dos protocolos
apresentada, a fim de que o usurio,
independentemente de sua experincia,
possa realizar essa tcnica sem
maiores dificuldades.

2- ELETROFORESE

A eletroforese uma tcnica de
separao baseada na migrao das
molculas carregadas, numa soluo,
em funo da aplicao de um campo
eltrico. A eletroforese de protenas foi
realizada pela primeira vez em 1937 por
Arne Tiselius, que idealizou um mtodo
denominado eletroforese livre, o qual
consistia na decomposio do soro
sangneo em cinco fraes proticas
principais, trabalho que lhe rendeu um
prmio Nobel. Nas ltimas dcadas,
essa tcnica tem sofrido
aperfeioamentos constantes,
possibilitando anlises mais precisas. O
mtodo mais utilizado hoje se denomina
eletroforese zonal, que utiliza uma
matriz slida, um gel de poliacrilamida.
A velocidade da migrao das protenas
neste suporte depende da fora do
campo aplicado, da carga, do tamanho
e da forma das molculas, da fora
inica, da viscosidade e temperatura do
meio.

2.1- Eletroforese Desnaturante em
Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

A eletroforese em gel de
poliacrilamida na presena de
dodecilssulfato de sdio (SDS) um
mtodo muito utilizado para a anlise de
massas moleculares de protenas
oligomricas. O gel uma matriz
constituda de um polmero de
acrilamida com ligaes cruzadas de N,
N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade
da malha pode ser escolhida. Quanto
maior a concentrao de acrilamida,
menores sero os poros da malha
formada. A soluo de acrilamida
estvel por at um ms. Quando
estocada por perodos prolongados,
transforma-se em cido acrlico, que
pode causar distores no gel.
importante frisar que a acrilamida
2
fotosensvel e neurotxica, devendo,
portanto, ser estocada em frasco escuro
e manuseada com o maior cuidado
possvel.
Antes de iniciar a eletroforese, as
variveis forma e carga nativa das
protenas devem ser eliminadas para
que a separao dependa apenas de
sua massa molecular. Para isso, as
protenas so misturadas com SDS, um
detergente anfiptico cuja funo
desnatur-las, ou seja, convert-las
numa estrutura linear a forma nativa
geralmente globular e conferir-lhes
densidade de carga uniforme. O SDS
tem alta carga negativa e uma cauda
hidrofbica que interage com as cadeias
polipeptdicas numa proporo
aproximada de 1,4 g de SDS para cada
grama de protena, tornando-as
negativamente carregadas. Na ausncia
do SDS, as protenas com massas
iguais podem migrar diferentemente na
malha do gel devido ao diferencial de
cargas de suas estruturas
tridimensionais. Alm da adio do
SDS, as protenas podem ser
opcionalmente fervidas na presena de
um agente redutor, como ditiotreitol
(DTT) ou 2-mercaptoetanol, que
desfazem as pontes dissulfetos,
ajudando a eliminar a estrutura
tridimensional dos polipeptdeos.
Aps esse tratamento, as
protenas so aplicadas no topo de um
gel de poliacrilamida e submetidas a
uma corrente eltrica, fazendo com que
elas migrem atravs da malha de
acrilamida em direo ao plo positivo.
Dependendo do seu tamanho, cada
protena se mover diferentemente: as
protenas menores migraro mais
rapidamente, enquanto que as maiores
tero mais dificuldade em atravessar a
malha do gel e, assim, se movero mais
lentamente. Quando se representa a
mobilidade eletrofortica frente ao
logaritmo dos pesos moleculares
conhecidos de diversas cadeias
polipeptdicas (protenas marcadoras),
obtm-se uma reta que pode ser
utilizada como padro para o clculo do
peso molecular das subunidades da
protena de interesse.

