Sade & Ambiente em Revista, Duque de Caxias, v.2, n.2, p.
01-10, jul-dez 2007
PROTEOMICA - UMA ABORDAGEM FUNCIONAL DO ESTUDO DO GENOMA
Adriana Moreira da Silva e Silva 1 , Gustavo Coelho Corra 1 & Emerson Moreira Reis 1 'Universidade do Grande Rio - UNIGRANRIO
RESUMO O sequenciamento genmico e o conseqente conhecimento da sequncia completa de todos os genes so contribuies importantissimas para se estudar melhor os organismos vivos. Porem, estas inIormaes no so suIicientes para saber quais proteinas esto sendo realmente expressas na celula, num dado momento, numa determinada condio. A protemica e um novo campo de estudo e tecnologia que se prope a analisar de Iorma global o conjunto de proteinas expressas numa celula ou tecido, isto e, o proteoma. Devido a natureza dinmica do proteoma (ele se altera Irente a diIerentes condies e estimulos), seu estudo representa uma Iorma de procurar possiveis Iunes das proteinas e uma Iorma de investigar processos metabolicos em sistemas vivos para melhor entender o Iuncionamento de uma celula ou tecido a nivel molecular. Na era pos-genmica, o surgimento da protemica esta diretamente relacionado a necessidade de se investigar o controle da expresso gnica e seus impactos no metabolismo celular. Neste aspecto a protemica pode gerar inIormaes importantes como: quais proteinas so expressas; niveis de expresso destas proteinas; momento de expresso destas proteinas; modiIicaes pos-traducionais; respostas expressas pelas celulas em diIerentes situaes ou tratamentos, diIerenas moleculares entre linhagens de celulas e interao gnica. Os estudos de analise protemica vm complementar os dados de analise e sequenciamento de genomas, auxiliando na compreenso das redes de Iuncionamento e regulao celular, representando a ponte de ligao entre o genotipo e o Ienotipo de um organismo.
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ABSTRACT Genome sequencing is a very important contribution Ior better understanding liIe and diIIerent organisms. Genome sequencing is a Iield oI genomics and intends to determine the entire DNA sequence oI an organism. In the other hand, these DNA sequence data do not provide enough inIormation about the expression oI proteins in a cell at diIIerent conditions. Proteomics is the new technology proposed to evaluate the pool oI proteins (proteome) expressed in a speciIic tissue or cell. Proteome diIIers Irom cell to cell and constantly changes through its biochemical interactions with the genome and the environment. Proteome investigation represents a new way to understand metabolic processes and cell work. In the pos-genomic era, proteomics can generate important inIormation as: the kind oI expressed proteins, situation oI expression, protein modiIications aIter translation, diIIerent responses to environmental conditions and gene interaction. Proteomics associated with genomics can provide better understanding oI cell regulation and Iunctions. Proteomics is a link between genotypic inIormation and Ienotypic characteristics oI the organisms.
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INTRODUO Os estudos de sequenciamento de genoma, iniciados nos anos 90, desenvolveram-se rapidamente e atualmente encontram-se disponiveis as seqncias de genes de organismos inteiros, como plantas, animais e ate mesmo o genoma humano. Esta rapida e crescente disponibilizao de dados genmicos despertou grande interesse cientiIico, porem, o conhecimento acumulado com os sequenciamentos de genomas em diIerentes organismos demonstra que e preciso caminhar mais adiante (Hirano et al., 2004). Na era pos-genmica, tem Iicado evidente que apenas com seqncias completas de nucleotideos no DNA no e possivel elucidar muitos dos processos biologicos (Pandey & Mann, 2000). Adicionalmente as inIormaes obtidas pela analise do genoma, e preciso ter conhecimento, por exemplo, sobre quais proteinas esto realmente sendo expressas, quando e em quais niveis esta expresso ocorre e sobre as eventuais modiIicaes pos-transcricionais. O Iato de as celulas de um organismo ter o mesmo genoma, mas apresentarem as mais variadas Iunes e morIologias, Iruto de diIerentes composies de proteinas expressas, ilustra a importncia de estudar no so a seqncia dos genes, mas tambem a sua expresso para podermos compreender a suas Iunes biologicas. Desta Iorma, em paralelo a esta disponibilizao de dados genmicos, Ioram desenvolvidas outras tecnicas para o estudo do genoma Iuncional, como a analise dos transcritos de RNAm (analise de transcriptoma ou transcriptmica) e mais tarde de analise do conjunto de proteinas expressas a partir do genoma (analise de proteoma ou protemica) (Canovas et al., 2004).
