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Validao de Mtodos Analticos: determinao do teor de acar numa amostra de produto alimentar.

Tnia Margarida Pereira Figueiredo

Tnia Margarida Pereira Figueiredo

VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS


Determinao do Teor de Acar numa amostra de produto alimentar

2012

Mestrado em Qumica

Departamento de Qumica

FCTUC

Tnia Margarida Pereira Figueiredo

VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS


Determinao do teor de acar numa amostra de produto alimentar.

Dissertao apresentada para provas de Mestrado em Qumica, rea de especializao em Controlo de Qualidade e Ambiente

Jorge Lus Gabriel F. S. Costa Pereira

Julho de 2012

Universidade de Coimbra

Agradecimentos
Ao longo do nosso processo de crescimento como pessoas, vamos deparando-nos com novas realidades at ento desconhecidas, preciso percorrer um longo caminho para atingir os nossos objectivos, mas tudo isto no seria possvel sem que haja interveno de todos aqueles que nos rodeiam. Este trabalho representa o fim de um ciclo e o incio de outro. No ciclo que agora se fecha, muitas foram as pessoas que, de uma forma ou de outra, contriburam para que esta caminhada fosse menos cansativa, com palavras de incentivo, com conversas e ideias que me ajudaram a ver a vida de uma forma diferente. A todas elas agradeo e dedico-lhes este trabalho. Ao Doutor Jorge Costa Pereira, por ter aceitado ser meu orientador e, desta forma, me ensinar a usar, de uma forma mais adequada e proveitosa, as ferramentas analticas que se encontram ao nosso dispor e que, nem sempre as usamos ou porque no sabemos que elas existem, ou ento porque no sabemos como usa-las. Agradeo-lhe, ainda, por ter acreditado nas minhas capacidades para a realizao deste trabalho, encorajando-me e dando-me nimo para continuar e no desistir. Dra. Ctia Vaz e Dra. Rita Oliveira pela pacincia e inestimvel apoio prestados durante a realizao deste trabalho e, principalmente, pela oportunidade de muito aprender com a experincia e conhecimento cientfico que lhes pertence. Agradeo ao meu namorado, Fbio, por todos os momentos fantsticos que me proporcionaste, mas, acima de tudo, pela pacincia que tiveste comigo, especialmente este ano que no foi nada fcil, pelo teu carinho, amor e dedicao, mesmo nos momentos mais complicados da minha vida. Sem Ti nada disto era possvel. Muito Obrigado! Agradeo a todos os meus amigos por todo o seu apoio, carinho, pacincia durante estes anos, com perodos bons e outros menos bons e ainda aos meus colegas de curso que estiveram por perto na minha vida acadmica.
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Obrigada a toda a minha famlia, em especial minha av e minha madrinha, pela pacincia, carinho, disponibilidade e apoio. Por ltimo o meu muito obrigado ao meu pai, o meu anjo da guarda.

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Prefcio
Este trabalho encontra-se desenvolvido sob a forma de cinco captulos. No primeiro captulo procurou-se transmitir e resumir, sob a forma de uma perspectiva global o tema do trabalho e o objectivo do mesmo. No segundo captulo pretendeu-se abordar os fundamentos tericos essenciais para a execuo do mesmo enquanto no terceiro captulo apresenta-se a seco experimental onde se descreve os mtodos e materiais necessrios. No quarto captulo apresenta-se os resultados obtidos no decorrer do trabalho, bem como o seu tratamento estatstico e discusso dos mesmos. No quinto captulo apresenta-se as concluses finais do trabalho realizado. Por fim, no sexto e ltimo capitulo, apresentam-se as referncias bibliogrficas consultadas na elaborao do presente trabalho. Para facilitar a transferncia de dados e permitir manter a coerncia dessa informao, optou-se por representar os nmeros reais sob a forma exponencial com a notao utilizada nos programas de clculo onde, por exemplo, 3,201E-08 representa o valor 3,201 x 10-8 escrito correctamente no formato cientfico. Sempre que possvel e adequado, os valores estimados esto representados com a sua incerteza associada, respectivo erro padro, indicada entre parntesis, seguida das respectivas unidades, de forma a conferir maior significado estatstico aos resultados obtidos.

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Resumo
A recomendao da Organizao Mundial de Sade (OMS) de que o consumo de acar no ultrapasse os 10% das calorias na dieta e, para tal, necessrio ter conhecimento da quantidade de acar que se ingere em cada poro de alimento confeccionado e a rotulagem muito importante para este conhecimento. Deste modo, no presente trabalho, pretendeu-se validar o mtodo de doseamento simultneo de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose, por HPLC-RI, de forma a ser possvel determinar a quantidade (percentagem) total e individual de acares numa amostra de pastelaria. Na validao foram avaliados os parmetros: especificidade, gama de trabalho, sensibilidade, limites analticos, preciso e exactido.

Abstract
The recommendation of the World Health Organization (WHO) is that sugar consumption does not exceed 10% of the calories in the diet, and for this it is necessary to know the amount of sugar you eat in each serving of cooked food and labeling is very important for this knowledge. Thus, in this study was intended to validate the method of simultaneous determination of fructose, glucose, sucrose, maltose and lactose, by HPLC-RI to be able to determine the quantity (percent) and individual total sugar in a sample pastry. In the validation parameters were evaluated: specificity, working range, sensitivity, analytical limits, precision and accuracy.

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Abreviaturas
ANOVA Analysis Of Variance AOAC Association of Official Analytical Chemists CE Cromatografia por Excluso CG Cromatografia Gasosa CSC Cromatografia com Fluido Supercrtico CLC Cromatografia Lquida Clssica CLFL Cromatografia Lquida com Fase Ligada CLL Cromatografia Lquido-Lquido CLS Cromatografia Lquido-Slido CV Coeficiente de Variao ER Erro Relativo EUA Estados Unidos da Amrica FE Fase Estacionria FM Fase Mvel FR Fase Reversa GFC Cromatografia com Filtrao em Gel GPC Cromatografia com Permeao em Gel HCl cido Clordrico HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia HPLC-RI - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com detector de ndice de Refraco ISO Organizao Internacional para a Padronizao (do ingls International Organization for Standardization) IUPAC Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (do ingls International Union of Pure and Applied Chemistry)

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MRC Material de Referencia Certificado NIST - National Institute of Standards and Technology ODS Octadecilsilano OMS Organizao Mundial de Sade R Coeficiente de Correlao RI ndice de Refraco RSD Desvio Padro Relativo USP Farmacopeia dos Estados Unidos da Amrica (do ingls United States Pharmacopoeia) Xd Limite de deciso XLD Limite de deteco XLQ Limite de quantificao Yd Sinal instrumental referente ao limite de deciso YLD Sinal instrumental referente ao limite de deteco YLQ Sinal instrumental referente ao limite de quantificao

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ndice 1. Introduo .................................................................................................... 2 1.1 DanCake ............................................................................................... 2

2. Fundamentao Terica .............................................................................. 5 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 Hidratos de carbono .............................................................................. 5 Origem ............................................................................................... 5 Refinao ........................................................................................... 7 Monossacardeos ............................................................................. 10

2.1.3.1 Glucose ............................................................................................ 10 2.1.3.2 Frutose ............................................................................................. 11 2.1.4 Dissacardeos .................................................................................. 12

2.1.4.1 Sacarose .......................................................................................... 13 2.1.4.2 Maltose ............................................................................................ 13 2.1.4.3 Lactose ............................................................................................ 14 2.1.5 2.2 2.2.1 2.2.2 Acar no organismo ....................................................................... 14 Cromatografia ..................................................................................... 16 Mecanismos de separao .............................................................. 17 Tipos de cromatografia .................................................................... 23

2.2.2.1 Cromatografia planar ....................................................................... 23 2.2.2.2 Cromatografia em coluna ................................................................. 25 2.2.3 HPLC ............................................................................................... 26

2.2.3.1 Fases ............................................................................................... 30 2.2.3.2 Detectores........................................................................................ 34 2.2.4 2.3 2.3.1 2.3.2 Identificao e quantificao ............................................................ 35 Quantificao de hidratos de carbono ................................................. 36 Variantes .......................................................................................... 36 Equipamento .................................................................................... 37

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2.3.3 2.4 2.4.1

Teste de Conformidade do sistema de HPLC .................................. 46 Validao de procedimentos analticos (ICH) ..................................... 48 Parmetros de desempenho ............................................................ 48

2.4.1.1 Especificidade e selectividade ......................................................... 50 2.4.1.2 Gama de trabalho e linearidade da curva de calibrao .................. 50 2.4.1.3 Sensibilidade.................................................................................... 51 2.4.1.4 Limiares analticos ........................................................................... 51 2.4.1.5 Preciso ........................................................................................... 52 2.4.1.6 Exactido ......................................................................................... 54 2.4.1.7 Robustez .......................................................................................... 57 2.4.1.8 Coerncia......................................................................................... 57 2.5 2.5.1 Tratamento estatstico de dados ......................................................... 58 Distribuies estatsticas relevantes ................................................ 58

2.5.1.1 t-student ........................................................................................... 58 2.5.1.2 Fisher ............................................................................................... 59 2.5.2 Teste de hipteses ........................................................................... 60

2.5.2.1 Diagnstico de valores discrepantes ............................................... 62 2.5.2.2 Escolha do modelo .......................................................................... 63 2.5.3 Anlise de varincia ......................................................................... 64

3. Seco experimental ................................................................................. 67 3.1. 3.1.1. 3.1.2. Reagentes ........................................................................................... 67 Fase mvel (HPLC) ......................................................................... 67 Soluo-me padro de glucose, frutose, sacarose, lactose e

maltose 67 3.1.2.1. 3.1.3. 3.2. Preparao das solues padro de acares ............................. 67 Preparao das solues de Carrez ................................................ 68 Equipamento ....................................................................................... 68

3.3. 3.3.1. 3.3.2.

Mtodos .............................................................................................. 68 Preparao da amostra.................................................................... 68 Condies de operao ................................................................... 69

4. Resultados e discusso ............................................................................. 71 4.1. 4.2. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.4. Linearidade e gama de trabalho .......................................................... 71 Limiares analticos............................................................................... 79 Preciso .............................................................................................. 80 Repetibilidade .................................................................................. 80 Preciso intermdia ......................................................................... 80 Exactido ............................................................................................ 86

5. Concluses ................................................................................................ 91 6. Bibliografia ................................................................................................. 94 Anexo I - As aplicaes do acar na rea da produo alimentar.................. 98 Anexo II Cromatogramas obtidos na leitura dos padres e amostra ........... 100

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1. Introduo

1. Introduo
Os hidratos de carbono, tambm conhecidos por glcidos, devem representar a principal fonte de energia da nossa alimentao, entre 55 e 75%. So constitudos por unidades bsicas denominadas oses. Todos os hidratos de carbono so decompostos no organismo atravs da aco de enzimas especficas at sua forma bsica, o monmero, sendo ento absorvidos e metabolizados. Consoante o nmero de unidades bsicas pode-se agrupar os hidratos de carbono em monossacardeos, dissacardeos ou polissacardeos. Uma vez que os acares esto frequentemente presentes nos hbitos alimentares, sobretudo dos consumidores mais jovens, e tendo em vista que o doseamento dos acares deve ser precisa para o controlo de qualidade, pretendeuse com este trabalho efectuar a validao do mtodo de doseamento simultneo de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose, por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com deteco por ndice de refraco. Neste trabalho, foi desenvolvido e implementado, de acordo com as necessidades do laboratrio Fsico-qumico e de Controlo de Qualidade da empresa DanCake, um mtodo que permite quantificar o teor de acar total ou o teor individual de cada mono e dissacardeo, presente nos alimentos da sua linha de produo.

1.1 DanCake
A DanCake uma empresa portuguesa fundada em 1978 que desenvolve a sua actividade no sector alimentar. conhecida nacional e internacionalmente pela sua oferta de bolos e produtos de confeitaria. Um negcio

assegurado por uma gesto familiar, vindo a a DanCake apostar tem no

desenvolvimento sustentado que representa, actualmente, uma capacidade produtiva de


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Figura 1.1 Imagem area da DanCake Coimbra.

45 mil toneladas, com uma margem de crescimento adicional de cerca de 40%. A empresa tem duas unidades de produo (Coimbra e Lisboa), sendo um dos maiores fabricantes de biscoitos de manteiga a nvel mundial. Mais de 600 colaboradores asseguram o funcionamento da empresa portuguesa que representa o maior volume de exportao neste sector. A qualidade dos produtos DanCake reconhecida internacionalmente, tendo sido certificada com o Nvel Superior (Higher Level) pelo British Retail Consortium (BRC) e International Food Standard (IFS). O investimento tecnolgico e o alargamento da sua oferta de produtos para ir ao encontro das necessidades do consumidor tm sido as suas preocupaes principais. Com 30 anos de actividade e uma posio solidificada nacional e internacionalmente, a DanCake uma empresa sempre atenta aos desafios que o mercado lhe tem colocado. Numa poca em que as preocupaes com a sade e nutrio tem pautado a vida dos consumidores, a DanCake procura adaptar-se e contribuir para um estilo de vida mais equilibrado, numa tendncia transversal a todas as suas marcas e que procura influenciar especialmente as escolhas dos mais jovens. A reduo de acares, gorduras e sal em produtos DanCake j existentes e o lanamento de novos snacks, mais saudveis, so caminhos que esta empresa apontou para se desenvolver, respondendo e antecipando as necessidades de um mercado sempre em mudana e crescentemente exigente.

2. Fundmento Teoric

2. Fundamentao Terica
Neste captulo procede-se a uma reviso bibliogrfica, na literatura existente, de factos e conceitos essenciais ao desenvolvimento do restante trabalho.

2.1

Hidratos de carbono
Os hidratos de carbono so aldedos poli-hidroxilados, cetonas poli-

hidroxiladas ou compostos que, por hidrlise, se podem transformar nos anteriores. Os hidratos de carbono que no se podem hidrolisar para compostos mais simples designam-se por monossacardeos. Os hidratos de carbono que se podem hidrolisar em duas molculas de monossacardeos designam-se por dissacardeos. Aos hidratos de carbono que, por hidrlise, originam vrias molculas de

monossacardeos d-se a designao de polissacardeos. [1] Os monossacardeos podem, ainda, subdividir-se em aldoses no caso de conterem o grupo aldedo, ou cetoses quando possuem o grupo cetona. Os hidratos de carbono que reduzem o reagente de Fehling (ou o de Benedict) ou o reagente de Tollens conhecem-se por acares redutores. Todos os monossacardeos, quer aldoses quer cetoses, so acares redutores, assim como a maioria dos dissacardeos, constituindo a sacarose uma excepo.

2.1.1 Origem
Antes de existir acar, tal como hoje o conhecemos, existiam apenas duas fontes de sabor doce no mundo: o mel e a cana. [2] A cana cultivada j desde a Antiguidade. Tero sido os povos das ilhas do Sul do Pacfico, por volta do ano 20.000 a.C., a descobrir as propriedades desta planta, que crescia espontaneamente nas suas terras. Foi na Nova Guin que a cana foi pela primeira vez cultivada. A partir desta zona, a cultura estendeu-se depois a outras ilhas vizinhas, como as Fiji ou a Nova Calednia. Mais tarde, a canade-acar ter chegado a outros pases, como as Filipinas, a Indonsia, a Malsia ou a ndia. Foram os Indianos o primeiro povo a extrair o suco da cana e a produzir, pela primeira vez, acar em bruto, baptizado com o nome gur, por volta de 500 a.C..
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A tcnica da produo de acar disseminou-se aos poucos por toda a regio do Mdio Oriente. Os rabes aprenderam com os Persas a produzir acar slido e foi desta forma que, por volta do sculo III a.C., se estabeleceram as rotas do acar, com caravanas a fazer o transporte entre os pases asiticos e africanos. Mais tarde os Europeus viajaram at pases longnquos, descobriram a cultura da cana-de-acar e introduziram-na na Grcia, em Itlia e em algumas regies da Frana. No entanto, o sucesso no foi grande pois o clima no era o mais adequado e o oriente continuou a ser o maior fornecedor de acar do mundo ocidental. Nesta altura, eram os mercadores venezianos os principais intermedirios deste comrcio: em Alexandria compravam o acar proveniente da ndia, fazendo-o depois chegar ao resto da Europa. Durante centenas e centenas de anos o acar foi, assim, considerado uma especiaria extremamente rara e valiosa. Apenas nos palcios reais e nas casas nobres era possvel consumir acar. Vendido nos boticrios (as farmcias de ento), o acar atingia preos altssimos, sendo apenas acessvel aos mais poderosos. No incio do sculo XV deu-se uma viragem importante na histria do acar: o infante D. Henrique resolveu introduzir na Madeira a cultura da cana. Com a passagem do cabo da Boa Esperana, os Portugueses passaram a viajar para a ndia com bastante regularidade e, nesta poca, tornaram-se os maiores negociantes de acar. Normalmente associa-se o acar a um produto de origem sul-americana, no entanto, ter sido apenas na altura dos Descobrimentos que Cristvo Colombo ter levado alguns exemplares de cana-de-acar provenientes das Canrias para plantar em S. Domingos, a actual Repblica Dominicana. A cultura de cana encontrou no novo continente excelentes condies para se desenvolver, e no foram precisos muitos anos para que, em praticamente todos os pases recm-colonizados, os campos se cobrissem de cana-de-acar. Os navegadores portugueses apostaram nos solos frteis das terras brasileiras para instalar plantaes de cana. Os solos eram frteis, o clima o mais adequado e o sucesso foi elevado e, por volta de 1580, existiam no Brasil cerca de 115 engenhos, a funcionar com a mo-de-obra de 10 000 escravos. Nesta poca, na Europa, o
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acar era um produto de tal maneira cobiado que foi apelidado de ouro branco, tal era a riqueza que gerava. Em 1747, o qumico alemo Andreas Marggraf desenvolveu uma alternativa ao acar de cana conseguindo produzir acar cristalizado a partir de suco extrado de razes de beterraba. O discpulo de Marggraf, Franz Carl Achard, instala, em 1796, a primeira refinaria de acar de beterraba da Europa. O acar obtido no tinha, no entanto, a qualidade desejvel, sendo ainda bastante caro. A Primeira Guerra Mundial trouxe graves problemas. Os bombardeamentos destruram muitas das refinarias de acar de beterraba europeias e foram grandes as dificuldades em obter mo-de-obra e matrias-primas. No entanto, bastaram alguns anos para a produo recuperar. Em 1920, a produo de acar de beterraba corria to bem que se gerou uma crise e os preos acabaram por cair. Em 1937 realizou-se um acordo para regular o mercado de acar e foi criado o Conselho Internacional do Acar, e em 1968 viria a nascer o mercado comum do acar, que tornou a Comunidade Europeia o maior produtor de acar de beterraba do mundo. Hoje, entre 131 pases produtores de acar, 79 produzem acar de canade-acar e fornecem 3/4 da produo mundial de acar. O maior produtor o Brasil, seguido pela ndia. O acar tornou-se um alimento comum dieta de todos os pases, constituindo uma fonte de energia de fcil e rpida assimilao. Consumido com moderao contribui para uma dieta equilibrada, proporcionando um sabor agradvel aos alimentos. Para alm disso, o sabor doce um dos mais apreciados pelo ser humano, o que torna o acar um dos alimentos capazes de oferecer momentos de bem-estar e de prazer. [2]

2.1.2 Refinao
O produto obtido nas fbricas de acar de cana, acar bruto, no apresenta uma qualidade suficiente, sob o ponto de vista qumico e microbiolgico, para ser comercializado directamente para consumo humano. Assim, o acar bruto deve ser purificado para obter a qualidade desejada. Esta purificao efectuada num processo denominado Refinao.