2.2- Eletroforese Bidimensional

A eletroforese bidimensional (2D)
foi inicialmente desenvolvida por
O'Farrel e Klose em 1975. A
metodologia original consistia na
preparao de gis cilndricos de
poliacrilamida, em que um gradiente de
pH era estabelecido por meio de uma
pr-corrida com anfteros especficos
(tambm chamados de anflitos), que
apresentam alta capacidade
tamponante em pHs prximos aos seus
pontos isoeltricos (pIs). As protenas
eram, ento, submetidas a uma
focalizao isoeltrica (IEF - Isoelectric
Focusing) e, posteriormente, a uma
eletroforese na presena de SDS, por
meio de um sistema convencional
descrito por Laemmli (1970). Dessa
forma, as protenas eram separadas na
primeira dimenso de acordo com seus
pIs (IEF) e na segunda dimenso em
funo de sua massa molecular (SDS-
PAGE).
Apesar de engenhosa, a
metodologia era muito trabalhosa,
demorada, difcil de ser reproduzida em
diferentes laboratrios e dependia da
habilidade do pesquisador para
obteno de resultados consistentes
(PANDEY e MANN, 2000). Atualmente,
muitos desses problemas foram
resolvidos com o desenvolvimento de
novas tecnologias. Um avano
importante que contribuiu para o
aumento da reprodutibilidade da
eletroforese 2D foi o desenvolvimento
dos gis em forma de tiras com
gradiente de pH imobilizado (IPG -
immobilized pH gel) (GRG et al.,
1985). As tiras so feitas pela co-
polimerizao da acrilamida com o
reagente Immobiline (Amershan
Biosciences/GE Heathcare), que
contm grupos tamponantes cidos e
bsicos. Outro avano importante foi o
3
aperfeioamento dos mtodos de
preparao de amostras proticas, os
quais consistem das seguintes etapas:
(1) a extrao, usando-se diferentes
tampes para amostras especficas; (2)
a precipitao, para concentrar as
protenas e eliminar as substncias
interferentes, e (3) a solubilizao
destas protenas. No que se refere s
duas ltimas etapas, a precipitao das
protenas a -20C com cido
tricloroactico (TCA) a 10% em acetona
(DAMERVAL et al., 1986), seguida pela
solubilizao das protenas em um meio
com altas concentraes de uria (8,0 -
9,5M) ou uma combinao de uria 5-
7M com tiouria 2M (RABILLOUD et al.,
1997), tem sido amplamente utilizada
para obteno de extratos proticos
totais, principalmente em tecidos
vegetais e microorganismos. Na
presena de altas concentraes de
uria, a tiouria adquire uma eficiente
ao caotrpica, aumentando, portanto,
a solubilidade das protenas de
membranas. Alm disso, a descoberta
de novos detergentes no inicos, tais
como os surfatantes CHAPS e SB 3-10,
usados juntamente com agentes
redutores adequados para a IEF, como
ditiotreitol (DTT) e tributilfosfina (TBP)
tm fortemente contribuido para a
solubilizao de um maior nmero de
protenas a serem separadas na
eletroforese 2D (HERBERT, 1999). A
partir da, a eletroforese 2D passou a
ser a principal tcnica de separao de
protenas utilizada antes da aplicao
da amostra no espectrmetro de massa.
Sua vantagem em relao a outras
tecnologias a capacidade de separar
com alta resoluo um grande nmero
de protenas de uma amostra complexa
e a possibilidade de se fazer anlises
de expresso gnica por meio da
comparao dos padres proticos.
Pelo exposto acima, conclui-se que a
eletroforese 2D uma tcnica
quantitativa e qualitativa.
Entretanto, h um consenso de
que no possvel a visualizao, num
nico gel, de todas as protinas
expressas num tecido complexo como o
de organismos pluricelulares
(HERBERT et al., 2001). Protenas com
pesos moleculares muito altos ou muito
baixos no so bem separadas nas
eletroforeses 2D. Protenas altamente
hidrofbicas e alcalinas tambm
necessitam de mtodos especficos de
preparao das amostras. Alm disso,
protenas com um pequeno nmero de
cpias dentro da clula, como as
protenas sinalizadoras, no so
reveladas pelos mtodos convencionais
de colorao, tais como nitrato de prata
e azul brilhante de coomassie. Com
base nestas dificuldades, algumas
estratgias para se indentificar um
maior nmero de protenas foram
propostas: o pr-fracionamento das
amostras por meio de extraes
seqenciais, o estudo do proteoma
organelar em fraes subcelulares, a
utilizao de tiras com faixas estreitas
de pH e a sobreposio destes, alm de
tcnicas de coloraes especficas
utilizando reagentes fluorescentes,
radioativos ou imunoqumicos (GRG
et al., 2000; HERBERT et al., 2001).
Embora seja conhecida desde os
anos 70, a eletroforese 2D s passou a
ter grande notoriedade na dcada de
1990, aps uma revoluo silenciosa da
qumica de protenas, com o surgimento
da protemica (WILKINS et al., 1997). O
termo proteoma foi proposto apenas em
1995 por Wilkins como sendo todo o
contedo de protenas expressas por
um genoma. Aps a euforia provocada
pelo seqenciamento dos genomas de
vrios organismos, a comunidade
cientfica percebeu que, para se
compreender a funo gnica em toda a
sua plenitude, era necessrio o estudo
em larga escala das protenas
expressas. Constatou-se que, embora
importante, a anlise das seqncias de
nucleotdeos nem sempre reflete uma
relao direta com os nveis de
protenas expressas e,
conseqentemente, de atividade
4
biolgica (GYGI et al., 1999). A razo
disso que o controle da expresso
gnica ocorre desde a transcrio do
mRNA at as modificaes ps-
traducionais como glicosilao,
fosforilao, acilao, hidroxilao,
carboxilao, ubiquitinao, entre
outras, as quais alteram a atividade
protica. Pelos motivos expostos, a
anlise protemica hoje um dos meios
mais eficientes para o estudo funcional
dos genes e genomas de organismos
complexos.