O GENOMA E O FLUXO DA INFORMAO GENTICA O genoma e o conjunto de genes de uma especie, ou seja, todo o conjunto de DNA que ele carrega em suas celulas (Deloukas et al., 1998). A seqncia de nucleotideos destes genes determina a inIormao genetica, que precisa ser transcrita para um RNAm e traduzida em proteinas que iro realmente desempenhar as Iunes celulares que mantem os organismos vivos (Hahn 1998 e Ban et al., 1999) As proteinas so polimeros de aminoacidos que podem agir como enzimas, anticorpos, hormnios, componentes estruturais, receptores celulares etc. O termo proteina vem do grego proteios e signiIica a mais importante`. Todas as proteinas so resultados da expresso gnica em uma celula, isto e, o processo de transcrio do gene produzindo uma molecula de RNA mensageiro e o processo de traduo da inIormao genetica contida na seqncia de nucleotideos deste RNA em uma seqncia de aminoacidos que ira constituir a proteina (Ban et al., 1999). A este processo e que chamamos Iluxo da inIormao genetica (Figura 1).
ESTUDO DO GENOMA FUNCIONAL Os projetos genoma envolvem o sequenciamento dos conjuntos de genes de um organismo inteiro ou de parte dele, no revelando, porem dados sobre a expresso destes genes, a quantidade expressa e o Iuncionamento dos seus produtos. Para este tipo de estudo Ioram desenvolvidas as abordagens de avaliao do genoma Iuncional, como a transcriptmica e a protemica. A transcriptmica se baseia no estudo da expresso dos genes. Neste tipo de abordagem so analisadas somente as moleculas de RNA mensageiro (RNAm) produzidas em uma celula ou tecido a partir de seu genoma. Neste caso, podem- se obter inIormaes precisas sobre a regulao da transcrio. Porem, devido a mecanismos de regulao pos-traducionais, a quantidade de proteina expressa no e necessariamente proporcional a quantidade de seu RNAm correspondente (Anderson & Seilhamer, 1997), o que muitas vezes deixa duvidas quanto ao papel deste gene no metabolismo celular.
PROTEMICA O termo protemica Ioi inicialmente introduzido em 1995 e Ioi deIinido como sendo a
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caracterizao em larga escala do conjunto de proteinas expressas em uma celula ou tecido (Wilkins et al., 1997). A este conjunto de proteinas expressas em uma celula ou tecido, a partir do genoma, e que denominamos proteoma. O proteoma de um organismo reIlete o conjunto de proteinas expressas por este organismo em determinada situao e, ao contrario do genoma, no e estatico e pode se modiIicar dependendo das condies e estimulos a que este organismo esta exposto. Sendo assim, o proteoma reIlete a expresso das moleculas que inIluenciam mais diretamente a bioquimica e o Iuncionamento celular. O mesmo tipo de celula pode apresentar diIerentes proteomas em resposta a ao de drogas, inIeco por patogenos, poluio e diIerentes tipos de estresse abiotico. A protemica visa o estudo da estrutura, Iuno e o controle dos sistemas biologicos pela analise das varias propriedades das proteinas, incluindo tambem os estudos da seqncia (identidade), abundncia, atividade e estrutura das proteinas expressas por uma celula, assim como as modiIicaes, interaes e translocaes soIridas pelas proteinas (Williams & Hochstrasser, 1997).