O acar bruto transportado a granel das fbricas de acar para as refinarias. Nas refinarias o acar bruto armazenado em silos, normalmente na forma de capela. Dos silos o acar transportado por tapetes de banda para a seco de Afinao. [3] Na Afinao o acar bruto misturado com xarope de afinao (inicialmente com gua) a 76 C, produzindo-se o magma de afinao. Este magma ento centrifugado em centrfugas descontnuas de alta velocidade. Na centrifugao o acar separado nas redes lavado com gua quente. O acar obtido na centrifugao, o acar afinado, dissolvido com gua quente ou guas doces obtendo-se o licor de afinao. O xarope separado nas centrfugas, o xarope de afinao, usado para formao do magma de afinao. O excesso de xarope de afinao enviado para a seco de Recuperao. Devido ao alto teor de substncias em suspenso no licor de afinao, este deve ser clarificado antes das etapas de Descolorao e Cristalizao. Esta clarificao pode ser efectuada usando um de trs processos: Filtrao; Carbonatao; Fosfatao.

No primeiro processo, adiciona-se ao licor de afinao um auxiliar de filtrao e efectuada uma filtrao atravs e uma pr-camada de auxiliar de filtrao em filtros de placas, membranas ou rotativos. Este processo no econmico para grandes capacidades e grandes contedos de substncias em suspenso no licor. Na Carbonatao a filtrao do licor de afinao efectuada atravs de um precipitado de carbonato de clcio. O precipitado obtido fazendo reagir hidrxido de clcio, adicionado ao licor de afinao, com anidrido carbnico obtido das caldeiras de produo de vapor. Durante a precipitao algumas impurezas de alto peso molecular existentes no licor so co-precipitadas com o carbonato de clcio. Depois da formao do precipitado, este filtrado em filtros de placa, membrana ou rotativos.

Na fosfatao obtm-se um precipitado fazendo reagir o hidrxido de clcio, misturado ao licor de afinao, com cido fosfrico. O fosfato de clcio formado misturado com ar favorecendo a sua flutuao no licor. Para aumentar a separao de corantes aninicos so usualmente adicionados polmeros catinicos. A separao do precipitado formado efectuada em clarificadores. O licor clarificado ento descolorado antes de ser concentrado e cristalizado. Os principais sistemas de descolorao so: Por resinas de permuta inica; Por carves adsorventes (em p ou granulados); Por oxidao (perxido de hidrognio ou ozono).

O licor final ento concentrado em evaporadores de mltiplo efeito (normalmente dois efeitos). O licor obtido, licor concentrado, ento cristalizado para se obter o acar branco. Para se obter o acar branco o licor concentrado normalmente cristalizado em trs etapas (trs cozeduras). As massas cozidas obtidas nestas cristalizaes so centrifugadas em centrfugas de alta velocidade onde os cristais de acar so separados do xarope me da cristalizao. O acar sado das centrfugas, com uma humidade de cerca de 1,5%, seco em secadores com uma corrente de ar quente. O acar seco ento condicionado em silos para libertar a humidade ligada. Depois do condicionamento, o acar peneirado e/ou classificado antes de ser comercializado a granel, em contentores de 1 tonelada, em sacos de 50 kg, em pacotes de 1 ou 2 kg, em saquetas ou noutra forma. [3]

2.1.3 Monossacardeos
Os monossacardeos (oses) so os acares simples, sendo geralmente cristalinos, doces e solveis em gua, de frmula estrutural geral [CH2O]n, sendo o nmero de carbonos superior a 2 (n > 2). Quimicamente estes compostos possuem diversos grupos hidroxilo (-OH), podendo ser poli-hidroxialdedos (aldoses) ou polihidroxicetonas (cetoses), dependendo do grupo funcional que contm, aldedo ou cetona, respectivamente. So molculas no hidrolisveis e redutoras (grupos aldedo e cetona podem sofrer oxidao), sendo classificadas de acordo com o nmero de tomos de carbono. O gliceraldedo (aldotriose) e a di-hidroxiacetona (cetotriose) so os monossacardeos mais pequenos com apenas 3 tomos de carbono (C 3H6O3). No entanto, as oses mais comuns e importantes nos seres vivos so as aldopentoses e as aldo-hexoses com 5 e 6 tomos de carbono, respectivamente. As hexoses que se destacam pela sua importncia so a glicose e frutose, que obedecem frmula de estrutura geral C6H12O6 e so as principais fontes de energia dos seres vivos. Estas biomolculas so ricas em energia, constituindo os principais combustveis celulares. O monossacardeo mais abundante a glucose, que se encontra presente no mel, uvas e outros frutos, assim como no sangue. [4]

2.1.3.1
A

Glucose
glicose, glucose ou dextrose, um

monossacardeo, o hidrato de carbono mais importante na biologia. As clulas usam a glucose como fonte de energia e intermedirio metablico. [5] A glucose um dos principais produtos da fotossntese e inicia a respirao celular em procariontes e eucariontes. um cristal slido de sabor adocicado, de frmula molecular C6H12O6, encontrado na natureza na forma livre ou combinada. No metabolismo, a glucose uma das principais fontes de energia e fornece 4 calorias de energia por grama. A glucose hidratada (como no soro glicosado) fornece
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Figura 2.1 Estrutura da Glucose.

3,4 calorias por grama. A sua degradao qumica durante o processo de respirao celular d origem a energia qumica (armazenada em molculas de ATP aproximadamente 30 molculas de ATP por molculas de glucose), gs carbnico e gua. A glicose contm seis tomos de carbono e um grupo aldedo e , consequentemente, referida como uma aldohexose. A molcula de glicose pode existir numa forma de cadeia aberta (acclica) e anel (cclica). Em soluo aquosa as duas formas esto em equilbrio, e em pH 7 a forma cclica predominante. Como o anel contm cinco tomos de carbono e um tomo de oxignio, o que lembra a estrutura do pirano, a forma cclica da glucose tambm referida como glucopiranose. Neste anel, cada carbono est ligado a um grupo hidroxilo lateral com excepo do quinto tomo, que se liga ao sexto tomo de carbono fora do anel, formando um grupo CH2OH.

2.1.3.2

Frutose
Frutose, tambm conhecida como

acar das frutas, um monossacardeo (C6H12O6), com os carbonos dispostos em anel. [6] tambm conhecida como levulose, pois uma soluo saturada capaz de
Figura 2.2 Estrutura da Frutose.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro transformar luz linearmente polarizada em luz circularmente polarizada, com rotao

ptica para esquerda. mais doce que a sacarose, que o acar refinado comum, encontrado na cana-de-acar. Como possui um grupo cetona como grupo caracterstico, a frutose considerada uma cetose. Como possui 6 carbonos, considerada uma hexose. , portanto, uma cetohexose. Tem uma estrutura em anel pentagonal com dois grupos hidroxi-metilo. No organismo humano, a frutose fosforilada a frutose-6-fosfato pela hexocnase, seguindo, posteriormente, para a gliclise onde metabolizada a ATP. No fgado, contudo, a frutose transformada em gliceraldedo-3-fosfato e s depois
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entra na via glicoltica. Desta forma, entra depois do maior ponto de regulao da actividade glicoltica, a reaco catalisada pela cnase da frutose fosforilada. Assim, um consumo excessivo de frutose leva a uma saturao da via glicoltica, o que leva formao de elevadas quantidades de acetil-CoA o que aumenta a biossntese de cidos gordos, provocando acumulao de gorduras no tecido adiposo. A frutose e a glicose esto fortemente presentes nas uvas, e so a base qumica do vinho. A aco de leveduras sobre estes acares (e nunca sobre sacarose) faz a transformao dos acares em lcool etlico e gs carbnico. Assim como a glucose, a frutose tambm se apresenta em duas formas: cadeias abertas (acclicas) e cadeias fechadas (hemiacetal). Em soluo aquosa, a forma tautomrica predominante a beta-Dfrutopiranose (73% a 20 C), seguida da forma beta-D-frutofuranose (20%). Em forma cristalina, a anlise de raio X mostra que a forma adoptada a beta-D-frutopiranose. [7]

Figura 2.3 - Relao entre os ismeros da frutose em forma acclica e cclica (hemiacetal).

2.1.4 Dissacardeos
As molculas de dissacardeo so relativamente pequenas e solveis em gua, podendo alterar o equilbrio osmtico das clulas. So tambm a principal forma de transporte dos hidratos de carbono.

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Exemplos de dissacardeos importantes e comuns so a sacarose, maltose e a lactose.

2.1.4.1

Sacarose
um dissacardeo formado

pela unio de uma molcula de glicose e uma de frutose atravs de uma lidao glicosdica,. Encontrase em abundncia na cana-deaucar, frutas e beterraba. [8]
Figura 2.4 Estrutura da Sacarose. C1 C2

A sacarose, o acar comum comercial, hidrolisada com grande facilidade por cidos diludos, resultando de uma mistura equimolar de D-glicose e D-frutose, que levogira, porque a frutose possui rotao especfica negativa (-92,4) mais alta do que a rotao especfica positiva da glicose (+52,7). A reaco chamada de inverso e estritamente monomolecular, isto , a fraco da sacarose presente, cindida por unidade de tempo, constante. Assim, a velocidade da reaco depende exclusivamente da concentrao de sacarose. A sacarose no um acar redutor. Isso significa que os dois grupos redutores dos monossacardeos que a formam esto envolvidos na ligao glicosdica, ou seja, o tomo de carbono C1 da glicose e C2 da frutose devem participar da ligao.

2.1.4.2

Maltose
A maltose a principal substncia de

reserva da clula vegetal, tambm a juno de duas molculas de glicose. Ao realizar a digesto o amido passa a ser primeiramente maltose e depois glicose. A maltose
Figura 2.5 Estrutura da Maltose.

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encontrada em vegetais, e tem funo energtica. [9]

2.1.4.3

Lactose
Lactose (galactose -1,4 glucose) um

tipo de glicdio que possui ligao glicosdica. o acar presente no leite e seus derivados. A lactose formada por dois hidratos de carbono menores, chamados

monossacardeos, a glicose e a galactose, sendo, portanto, um dissacardeo. [10]


Figura 2.6 Estrutura da Lactose.

O leite humano contm de 6-8% de lactose e, o de vaca, de 4-6%. fracamente doce. As leveduras no a fermentam, mas podem ser adaptadas para faz-lo. Lactobacilos transformam a lactose em cido lctico.

2.1.5 Acar no organismo


Juntamente com o oxignio, os acares so a principal fonte de energia da clulas do corpo, indispensvel a todas as reaes metablicas que fazem o corpo funcionar. O acar da cana uma fonte de energia rpida, de utilizao imediata. O consumo de acar, em doses adequadas, tambm favorece a liberao de substncias que produzem sensao de bem estar. [11] No entanto, o acar no usado pelo organismo ser armazenado no corpo, criando depsitos de gordura e aumentando o nvel de acar no sangue. Por isso, o consumo excessivo do alimento est relacionado ao aumento da obesidade, da diabetes e da sndrome metablica, um conjunto de distrbios que aumenta o risco de doenas cardacas. Um ponto negativo do excesso de consumo de acares a sobrecarga no pncreas para produo de insulina1, que mantm os nveis de glicose controlados no sangue. Esta deficincia pode levar diabetes tipo 2. O consumo exagerado de
1

O pncreas rgo responsvel pela produo de insulina.

14

acar pode contribuir para elevar o nvel de triglicridos, gordura perigosa, que ao se acumular pode obstruir as artrias. O resultado pode ser a maior probabilidade de desenvolver doenas cardiovasculares. A figura 2.7 mostra, esquematicamente, a regulao da concentrao de glicose no sangue, face a uma elevada ou a uma reduzida taxa de glicose.

Figura 2.7 Regulao da concentrao de glicose no sangue, face a uma elevada ou a uma reduzida taxa de glicose. Figura adaptada de [http://revistaescola.abril.com.br/ensino-medio].

15

2.2

Cromatografia

Devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de espcies qumicas, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os mtodos analticos modernos, podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tcnicas instrumentais de anlise. [12] Sendo a cromatografia um mtodo fsico-qumico, ela fundamenta-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interaces entre duas fases imiscveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase estacionria, designada por fase mvel. [13, 14] Atribuida ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett, a descoberta da cromatografia como tcnica analtica ocorreu em 1906, quando este descreveu a sua experincia na separao dos componentes de extrato de folhas. Neste estudo o botnico conseguiu separar pigmentos de

cloroplastos em folhas verdes de plantas, onde usou uma coluna de vidro recheada com carbonato de clcio como fase estacionria e ter de petrleo como fase mvel, ocorrendo a separao de componentes em faixas coloridas, este fato deu origem ao nome de cromatografia (chrom = cor e grafie = escrita) embora o processo no dependa da cor. Apesar de estudos semelhantes terem sido desenvolvidos, Tswett foi o primeiro a compreender e interpretar este processo como aceite atualmente, utilizando o termo cromatografia para descrever as zonas coloridas que se moviam dentro da coluna. [14] A tcnica cromatogrfica foi praticamente ignorada at a dcada de 30 quando foi redescoberta por Kuhn e Lederer que apefeioaram a cromatografia em coluna, separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando uma montagem semelhante de Tswett, com carbonato de clcio como fase estacionria e ter de petrleo como fase mvel. A partir da a cromatografia foi aperfeioada e, em conjunto com os avanos tecnolgicos, foi levada a um alto grau de sofisticao que resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas. [12, 13]
16
Figura 2.8 Botnico russo Mikhael Semenovich Tswett.

2.2.1 Mecanismos de separao


A separao em cromatografia lquida de alta eficincia pode ocorrer por partio, absoro, troca inica, fase ligada ou por excluso.

Lquido-lquido ou partio Com a finalidade de obter a separao de aminocidos, Martin e Synge, em 1941 desenvolveram a cromatografia lquido-lquido (CLL), utilizando como fase estacionria gua em slica e como fase mvel clorofrmio. Este mtodo preferencialmente utilizado na separao de compostos no-inicos, polares e que apresentem baixo a moderado peso molecular. [15] O mtodo consiste de uma fase estacionria lquida que por adsoro fsica retida na superfcie da coluna empacotada, geralmente com slica, e de uma fase mvel, tambm lquida, que passa sobre esta fase estacionria sendo uma destas polar e a outra apolar. A separao baseia-se na solubilidade da amostra em relao ao solvente (fase mvel) e fase estacionria, sendo assim os componentes da amostra que so mais solveis na fase mvel so eludos primeiro enquanto os que tm maior afinidade com a fase estacionria so selectivamente retidos por ela. [15, 16, 18] A desvantagem da cromatografia liquido-liquido, que pode acarretar a deteriorao da coluna, a solubilidade da fase estacionria na fase mvel, ocasionando a no reprodutibilidade nas separaes repetitivas. A fim de solucionar este problema pode-se saturar a fase mvel com a fase estacionria atravs de uma pr-coluna que contenha um percentual elevado da substncia que compe a mesma, disposta antes do injector; ou tambm ligar a fase estacionria quimicamente ao material de suporte. [16] A CLL pode ser dividida em cromatografia lquido-lquido normal (onde a fase estacionria polar e a fase normal apolar) e em cromatografia com fase reversa (fase estacionria apolar e fase mvel polar). As fases mveis e estacionrias mais utilizadas nestes mtodos esto descritas na tabela 2.1. [18]

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Tabela 2.1 - Fases mveis e estacionrias mais utilizadas na CLL

Fases estacionrias Normal , -oxidipropionitrila Carbowax (400, 600, 750, etc. Glicis (etileno, dietileno) Ciano-etil-silicone Hidrocarbonetos

Fases mveis

saturados:

hexano

heptano; solventes aromticos: tolueno e xileno; hidrocarbonetos saturados

misturados (at 10%) com dioxano, metanol, etanol, clorofrmio, cloreto de metileno. Fase reversa

Esqualano Zipax-HCP Ciano-etil-silicone

gua

misturas

lcool-gua;

acetonitrilo e misturas acetonitrilo-gua

Cromatografia Lquida com Fase Ligada Tendo por objectivo solucionar o problema da perda da fase estacionria da CLL surgiu a cromatografia liquida com fase ligada (CLFL), na qual a fase estacionria est quimicamente ligada superfcie de um suporte eliminando, assim, o problema da solubilidade desta na fase mvel. [16] Nesta forma de cromatografia as fases monomricas e polimricas ligam-se a uma vasta gama de materiais de suporte. As fases ligadas so geralmente preparadas por reaces de silanizao. Na superfcie da slica que foi completamente hidrolisada, por aquecimento com HCl 0,1M por um dia ou dois, forma-se grupos silanis, estes grupos, posteriormente, iro reagir com cloro-silanos substitudos formando as fases estacionrias quimicamente ligadas (sendo clorometil-silano amplamente utilizado), como pode ser visto na figura 2.9. [18]

CH3 Si OH + Cl Si CH3 R Si O

CH3 Si CH3 R + HCl

Figura 2.9 - Reaco de silanizao de um cloro-silano substitudo com silanol.