3- PROTOCOLO EXPERIMENTAL

A eletroforese bidimensional consiste
em cinco etapas principais:

1) Preparao da amostra
2) Primeira dimenso: focalizao
isoeltrica
3) Segunda dimenso: eletroforese
desnaturante em gel de poliacrilamida
4) Deteco das protenas
5) Digitalizao e anlise de imagem

3.1- Preparao da Amostra

O melhor mtodo de extrao,
precipitao e solubilizao das
protenas varia de uma amostra para
outra e deve ser estabelecido para cada
caso em particular (HERBERT, 1999).
Apesar disso, alguns passos essenciais
devem ser seguidos: as protenas
devem ser parcialmente purificadas,
completamente solubilizadas,
desagregadas, desnaturadas e
reduzidas.
O processo de solubilizao tem
como objetivos quebrar as interaes
macromoleculares (incluindo todas as
interaes no covalentes e as pontes
dissulfeto), prevenir modificaes nas
protenas e mant-las em soluo
durante a eletroforese da segunda
dimenso. Para o rompimento de
interaes no covalentes, so
utilizados agentes caotrpicos, como a
uria, que altera os parmetros do
solvente e exerce profundos efeitos
sobre todos os tipos de interaes no
covalentes. A tiouria um agente
caotrpico mais eficiente do que a uria,
mas pouco solvel em gua. A mistura
uria-tiouria tem sido muito utilizada,
pois mais eficiente do que a uria
sozinha (RABILLOUD et al., 1997).
O -mercaptoetanol foi o agente
redutor mais usado no princpio da
tcnica de 2D. Sua ao tamponante,
contudo, destri o gradiente de pH na
regio bsica das tiras de gel (strips).
Posteriormente, o DTT passou a ser
utilizado por ser mais eficiente e
apresentar melhores resultados
embora haja protenas com muita
cistena que no so totalmente
reduzidas com DTT. A tributilfosfina
(TBP) o mais potente agente redutor
disponvel no mercado atualmente.
voltil, txica e requer solvente orgnico
para dissolver em gua. Para romper as
interaes hidrofbicas, so usados
detergentes no-inicos ou
zwitterinicos (com carga lquida
neutra), como o Triton X-100 e, mais
recentemente, o CHAPS.
Nosso laboratrio vem obtendo
excelentes resultados na preparao de
amostras de razes de algodoeiro, uma
planta bastante recalcitrante, usando o
seguinte protocolo: (1) extrao com
tampo Tris-HCl 40mM, pH 7,0,
sacarose 250mM, Triton X-100 1%,
EDTA 10mM, DTT 1mM e PMSF 1mM;
(2) precipitao das protenas a -20C
com cido tricloroactico 10% em
acetona; (3) ressolubilizao em
soluo de uria 7M, tiouria 2M,
CHAPS 4%, IPG Buffer 2% e DTT
65mM (Figura 1).

5


Figura 1. Eletroforese bidimensional
das protenas de razes de algodoeiro
resistente a Meloidogyne incognita.