FUNCIONALIDADE DA ANLISE PROTEMICA Os dados gerados por analise protemica permitem alcanar diIerentes objetivos, como: I - Esclarecer as proteinas envolvidas em rotas metabolicas relacionadas aos diIerentes processos celulares. II - IdentiIicar novos alvos Iarmacologicos e marcadores biologicos, relacionados ao processo de estabelecimento e progresso de doenas. III - IdentiIicao de moleculas bioativas a partir de extratos biologicos naturais, levando ao desenvolvimento de novos Iarmacos. IV - Caracterizao das respostas celulares a determinadas drogas, doenas e mudanas ambientais.
METODOLOGIA Embora o conceito de proteoma seja relativamente novo, este estudo utiliza tecnicas de separao de proteinas ja desenvolvidas a bastante tempo como a eletroIorese bidimensional (OFarrel, 1975). Porem seu uso em analise de proteomas era limitado devido a baixa reprodutibilidade dos geis e a inexistncia de metodos sensiveis o bastante para identiIicar as proteinas separadas. A eletroIorese consiste em separar, sob a inIluncia de um campo eletrico, moleculas que possuem cargas. A velocidade de migrao depende de Iatores como: tamanho, Iorma e carga eletrica da molecula em estudo. Na eletroIorese bidimensional, as proteinas so submetidas a duas etapas de separao eletroIoretica consecutivas, baseado nas diIerentes propriedades das proteinas. A primeira etapa de separao, denominada primeira dimenso, consiste em uma Iocalizao isoeletrica (IEF), onde as proteinas so separadas pela sua carga eletrica em um gel de poliacrilamida com um gradiente de pH (Figura 2). Nesta etapa as proteinas migram no gel ate atingirem uma posio estacionaria onde possuam carga liquida zero, sendo este, o ponto isoeletrico da proteina. Na segunda dimenso, as proteinas previamente separadas pela IEF so submetidas a uma eletroIorese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), onde so separadas de acordo com suas massas moleculares (Figura 3). Como os parmetros usados na primeira dimenso (ponto isoeletrico) e na segunda dimenso (massa molecular) so independentes, a separao atinge um alto nivel de resoluo, o que permite a visualizao de centenas de proteinas diIerentes ao mesmo tempo. Apos a eletroIorese bidimensional as proteinas so visualizadas diretamente no gel, atraves de metodos de colorao com azul de Comassie ou por colorao com prata, resultando num perIil bidimensional de pontos (denominados 'spots), cada um contendo multiplas copias de uma proteina (Figura 4). A identiIicao das proteinas presentes nos perIis de eletroIorese bidimensional e Ieita por espectrometria de massas (Figura 5). A espectrometria de massas e uma tecnica analitica de estudo de moleculas que se baseia no movimento de ions em campos eletricos e magneticos para classiIica-los de acordo com sua relao massa -carga, produzindo um espectro de massas. A espectrometria de massas ja e utilizada ha muitos anos para o estudo de moleculas inorgnicas, porem, somente na ultima decada esta tecnica Ioi aperIeioada para o estudo de moleculas biologicas (proteinas) sem que ocorra a destruio destas durante o processo de ionizao (Yates,
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1998). O aperIeioamento destas tecnicas de eletroIorese bidimensional e espectrometria de massas Ioi o que possibilitou o avano no estudo de proteinas em larga escala e o surgimento do conceito de analise de proteomas (Tyers & Mann, 2003).