18

De acordo com o grupo funcional que est ligado ao radical R que se classifica quanto a fase normal, quando este de natureza polar, e fase reversa quando este de natureza apolar. Na tabela 2.2 esto descritas as principais sustncias utilizadas como radical R tanto em fase normal como em fase reversa. [15]
Tabela 2.2 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionrias de cromatografia lquida com fase ligada

Fase normal - C2H4CN (ciano) -C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol) -C3H6NH2 (amina) -C3H6N(CH3)2 (dimetilamina)

Fase reversa Cadeia C8 (- octil) Cadeia C18 (-octildecil)

Os grupos silanis que no reagiram podem absorver molculas polares, levando a mudanas nas propriedades cromatogrficas da fase ligada na cromatografia com fase reversa, j que esta apresenta a fase estacionria apolar, ou tambm pode ocorrer a formao de caudas nos picos cromatogrficos, particularmente com solutos bsicos. Estes efeitos podem ser reduzidos pela inactivao de grupos silanis que so funcionalizados pela reaco com trimetilcloro-silano, que em funo do seu tamanho menor, tem a capacidade de se ligarem a muitos grupos silanis. [18,15]

Lquido-slido ou adsoro Sendo introduzida inicialmente por Stwett no incio do sculo XX, a cromatografia lquido-slido (CLS) a forma mais clssica da cromatografia lquida e devido a recentes adaptaes tornou-se a mais importante tcnica de separao dos mtodos de HPLC. [15] Este tipo de cromatografia baseia-se na competio entre as molculas do soluto e do solvente pelos stios activos do adsorvente, estando relacionada com a
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interaco entre os grupos funcionais das partculas do suporte da fase estacionria e os grupos polares das molculas do soluto. [19] Primeiramente uma molcula da fase mvel passa a ser deslocada da superfcie para que possa ser adsorvida pela fase estacionria, levando em considerao que esta possui uma superfcie polar, ter pouca afinidade com grupos apolares que no sero retidos por no terem sido deslocados da fase mvel. [16] As fases estacionrias devem permitir a interaco diferencial com os componentes da amostra a serem separadas. Os grupos que so capazes de formar pontes de hidrognio sero fortemente retidos pela superfcie do adsorvente assim como as molculas polarizveis que iro apresentar a interaco dipolo dipoloinduzido, portanto o grau de reteno depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional, sendo que compostos que contm grupos funcionais polares sero fortemente retidos pelo adsorvente polar e, portanto, eludos por ltimo, enquanto que com os solutos apolares ocorrer o contrrio. [15, 16, 19] Geralmente usa-se como adsorvente, um slido activo com grande rea superficial, os mais comumente usados so a slica e a alumina. Um aspecto que deve ser considerado que adsorventes muito activos podem adsorver irreversivelmente o soluto sendo que a slica que ligeiramente cida pode reter fortemente solutos bsicos e a alumina que bsica no deveria ser usada em cromatografia de compostos sensveis a bases. [18] A escolha do solvente de extrema importncia neste mtodo devido ao facto deste competir com o soluto pelos stios activos do adsorvente, pois quanto mais forte a interaco da fase mvel com a estacionria, menor a adsoro do soluto. Os solventes so classificados de acordo com sua srie eluotrpica, ou seja, a sua capacidade de absoro, que so utilizadas na escolha do melhor solvente a ser utilizado para uma determinada separao. Este tambm deve ser puro, pois impurezas podem afectar tanto a eficincia da coluna como a deteco. [18]

Cromatografia por troca inica

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A cromatografia por troca inica um mtodo de absoro que se baseia na interaco electrosttica entre o soluto e a fase estacionria, buscando o equilbrio de troca entre ies em soluo e ies de mesmo sinal na superfcie de um slido que deve ser insolvel e de alto peso molecular. A amostra a ser separada geralmente uma soluo aquosa contendo ies orgnicos e inorgnicos. Na superfcie da fase estacionria caties e anies so covalentemente ligados e ies so trocados com a fase mvel, separando assim os ies que no interagem com a resina daqueles que se ligam com os grupos carregados. [15, 19] A fase estacionria utilizada neste mtodo, geralmente, uma resina de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno qual so ligados os grupos inicos. As trocas podem ser catinicas ou aninicas o que depende da natureza da fase estacionria. Os stios activos mais comuns para as resinas permutadoras de caties so o grupo cido sulfnico -SO3-H+, um cido forte, e o grupo cido carboxlico COO-H+, um cido fraco. E para os trocadores de anies so os que contm grupos amina tercirias -N(CH3)3+OH-, base forte, e aminas primrias N+OH-, base fraca. Os grupos inicos possuem contra-ies que so deslocados por ies de carga similar da fase mvel. Nas trocas catinicas, as resinas possuem stios activos negativos e contra-ies com carga positiva, de forma que os caties da resina sejam trocados pelos caties da amostra. Nas trocas aninicas, ocorre o contrrio, os stios activos da resina tm carga positiva e o contra-io tem carga negativa permitindo a troca destes com a fase mvel. O esquema das trocas catinicas e aninicas pode ser visualizado na figura 2.10. [15, 16, 19]

XX+

R+YR-Y+

YY+

R+ X- (troca aninica) R- X+ (troca catinica)

Figura 2.10 - Esquema de troca inica da Cromatografia por Troca Inica

Atravs da alterao do pH ou aumento da troca inica, que leva ao enfraquecimento das interaces electrostticas, a fase mvel deve ser modificada, a fim de eluir o soluto da resina. [19]

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Geralmente os compostos que so separados por este mtodo so cidos carboxlicos, bases orgnicas, peptdeos e aminocidos, que podem ionizar-se em solues com pH devidamente tamponado, bem como anies inorgnicos e caties metlicos ou complexos. [20]

Cromatografia por excluso Geralmente utilizada na separao de componentes de alto peso molecular, a cromatografia por excluso (CE) baseia-se na separao de acordo com o tamanho efectivo das molculas. Este mtodo subdividido em cromatografia por filtrao em gel (GFC) e cromatografia com permeao em gel (GPC). A GFC utilizada na separao de espcies solveis gua (polares) sendo a fase estacionria hidroflica, na GFC os solventes utilizados so orgnicos apolares e fases estacionrias hidrofbicas, o que torna o mtodo complementar, sendo que podem ser analisadas substncias polares e apolares. [15, 18] Pelo facto de no haver interaces fsicas ou qumicas entre o soluto e a fase estacionria, a CE difere dos demais mtodos cromatogrficos. O principal mecanismo de reteno das molculas do soluto a penetrao diferenciada destas no interior das partculas do gel. A coluna empacotada com matria inerte com poros de tamanho controlado, ao entrar em contacto com a fase estacionria as molculas pequenas ficam retidas no interior dos seus poros apresentando maior tempo de reteno e sendo eludas mais lentamente pela fase mvel, enquanto que as molculas maiores, que no conseguiram penetrar nos poros, so carregadas pela fase mvel, tendo, portanto, menor tempo de reteno. [15, 16, 18] Utiliza-se este mtodo na separao de materiais orgnicos e inorgnicos, mas a sua maior utilidade no estudo de biomolculas ou de compostos com alto grau de polimerizao. O material utilizado no empacotamento da coluna deve ter estrutura rgida a fim de facilitar o empacotamento, e que sejam capazes de suportar as presses elevadas da cromatografia lquida de alta eficincia. Geralmente o empacotamento da coluna para este mtodo feito por polmeros e partculas de slica, ambos com dimetro de 5 a 10m. [15, 18]

22

2.2.2 Tipos de cromatografia


A classificao dos mtodos cromatogrficos pode ser quanto ao mecanismo de separao, quanto a tcnica utilizada, e em relao ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificao mais popular a que leva em considerao o tipo de superfcie na qual ocorre a separao (figura 2.10), sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. [13]

Cromatografia

Planar

Coluna

Camada fina

Papel

Lquida

Fluido Supercrtico

Gasosa

Clssica

HPLC

Figura 2.10 Diagrama resumo dos tipos de cromatografia.

2.2.2.1

Cromatografia planar

A separao ocorre numa superfcie plana, geralmente uma placa de vidro ou metal, impregnado com a fase estacionria ou ento numa folha de papel embebida com um solvente apropriado. Este mtodo divide-se em cromatografia em camada fina e cromatografia em papel. [13]

Cromatografia em camada fina A cromatografia em camada fina uma ferramenta para anlises qualitativas rpidas e extremamente efectiva e conveniente para esse propsito. tambm conveniente para o isolamento de pequenas quantidades de fraces de misturas complexas ou na purificao de substncias. A fase estacionria constituda de um slido finamente dividido que reveste um material de suporte rgido e inerte de modo

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que o processo de separao ocorre numa superfcie plana, essencialmente bidimensional, ao conjunto denomina-se placa de cromatografia. A cromatografia desenvolve-se com a fase mvel migrando atravs da fase estacionria por aco da capilaridade e a este processo chama-se corrida. Como a amostra interage com a fase mvel e a fase estacionria, medida, que o solvente vai ascendendo na placa a amostra vai sendo arrastada pelo solvente numa velocidade que depende da atraco do soluto pela fase estacionria. Assim, diferentes solutos com diferentes interaces com a fase estacionria seriam arrastados a velocidades diferentes e, a partir de uma nica mancha seria obtido um cromatograma com vrias manchas, tantas quanto os componentes de mistura. [21] A separao consiste no deslocamento diferencial sobre uma camada fina de adsorvente retido sobre uma superfcie plana. O processo de separao fundamenta-se na adsoro, mas quando so utilizadas fases estacionrias tratadas pode ocorrer partio ou troca inica, podendo ento ser utilizada tanto na separao de substncias hidrofbicas como hidroflicas. [22]

Cromatografia em papel Classificada como cromatografia de partio lquido-liquido, na qual a separao dos componentes est relacionada com as diferentes solubilidades relativas destes componentes nas fases mveis e estacionria. Os componentes que tm maior solubilidade na fase estacionria so selectivamente retidos e movimentam-se mais lentamente ao longo do papel, enquanto que os componentes com maior solubilidade na fase mvel movem-se mais rapidamente. [23] um mtodo de separao em funo do deslocamento diferencial de solutos arrastados por uma fase mvel, sendo retirados selectivamente por uma fase estacionria lquida, na cromatografia com fase normal. Uma mancha de amostra depositada perto da base de um pedao de papel filtro e este colocado numa cmara de desenvolvimento. O solvente migra por capilaridade e os componentes movem-se a diferentes velocidades. [21] Esta tcnica utiliza pequena quantidade de amostra, tem boa capacidade de resoluo e preferencialmente aplicada na separao e identificao de componentes polares. [23]
24

2.2.2.2

Cromatografia em coluna

A separao ocorre no interior de um tubo de vidro ou metal. De acordo com o estado fsico da fase mvel distingue-se a cromatografia gasosa, a cromatografia de fludo supercrtico ecromatografia lquida. [13] Embora nas demais modalidades a unidade de separao possa ser preparada pelo usurio para fins de pesquisa ou reduo de custos, no prtica aconselhvel para aqueles que desejam executar experincias reprodutveis. Nestes casos, produtos comerciais produzidos em srie apresentam maior homogeneidade, o que se traduz em maior confiabilidade nos resultados.

Cromatografia gasosa Neste mtodo a fase estacionria pode ser slida, com uma grande rea superficial, ou lquida, onde uma pelcula delgada lquida recobre um slido inerte; e a fase mvel um gs denominado gs de arraste, sendo este inerte tem a finalidade de transportar as molculas a serem separadas. Assim, uma corrente de gs elui continuamente pela coluna e quando a amostra vaporizada ela introduz-se nesta corrente sendo arrastada atravs da coluna. [13, 24]

Cromatografia com fluido supercrtico (CSC) Neste mtodo um gs ou um lquido no estado supercrtico utilizado como fase mvel, possuindo propriedades do solvente que se situam entre as de um lquido e de um gs. Existe uma presso na qual o lquido e o vapor esto como fases separadas, acima do ponto crtico, independente da presso, existir apenas uma fase que chamada de fluido supercrtico. Quando comparada com a cromatografia lquida este mtodo proporciona um aumento na resoluo e na velocidade, pois o coeficiente de difuso do soluto maior em fludos supercrticos. Em relao cromatografia gasosa este tem menor resoluo e velocidade, mas capaz de dissolver solutos no-volteis. [13, 25]

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Cromatografia lquida A fase estacionria utilizada neste mtodo, como na cromatografia gasosa, pode ser um slido ou um lquido e como fase mvel utiliza-se um lquido no qual o soluto est dissolvido, assim, enquanto a fase mvel elui sobre a fase estacionria os solutos so separados de acordo com a interao destes com as fases, sendo eludo primeiro os que tm maior afinidade com a fase mvel e posteriomente os que tm maior afinidade com a fase estacionria. A cromatografia lquida pode ser dividida em: Cromatografia lquida clssica (CLC): este mtodo utiliza colunas com dimetros relativamente grandes, empacotadas com fases estacionrias finamente divididas, pelas quais passam as fases mveis sob ao da gravidade. Separa misturas bastante complexas, porm demorada e necessita que seja feito exame qumico ou espectroscpico das fraes colhidas. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC): Utiliza colunas fechadas que contm partculas muito finas que proporcionam separaes muito eficientes, so utilizadas altas presses para forar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da anlise.

2.2.3 HPLC
Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das tcnicas de separao, a cromatografia lquida de alta eficincia tem aplicao indispensvel em vrios laboratrios. Ela utiliza equipamentos muito sofisticados que podem ser totalmente automatizados. Neste mtodo so utilizadas pequenas colunas, nas quais uma fase mvel lquida elui sobre a fase estacionria que est em seu interior. Emprega-se alta presso na separao dos componentes da amostra de forma a ser capaz de completar a anlise em alguns minutos. [16, 26]

26

Inicialmente a cromatografia lquida utilizava colunas de vidro com dimetro de 1 a 5 cm e comprimento de 50 a 500 cm, sendo o dimetro das partculas das fases estacionrias slidas geralmente entre 150 a 200m, nestas condi es o fluxo era muito baixo, da ordem de alguns dcimos de milmetros por minuto, tornando os tempos de separao muito longos. Na tentativa de acelerar o processo foi utilizado bombeamento e aplicadas bombas de vcuo, o que no foi eficiente, pois o aumento do escoamento fazia com que aumentasse tambm a altura dos pratos tericos. Alguns cientistas j haviam percebido, no incio do desenvolvimento da cromatografia, que a diminuio das partculas da fase estacionria poderia aumentar a eficincia da coluna, mas somente nos anos 60 foi possvel rechear as colunas com partculas pequenas, necessrias para aumentar a resoluo, e tambm, adquirir equipamentos que funcionam a alta presso, o que necessrio para uma boa velocidade de eluio. [15, 16] O avano considervel da cromatografia lquida deu-se por volta de meados dos anos 60, sendo o primeiro cromatgrafo lquido de uso prtico construdo em 1964 por Csaka Horvath na Universidade de Yale. Este operava em presses de at 1000psi (6897kPa ou 6897bar), com fase mvel em gua tamponada passando por colunas de 1mm de dimetro interno e com detector de espectrmetro de ultravioleta. As primeiras misturas separadas continham cidos nucleicos. [18]

Diferenas entre a CLC e a HPLC A cromatografia lquida clssica utiliza-se de um equipamento barato no qual o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se adsorver de forma irreversvel; a coluna deve ser cheia a cada separao acarretando desperdcio de material e de mo-de-obra. O analista deve ser experiente e a eluio feita pela aco da gravidade tornando o processo moroso. A quantificao e deteco so feitas pela anlise manual das fraces individuais, o que requer muito tempo devido ao grande nmero de fraces colhidas, tambm pode ser usada alguma tcnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, anlise qumica ou registo gravimtrico, e os resultados so registrados em forma de cromatograma, um grfico da concentrao da amostra versus o nmero da fraco. Estas etapas podem ser vistas na figura 2.11. [16, 26]

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Preparao de coluna

Aplicao de Amostra

Eluio

Deteco e Quantificao
Evaporar para pesagem Anlise Qumica Espectrofotom trica

Figura 2.11 - Etapas da cromatografia lquida clssica

Na cromatografia lquida de alta eficincia (figura 2.12) o circuito fechado, podendo ser utilizada inmeras vezes. As colunas utilizadas so bastante eficientes, mas oferecem resistncia vazo da fase mvel necessitando a aplicao de sistemas de bombas de alta presso, que fazem com que a velocidade da eluio aumente. As anlises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente controlada. A injeco feita com microsseringas ou atravs de vlvulas de injeco e podem ser utilizados diversos tipos de detectores. Este mtodo no necessita de tanta experincia do operador, tem alta resoluo, sensibilidade e reprodutibilidade, mas dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao. [16, 19]

Figura 2.12 - Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia

Comparao da CG com a HPLC Na cromatografia gasosa as amostras devem ser volteis, para que possam passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estveis, a fim de que no se decomponham nas condies da separao. Isso faz com que somente gases e cerca de 20% dos compostos orgnicos possam ser analisados por este mtodo
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sem que suas estruturas sejam modificadas para aumentar a sua volatilidade. A amostra no deve interagir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel um gs inerte tendo como funo somente carregar a amostra volatilizada. Neste mtodo os equipamentos so mais baratos e o tempo de anlise reduzido. [16, 19, 26] Na HPLC as amostras no precisam ser volteis nem termicamente estveis, basta que sejam solveis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. A amostra interage com as duas fases, o que faz com que tenha maior variedade de mecanismos de separao, enquanto que na CG a amostra s interage com a fase estacionria. Este mtodo possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variao tanto na fase mvel como na fase estacionria, o que no ocorre na CG, pois a fase mvel sempre um gs inerte. As principais caractersticas de ambos os mtodos esto descritas na tabela 2.3. [19, 26]

Tabela 2.3 - Principais caractersticas da CG e HPLC

Parmetros Fase mvel Fase estacionria Tamanho da coluna Fase do composto - Injectado - Detectado Temperatura da coluna Identificao dos sinais cromatogrficos Quantidade mnima detectvel

CG Gs inerte Lquida ou slida 1,0 a 100,0m

HPLC Lquida Lquida ou slida Menor que 30,0cm

Gs ou lquido Gs 100 a 300C Tempo de reteno

Lquido Lquido De ambiente a 65C Tempo de reteno

10-12g Ionizao em chama

10-9g Absorbncia do UVVIS 500 a 25.000

Detectores mais usados

ou captura de electres

Pratos tericos por coluna

2.000 a 3000.000

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2.2.3.1 Fases
Em HPLC pode-se distinguir fase mvel e fase estacionria. De seguida procede-se classificao de cada uma das fases mencionada. Fases Mveis Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fcil purificao. Deve dissolver a amostra sem decompor os seus componentes, para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificao. No deve dissolver a fase estacionria e deve ser compatvel com o detector. A fase mvel deve ter baixa viscosidade, pois isso ir interferir directamente na eficincia da separao, devido ao facto de solventes viscosos alm de dificultarem a transferncia de massa entre a fase mvel e a fase estacionria, tambm influenciarem na intensidade da vazo. [16] Se durante a separao for utilizado um nico solvente de composio constante a eluio chamada de isocrtica. Mas algumas amostras que so formadas de componentes que necessitam de uma separao por gradiente, para que esta seja mais eficiente, requerem mudana na composio da fase mvel durante a anlise, com a variao da proporo entre os solventes, que geralmente diferem entre si na polaridade. A separao por gradiente tem as vantagens de reduzir o tempo de anlise, aumentar a resoluo e reproduzir sinais

cromatogrficos mais finos e mais simtricos. Mas tambm apresenta as desvantagens de aumentar o custo (j que necessita de bomba com misturador), no ser compatvel com todos os detectores (como por exemplo, com o detector de ndice de refraco), ter menor estabilidade da linha de base pela variao da fase mvel e tambm pode degenerar a coluna, sendo necessrio fazer a sua regenerao, pois a mudana na fora da fase mvel, no incio e no final da cromatografia, elevada. [15, 26] Uma fase mvel adequada indispensvel para a HPLC, por isso necessrio examinar factores que determinam a sua escolha, como a polaridade desta, que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase estacionria e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separao for com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a
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separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da polaridade. Outros factores que tambm devem ser considerados so o ponto de ebulio, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxicidade. [18]

Fases Estacionrias As fases estacionrias a serem utilizadas na HPLC devem ter alta resoluo entre os componentes da amostra, devem ser de fcil introduo na coluna, ter dimetro uniforme e partculas porosas ou peliculares. [16, 26] As partculas da fase estacionria podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: macropartculas (quando apresentam dimetro entre 20 e 40m) intermedirias (quando tem entre 20 e 10m) e micropartculas (de 3 a 10m). Quanto menor for a partcula, maior ser a eficincia da separao, melhorando assim o processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das partculas, pois partculas menores reduzem a distncia de contacto do soluto com as fases estacionria e mvel, facilitando o equilbrio e, consequentemente, melhorando a eficincia da coluna. Elas podem ser de formato esfrico, tambm chamado de regular, e de formato irregular, sendo que as regulares so mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutvel da coluna e por esse motivo so mais caras. [19, 26] De acordo com a natureza das fases mvel e estacionria pode-se classificar o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa: Cromatografia em fase normal: neste mtodo a fase estacionria utilizada polar e a fase mvel apolar, em relao eluio, os solutos mais apolares so eludos primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estacionria e so eludos por ultimo. [18] Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionria apolar e a fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais apolares eludos posteriormente. [18]

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Sendo o material mais utilizado como empacotamento de colunas a slica, que consiste principalmente em dixido de silcio (SiO2) com o tomo de silcio no centro de um tetraedro, sendo a valncia remanescente na superfcie ocupada por um hidroxilo (-OH) (figura 2.13). Esta no deve ser utilizada em pH acima de 8,0, pois isso acarretaria a sua dissoluo. Ento, para a cromatografia de compostos bsicos com pH entre 8,0 e 12,0 recomenda-se o uso de compostos polimricos como poliestireno, ligado covalentemente fase estacionria. [19, 25]

Figura 2.13 - Estrutura esquemtica da slica gel.