3.2- Primeira Dimenso: Focalizao
Isoeltrica (IEF):

O ponto isoeltrico (pI) de uma
protena corresponde ao valor de pH no
qual o somatrio de todas as suas
cargas parciais igual a zero. Esta
propriedade depende da fora inica, da
natureza do tampo usado e qualquer
outro soluto presente no meio, mas no
depende da concentrao da protena.
O ponto isoeltrico de uma protena
determinado por uma tcnica conhecida
como focalizao isoeltrica
(eletrofocalizao). Esta tcnica
consiste em uma separao
eletrofortica, na qual as protenas so
separadas de acordo com as diferenas
de seus pontos isoeltricos. Uma vez
submetidas a um campo eltrico, as
protenas migraro at encontrar uma
faixa de pH referente ao seu pI e neste
ponto ficaro com carga total neutra,
interrompendo a migrao no gel
(BERKELMAN e STENSTED, 1998).

3.2.1- Rehidratao das tiras de gel
(strips):

As tiras de IPG (immobilized pH
gel) so obtidas comercialmente na
forma desidratada com diversas faixas
de pH e tamanhos e devem ser
rehidratadas antes da focalizao
isoeltrica. As amostras podem ser
misturadas soluo de rehidratao
ou aplicadas sobre a tira usando o
acessrio denominado copo de
carregamento (sample cups). O primeiro
procedimento permite a aplicao de
uma maior quantidade de protenas
(~1mg), minimiza a precipitao durante
a entrada no gel, principalmente para
protenas de membrana, e evita a
manipulao exigida durante a
aplicao usando o segundo
procedimento.
Quando o sistema Multiphor II
utilizado para a IEF, as tiras de IPG
devem ser rehidratadas na bandeja de
rehidratao (DryStrip Reswelling Tray).
Nessa etapa, aplica-se a soluo de
rehidratao diretamente nas fendas da
bandeja, e ento se coloca as tiras com
a superfcie do gel virada para baixo.
Em seguida, aplica-se 2mL de leo
mineral (DryStrip Cover Fluid) em cada
fenda, para evitar a cristalizao da
uria. Usando-se o novo equipamento
da GE Healthcare, denominado
IPGphor II, possvel fazer a
rehidratao e, imediatamente, a
focalizao isoeltrica, evitando perda
de tempo e manipulaes
desnecessrias das tiras. O perodo
necessrio para a rehidratao das tiras
de, no mnimo, 10 horas e deve ser
realizada a temperatura ambiente.

Soluo de rehidratao (BERKELMAN
e STENSTED, 1998):
6


Reagentes Concentrao final
Uria* 8M
CHAPS 2%
Pharmalyte 3-10 ou IPG Buffer 3-
10
2%
Azul de bromofenol 0,002%
Dissolver em H
2
O milli-Q

Estocar a -20C em alquotas de 0,5mL.
Obs.: o DTT (7mg para cada 2.5mL)
deve ser adicionados no momento do
uso.

3.2.2- Focalizao Isoeltrica (IEF):

A focalizao isoeltrica feita
em temperatura constante de 20C no
sistema de eletroforese Multiphor II,
usando o Immobiline DryStrip Kit da
Amersham Bioscience/GE Healthcare.
A corrida realizada com a fonte de
eletroforese EPS 3501 XL, em trs
etapas:


Programa para o Multiphor II (tira de 18 cm; pH 3-10 linear)

Fase Voltagem Amperagem Potncia Tempo
1 300V 2mA 5W 0:01h
2 3500V 2mA 5W 1:30h
3 3500V 2mA 5W 5:00h

Programa para o IPGphor II (tira de 18 cm; pH 3-10 linear)

Fase Voltagem Volt/horas Tempo
Rehidratao - - 12h
1 500V 500 1:00h
2 1000V 1000 1:00h
3 8000V 16000 4:00h

A utilizao do sistema IPGphor II para
a IEF apresenta algumas vantagens: (1)
bandeja de rehidratao, fonte de
eletroforese e regulador de temperatura
integrados em um s sistema; (2)
reduo do tempo de focalizao; (3)
menor manipulao das tiras.

Obs.: O programa para IEF varia de
acordo com o tamanho da tira e a faixa
de variao de pH. Aps a focalizao,
as tiras podem ser congeladas a -80C
para posteriormente realizar a segunda
dimenso.