CONCLUSO A crescente gerao de dados genmicos e o progresso tecnologico no estudo de proteinas, Iizeram com que a analise protemica se tornasse uma poderosa Ierramenta para estudos sobre a Iisiologia e a genetica de varios organismos vivos, inclusive as plantas (Rossignol et al., 2006). Na area medica varios estudos protemicos Ioram realizados na caracterizao do cncer (Saint-Guiron et al., 2007; Fontana et al., 2007), de doenas neurologicas como o mal de Alzheimer (German et al., 2007), inIecciosas e cardiacas (Poon et al., 2001). Outros estudos mostram a caracterizao de agentes inIecciosos, como Mycobacterium tuberculosis (tuberculose) (Ryoo et al., 2007), inclusive comparando o proteoma de cepas patognicas e no patognicas de microorganismos, o que pode auxiliar no desenvolvimento de metodos diagnosticos e de agentes teraputicos. Alem disso, a analise protemica tem sido utilizada na busca de novas moleculas bioativas em venenos de animais peonhentos ou em extratos naturais com propriedades teraputicas (Pimenta et al., 2001). Na area vegetal, os trabalhos de analise protemica tem trazido grandes contribuies, principalmente com relao a plantas economicamente interessantes como o milho, trigo, arroz, batata (Rossignol et al., 2006). Alguns trabalhos de analise protemica vegetal Iocalizam mais o estudo das proteinas produzidas por patogenos para estabelecer a inIeco na planta hospedeira, como o trabalho desenvolvido por Smolka et al. (2003), onde Ioram identiIicadas as principais proteinas expressas pela bacteria Xyllela fastidiosa durante o processo de inIeco de plantas de citrus. Outros trabalhos visam ao estudo das respostas das plantas as inIeces pelos patogenos. Neste tipo de abordagem, alguns estudos recentes utilizando a analise protemica tem apresentado dados novos e signiIicativos para o entendimento do processo de sinalizao que dispara a resposta de deIesa em plantas (Qureshi et al, 2007). Existem ainda trabalhos caracterizando o proteoma de plantas em resposta a stress (Nesatyy & Suter, 2007), outros estudos relacionando o proteoma expresso durante o desenvolvimento de plantas economicamente interessantes (Mechin et al., 2007) e outros ainda utilizando a protemica para estudos Iilogeneticos (Gutierrez et al., 2004). Todos os estudos nesta area de protemica vegetal vm contribuir de Iorma signiIicativa para uma melhor compreenso dos Iatores que atuam nas vias de sinalizao em plantas, no disparo da resposta de deIesa vegetal, contribuindo com inIormaes que podem levar ao desenvolvimento de novos produtos e tecnologias de controle de pragas e doenas, principalmente em culturas economicamente importantes. Estas inIormaes nos mostram que os estudos de analise protemica vm complementar os dados da transcriptmica e dos sequenciamentos de genoma, auxiliando na compreenso das redes de Iuncionamento celular e, desta Iorma, representando a ponte de ligao entre o genotipo e o Ienotipo de um organismo.
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Recebido em / Received: Agosto de 2007 Aceito em/ Accepted: Novembro de 2007
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Anexo - Figuras
DNA 5' ATG CAC GGG AGA // TTG AAC CCA AAA TCC 3' 3' TAC GTG CCC TCT // AAC TTG GGT TTT AGG 5'
RNAm 5' AUG CAC GGG AGA // UUG AAC CCA AAA UCC 3'
Protena Met His Gly Arg // Leu Asn Pro Lys Ser
Figura 1: Fluxo da inIormao genetica evidenciando os processos de transcrio, traduo e enovelamento proteico.
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Figura 2: Primeira dimenso isoeletroIocalizao (IEF) das proteinas. As proteinas so separadas em gel de poliacrilamida contendo um gradiente de pH. As proteinas migram atraves do gel ate atingirem uma posio estacionaria, onde possuam carga liquida zero, isto e, quando o pH do gel e igual ao ponto isoeletrico da proteina.
Figura 3: Segunda dimenso eletroIorese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE). As proteinas separadas pela IEF so submetidas ao SDS-PAGE, que permite a separao das proteinas de acordo com seus pesos moleculares.
(+) acido gradiente de pH (-) bsico pH estacionrio pI da protena Proteinas maiores Proteinas menores p pI I P Pe es so o m mo ol le ec cu ul la ar r ( (m mW W) )
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Figura 4: Segunda dimenso Ioto de uma eletroIorese bidimensional.
Figura 5: IdentiIicao em banco de dados cada um dos spots e removido do gel (recortado com bisturi) e submetido a espectrometria de massas por uma metodologia denominada peptide mass fingerprinting.
m mW W 14 21 31 45 66 97 mW ( kDa ) 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 4,1 pI mW pI Espectrometria de massas e peptide mass fingerprinting
Edital 11_2024 de Convocação para Comprovação de titulos (fase I) e Distribuição de Aulas e Contratação (fase II). Professor, Edital 30_2022 e 78_2023, dia 19_02_2024