Uma superfcie de slica tem cerca de 8mol de grupos silanol (Si -OH) por metro quadrado, em pH entre 2,0 e 3,0 estes encontram-se completamente protonados e numa ampla faixa de pH acima de 3,0 dissociam-se em Si-O-, que se ficarem expostos podem reter fortemente bases protonadas (como RNH 3+), provocando a formao de caudas nos sinais cromatogrficos. [25] A slica sozinha pode ser usada como fase estacionria para a cromatografia de adsoro, j para sua utilizao na cromatografia de partio esta deve estar quimicamente ligada, na qual dependendo do radical R esta pode ser utilizada como fase normal ou fase reversa. A fase estacionria de octadecil (C 18) a mais utilizada na cromatografia lquida de alta eficincia, sendo representada por ODS (octadecilsilano). [25] Alguns tipos de fases estacionrias para HPLC esto descritos na tabela 2.4.

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Tabela 2.4 - Tipos de fases estacionrias para HPLC

Descrio Octadecil (C18) Octil (C8) Etil (C2) Metil (C1) Fenil (PH) Cicloexano (CH) Cianopropil (CN) Diol ( 2 OH) Slica (Si) cido Carboxlico (CBA) cido Propilsulfnico (PRS) cido Benzenossulfnico (SCX) Aminopropil (NH2) Amina Primria/Secundria (PSA) Dietilaminopropil (DEA) Amina Quaternria (SAX) cido Fenilbornico (PBA)

Polaridade/ interaco Altamente apolar Moderadamente apolar Fracamente apolar Fracamente apolar Moderadamente apolar Moderadamente apolar Moderadamente apolar/polar Polar Polar Troca catinica fraca Troca catinica forte Troca catinica forte Troca aninica fraca/polar Troca aninica fraca/polar Troca aninica fraca/polar Troca aninica forte Covalente

Como fase estacionria, alm da slica, podem ser utilizados slidos semirgidos, que geralmente so constitudos de partculas porosas de poliestireno entrecruzado com divinilbenzeno. Estes podem ser usados em HPLC por excluso com fase mvel orgnica e ainda so muito utilizados na cromatografia por troca inica. [20] Na cromatografia lquido-slido pode ser utilizada a alumina, alm da slica, podendo esta tambm ser utilizada na cromatografia lquido-lquido, assim como o vidro de porosidade controlada, carbono grafitizado, titnio, zircnio e slica recoberta com zircnio.

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2.2.3.2 Detectores
Tendo como funo monitorizar o fluxo da fase mvel na sada da coluna, o detector mede de forma contnua propriedades fsicas ou fsico-qumicas da amostra, ou da soluo que a contm enviando um sinal para registo que , geralmente, directamente proporcional concentrao do componente na amostra. O detector ideal aquele que apresenta as seguintes caractersticas: de amostra; Ser estvel e insensvel a variaes de temperatura e de fluxo, Possuir alta sensibilidade para detectar pequenas quantidades

no caso de eluies com gradiente; amostra; Deve efectuar uma leitura contnua; [20, 27] O sinal deve manter uma relao linear com a concentrao da

Os detectores dividem-se em duas grandes classes: Detectores de propriedades macroscpicas, que so aqueles

que medem as alteraes de propriedades fsicas provocadas pelo soluto na fase mvel; Detectores de propriedades do soluto, que so aqueles que

respondem a uma dada propriedade qumica ou fsica do soluto e so, idealmente, independentes da fase mvel.

Os tipos de detectores esto descritos na tabela 2.5. Em HPLC os detectores mais utilizados so os espectrofotomtricos (UV ou fluorescncia), condutomtricos e refractomtricos. [18, 28]

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Tabela 2.5 Detectores utilizados em HPLC

Detector

Limite de deteco (ng)

Gradiente

Aplicao

Ultravioleta ndice de refraco Espalhamento de luz Electroqumico Fluorescncia Espectrometria de massas Infravermelho com

0,1-1 100-1000 0,1-1 0,01-1 0,0001-0,01 0,1-1 1000

Sim No Sim No Sim Sim Sim

Selectivo Universal Alta massa molar Selectivo Selectivo Universal Selectivo

transformada de Fourier

2.2.4 Identificao e quantificao


A identificao dos componentes de uma amostra feita atravs da comparao dos cromatogramas obtidos com padres. Nestes padres o componente em questo eludo nas mesmas condies da amostra a ser analisada, tendo a formao de um pico num determinado tempo chamado de tempo de reteno, sendo assim os componentes so identificados pelo tempo de reteno. Os cromatogramas so grficos do tempo em minutos pela resposta do detector. Os padres so obtidos comercialmente e so analisados em diferentes concentraes, formando assim uma curva de calibrao. Esta trata-se de um grfico da concentrao do componente pela rea do pico obtido. Atravs desta pode-se quantificar os componentes da amostra quando se obtm a rea dos sinais cromatogrficos.

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2.3

Quantificao de hidratos de carbono


Para se estimar o teor de acares redutores e acares redutores totais em

alimentos, existem vrios mtodos qumicos no selectivos que fornecem resultados, com elevado grau de confiabilidade, quando utilizados correctamente aps eliminao de interferentes. Os mtodos qumicos clssicos conhecidos para a anlise de acares redutores so na sua maioria fundamentados na reduo de ies cobre em solues alcalinas (soluo de Fehling), mas tambm existem mtodos fundamentados na desidratao dos acares, por uso de cidos concentrados, com posterior colorao com compostos orgnicos, alm da simples reduo de compostos orgnicos, formando outros compostos de colorao mensurvel na regio do visvel. [29]

2.3.1 Variantes
Entre os vrios mtodos quantitativos disponveis para determinao de acares totais e de acares redutores esto: Musson-Walker; Lane-Eynon; Somogy e Nelson; mtodos cromatogrficos e mtodos pticos. [29] O mtodo Musson-Walker fundamenta-se na quantificao do precipitado de xido cuproso formado aps a reduo de ies cobre bivalentes, em meio bsico, pelos acares redutores (glicose e frutose). [30] No mtodo Lane-Eynon os ies cpricos da soluo de Fehling so reduzidos quantitativamente, sob ebulio, a xido cuproso por titulao com soluo de acar redutor. O ponto final alcanado quando um pequeno excesso do acar redutor descolora o azul-de-metileno. No mtodo de Somogy e Nelson a glicose desproteinada da amostra reduz sal de cobre, em meio alcalino e a quente. A forma reduzida do sal de cobre actua sobre o reactivo molbdico determinando o aparecimento da cor azul, cuja intensidade proporcional ao teor de glicose da amostra. Sob a aco do calor, os acares redutores decompem-se parcialmente em fragmentos oxidveis pelo hidrxido cprico, resultando em cido oxlico, malnico, etc. Nesta reaco o
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hidrxido cprico (azul) reduz-se a hidrxido cuproso (amarelo). Continuando o aquecimento, o hidrxido cuproso perde uma molcula de gua, transformando em xido cuproso (vermelho). O xido cuproso assim formado vai reduzir o reactivo molbdico dando o xido de molibdnio (Mo3O8) de colorao azul, cuja intensidade proporcional a quantidade de glicose existente na amostra. [30] No trabalho posteriormente descrito recorreu-se a mtodos cromatogrficos como meio de separao dos mono e dissacardeos, e a mtodos pticos, nomeadamente ao ndice de refraco, como meio de identificao e quantificao dos acares.

2.3.2 Equipamento
A instrumentao bsica de um cromatgrafo lquido consiste nos seguintes componentes (figura 2.14): Reservatrio do solvente, bomba de alta presso, misturador de solventes, injetor, microsseringas, loop, coluna, detector, coletor de solvente, registador e sistema computadorizado para colheita de dados. [19]

Colector de solvente

Reservatrio do solvente

Coluna Sistema computadorizado de colector de dados

Microsseringa

Cmara de mistura

Injector

Detector loop Bomba de alta presso

Registo

Figura 2.14 - Esquema do cromatgrafo lquido.

Sistema de abastecimento da fase mvel O abastecimento da fase mvel equipado com um ou mais reservatrios que podem ser de vidro (o prprio recipiente do solvente), de plstico (desde que este seja inerte), ou de ao inoxidvel, sendo que este no apropriado para fases
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mveis tamponadas em pH baixo, pois poder ocorrer a corroso do recipiente. [15, 26, 31] Fases mveis como a gua e outros solventes polares tm tendncia em dissolverem gases como oxignio e nitrognio e, se estes gases forem libertados dentro do equipamento, podem formar bolhas na coluna e, no sistema de deteco, estas bolhas podem causar o alargamento da banda e interferir na eficincia do detector. Por este motivo, os solventes devem ser desgaseificados, o que pode ser feito atravs de sistemas de bomba de vcuo, de sistemas de destilao, de dispositivos de aquecimento e agitao do solvente, sob a ao de ultra-som e tambm atravs do sistema de borbulhamento que geralmente feito com gs hlio, por ser um gs inerte e de baixa solubilidade. [15, 31, 32] Alguns sistemas contem tambm filtros com a finalidade de impedir que a poeira e particulas no solvente causem danos no sistema de bombeamento e de injeo e entupimento da coluna. No necessriamente os desgaseificadores e filtros devem fazer parte do equipamento, um mtodo bastante eficiente passar os solventes em filtros milipore sob vcuo, antes de introduzi-los no recipiente, o que ocasiona a remoo dos gases e materiais em suspenso. [15, 16]

Programadores de fase mvel

Quando se utiliza a eluio por gradiente necessria a mudana na composio da fase mvel, que feita por programadores de fase mvel. Os solventes utilizados apresentam diferentes polaridades variando a percentagem destes em mistura binria, ternria ou quaternria, aumentando a fora cromatogrfica da fase mvel, fazendo assim, com que os sinais cromatogrficos retidos eluam mais rapidamente. Tambm podem ser utilizados em misturas isocrticas, em que a fase mvel apesar de ter uma concentrao contnua, formada por mais de um solvente. Para que a programao seja automtica so utilizados microcomputadores. Existem dois tipos de programadores: a baixa e a alta presso. [20] Nos programadores de baixa presso (figura 2.15) os reservatrios de solventes esto dispostos em ordem crescente de polaridade e os solventes so misturados antes da bomba. O gradiente faz-se atravs de uma vlvula ligada ao
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reservatrio do solvente, sendo que esta programada para ficar aberta at que saia o volume desejado dos solventes, que sero misturados presso atmosfrica numa cmara com agitao magntica, posteriormente so enviados a uma bomba de alta presso, passando pelo injector, coluna e detector. [20]

Controlador do sistema

Cmara de mistura

Injector Vlvulas Bomba de alta presso

Reservatrio do solvente

Figura 2.15 - Programador de fase mvel a baixa presso

Nos programadores de alta presso (figura 2.16) diferentes solventes alimentam diferentes bombas. A vazo de cada bomba modificada para produzir os mais variados tipos de gradientes. Os solventes so liberados pelas bombas estando estes a alta presso e vo para uma cmara de pequeno volume onde so misturados por agitao magntica, sendo encaminhados posteriormente ao injector, coluna e detector. [20]
Controlador do sistema

Injector Cmara de mistura Bomba de alta presso Reservatrio do solvente

Figura 2.16 - Programador de fase mvel a alta presso

Sistema de bombeamento Devido ao facto de trabalhar com colunas de partculas muito reduzidas, a cromatografia lquida de alta eficincia necessita que o fluxo da fase mvel seja constante e a alta presso o que se consegue atravs de um sistema de bombeamento eficaz. A utilizao de alta presso necessria, pois as partculas exercem alta resistncia ao fluxo da fase mvel e, se no fosse utilizada, a anlise
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seria muito lenta. O fluxo deve ser constante para garantir a reprodutibilidade, sensibilidade e resoluo da anlise. Utiliza-se tambm o sistema de bombeamento para fazer gradiente de eluio quando os compostos apresentam factor de separao muito prximo. [26] Alguns aspectos importantes para o sistema de bombeamento so: presso mxima de 600bars, vazo contnua, intervalos de vazo de 0,1 a 1mL/min, reprodutibilidade e constncia da vazo de 1%. [16] Tendo em considerao o desempenho e caractersticas de funcionamento, existem basicamente dois tipos de bombas, as pneumticas e as mecnicas. [16]

Bombas pneumticas

Neste tipo de bombas um gs inerte exerce uma presso deslocando o lquido de forma contnua, a presso pode ser directamente sobre o lquido ou sobre um recipiente onde o mesmo est contido. Estas bombas so baratas e fornecem um fluxo que no sujeito a pulsaes, sendo que o fluxo total depende do fluxo do gs e a presso depende do gs usado e do recipiente. Ela pode ser vista na figura 2.17. [27]
Para a coluna

Anel Hermtico

Reservatrio da fase mvel

Gs

Figura 2.17 - Bomba pneumtica.

Bombas mecnicas

As bombas mecnicas podem ser divididas em bombas recprocas e bombas tipo seringa: Bombas recprocas: Consiste de uma pequena cmara na qual o solvente bombeado pelo deslocamento de um pisto controlado por um motor, desloca
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fluxos de volume constante, porm de forma descontnua, ou seja, em pulsos. Esse tipo de bomba pode ser visto na figura 2.18. [15, 27]
Para a coluna

Anel Hermtico Vlvulas unidireccionais

Do reservatrio da fase mvel

Figura 2.18 - Bomba recproca.

Bombas do tipo seringa: Tambm chamadas de bombas de deslocamento contnuo (figura 2.19), estas bombas so formadas por um pisto que se move por aco de um mecanismo de rosca, sustentado por um motor, o fluxo contnuo e sem pulsaes, porm tem capacidade total limitada, devendo parar para o enchimento aps o fornecimento de uma quantidade relativamente baixa de solvente. [15, 32]
Para a coluna

Reservatrio da fase mvel Anel Hermtico

Motor

Figura 2.19 - Bomba do tipo seringa.

Medidores e controladores de presso Problemas no equipamento, como entupimentos ou vazamentos, podem ser diagnosticados pelos monitores de presso, que tambm podem ser utilizados para

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aperfeioar a separao. Podem ser utilizados dois tipos de medidores de presso: Bourbon ou diafragma (figura 2.20) e transdutor de presso (figura 2.21). Bourbon ou diafragma: no qual um tubo de ao inoxidvel flexvel preenchido com um lquido viscoso a baixa presso, se expande com o aumento da presso da fase mvel que vai da bomba para a coluna, essa expanso desloca o ponteiro acusando o aumento da presso.

Figura 2.20 - Medidor de presso Bourbon

Transdutor de presso: Ao ir da bomba para a coluna a fase mvel exerce uma presso numa membrana, que sentida no transdutor convertendo a presso em corrente elctrica, cujo valor medido.

Figura 2.21 - Medidor de presso do tipo transdutor de presso.

Sistema de injeco da amostra Para se obter uma boa eficincia em anlises cromatogrficas, um factor muito importante a se considerar a maneira como se introduz a amostra na coluna. A injeco deve ser reprodutvel e ter grandes variedades de volumes, assim como no deve introduzir bolhas. Esta parte do instrumento necessita de um cuidadoso desenho, pois devem resistir a altas presses e as suas cavidades devem ser
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completamente lavadas pela fase mvel. So duas as formas de injeco da amostra: com microsseringas e com vlvula rotatria, sendo esta de injeco automtica. [20, 27] O injector do tipo seringa apresenta a vantagem de ser mais barato, porm de baixa reprodutibilidade e necessita de um septo para evitar o retorno da amostra e do mbolo para fora do injector. O sistema de injeco mais utilizado o da vlvula rotatria, pois alm de ser reprodutvel, elimina o problema de retorno da amostra. Neste sistema o volume injectado no necessita ser preciso, pois a vlvula rotativa tem um capilar de amostragem de volume fixo (loop) capaz de seleccionar volumes de 1 a 100 L de amostra, sendo o excesso levado para fora do equipamento. Na figura 2.22 pode ser visualizado o mtodo de injeco da amostra com a vlvula rotatria. Na posio de carregar (figura 2.22 a) um determinado volume de amostra carregado enquanto a fase mvel vai directa para a coluna, a rotao da posio geralmente feita manualmente, assim na posio injectar (figura 2.22 b), mudam-se as conexes, fazendo com que a fase mvel passe pela ala de amostragem e arraste a amostra para a coluna. [20, 26]

Figura 2.22 - Vlvula rotatria de amostragem para HPLC: a) posio para carregar e b) posio para injectar.

Coluna Num cromatgrafo lquido podem existir trs tipos de colunas, a coluna de saturao, a coluna de guarda e a coluna analtica, como pode ser visto na figura 2.23.

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Coluna de saturao

Coluna de guarda

Coluna analtica

Figura 2.23 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC.