3.3- Segunda Dimenso: Eletroforese
Desnaturante em Gel de
Poliacrilamida

Como as bandas proticas
tendem a se sobrepor, os mtodos
unidimensionais de separao, como a
eletroforese em gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE), podem separar um
nmero relativamente pequeno de
protenas (geralmente menos de 50). A
eletroforese bidimensional, ao combinar
dois processos distintos de separao,
pode ser usada para separar mais de
1000 protenas em um nico gel. Na
primeira dimenso (IEF), as protenas
7
so separadas em funo das suas
cargas nativas (pI). Posteriormente, a
tira de gel mergulhada em uma
soluo de equilbrio contendo SDS e
depois colocada no topo de um gel de
poliacrilamida cuja espessura
geralmente de 1mm para a realizao
da eletroforese de segunda dimenso,
atravs da qual cada cadeia
polipeptdica migra em funo de sua
massa molecular. O resultado final
consiste em um gel com diversos discos
(spots) dispersos, cada um
correspondendo a uma protena
particular. O poder de separao to
grande que duas protenas que diferem
em apenas um aminocido carregado
podem ser prontamente distinguidas.

3.3.1- Reagentes e solues
estoques

a) Acrilamida-bisacrilamida (30:0,8):
29,2g de acrilamida e 0,8g de
bisacrilamida para 100mL de
soluo aquosa (H
2
O Milli-Q).
Filtrar em papel de filtro
Whatman n1 (0,45 m) e estocar
a 4C em frasco escuro por at
um ms.
b) Tampo Tris-HCl 1,5M pH 8,8
(gel de separao): 18,167g de
Tris + 48mL de HCl 1M, ajustar o
pH se necessrio, completar com
gua para 100mL. Filtrar em
papel de filtro Whatman n 1
(0,45 m). Estocar a 4C por at
trs meses.
c) SDS 10% (p/v): 10g de SDS em
100mL de gua. Estocar a
temperatura ambiente por at
seis meses.
d) TEMED 10%: 1mL de TEMED
em 10mL de H
2
O milli-Q; estvel
a 4C em frasco escuro.
e) Persulfato de Amnia 10% (p/v):
0,5g para 10mL de soluo
aquosa. Melhor usar soluo
fresca.
f) Tampo de corrida Tris 0,025M,
glicina 0,192M, SDS 0,1% (pH
8,3): Para uma soluo
concentrada (10X) - 30,3g de
Tris, 144,13g de glicina e 10g de
SDS em 1000mL de soluo
aquosa. Diluir 10 vezes na hora
de usar. Estocar a temperatura
ambiente por at um ms.


3.3.2- Preparao do gel 12,5% (SDS-PAGE):

Reagentes Volume
pipetado
Acrilamida-Bisacrilamida (30:0,8) 188mL
Tampo Tris-HCl pH 8,8 113mL
H
2
O milli-Q 117,5mL
Glicerol 22,5mL
SDS 10% 4,5mL
Persulfato de Amnio 10% 4,5mL
TEMED 10% 0,62mL

3.3.3- Equilbrio da tira (strip):

Aps a primeira dimenso (IEF) a
tira deve ser equilibrada por duas vezes
de 15 minutos antes de correr a
segunda dimenso (SDS-PAGE). O
primeiro equilbrio feito com DTT a 1%
e o segundo com iodoacetamida a
2,5%.


8
Soluo de equilbrio:

Reagentes Concentrao final
Tris-HCl 1,5M pH 8,8 50mM
Uria 6M
Glicerol (87%) 30%
SDS 2%
Azul de bromofenol 0,002%
Dissolver em H
2
O milli-Q

Estocar a -20C em alquotas de 5mL.
Adicionar o DTT e a iodoacetamida
apenas no momento de usar.

3.3.4- Corrida SDS-PAGE:

A tira de IPG deve ser colocada
no topo do gel e selada com agarose a
0,5%. A corrida da segunda dimenso
pode ser feita no sistema eletrofortico
Ettan Daltsix (Amersham
Biosciences/GE Healthcare) com
amperagem ou potncia constante em
baixa temperatura (10C) para evitar o
aquecimento. A corrida deve ser
interrompida quando o azul de
bromofenol atingir o final do gel.