Coluna de saturao

Tambm chamada de pr-coluna, colocada entre a bomba e o injector sendo usada para condicionar a fase estacionria. Muito empregue no passado quando se utilizava a cromatografia lquido-lquido com a finalidade de saturar a fase mvel com o lquido da fase estacionria, no sendo to necessria actualmente devido ao grande desempenho das fases estacionrias quimicamente ligadas. Mas ainda pode ser utilizada quando se usam recheios base de slica e uma fase mvel que dissolve este material, tendo este efeito aumentado com o aumento da temperatura, polaridade, fora inica e pH da fase mvel, de modo que a fase mvel estando saturada com fase estacionria, no ir reagir com a fase estacionria contida na coluna. Pode ser usada tambm para reter impurezas da fase mvel a fim de preservar a coluna. [20, 26]

Coluna de guarda

Colocada entre o injector e a coluna analtica, esta possui normalmente de 2 a 5cm e tem o mesmo dimetro interno e fase estacionria da coluna analtica. utilizada para prevenir que impurezas e compostos fortemente retidos, contaminem a coluna de separao, aumentando assim o seu tempo de uso, portanto a coluna de guarda deve ser renovada com certa frequncia, pois satura rapidamente. Devido ao seu pequeno tamanho, em relao ao tamanho da coluna analtica, o custo das diversas trocas desta ainda muito menor do que uma nova analtica, que deteriorada rapidamente quando no se usa a coluna de guarda. [20, 26]
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Coluna analtica

Esta deve ser constituda de algum material inerte, de dimetro uniforme, capaz de resistir s presses que sero usadas. O material mais utilizado o ao inoxidvel, mas tambm podem ser constitudas de vidro reforado e slica fundida, sendo esta ltima mais utilizada na confeco de colunas capilares. As mais usadas apresentam dimetro interno de 4,6mm, comprimento de 250mm e so recheadas com partculas porosas com dimetro de 5m. A escolha da coluna feita em funo da sua capacidade, que determinada pelas suas dimenses, material de empacotamento, comprimento e dimetro interno. Dependendo do dimetro interno as colunas podem ser classificadas de diferentes formas, como descreve a tabela 2.6. [20, 26]
Tabela 2.6 - Classificao das colunas de separao

Nome

Comprimento (cm)

Dimetro interno (mm) 2-6

Vazo (l min-1) 1.000-5.000

Tamanho de partcula (m) 3

Colunas Rpidas Convencional ou analtica Small bore ou microbore Capilar recheada Capilar semipermevel Capilar aberto Preparativa

3-10

5-30

2-6

1.000-3.000

3; 5; 10

10-100

1-2

5-200

1; 3; 5

20-200

0,1-0,5

0,1-20

1; 3

10-10.000

0,02-0,1

0,1-2

1; 3

100-10.000 >20

0,01-0,075 >10

0,05-2 >1.000

a >10

a: Filme lquido ligado nas paredes.

Registo de dados Os dados obtidos pelos detectores, podem ser registados ou manipulados atravs de um registador, um integrador ou um microcomputador. O integrador fornece o tempo de reteno de cada pico, a rea de cada um e a rea total de
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todos eles. Para aumentar a versatilidade, exactido e preciso da cromatografia lquida de alta eficincia utilizam-se microcomputadores, que alm de processar os dados obtidos pelo detector, armazenando-os, podem controlar a composio da fase mvel, a vazo que sai da bomba, a injeco da amostra, a temperatura da coluna, podendo diagnosticar possveis problemas. [20]

2.3.3 Teste de Conformidade do sistema de HPLC


A execuo de um teste de conformidade do sistema uma parte necessria em cada determinao cromatogrfica quantitativa. Num teste de conformidade de sistema, verifica-se se o sistema cromatogrfico no seu todo se encontra num estado satisfatrio para a aplicao do mtodo de HPLC especfico para um dado produto e com eficincia suficiente. [33] Distingue-se do teste de rotina de conformidade do sistema, a efectuar em cada anlise, o teste alargado de conformidade do sistema, a realizar com uma periodicidade pr-estabelecida e o teste completo de conformidade do sistema que s usado em algumas ocasies. [33]

Teste de rotina de conformidade do sistema Este teste realizado em cada anlise cromatogrfica que seja efectuada no HPLC. O teste de qualificao visual do sistema, a preciso do sistema cromatogrfico, a resoluo e a simetria so os parmetros verificados em cada anlise. [33]

Teste alargado de conformidade do sistema Este teste realiza-se quando se verificar uma das seguintes situaes: cada 500 injeces, de seis em seis meses, sempre que for necessrio comprovar o desempenho do mtodo e quando se coloca uma coluna nova a uso. [33]

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Teste completo de conformidade do sistema Este teste realizado sempre que se verificar uma das seguintes situaes: de dois em dois anos, o mtodo de anlise efectuado pela primeira vez no equipamento, no caso de pequenas alteraes das caractersticas do equipamento. Quando feita qualquer alterao nos mtodos cromatogrficos, o mtodo deve ser revalidado de acordo com procedimentos vlidos. [33] Alm dos pontos verificados no teste alargado de conformidade do sistema, ainda feita uma linearidade completa e uma avaliao do limite de quantificao. [33]

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2.4

Validao de procedimentos analticos (ICH2)


Este texto apresenta uma discusso sobre as caractersticas a serem

consideradas durante a validao dos procedimentos analticos incluindo a parte de pedidos de registo apresentados na Comunidade Europeia, Japo e EUA. [34] O objectivo da validao de um procedimento analtico demonstrar que adequado para a sua finalidade pretendida A discusso da validao de procedimentos analticos dirigida para os quatro tipos mais comuns de procedimentos analticos: Testes de identificao: so destinados a assegurar a identidade de um analto numa amostra. Isto normalmente conseguido por comparao de uma propriedade da amostra (por exemplo, do espectro,

comportamento cromatogrfico, a reactividade qumica, etc) com a de um padro de referncia; Testes para o contedo de impurezas; podem ser tanto um teste quantitativo ou um teste de limite para a impureza numa amostra. Este teste destina-se a reflectir com preciso as caractersticas de pureza da amostra. So necessrias caractersticas diferentes de validao para um teste quantitativo do que para um teste de limite; Testes quantitativos da fraco activa em amostras de substncia de frmaco ou medicamento, ou outro componente seleccionado no produto. [34]

2.4.1 Parmetros de desempenho


O objectivo do procedimento analtico deve ser claramente entendido uma vez que ir governar as caractersticas de validao que precisam ser avaliadas. Os parmetros de desempenho do mtodo, necessrios avaliar, so:
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Especificidade e selectividade Gama de trabalho e linearidade da curva de calibrao

International Conference on Harmonisation

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Sensibilidade Limites: deciso, deteco e quantificao Preciso: repetibilidade, intermdia e reprodutibilidade Exactido Robustez Coerncia

A tabela seguinte lista as caractersticas de validao consideradas como as mais importantes para a validao de diferentes tipos de procedimentos analticos. Esta lista deve ser considerada tpica para os procedimentos de anlise citados, mas as excepes ocasionais devem ser tratadas numa base caso a caso. Deve notar-se que a robustez no est listada na tabela, mas deve ser considerada numa fase adequada no desenvolvimento do processo analtico. [34] Alm disso a revalidao pode ser necessria nas seguintes circunstncias: quando se verificam alteraes na sntese do composto que constitui a amostra; aquando alteraes na composio do produto acabado; e na presena de mudanas no procedimento analtico. O grau de revalidao necessrio depende da natureza das alteraes.
Tabela 2.7 Caractersticas de validao de diferentes procedimentos analticos.

Tipo de procedimento analtico Exactido Preciso Repetibilidade Preciso intermdia Especificidade


(2)

Identificao + -

Teste de Impurezas Quantificao Limite + + + (1) + + + +


(3)

Doseamento + + + (1) + + +

+ + -

Limite de deteco Limite de quantificao Linearidade Gama de trabalho

- Significa que esta caracterstica no normalmente avaliada + Significa que esta caracterstica normalmente avaliada (1) nos casos em que a reprodutibilidade (ver glossrio), foi realizada, preciso intermediria no necessrio verificar (2) a falta de especificidade de um procedimento analtico pode ser compensada por apoio a outros procedimento(s) analtico (s) (3) Pode ser necessria em alguns casos

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2.4.1.1 Especificidade e selectividade


A especificidade foi considerada como a capacidade do mtodo analtico em detectar o(s) analto(s) de interesse na presena de outros componentes da matriz. [35, 36] a capacidade que o mtodo possui de quantificar exclusivamente um composto especfico independente da matriz da amostra e das suas impurezas. Para anlise qualitativa (teste de identificao) necessrio demonstrar a capacidade de seleco do mtodo entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela obteno de resultados positivos em amostras contendo o analto, comparativamente com resultados negativos obtidos com amostras que no contm o analto, contendo estruturas semelhantes. [36] A especificidade e a selectividade esto relacionadas com o evento da deteco. A especificidade refere-se a um mtodo especfico para um nico analto e a selectividade refere-se a um mtodo utilizado para vrios analtos com capacidade de distino entre eles. [36] Em HPLC estes parmetros so avaliados geralmente atravs da capacidade de resoluo cromatogrfica, da eficincia da separao e do factor de assimetria.

2.4.1.2 Gama de trabalho e linearidade da curva de calibrao


Em qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do analto no qual o mtodo pode ser aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser dos valores dos limites de deteco e de quantificao e os ltimos dependem do sistema de resposta do equipamento de medio. [37] A faixa linear definida como a faixa de concentraes na qual a sensibilidade pode ser considerada constante e so normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado obtido pelo mtodo analtico. [38] Para escolher a faixa de trabalho procede-se da seguinte maneira: quando se tem uma amostra especfica, a concentrao esperada deve situar-se no meio da faixa de trabalho e quando a concentrao do analto desconhecida utiliza-se a faixa de trabalho estudada para amostras diversificadas. Os valores medidos tm

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que estar dentro da faixa de trabalho, e os valores medidos prximos ao limite inferior da faixa de trabalho ter que ser diferente dos brancos dos mtodos. A linearidade a capacidade de uma metodologia analtica demonstrar que os resultados obtidos so directamente proporcionais concentrao do analto na amostra, dentro de um intervalo especificado. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa, e formulada como expresso matemtica (equao da regresso linear) que vai ser utilizada o clculo da concentrao do analto a ser determinado na amostra real. O coeficiente de correlao (r) um indicador da interdependncia entre o sinal medido e as concentraes dos respectivos padres. Contudo, o coeficiente de determinao (r2) que deve ser utilizado para traduzir a adequabilidade de um modelo linear aos valores experimentais.

2.4.1.3 Sensibilidade
Sensibilidade um parmetro que demonstra a variao da resposta em funo da concentrao do analto. Pode ser expressa pela inclinao da curva de regresso linear de calibrao, e determinada simultaneamente aos testes de linearidade. A sensibilidade depende da natureza do analto e da tcnica de deteco utilizada. [38]

2.4.1.4 Limiares analticos


Os limites inferiores da curva de calibrao so concentraes que indicam a capacidade de deteco e quantificao do mtodo analtico a esse nvel de concentrao. Estes so estimados com base na incerteza da quantificao do analto e podem ser obtidos atravs de: Rplicas do branco, Incerteza dos parmetros da curva de calibrao, Incerteza na disperso dos valores em torno da curva de calibrao.

Sempre que possvel deve-se estimar os limites inferiores com base em leituras de rplicas de branco de padro. No caso de no se dispor de brancos de

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padro ou algum destes limites conduzir a uma concentrao sem significado fsico deve-se utilizar os parmetros da recta de calibrao. [38] A capacidade de deteco ou limite de deciso (xd) a concentrao mnima do analto que corresponde a um sinal dbio, com probabilidade de cometer um erro do tipo de 5% e um erro do tipo de 50%, o que equivale a

(2.1)

O limite de deteco (xLD) a concentrao que corresponde ao menor sinal instrumental que estatisticamente distinto do valor obtido pelo branco para o nvel de significncia de 5%, assumindo um erro do tipo = 0.05 e um erro do tipo

=0.05. Assim, o sinal instrumental referente ao limite de deteco (yLD) deve corresponder a

(2.2)

O limite de quantificao (xLQ) a concentrao mnima acima da qual h confiana estatstica na quantificao da concentrao ( corresponde ao sinal ). Este limite

(2.3)

Nas equaes anteriores, calibrao,

o parmetro de ajuste obtido para a recta de

o valor crtico obtido da distribuio t-student com um nvel de corresponde ao desvio

significncia de 0,05 e com n-2 graus de liberdade, padro do parmetro da recta.

2.4.1.5 Preciso
A preciso a avaliao da proximidade dos resultados obtidos numa srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra, onde as duas

52

formas mais comuns de express-la so por meio de repetibilidade, preciso intermdia e reprodutibilidade. A preciso geralmente expressa como desvio padro ou desvio padro relativo. Ambas repetibilidade e reprodutibilidade so geralmente dependentes da concentrao do analto e, deste modo, devem ser determinadas para um diferente nmero de concentraes. A repetibilidade o grau de concordncia entre os resultados de medies sucessivas, efectuadas sob as mesmas condies de medio. Todas as medies so efectuadas com o mesmo procedimento, mesmo analista, mesma

instrumentao, no menor intervalo de tempo possvel. A repetibilidade pode ser expressa quantitativamente em termos da caracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meio da anlise de padres, material de referncia ou adio ao branco de vrias concentraes da gama de trabalho. A repetibilidade dada pelo desvio padro sr associado mdia dos resultados assim obtidos. O limite de repetibilidade (r) o valor mximo permitido para a diferena absoluta entre dois ensaios obtidos em condies de repetibilidade, calculada para o nvel de confiana a 95 %, onde m corresponde ao nmero de rplicas do ensaio. (2.4)

Reprodutibilidade avalia a impreciso ao nvel mundial, reflectindo as diferenas aleatrias esperadas para a comparao dos mesmos resultados entre laboratrios distintos. Embora a reprodutibilidade no seja uma componente de validao do mtodo executado por um nico laboratrio, considerada importante quando um laboratrio procura a verificao do desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos atravs de comparao inter-laboratorial. A partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular o limite de reprodutibilidade R, o qual permite ao analista decidir se a diferena entre os valores da cpia das amostras analisadas sob condies de

reprodutibilidade significante. [38]

53

Preciso intermdia refere-se concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Para a determinao da preciso intermdia recomendase um mnimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. Esta medida de impreciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados do laboratrio. Segundo a norma ISO 5725:3, a preciso intermdia pode ser avaliada de trs formas distintas: atravs de cartas de controlo de amplitudes aplicadas a rplicas, a duplicados da amostra e a padres, quando se realizam n ensaios sobre t amostras ou padres ou quando se realizam n medies sobre uma mesma amostra, amostras supostamente idnticas ou o mesmo padro. De acordo com esta norma o mtodo considera-se preciso em termos de preciso intermdia se o coeficiente de variao for inferior a 2.0 %.

2.4.1.6 Exactido
A exactido de um mtodo analtico traduz a proximidade do valor obtido em relao ao valor esperado, estipulado ou verdadeiro. Um mtodo diz-se exacto se o erro sistematico (modulo do erro absoluto) inferior ao intervalo de confianca estimado. calculada como percentagem de recuperao da quantidade conhecida do analto adicionado amostra, ou como a diferena percentual entre as mdias e o valor verdadeiro, acrescida dos intervalos de confiana. [38] A exactido do mtodo deve ser determinada aps o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mnimo, nove determinaes contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, trs concentraes, baixa, mdia e alta, com trs rplicas cada. Os processos normalmente utilizados para avaliar a exactido de um mtodo so, dentre outros: uso de materiais de referncia, participao em comparaes inter-laboratoriais e realizao de ensaios de recuperao. Os materiais de referncia certificados so utilizados no processo de validao de um mtodo de ensaio para avaliar o desempenho do laboratrio, por isso o fornecimento de materiais de referncia certificados (MRC) realizado por organismos reconhecidos e confiveis, como por exemplo o NIST. Na avaliao da
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exactido utilizando um material de referncia, os valores mdios obtidos pelo laboratrio e o desvio padro de uma srie de ensaios em duplicado, devem ser comparados com os valores certificados do material de referncia, para esta comparao podem ser utilizados: Erro absoluto Erro relativo (ER); z Score; Erro normalizado; Testes de recuperao.

Erro Absoluto A exactido de uma medida geralmente descrita em termos de erro absoluto, que definido como a diferena entre o valor observado/obtido ( ) e o valor aceite como verdadeiro ( ). | | (2.5)

Erro relativo o quociente entre o erro absoluto e o valor correcto. [38] (2.6)

z Score O factor de desempenho (Z-score) expressa-se em termos de varivel reduzida e estimado atravs da equao 2.7. (2.7)

55

Onde S representa a incerteza associada ao material certificado (MRC) ou o desvio padro da mdia dos laboratrios no ensaio inter-laboratorial. Segundo um protocolo com a Association of Official Analytical Chemists (AOAC), International Organization for Standardization (ISO) e International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) se o factor de desempenho em mdulo for menor ou igual a um, o desempenho bom, se for menor ou igual a dois o desempenho satisfatrio, caso se encontre entre dois e trs o desempenho questionvel e por ltimo se for superior ou igual a trs o desempenho do mtodo mau. [38] Erro normalizado O erro normalizado estimado atravs da equao 2.8 onde U lab corresponde incerteza associada ao laboratrio e UCRM incerteza associado ao valor de referncia. Quando o valor de erro normalizado em valor absoluto menor ou iguala a 2 o ensaio realizado satisfatrio. [38]

(2.8)

Testes de recuperao Os testes de recuperao permitem avaliar a exactido sem recorrer a materiais certificados, o que uma excelente vantagem econmica para o laboratrio, usando somente solues de padro e amostras. Este tipo de teste permite testar a resposta na presena da prpria matriz da amostra em causa, o que bastante vantajoso pois no comum haver materiais certificados com matrizes idnticas ou similar aquele que se est interessado. [38] Caso se represente a concentrao recuperada em funo da concentrao adicionada obtm-se um grfico com variao linear que pode ser ajustado por um polinmio de primeiro grau conhecido por funo de recuperao: (2.9)

56

Com esta funo podemos interpretar o tipo de erro sistemtico cometido no mtodo. Assim, a ordenada na origem (a) est relacionada com um erro sistemtico constante e o declive (b) est relacionado com um erro sistemtico proporcional.

2.4.1.7 Robustez
A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variaes. Um mtodo diz-se robusto se revelar praticamente insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer quando esse est sendo executado. [38] Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao tratamento de Youden. Trata-se de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for robustez de um mtodo, maior ser a confiana desse relacionamento sua preciso.

2.4.1.8 Coerncia
A coerncia de um mtodo analtico expressa a concordncia de valores obtidos quando so introduzidas variaes aleatrias nas condies experimentais do mtodo. De acordo com a USP este parmetro pode ser medido atravs da reprodutibilidade dos resultados obtidos sob a variao de diferentes condies (diferenas dentro do laboratrio, analistas, instrumentos, reagentes, perodos de trabalho).

57

2.5

Tratamento estatstico de dados


A estatstica uma ferramenta fundamental na anlise qualitativa e quantitativa

de um analto numa certa matriz. As medidas so inerentemente variadas [38], isto , os dados analticos obtidos apresentam variaes em torno de um valor central, regra geral, mais frequente. No entanto, a distribuio normal dos dados pode ser assumida na grande maioria dos resultados de anlise fsico-qumica.

2.5.1 Distribuies estatsticas relevantes


As distribuies estatsticas (t-student e F de Fisher) esto muito relacionadas com o teste de hipteses uma vez que estas, devido a serem bem caracterizadas, podem ser utilizadas como termo de comparao em diversas situaes reais, providenciando os valores crticos necessrios. [38]

2.5.1.1 t-student
Quando est em causa a comparao de estimativas de posio, assumindo que se trata de distribuies normais e independentes, calcula-se o valor teste

(2.10) o valor tomado como verdadeiro e

Onde o valor mdio observado,

o desvio padro associado ao valor mdio. Compara-se o resultado com o valor crtico da distribuio t-student ao nvel de confiana de 100.(1 - ) %. A hiptese nula assumie a igualdade de valores e a hiptese alternativa assume a desigualdade:

Consequentemente o valor crtico refere-se distribuio cumulativa bilateral (hiptese centrada assumindo eventual diferena nos extremos). [38] Caso se procure demonstrar que o valor estimado superior ao valor correcto, a hiptese nula assume a situao da igualdade (valor inferior ou igual ao tomado como verdadeiro) enquanto que a hiptese alternativa d conta desta diferena,

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Os valores crticos correspondem distribuio cumulativa unilateral (hiptese marginal), onde corresponde ao nvel de significncia.

2.5.1.2 Fisher
Quando est em causa a comparao de varincias de distribuies normais, aleatrias e independentes, calcula-se o valor teste dado pelo quociente entre duas varincias, e : (2.11) Este deve seguir uma distribuio de Fisher. Assume-se como hiptese inicial (H0) que no h diferena significativa entre as varincias (diferena puramente aleatria),

O que corresponde a efectuar um teste bilateral para o quociente das varincias. O intervalo de confiana a 95% para este quociente de varincias dado por: (2.12) Onde e correspondem aos graus de liberdade do numerador e

denominador, respectivamente. Por uma questo de simplificao, impe-se que este quociente seja maior que a unidade (por exemplo: maior nmero de graus de liberdade para o numerador, diviso da varincia pela componente puramente aleatria) o que faz com que se possa converter o teste bilateral num teste unilateral, mais fcil de processar. Deste modo,

59

A hiptese nula (H0) assume que no h diferena significativa entre varincias e a hiptese alternativa (H1) assume que se houver diferena significativa, a varincia do numerador excede a do denominador. Contudo, o valor teste deve ser comparado com o valor crtico de F bilateral.

2.5.2 Teste de hipteses


Devido ao pequeno nmero de dados normalmente usados, intervalos de confiana largos podem obscurecer diferenas inaceitveis. Por outro lado, devido a pequenas anomalias que ocorrem por vezes, nas sries analticas, as diferenas so identificadas como significantes, o que no apresenta qualquer relevncia prtica. A componente aleatria intrinsecamente envolvida implica sempre a possibilidade de se cometer um erro de juzo. Atendendo forma como estes se desviam em relao ao valor tomado como correcto, os erros estatsticos, podem ser classificados em erros por excesso e erros por defeito. Os erros por excesso correspondem a uma falsa rejeio, ou seja, um erro do tipo I () onde a hiptese nula estava correcta e foi abusivamente rejeitada por ter sido considerada falsa. Os erros por defeito referem-se a uma falsa aceitao, ou seja, um erro do tipo II () onde a hiptese nula estava errada e foi abusivamente aceite como verdadeira. O nvel de significncia de teste, designada por (frequentemente expresso sob a forma percentual 100%.) corresponde probabilidade mxima com que se pretende proceder rejeio abusiva (erro tipo I). A probabilidade de aceitao de hiptese correcta designa-se de nvel de confiana e corresponde probabilidade de (1-) (em termos percentuais 100 (1-) %). Na formulao de hipteses estatsticas, a hiptese nula (H0) vai no sentido de no haver diferena significativa, isto , de pertencer ao grosso da distribuio tambm designado de (1 ); a hiptese alternativa (H1) encontra-se direccionada para a diferena significativa (), o complemento da hiptese nula. [38]

Procedimento Os testes estatsticos constituem uma ferramenta para, com critrios estatsticos, auxiliar na tomada de decises na interpretao de resultados. Cada
60

teste estatstico depende do nvel de confiana para o qual as concluses so desejadas assim como do nmero de graus de liberdade para essas circunstncias. [38] Os testes estatsticos devem ser efectuados com base num procedimento lgico que passa pelos seguintes passos: a) Formulao do problema: Deve-se realizar uma anlise do evento de forma a racionalizar a questo e poder testar. b) Escolha do teste: O teste escolhido de acordo com o objectivo pretendido, ou seja, com base na distribuio estatstica que melhor se adequa3. c) Nvel de significncia: Nvel com o qual se pretende obter concluses. Deve ser estabelecido previamente o valor do erro mximo admissvel para se tirar concluses erradas por rejeio abusiva (). Regra geral o nvel de significncia refere-se a = 0,05 podendo tambm ser reduzido para = 0 ,01 para serem tiradas concluses mais definitivas. d) Hipteses de trabalho: As hipteses devem ser complementares e de forma a abranger o universo do evento. A hiptese nula (H0) deve ser formulada no sentido de no haver diferena (est tudo correcto, dentro do intervalo de confiana da estimativa, (1- )). A hiptese alternativa (H1) incide sobre a diferena significativa (no est conforme, fora do intervalo de confiana da estimativa ()). e) Simetria do teste: Esta depende do modo como as hipteses foram formuladas. Se o que se pretende um teste de desigualdade (superior a ou inferior a um determinado valor), apenas se est interessado em considerar um extremo da distribuio como referncia e por isso o teste estatstico tem uma simetria unilateral. Pelo contrrio, se o que se pretende um teste de igualdade, ou seja, comparar a parte central da distribuio com determinada estimativa, agora o teste estatstico apresenta uma simetria bilateral. f) Clculo do teste: Calcula-se com base na expresso da distribuio estatstica correspondente. g) Comparao com valores crticos (Xcrit): Os valores crticos esto tabelados de acordo com o nvel de significncia e com o nmero de graus de liberdade. Estes
3

As distribuies estatsticas mais comuns para efectuar testes estatsticos so a normal, t student, F-Fisher e qui-quadrado.

61

valores permitem definir as regies de aceitao e de rejeio das hipteses formuladas. h) Concluso: No caso do valor experimental ultrapassar os limites tabelados (regio de rejeio) diz-se que, ao nvel de confiana 100 (1-) % h diferena significativa e a hiptese nula deve ser rejeitada em detrimento da hiptese alternativa; caso contrrio, no existe evidncia estatstica para rejeitar a hiptese nula. Os testes estatsticos podem ser efectuados a diferentes nveis de significncia. As normas ISO recomendam testes de significncia aos nveis de 5% (=0.05, probabilidade de efectuar 1 insucesso em cada 20 decises) e 1% (=0.01, probabilidade de taxa de insucesso de 1/100).

2.5.2.1 Diagnstico de valores discrepantes


Valores discrepantes so valores que no pertencem a uma determinada distribuio. Dado que as estimativas paramtricas so sensveis a valores contaminados, estes valores, designados de outliers, produzem em geral erros de estimativa quer na posio (enviesamento) quer na disperso (aumento da impreciso). Como tal, para que este efeito de estimativa errada seja evitado tem que se testar inicialmente qualquer conjunto de dados antes de se proceder a qualquer estimativa. Os resultados experimentais que mais se afastam dos valores previstos pelo modelo podem ser eventuais outliers. Dado a sua insensibilidade a valores discrepantes, a regresso robusta pode ser til para detectar estes outliers. Os eventuais valores discrepantes da curva de calibrao podem ser testados atravs de um teste F (similar ao teste de Mandel), o e/ou atravs de um teste do tipo t-student. [38]

Teste F O teste baseia-se em comparar o aumento da variabilidade residual ao incluir o valor suspeito da curva de calibrao com uma estimativa de erro puramente aleatrio. Compara-se o aumento na varincia do ajuste ao introduzir o valor dbio no conjunto dos pontos da curva de calibrao com uma estimativa de erro
62

puramente aleatrio que resulta da varincia do ajuste com (n-1) valores experimentais, pela equao (2.13).

(2.13)

Se este valor exceder o valor crtico isso indica que a hiptese nula (H0: o valor em questo tambm pertence curva de calibrao ou seja, no afecta significativamente a qualidade do ajuste) tem uma probabilidade inferior a 100.%4 de no ser vlida sugerindo a rejeio deste valor como precauo estatstica no sentido de no cometer erros sistemticos na calibrao e de reduzir a incerteza na estimativa da concentrao das amostras. [38]

Teste t-student A anlise de valores discrepantes pode tambm ser efectuada sob a forma de teste t-student em que se compara a proximidade do valor experimental em causa ( ) com o respectivo valor previsto pela curva de calibrao ( )) em relao

disperso dos valores da curva de calibrao sobre o modelo, pela equao (2.14). | |

(2.14)

Caso sejam detectados outliers na curva de calibrao esta dever ser repetida para evitar que as estimativas obtidas com as amostras no corram risco de erro sistemtico. [38]

2.5.2.2 Escolha do modelo


A escolha do modelo deve assentar em diagnsticos simples e estatisticamente fundamentados. Os diagnsticos mais utilizados so: determinao visual da linearidade, teste de Mandel, anlise ANOVA do ajuste e a anlise de resduos. [38]
4

A rejeio de pontos de uma curva de calibrao um procedimento que vai afectar todas as estimativas subsequentes, razo pela qual o nvel de confiana imposto deve ser de 99% ( = 0.01).

63

A determinao visual da linearidade consiste em sobrepor aos valores experimentais um segmento de recta por forma a se aproximar do nmero mximo de valores experimentais. Esta abordagem no suficiente e existem diversas situaes em que h dvidas. O teste de Mandel consiste em ajustar um polinmio de primeiro grau (P 1) e um polinmio de segundo grau (P2), estimar as respectivas somas de resduos quadrados e comparar o aumento da varincia do ajuste ao baixar o grau do polinmio. O teste consiste em comparar o incremento da varincia do ajuste ao excluir um parmetro (coeficiente do termo de segundo grau) com uma estimativa de erro puramente aleatrio (pure error) que pode ser estimado com base na varincia do modelo que melhor ajusta os valores experimentais ( (2.15) ).

Se o aumento na varincia do ajuste devida eliminao de um parmetro for equiparvel varincia aleatria, o parmetro excludo no necessrio ao modelo. As hipteses de trabalho so:

Se o valor F calculado no exceder o valor crtico

a hiptese nula

deve ser aceite o que indica que o polinmio de primeiro grau adequado para a curva de calibrao.

2.5.3 Anlise de varincia


A anlise de varincia (ANOVA) uma ferramenta estatstica importante para distinguir as diversas contribuies sobre a varincia total observada. A ANOVA permite distinguir dentro da variabilidade total de diversos conjuntos de valores experimentais as contribuies puramente aleatria e a contribuio sistemtica entre amostras. Deste modo permite verificar se as amostras (ou factores) exercem um efeito significativo fazendo com que estes se sobreponham componente aleatria contribuindo para diferenas significativas entre si.
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A ANOVA permite comparar em simultneo vrias mdias (nveis diferentes do factor) e estimar as diversas contribuies de variabilidade: puramente aleatria (estimada dentro de cada amostra), variabilidade entre amostras, etc. Como pressupostos assume-se que as distribuies em causa so: Normais e independentes, H homogeneidade de varincia (variabilidade interna)

Se o factor em estudo (factor A) no influi de modo significativo, ambas as disperses so estimativas da varincia da componente aleatria. J se o factor influi de modo significativo, a disperso devida ao factor A (sA) torna-se maior que a componente puramente aleatria (s0). A comparao das disperses conseguida atravs do teste F, equao (2.16): (2.16)

65

3. Seco Experimentl

66

3. Seco experimental
Nesta seco so enumerados os reagentes e equipamentos necessrios realizao do trabalho. Encontra-se tambm nesta seco a descrio da preparao de algumas solues relevantes.

3.1.Reagentes
Os reagentes utilizados foram: Acetonitrilo e gua para HPLC adquiridos na Fisher Cientific; padro de glucose, maltose, frutose e lactose, de grau analtico para HPLC adquiridos na Sigma-Aldrich; e padro de sacarose de grau analtico para HPLC adquirido na Acros-Organics. Para as solues Carrez I e II foi utilizado Hexacianoferrato de potssio trihidratado K4[Fe(CN)6].3H2O de grau analtico, adquirido na Merck e Sulfato de zinco heptahidatado ZnSO4.7H2O de grau analtico, adquirido na Panreac.

3.1.1. Fase mvel (HPLC)


A fase mvel utilizada constituda de gua ultrapura para HPLC e acetonitrilo numa razo de 78:22 (V:V).

3.1.2. Soluo-me padro de glucose, frutose, sacarose, lactose e maltose


Pesar rigorosamente cerca de 2,5g de glucose, 2,5g de frutose, 5,0g de sacarose, 2,5g de lactose e 2,5g de maltose para um balo volumtrico de 50,00mL. Dissolver em gua e completar o volume.

3.1.2.1. Preparao das solues padro de acares


Para 7 bales volumtricos de 50,00 ml pipetar 0,7; 1,00; 2,00; 5,00; 10,00; 15,00 e 25,00mL da soluo padro de acares. Completar o volume dos bales com gua.

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3.1.3. Preparao das solues de Carrez


Soluo de Carrez I: soluo 150g/l de K4[Fe(CN)6].3H2O Soluo de Carrez II : soluo 300g/l de ZnSO4.7H2O

3.2.Equipamento
No desenvolvimento deste trabalho foram utilizados os seguintes

equipamentos: Cromatgrafo lquido de alta resoluo com injector, detector de ndice de refraco e sistema de aquisio de dados. Coluna: de slica ligada a NH2 com 25 cm x 4 mm x 5 m, com pr-coluna. Filtros de 0,45 m. Filtros S&S 602 1/2. Banho ultra-snico.

3.3.Mtodos
De seguida apresentam-se os mtodos utilizados no decorrer do trabalho.

3.3.1. Preparao da amostra


Para um balo volumtrico de 100mL pesar rigorosamente cerca de 15g da amostra finamente triturada e adicionar 50 ml de gua a 60 C, mexer bem at obter uma mistura homognea. Precipitar as protenas por adio sucessiva com agitao de 3 ml da soluo de Carrez I e 3 ml da soluo de Carrez II. Arrefecer at temperatura ambiente. Filtrar por filtro de pregas (S&S 602 1/2) e recolher o filtrado em balo volumtrico de 100 ml e completar ao trao com gua. Filtrar por membrana de 0.45 m. A amostra deve ser analisada imediatamente aps a preparao.

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3.3.2. Condies de operao


As condies cromatogrficas de trabalho para o doseamento doa acares em simultneo na amostra foram: Fluxo: 1.0 ml/min; Temperatura do forno: 40 C; Volume de injeco: 20,00l. Auto injector: Temperatura ambiente Tempo de corrida: 15 minutos Deteco: RI

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4. Resultdos e Discusso

70

4. Resultados e discusso
4.1.Linearidade e gama de trabalho
A linearidade foi avaliada por meio da construo de uma curva de calibrao para as substncias a analisar. Para isto preparou-se uma soluo padro me, da qual se diluiu, posteriormente, volumes de 0,5mL, 0,7mL, 1,0mL, 5,0mL, 10,0mL, 15,0mL e 25,0mL. De forma a facilitar a escrita e a compreenso dos resultados, s diluies anteriores, passa-se a designar por padro 0,5, padro 0,7, padro 1, padro 5, padro 10, padro 15 e padro 25, respectivamente. Na figura seguinte consta um cromatograma obtido para a soluo padro 10, onde se evidenciam os sinais cromatogrficos relativos a cada composto em estudo, assim como os respectivos tempos de reteno.

Figura 4.1 Resposta instrumental ao padro 10, com respectiva identificao dos sinais cromatogrficos e tempos de reteno.

Na Tabela 4.1 encontram-se registados os valores mdios obtidos para cada padro, assim como a incerteza obtida pelo desvio padro das leituras das reas.

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Tabela 4.1 reas da curva de calibrao do doseamento de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose.

Padro Concentrao (g/l) rea Incerteza Concentrao (g/l) rea Incerteza Concentrao (g/l) rea Incerteza Concentrao (g/l) rea Incerteza Concentrao (g/l) rea Incerteza ) ) ) ) )

0,70 0,70 1,9298 0,0052 0,70 0,79256 0,00047 1,40 3,986 0,0053 0,70 0,8811 0,0092 0,70 0,4364 1,0E-04

1,00 1,00 3,10083 0,00065 1,00 2,2091 0,0077 2,00 6,5193 0,0031 1,00 1,592 0,0188 1,00 1,1162 2,7E-05

2,00 Frutose 2,00 5,4231 0,0031 Glucose 2,00 3,5259 0,0022 Sacarose 4,00 11,3080 0,007 Maltose 2,00 2,7332 0,0032 Lactose 2,00 1,8419 2,7E-05

5,00 5,00 12,5361 0,0059 5,00 9,3785 0,0486 10,00 26,1958 0,0046 5,00 6,4666 0,0065 5,00 4,5599 5,5E-05

10,00 10,00 27,6570 0,0032 10,00 20,8017 0,0050 20,00 57,686 0,013 10,00 14,3757 0,007 10,00 10,5518 9,0E-04

15,00 15,00 40,4095 0,0022 15,00 31,28600 0,00090 30,00 84,5179 0,0064 15,00 21,2329 0,0031 15,00 15,7385 1,0E-03

25,00 25,00 67,2123 0,0069 25,00 51,8819 0,0037 50,00 140,6726 0,0076 25,00 35,458 0,0105 25,00 26,4962 5,9E-05

Na figura 4.2 encontram-se as curvas de calibrao da resposta analtica aos padres.

72

80 60 40 20 0 0 150 10

60 50 40 30 20

A - Frutose
20 30

10 0 0 40 30 20 10

B - Glucose
20 30

rea )

100 50

10

C - Sacarose
0 0 20 40 30 25 20 15 10 5 0 0 10 60 0 0 10

D - Maltose
20 30

E - Lactose
20 30

Concentrao (g/L)
Figura 4.2 Curvas de calibrao da resposta analtica: A) frutose, B) glucose, C) sacarose, D) maltose e E) lactose.

Para um melhor ajuste para cada curva de calibrao realizaram-se testes estatsticos adequados referentes s trs fases crticas da calibrao: 1. Representatividade dos valores na curva de calibrao

(homogeneidade da varincia); 2. Escolha do modelo; 3. Deteco de outliers. O teste de homogeneidade da varincia tem como base a distribuio unilateral F de Fisher, onde o valor experimental obtido comparado com um valor crtico tabelado a 99% de confiana ( ). Como hipteses de trabalho assume-

se que a hiptese nula (H0) indica que a diferena que existe entre as varincias
73

no tem significado estatstico. Por sua vez, a hiptese alternativa (H1) indica que as varincias so estatisticamente diferentes. Na tabela 4.2 encontram-se os resultados obtidos neste teste.
Tabela 4.2 Resultados obtidos no teste F de homogeneidade da varincia para os padres em estudo.