Programa:

Fase Voltagem mxima Amperagem
mxima
Potncia/gel* Tempo
1 600V 400mA 5W 0:30h
2 600V 400mA 17W 4:00h

*Para mais de um gel multiplique a potencia pelo nmero de gis a serem corridos.


Soluo de agarose:

Reagentes Concentrao final
Agarose 0,5%
Azul de bromofenol 1% 0,002%
Dissolver em tampo de corrida

Aquecer a mistura at dissolver
completamente a agarose. Estocar a
4C em alquotas de 5mL.

3.4 - Deteco das Protenas

Um grande passo no uso da
eletroforese 2D ocorreu com o
progresso nas tcnicas analticas de
deteco e identificao. As protenas
separadas eletroforeticamente podem
ser visualizadas por mtodos gerais de
colorao, tais como azul brilhante de
coomassie, nitrato de prata,
fluorescncia ou autoradiografia, ou por
mtodos especficos como a colorao
de glicoprotenas ou deteco com
imunoqumicos.

Alguns fatores so importantes na
escolha do mtodo de colorao:

a) Faixa dinmica de deteco;
b) Linearidade;
c) Reprodutibilidade entre
experimentos;
d) Variabilidade inter protena;
9
e) Compatibilidade com mtodos de
identificao;

Aps a deteco das protenas, o
procedimento subseqente consiste em
identificar as macromoleculas de
interesse. Nas ltimas dcadas grandes
avanos foram obtidos na identificao
das protenas por meio do uso da
espectrometria de massa. As duas
principais tcnicas espectromtricas
para anlise de molculas biolgicas
grandes so: (1) a espectrometria de
massa com base na dessoro e
ionizao das protenas com laser,
auxiliado por uma matriz (MALDI -
Matrix-Assisted Laser Disorption
Ionization), que analisa a massa atravs
do tempo de vo dos ons no tubo de
anlise (ToF - Time of Flying); (2) e a
espectrometria de massa baseada na
ionizao por pulsos eltricos em meio
lquido (ESI - ElectroSpray Ionization).
A primeira tcnica analisa a
massa de fragmentos peptdicos obtidos
da digesto das protenas com uma
enzima proteoltica, como a tripsina. O
padro de massas obtido (peptides
mass fingerprint) comparado em
bancos de dados para a identificao
das protenas. Apesar de rpido e
prtico, este mtodo d apenas o grau
de similaridade dos padres de massas
de peptdeos entre protenas anotadas.
Portanto, fazem-se necessrios
mtodos complementares, a exemplo
do seqenciamento completo por meios
bioqumicos clssicos, tais como a
degradao de Edman, para uma
certificao mais acurada sobre a
identidade da protena. Por outro lado, a
espectrometria ESI analisa a massa dos
diversos fragmentos obtidos da coliso
dos polipeptdeos contra um gs inerte
como o argnio. A massa de todos os
fragmentos e a massa terica dos
resduos de aminocidos , ento,
utilizada num algoritmo computacional
para determinar a seqncia dos
resduos de aminocidos. Neste
aspecto a espectrometria ESI uma
ferramenta eficiente que pode substituir
o seqenciamento clssico.

3.5 - Digitalizao e Anlise de
Imagem

Com a sofisticao da
eletroforese 2D e o aumento da
sensibilidade dos mdotos de deteco
e identificao das protenas, tornou-se
uma tarefa muito laboriosa e pouco
confivel a anlise dos gis 2D apenas
por inspeo visual. Atualmente, esto
disponveis no mercado diversos
softwares que podem oferecer aos
pesquisadores um mtodo automtico,
prtico e estatisticamente seguro para
anlise comparativa dos gis 2D.
Os gis de eletroforese
bidimensionais corados com azul
brilhante de comassie ou nitrato de
prata so digitalizados com o auxlio de
um scanner especfico, como por
exemplo, o ImageScanner II, e
analisados com o ImageMaster 2D
Platinum v6.0 software da Amersham
Bioscence/GE Healthcare. Este sistema
permite a contagem do nmero de
spots, a caracterizao automtica dos
valores de pI e massa molecular, a
anlise dos nveis de expresso, assim
como diversos outros recursos para o
melhoramento da qualidade da imagem.

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Berlin: Springer-Verlag, 1997. 243 p.




















11
































Comunicado
Tcnico, 136






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