Frutose
padro 25 padro 0,7

Glucose 0,0037 0,0047 1,61

Sacarose 0,0076 0,0053 2,06

Maltose 0,0105 0,0092 1,30

Lactose 5,9E-05 1,0E-04 7,95

0,0069 0,0052 1,76

TV

Pela anlise da tabela, e considerando 11.07 o valor crtico calculado a um nvel de confiana de 99%, possvel ver que, para todos os compostos, o valor experimental (TV) inferior ao valor critico. Assim, a este nvel de confiana, a hiptese nula aceite, ou seja, verifica-se homogeneidade da varincia nos resultados obtidos para a curva de calibrao. Como as varincias so estatisticamente semelhantes, passa-se realizao de um teste de Mandel para a escolha do melhor modelo de ajuste. Se o aumento na varincia do ajuste devida eliminao de um parmetro for equiparvel varincia aleatria, o parmetro excludo no necessrio ao modelo. Assumindo como hipteses de trabalho que a hiptese nula indica que o modelo a usar o que tem menor nmero de parmetros, neste caso P01 (modelo linear), e que a hiptese alternativa indica que o melhor modelo ser aquele que possui maior nmero de parmetros. Se o valor F calculado no exceder o valor crtico a hiptese nula deve

ser aceite, o que indica que o polinmio de primeiro grau adequado para a curva de calibrao. Na tabela 4.3 encontram-se os resultados obtidos na realizao deste teste.

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Tabela 4.3 resultados do teste de Mandel para a escolha do modelo.

Modelo Frutose Glucose Sacarose Maltose Lactose P01 P012 P01 P012 P01 P012 P01 P012 P01 P012

SSqr 1,57 1,55 1,00 0,98 6,52 6,51 0,43 0,43 0,39 0,37

ndf 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4

varFit 0,31 0,39 0,20 0,24 1,30 1,63 0,09 0,11 0,08 0,09

TV 0,03 0,12 0,01 0,02 0,19

Fcrit

21,20

Na tabela, SSqr corresponde soma de quadrados, ndf corresponde ao nmero de graus de liberdade do modelo, varFit representa a varincia do ajuste, TV o valor experimental calculado e Fcrit o valor crtico tabelado a um nvel de confiana de 99%. Pela anlise da tabela possvel verificar que os valores experimentais calculados so inferiores ao valor crtico em todos os casos. Assim, para os compostos, o melhor modelo de ajuste ser o polinmio de primeiro grau uma vez que a hiptese nula vlida. O ltimo passo para a construo da curva de calibrao foi a verificao da existncia de outliers onde, numa primeira fase foram verificados por regresso robusta, atravs da anlise de resduos. A anlise de resduos pode ser efectuada com base em cartas de controlo segundo duas perspectivas distintas: a representao dos resduos em funo do ndice do valor experimental e representao dos valores com indicao dos limites de aviso e de aco. Na figura seguinte esto representados os resduos para todos os compostos.

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1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

A - Frutose

B - Glucose

Resduo

2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 5 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00

C - Sacarose
6 7 8 0 1 2 3 4 5

D - Maltose
6 7 8

E - Lactose
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Nmero de resduo
Figura 4.3- Representao grfica dos resduos (em valor absoluto) em funo do nmero de resduo do padro utilizado: A) Frutose, B) Glucose, C)Sacarose, D)Maltose e E) Lactose.

Atendendo a que o resduo obtido pela diferena, em valor absoluto, entre os valores obtidos e os valores previstos, o nmero de resduo que possua maior diferena poder constituir um valor aberrante da distribuio. No caso da frutose o valor correspondente aos resduos 4 e 5 devem ser analisados pois constituem possveis outliers. Para a glucose deve ser analisado o resduo 3. No caso da sacarose e da maltose, deve se analisado o resduo 4 de cada conjunto de dados. Para a h dois valores que devem ser analisados, pela possibilidade de serem aberrantes, correspondentes aos resduos 3 e 4.
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O diagnstico destes valores discrepantes realizado pelo teste de Mandel considerando os dados com os possveis outliers e sem eles. A tabela 4.4 resume os resultados obtidos na anlise de outliers.
Tabela 4.4 Resultados do teste de Mandel para verificar a existncia de outliers.

Resduo Frutose Glucose Sacarose Maltose Lactose 4 3 4 4 4

N 7 6 7 6 7 6 7 6 7 6

SSqr 1,57 0,46 1,01 0,52 6,52 1,71 0,43 0,09 0,39 0,10

ndf 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4

varFit 0,31 0,11 0,20 0,13 1,30 0,43 0,09 0,02 0,08 0,02

TV 9,75 3,76 11,22 14,82 11,81

Fu0.01

21,20

Pela anlise dos valores obtidos no teste estatstico realizado, verifica-se que nenhum dos resduos analisados em cada padro corresponde a um outlier, pois o valor obtido atravs do teste Mandel (TV) inferior ao valor crtico a 99 % de confiana (Fu0.01). Uma vez validado o conjunto de dados possvel determinar a equao linear que melhor descreve os resultados obtidos. As figuras 4.4, 4.5, 4.6, 4.7 e 4.8 mostram as rectas de ajuste obtidas, assim como as respectivas equaes e coeficientes de correlao. Curva de calibrao da Frutose
80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0,0 5,0 10,0 y = 2,6908x + 0,0467 R = 0,9996

rea

15,0 Ci (g/L)

20,0

25,0

30,0

Figura 4.4 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a frutose.

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Curva de calibrao de Glucose


60,0 50,0 40,0 rea 30,0 20,0 10,0 0,0 0,0 5,0 10,0 15,0 Ci (g/L)
Figura 4.5 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a glucose.

y = 2,1016x - 0,4994 R = 0,9998

20,0

25,0

30,0

Curva de calibrao da Sacarose


160,0 140,0 120,0 100,0 rea 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 Ci (g/L)
Figura 4.6 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a sacarose.

y = 2,8158x + 0,0439 R = 0,9997

40,0

50,0

60,0

Curva de calibrao da Maltose


40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0,0 5,0 y = 1,4232x - 0,1151 R = 0,9996

rea

10,0

15,0 Ci (g/L)

20,0

25,0

30,0

Figura 4.7 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a maltose.

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Curva de calibrao da Lactose


30,0 25,0 20,0 y = 1,0705x - 0,3013 R = 0,9995

rea

15,0 10,0 5,0 0,0 0,0 5,0 10,0 15,0 Ci (g/L) 20,0 25,0 30,0

Figura 4.8 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a lactose.

A gama de trabalho linear fica estabelecida com uma faixa de concentraes de 1,4 a 50,0 g/L para a sacarose, e 0,7 a 25,0 g/L para os padres de frutose, glucose, maltose e lactose.

4.2.Limiares analticos
Os limites de deciso (Xd), limites de deteco (XLD) e limites de quantificao (XLQ) foram estimados a partir dos parmetros das rectas de calibrao dos compostos. A tabela 4.5 contm os limiares analticos calculados para os compostos.
Tabela 4.5 Valores dos limiares analticos calculados para os acares.

XD Frutose Glucose Sacarose Maltose Lactose 0,11 0,11 0,21 0,11 0,11

XLD 0,22 0,23 0,43 0,22 0,23

XLQ 0,66 0,68 1,28 0,65 0,69

Pela anlise da tabela 4.5, e observando os valores da concentrao dos padres mais baixos para ambos os compostos, possvel verificar que o limite de

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quantificao inferior ao valor da concentrao do primeiro padro, o que est em conformidade com os requisitos no estabelecimento deste mesmo limite.

4.3.Preciso
Avaliada em termos de repetibilidade e de preciso intermdia.

4.3.1. Repetibilidade
A repetibilidade avaliada atravs da anlise do coeficiente de variao de um conjunto de rplicas consecutivas da mesma amostra. O mtodo considera-se preciso em termos de repetibilidade se o coeficiente de variao for inferior a 1.0 %. Neste caso fizeram-se dez injeces consecutivas de uma soluo amostra e da soluo padro no mesmo dia, no mesmo equipamento e pelo mesmo analista e procedeu-se anlise do coeficiente de variao das reas obtidas tanto para a amostra como para a soluo padro. Os resultados obtidos encontram-se presentes na tabela 4.6.
Tabela 4.6 - Concentrao e coeficientes de variao dos acares da amostra.

Padro Concentrao mdia (desvio padro) (g/L) Frutose Glucose Sacarose Maltose Lactose 24.96 (5.07x10-03) 24.94 (1.86x10-02) 49,94 (2.83x10-03) 24.99 (1.50x10-02) 25.03 (1.92x10-02) CV (%) 0.02 0.07 0.01 0.06 0.07

Amostra Concentrao mdia (desvio padro) (g/L) 1.00 (6.43x10-04) 11.97 (1.34x10-03) 28.80 (8.82x10-03) 4.02 (4.81x10-03) 5.99 (1.43x10-03) CV (%) 0.06 0.01 0.03 0.12 0.02

Pela anlise dos coeficientes de variao pode-se considerar o mtodo validado em termos de repetibilidade uma vez que os valores obtidos para o coeficiente de variao so inferiores a 1,0 %.

4.3.2. Preciso intermdia


Para estudar a preciso intermdia do mtodo foram realizadas anlises de amostras de padro e de amostra preparadas em diluies de 5mL, 15mL e 25mL

80

da soluo me, em dias diferentes, tendo sido avaliado o coeficiente de variao decorrente da injeco de trs gamas de concentrao diferentes. O mtodo considera-se preciso em termos de preciso intermdia se o coeficiente de variao obtido for inferior a 2.0%. Na tabela 4.7 encontram-se os valores obtidos para a anlise da preciso intermdia no doseamento da frutose.
Tabela 4.7- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a frutose.

Amostra (g/L) 5 0,199 1 Dia 0,197 0,197 0,201 2 Dia 0,195 0,204 0,201 3 Dia 0,194 0,193 15 0,412 0,414 0,412 0,412 0,417 0,419 0,411 0,410 0,411 25 0,997 1,006 1,002 0,995 0,995 1,002 0,999 0,997 1,005 5 4,637 4,638 4,646 4,639 4,642 4,646 4,648 4,646 4,639

Padro (g/L) 15 15,000 15,001 14,996 15,002 15,002 14,996 14,998 15,001 14,996 25 24,969 24,965 24,955 24,974 24,959 24,971 24,962 24,965 24,965

Com estes dados foi efectuada uma anlise ANOVA para verificar se os valores eram afectados pelo factor dia, ou seja, para verificar se o facto de as anlises serem efectuadas em dias diferentes tem influncia para a variabilidade total do conjunto de dados. Para a soluo amostra 5 o valor de teste obtido foi de 0,81 que vai ser comparado com o valor crtico, a um nvel de confiana de 95%, de 5,14. Como o valor experimental inferior ao valor crtico tabelado, a hiptese nula aceite, ou seja, o factor Dia no afecta os resultados e, por isso, no h interferncia para a variabilidade total. Ao mesmo nvel de diluio, para o padro, o valor de teste obtido da anlise ANOVA foi de 0,67. A um nvel de confiana de 95%, o valor tabelado superior ao valor de teste, logo a hiptese nula aceite. Para a soluo amostra 15 o valor de teste foi de 5,57 e, a um nvel de confiana de 95% o valor de teste inferior ao valor crtico, indicando que a hiptese nula (factor no influi) aceite. Na mesma gama, o factor no afecta os resultados obtidos para o padro pois o valor de teste (0,38) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%.
81

Quando se analisa a soluo amostra 25 verifica-se que efeito dirio no influi na varincia total uma vez que o valor de teste (0,61) inferior ao valor crtico a um nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro conclui-se o mesmo uma vez que o valor de teste de 0,66. Para as solues amostra e padro, preparadas de uma diluio de 5mL, o coeficiente de variao de 1,8% e 0,1%, respectivamente. Para as solues de diluio de 15mL, o CV de 0,5% para a amostra e 0,2% para o padro. Na gama de diluio de 25 mL, o coeficiente de variao de 0,4% na amostra e 0,1% no padro. Com isto, o mtodo de doseamento da frutose encontra-se validado relativamente preciso intermdia. Na tabela 4.8 encontram-se os valores obtidos para a anlise da preciso intermdia no doseamento da glucose.
Tabela 4.8- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a glucose.

Amostra (g/L) 5 0,888 1 Dia 0,883 0,898 0,898 2 Dia 0,888 0,897 0,886 3 Dia 0,894 0,899 15 7,174 7,182 7,191 7,183 7,179 7,180 7,184 7,178 7,182 25 11,974 11,974 11,971 11,962 11,973 11,970 11,962 11,963 11,971 5 4,707 4,704 4,703 4,691 4,704 4,709 4,698 4,703 4,696

Padro (g/L) 15 15,123 15,130 15,127 15,117 15,113 15,116 15,123 15,118 15,133 25 24,935 24,940 24,935 24,936 24,940 24,937 24,938 24,935 24,946

Para a soluo amostra 5 o valor de teste obtido foi de 0,46 que vai ser comparado com o valor crtico, a um nvel de confiana de 95%, de 5,14. Como o valor experimental inferior ao valor critico tabelado, a hiptese nula aceite, ou seja, no h interferncia do factor para a variabilidade total. Na mesma gama, para o padro, o valor de teste obtido da foi de 0,70. A um nvel de confiana de 95% possvel afirmar que o factor no influi na variabilidade total, uma vez que, o valor de teste inferior ao valor tabelado. O factor no afecta os resultados obtidos na amostra 15 pois o valor de teste (0,07) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Para a
82

soluo padro a 100% o valor de teste foi de 4,72 o que indica que o factor no influi uma vez que o valor crtico superior. Na gama das solues 25 o factor no afecta os resultados obtidos na amostra pois o valor de teste (2,04) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro o mesmo se conclui pois o valor de teste (0,44) inferior ao valor tabelado. Para as solues amostra e padro, preparadas atravs da diluio de 5 mL, o coeficiente de variao de 1,0% e 0,1 %, respectivamente. Para as solues diludas de 15 mL o CV de 0,1% para a amostra e 0,3% para o padro. Na gama de diluio de 25mL, o coeficiente de variao de 0, 4% na amostra e 0, 2% no padro. Com isto, o mtodo de doseamento da glucose encontra-se validado relativamente preciso intermdia. Na tabela 4.9 encontram-se os valores obtidos para a anlise da preciso intermdia no doseamento da sacarose.
Tabela 4.9- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a sacarose.

Amostra (g/L) 5 5,769 1 Dia 5,756 5,772 5,763 2 Dia 5,767 5,761 5,756 3 Dia 5,768 5,761 15 17,284 17,282 17,283 17,283 17,279 17,281 17,286 17,281 17,281 25 28,802 28,800 28,802 28,798 28,790 28,802 28,799 28,798 28,797 5 9,289 9,284 9,288 9,285 9,286 9,292 9,287 9,284 9,287

Padro (g/L) 15 30,005 29,999 29,995 30,002 29,998 30,008 29,997 29,998 30,001 25 49,942 49,937 49,943 49,943 49,947 49,948 49,948 49,945 49,939

Para a soluo amostra 5 o valor de teste obtido foi de 0,28 que vai ser comparado com o valor crtico, a um nvel de confiana de 95%, de 5,14. Como o valor experimental inferior ao valor critico tabelado, a hiptese nula aceite, ou seja, o factor Dia no afecta os resultados e, por isso, no h interferncia para a variabilidade total. Ao mesmo nvel de diluio, para o padro, o valor de teste obtido da anlise ANOVA foi de 0,71. A um nvel de confiana de 95%, o valor tabelado superior ao valor de teste, logo a hiptese nula aceite.

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Para a soluo amostra 15 o valor de teste foi de 0,61 e, a um nvel de confiana de 95% o valor de teste inferior ao valor crtico, indicando que a hiptese nula (factor no influi) aceite. Na mesma gama, o factor no afecta os resultados obtidos para o padro pois o valor de teste (0,78) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Quando se analisa a soluo amostra 25 verifica-se que efeito dirio no influi na varincia total uma vez que o valor de teste (1,30) inferior ao valor crtico a um nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro conclui-se o mesmo uma vez que o valor de teste de 1,82. Para as solues amostra e padro, preparadas de uma diluio de 5mL, o coeficiente de variao de 0,1% e 0,3%, respectivamente. Para as solues de diluio de 15mL, o CV de 0,1% para a amostra e para o padro. Na gama de diluio de 25 mL, o coeficiente de variao de 0,2% na amostra e 0,1% no padro. Com isto, o mtodo de doseamento da sacarose encontra-se validado relativamente preciso intermdia. Na tabela 4.10 encontram-se os valores obtidos para a anlise da preciso intermdia no doseamento da maltose.
Tabela 4.10- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a maltose.

Amostra (g/L) 5 0,808 1 Dia 0,803 0,800 0,807 2 Dia 0,804 0,809 0,814 3 Dia 0,802 0,795 15 2,426 2,411 2,414 2,410 2,404 2,420 2,412 2,401 2,411 25 4,017 4,029 4,011 4,023 4,015 4,022 4,016 4,020 4,024 5 4,617 4,622 4,615 4,621 4,623 4,630 4,625 4,622 4,623

Padro (g/L) 15 14,999 15,009 15,004 14,994 15,005 15,005 14,999 14,998 15,009 25 24,988 24,991 24,995 25,001 24,991 24,984 24,987 24,989 25,010

Para a soluo amostra 5 o valor de teste obtido foi de 0,26 que vai ser comparado com o valor crtico, a um nvel de confiana de 95%, de 5,14. Como o valor experimental inferior ao valor critico tabelado, a hiptese nula aceite, ou seja, no h interferncia do factor para a variabilidade total. Na mesma gama, para o padro, o valor de teste obtido da foi de 3,23. A um nvel de confiana de 95%

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possvel afirmar que o factor no influi na variabilidade total, uma vez que, o valor de teste inferior ao valor tabelado. O factor no afecta os resultados obtidos na amostra 15 pois o valor de teste (1,17) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro a 100% o valor de teste foi de 0,24 o que indica que o factor no influi uma vez que o valor crtico superior. Na gama das solues 25 o factor no afecta os resultados obtidos na amostra pois o valor de teste (0,02) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro o mesmo se conclui pois o valor de teste (0,17) inferior ao valor tabelado. Para as solues amostra e padro, preparadas atravs da diluio de 5mL, o coeficiente de variao de 0,9% e 0, 7%, respectivamente. Para as solues diludas de 15mL o CV de 0,3% para a amostra e 0, 4% para o padro. Na gama de diluio de 25mL, o coeficiente de variao de 0,2% na amostra e 0, 4% no padro. Com isto, o mtodo de doseamento da maltose encontra-se validado relativamente preciso intermdia. Na tabela 4.11 encontram-se os valores obtidos para a anlise da preciso intermdia no doseamento da lactose.
Tabela 4.11- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a lactose.

Amostra (g/L) 5 1,198 1 Dia 1,197 1,199 1,198 2 Dia 1,196 1,199 1,198 3 Dia 1,199 1,197 15 3,594 3,595 3,595 3,596 3,593 3,595 3,593 3,593 3,594 25 5,991 5,992 5,988 5,991 5,992 5,990 5,990 5,991 5,988 5 4,542 4,545 4,541 4,541 4,542 4,541 4,541 4,542 4,541

Padro (g/L) 15 14,984 14,984 14,983 14,985 14,985 14,983 14,984 14,983 14,984 25 25,034 25,032 25,035 25,034 25,032 25,033 25,033 25,035 25,033

Para a soluo amostra 5 o valor de teste obtido foi de 0,16 que vai ser comparado com o valor crtico, a um nvel de confiana de 95%, de 5,14. Como o valor experimental inferior ao valor critico tabelado, a hiptese nula aceite, ou seja, o factor Dia no afecta os resultados e, por isso, no h interferncia para a variabilidade total. Ao mesmo nvel de diluio, para o padro, o valor de teste obtido
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da anlise ANOVA foi de 0,65. A um nvel de confiana de 95%, o valor tabelado superior ao valor de teste, logo a hiptese nula aceite. Para a soluo amostra 15 o valor de teste foi de 2,88 e, a um nvel de confiana de 95% o valor de teste inferior ao valor crtico, indicando que a hiptese nula (factor no influi) aceite. Na mesma gama, o factor no afecta os resultados obtidos para o padro pois o valor de teste (0,28) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Quando se analisa a soluo amostra 25 verifica-se que efeito dirio no influi na varincia total uma vez que o valor de teste (0,53) inferior ao valor critico a um nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro conclui-se o mesmo uma vez que o valor de teste de 0, 26. Para as solues amostra e padro, preparadas de uma diluio de 5mL, o coeficiente de variao de 0,2% e 0,1%, respectivamente. Para as solues de diluio de 15mL, o CV de 0,3% para a amostra e 0,1% para o padro. Na gama de diluio de 25 mL, o coeficiente de variao de 0,3% na amostra e 0,1% no padro. Com isto, o mtodo de doseamento da lactose encontra-se validado relativamente preciso intermdia.

4.4.Exactido
Para avaliar a exactido do mtodo de doseamento dos acares na amostra procedeu-se preparao de amostras de placebo, fortificadas com padro, de modo a obter solues com concentraes diludas da soluo me 5mL, 15mL e 25mL, de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose e posteriormente compararam-se os valores obtidos com o padro de referncia, na mesma gama de concentraes. A exactido do mtodo de anlise foi avaliada pelo erro absoluto atravs do teste t-student e erro relativo e, posteriormente, procedeu-se determinao da percentagem de recuperao.

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Tabela 4.12- Resultados obtidos no estudo de exactido dos mtodos de quantificao dos doseamentos frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose.

Gama Frutose 5 15 25 Glucose 5 15 25 Sacarose 5 15 25 5 15 25 Lactose 5 15 25

Amostra (g/L) 4,64 4,64 15,00 15,00 24,96 24,96 4,76 4,72 15,13 15,12 24,93 24,93 9,29 9,29 30,00 30,00 49,94 49,94 4,62 4,62 15,00 15,00 24,99 24,99 4,54 4,54 14,98 14,98 25,03 25,03

Padro (g/L) 4,64 4,64 15,00 15,00 24,96 24,97 4,67 4,68 15,12 15,12 24,92 24,93 9,29 9,29 30,00 30,00 49,94 49,94 4,62 4,62 15,00 15,00 24,99 24,99 4,54 4,54 14,98 14,98 25,03 25,03

Maltose

Do estudo da exactido, tabela 4.12, obteve-se para a frutose, para cada gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 4,64 (1,05E-03), 15,00 (8,67E-04) e 24,96 (7,88E-04) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de 0,05, 0,01 e 0,01%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 4,64 (3,10E03), 15,00 (1,58E-04) e 24,96 (1,45E-03) g/L, para cada gama de concentraes, a exactido avaliada atravs do teste t-student conduz ao valor de teste 0,95, 1,26 e
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0,06 que inferior ao valor previsto pela distribuio t-student bilateral ao nvel de confiana de 95% (12,71). Os valores obtidos como estimativas de erro relativo foram de 0,03, 0,01 e 0,01% que se encontram dentro da gama pretendida (inferior a 5,0 %) e as percentagens de recuperao obtidas (100,03, 100,01 e 100,04 %) tambm se encontram dentro o intervalo pretendido (95,0 a 105,0 %). Pela anlise dos valores obtidos podemos afirmar que o mtodo se considera validado em termos de exactido para a frutose. No estudo de exactido para a glucose, tabela 4.12, obteve-se para cada gama de concentraes estimativas mdias de 4,74 (2,66E-02), 15,12 (1,01E-03) e 24,93 (1,14E-03) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de 0,10, 0,01 e 0,02%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 4,68 (5,99E-03), 15,12 (2,15E-03) e 24,93 (5,32E-03) g/L, para cada gama de concentraes, a exactido, avaliada atravs do teste t-student, conduz ao valor de teste 0,40, 2,06 e 1,20 que inferior ao valor crtico a um nvel de confiana de 95%. O valor obtido como estimativa de erro relativo foi de 1,3, 0,01 e 0,02% que se encontra dentro do pretendido uma vez que inferior a 5,0%, e a percentagem de recuperao obtida foi 101,32, 100,01 e 100,02% que se encontram compreendidas entre o intervalo de 95,0 e 105,0%. Assim, possvel concluir que o mtodo se encontra validado ao nvel de exactido para a glucose. Para a sacarose obteve-se, para cada gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 9,29 (1,16E-03), 30,00 (1,61E-03) e 49,94 (1,66E-03) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de 0,01, 0,01 e 0,02%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 9,29 (5,32E-03), 30,00 (1,03E-03) e 49,94 (1,41E03) g/L, para cada gama de concentraes, o teste t-student conduz ao valor de teste de 19,43, 6,57 e 1,39 que inferior ao valor previsto pela distribuio t student bilateral ao nvel de confiana de 95% (12,71) excepto para a gama de diluio de 5mL da soluo me, e desta forma verificou-se que, ao nvel de confiana 99% o valor crtico de 63.66, sendo o valor de teste inferior. Assim, para esta gama a hiptese nula considerada dbia, pelo que ao analisar o valor de prova (a probabilidade de aceitao da hiptese nula) de 3,3% possvel afirmar que o mtodo tende a ser exacto mas encontra-se levemente afectado por um erro sistemtico.

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Os valores obtidos como estimativas de erro relativo foram de 0,02, 0,01 e 0,01% que se encontram dentro da gama pretendida (inferior a 5,0 %) e as percentagens de recuperao obtidas (100,01, 100,01 e 100,02 %, respectivamente) tambm se encontram dentro o intervalo pretendido (95,0 a 105,0 %). Pela anlise dos valores obtidos podemos afirmar que o mtodo se considera validado em termos de exactido para sacarose. Do estudo da exactido, tabela 4.12, obteve-se para a maltose, para cada gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 4,62 (8,40E-05), 15,00 (3,32E-05) e 24,99 (8,93E-05) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de 0,01, 0,02 e 0,02%, respectivamente. Tendo como valores de referncia4,62 (2,69E05), 15,00 (6,46E-05) e 24,99 (5,59E-05) g/L, para cada gama de concentraes, a exactido, avaliada atravs do teste t-student, conduz ao valor de teste 1,86, 0,70 e 7,07 que inferior ao valor crtico a um nvel de confiana de 95%. O valor obtido como estimativa de erro relativo foi de 0,01, 0,01 e 0,03% que se encontra dentro do pretendido uma vez que inferior a 5,0%, e a percentagem de recuperao obtida foi 100,02, 100,03 e 100,03% que se encontram compreendidas entre o intervalo de 95,0 e 105,0%. Assim, possvel concluir que o mtodo se encontra validado ao nvel de exactido para a maltose. Para a lactose obteve-se, para cada gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 4,54 (2,53E-05), 14,98 (8,56E-04) e 25,03 (1,58E-03) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de 0,01, 0,02 e 0,01%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 4,54 (2,82E-03), 14,98 (4,83E-04) e 25,03 (1,24E04) g/L, para cada gama de concentraes, o teste t-student conduz ao valor de teste de 0,92, 0,39 e 0,14 que inferior ao valor previsto pela distribuio t student bilateral ao nvel de confiana de 95% (12,71). O valor obtido como estimativa de erro relativo foi de 0,04, 0,01 e 0,03% que se encontra dentro do pretendido uma vez que inferior a 5.0%, e a percentagem de recuperao obtida foi 100,04, 100,01 e 99,99% que se encontram compreendidas entre o intervalo de 95,0 e 105,0%. Assim, possvel concluir que o mtodo se encontra validado ao nvel de exactido para a lactose.

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5. Conclusoes

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5. Concluses

O trabalho desenvolvido visava essencialmente um objectivo a validao do mtodo de anlise de produtos alimentares por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. Para esse efeito preparou-se uma soluo padro me contendo 2,5g de frutose, 2,5g de glucose, 5,0g de sacarose, 2,5g de maltose e 2,5g de lactose, para 50,00mL. Desta soluo fizeram-se 7 diluies de 0,7mL, 1mL, 2mL, 5mL, 10mL, 15mL e 25mL, de forma a diminuir a concentrao inicial. A soluo da amostra foi preparada pesando, rigorosamente 15,0g da amostra para um volume final, aps o procedimento descrito na seco experimental, de 100,00mL. Para a avaliao dos parmetros de validao do mtodo de anlise do doseamento simultneo de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose na amostra em HPLC comeou-se por verificar a especificidade/selectividade do mtodo e atravs dos cromatogramas comprovou-se que no existem interferentes no doseamento dos acares. Pelo parmetro de linearidade estabeleceu-se para cada composto a respectiva curva de calibrao linear com equao de polinmio de primeiro grau. A gama de trabalho construiu-se a partir de sete padres e definiu-se de 1,4g/L a 50g/L para a sacarose, 0,7 a 25 g/L para os restantes acares considerados. A partir das curvas de calibrao estabeleceu-se os limiares analticos para os cinco compostos a dosear, onde se obteve como limites de quantificao 0,66g/L, 0,68g/L, 1,28/L, 0,65g/L e 0,69g/L, para a frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose, respectivamente. A preciso do mtodo verificou-se pela repetibilidade e preciso intermdia. Em termos de repetibilidade, os coeficientes de variao obtidos para os acares na soluo padro e na soluo amostra foram inferiores a 1,0 %, logo o mtodo encontra-se validado em termos de repetibilidade. Quanto preciso intermdia avaliou-se a soluo padro e amostra em trs gamas de concentraes diferentes (diluies de 5mL, 15mL e 25mL) e em trs dias diferentes. Em todos os casos os coeficientes de variao obtidos foram inferiores a 2,0 %, logo o mtodo considerase validado em termos de preciso intermdia, nestas gamas de concentrao.

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Como os parmetros indicadores da preciso do mtodo se encontram validados, o mtodo encontra-se tambm validado no parmetro preciso. A exactido do mtodo avaliou-se pelo erro absoluto atravs do teste tstudent a 95 % de confiana, erro relativo e posteriormente procedeu-se determinao da percentagem de recuperao, como terceiro parmetro de desempenho do mtodo quanto exactido, e em todos os casos verificou-se que o mtodo exacto, ou seja, no apresenta erro sistemtico significativo. A metodologia testada para doseamento, em simultneo, de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose, considera-se validada, uma vez que satisfaz as especificaes determinadas para cada parmetro de validao testado. Futuramente seria ainda de todo conveniente avaliar a estabilidade das solues amostra e padro, ao longo do tempo, enquanto se encontram na bancada de trabalho e tambm quando se encontram no auto-injector. Aps esta avaliao ser intenso validar o mesmo mtodo para o restante tipo de amostras produzidas na indstria onde decorreu o trabalho.

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6. Bibliogrfi

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6. Bibliografia
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Cromatografia: Princpios bsicos e

tcnicas afins. Rio de Janeiro, RJ, 2003 [14] LANAS, Fermando M. Cromatografia em fase gasosa. So Carlos: Acta, 1993. 254p [15] CECCHI, Heloisa Mscia. Fundamentos tericos e prticos em anlise de alimentos. 2 ed. rev. Campinas: Editora da Unicamp, 2003, 207p. [16] VOGEL, Arthur. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Tcnicos e Cientficos Editora S.A, 2002. 462p. [17] HARRIS, Daniel C. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Tcnicos e Cientficos Editora S.A., 2005. 876p. [18] HARRIS, Daniel C. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Tcnicos e Cientficos Editora S.A., 2005 [19] SKOOG, Douglas A.; HOLLER, James; NIEMAN, Timothy. Princpios de Anlise Instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. 836p [20] ARAJO, Julio M. A. Qumica de Alimentos: teoria e prtica. 3 ed. Viosa: Editora UFV, 2004, 416p. [21] DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. Atualidades em Qumica, n.7, p.21-25, mai.1998. [22] NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia: Princpios bsicos e

tcnicas afins. Rio de Janeiro, RJ, 2003 [23] LOPES, Joo Luis Callegari. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed. Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.45-57 [24] BRAGA, Gilberto Leite. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed. Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p. 29-43. [25] BONATO, Pierina Sueli. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed. Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.141-181. [26] GUIMARES, Luis Fernando Lopes; COLLINS, Carol H. Cromatografia lquida de alta eficincia. In: Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed. Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.183-238.

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[27] POMBEIRO, Armando. Tcnicas e Operaes Unitrias em Qumica Laboratorial. 4 ed. Lisboa: Fundao Calouste Gulbenkian, 2003, 1069p [28] PIZZOLATO, Tnia. Apostila da disciplina de Cromatografia do PPG em Qumica. Instituto de Qumica. UFRGS, 2001. [29] ANDRADE, dira Castelo Branco de, Anlise de alimentos: uma viso qumica da nutrio So Paulo: Livraria Varela, 2006 [30] SPENCER, G.L.; MEADE, G.P. Special Reagentes. Cane Sugar Handbook, New York, Wiley, 1945. [31] JARDIM, Isabel Cristina Fontes Sales; GUIMARES, Luis Fernando Lopes; COLLINS, Carol H. Fundamentos de cromatografia. Campinas: Editora da UNICAMP, 2006. 453p. [32] SCOTT, Raymond P. W.: Liquid Chromatography. 2003. 101p. Disponvel em: <http://www.library4science.com/>. Acesso em: 20 mai. 2012. [33] NETO, Francisco R. de A.; NUNES, Denise, da S. S. Cromatografia: Princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003. 187p. [34] Wellings, D. A., A Practical Handbook of Preparative HPLC, Elsevier, 2006. [35] Validation of Analytical Procedures: text and Methology Q2(R1), ICH, november 2005 [36] Chasin, A.M.; Nascimento, et all., Validao de mtodos em anlises toxicolgicas: uma abordagem geral, Revista Brasileira Toxicologia, 1998, v.11, n.1, p.1-6 [37] Guia Relacre 13, Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica, Relacre, 2000 [38] Jorge L.G.F.S. Costa Pereira, Caracterizao e Validao de Mtodos Analticos, Departamento de Qumica da Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade de Coimbra, Coimbra, 2008

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Anexos

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Anexo I - As aplicaes do acar na rea da produo alimentar

O acar, para alm de ser o adoante por excelncia, desempenha tambm outras funes que, embora menos conhecidas, o tornam um ingrediente importante na confeco alimentar. A sua capacidade para dar cor e paladar, e o seu contributo na textura, consistncia, conservao e fermentao dos alimentos, so propriedades que outros adoantes no conseguem alcanar. Eis aqui algumas das suas principais funes na cozinha: ADOAR - O acar d um sabor doce imediato aos alimentos. O acar o adoante de referncia. CONSERVAR O acar ajuda a travar o desenvolvimento de

microrganismos, porque imobiliza as molculas da gua que as bactrias, o fermento ou o bolor necessitam para crescer. Esta propriedade faz do acar um importante agente na preservao de compotas e outras conservas, mas tambm de bolos, impedindo que estes seque m e se tornem velhos. O acar tambm actua como antioxidante. Protege a fruta em conserva de oxidar e limita a tendncia das gorduras usadas na pastelaria ficarem ranosas. O acar, em si, conserva-se durante muito tempo, quando em condies normais de ambiente. DAR COR - O acar est na base do processo de caramelizao que produz sabores e graus de cor muito especficos em bolos e bombons. MODIFICAR SABORES - Usado em pequenas quantidades, o acar pode atenuar ou intensificar sabores. Os sabores salgado, amargo e cido so reduzidos com a aplicao de acar. , por exemplo, o caso da maionese, de produtos base de tomate e de frutos como groselha e toranja. DAR TEXTURA - Na pastelaria, o acar essencial para dar diferentes texturas aos alimentos confeccionados. O acar interage com gua, fermento e farinha, desempenhando um papel importante na consistncia dos produtos durante a cozedura, na sua densidade, cor e aparncia. Dependendo da quantidade utilizada e do tamanho dos cristais (da haver
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acar com tamanhos de granulado diferentes) podem obter-se diferentes efeitos no produto final. Na confeitaria, a capacidade do acar cristalizar e se dissolver em temperaturas diferentes e com quantidades variveis de gua, permite adquirir uma grande variedade de estruturas. Por exemplo, a textura do chocolate s possvel atravs da mistura do acar com a manteiga de cacau. Nas mousses, a ligao do acar com as claras de ovo que proporciona a estabilidade desta sobremesa. DAR CONSISTNCIA- Nas bebidas e nos gelados, a viscosidade do acar dissolvido d uma consistncia agradvel na boca. Nos iogurtes, a consistncia promovida atravs da aco especial do acar nas protenas do leite. INFLUENCIAR PROCESSOS CULINRIOS - O acar tem tambm propriedades que o tornam um agente activo em alguns processos culinrios: um excelente substrato para muitas fermentaes, acelerando o seu processo (ex.: a massa dos folares, bebidas); acelera o tempo de cozedura; na congelao, retarda o tempo a que congelam os alimentos, impedindo, por exemplo no caso dos gelados, que se formem demasiados cristais de gelo. Fora da rea alimentar, o acar tem ainda uma srie de utilizaes interessantes: Na produo de colas e cimentos; No fabrico de tintas; No tratamento de peles; Na composio de muitos produtos farmacuticos; Ajuda a curar feridas; usado para produzir penicilina. Se adicionado gua, ajuda a manter as flores frescas durante mais tempo; o ingrediente que faz o vidro utilizado no cinema nas cenas de duplo;

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Anexo II Cromatogramas obtidos na leitura dos padres e amostra

Figura A 2.1 Cromatograma obtido para o padro 1.

Figura A 2.2 Cromatograma obtido para o padro 5.

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Figura A 2.3 Cromatograma obtido para o padro 10.

Figura A 2.4 Cromatograma obtido para o padro 25.

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Figura A 2.4 Cromatograma obtido para a amostra.

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Anexo III Tabelas estatsticas relevantes


Tabela A 3.1 Valores crticos da distribuio t-student bilateral.

Tabela A 3.2 Valores crticos da distribuio de Fisher-Snedcor unilateral (=0,05).

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Tabela A 3.3 Valores crticos da distribuio de Fisher-Snedcor unilateral (=0,01).

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